Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aggressiivinen syöpien näytteille tehokas muuntaminen suuria määriä glukoosia laktaatin mukana hapon erityksen, ilmiö tunnetaan nimellä Warburg vaikutus. Hapan mikroympäristön ja emäksinen sytosoliin luoda protoni-gradientilla (happo gradientti) solukalvon läpi, joka edustaa protoni-motiivi energiaa. Lisääntyvä mittaustuloksia fysiologisista koskevat mallit viittaavat siihen, että happo kaltevuus stimuloi kasvaimen leviäminen, ja voi myös tukea sen energiantarpeesta. Kuitenkin suora biokemiallinen näyttö yhdistävät solunulkoisen happo kaltevuus polveen solunsisäisen ATP puuttuu. Tässä työssä me osoittavat, että syöpäsolut voivat syntetisoida merkittäviä määriä fosfaatti-joukkovelkakirjoja fosfaatin vastauksena happo kaltevuus poikki solukalvon. Totesi ilmiö on olemassa ilman Glykolyysivaiheen ja mitokondrioiden ATP synteesi, ja on ainutlaatuinen syöpä. Biokemialliset määritykset käyttäen elinkelpoisia syöpäsoluja, ja puhdistettu solukalvon vesikkelit hyödyntäen radioaktiivisen fosfaatin, vahvisti fosfaatti-sidoksen synteesi vapailta fosfaatti (P ​​

i), ja myös lokalisointi tämän toiminnan solukalvon. Lisäksi ATP, hallitseva muodostuminen pyrofosfaatti (PP

i) P

i havaittiin myös, kun solukalvon vesikkelit syöpäsoluista tehtiin transmembraaninen happo kaltevuus. Syöpä sytosoleissa havaittiin kykenee muuntamaan PP

i ATP, ja myös stimuloivat ATP synteesi P

i päässä rakkulat. Acid kaltevuus syntyneet glukoosiaineenvaihdunnan syöpäsolujen, kuten havaittiin kasvainten, myös osoittautunut kriittinen fosfaatti-sidoksen synteesi. Lyhyesti, nämä havainnot osoittavat roolin happaman kasvaimen miljöö mahdollisena energianlähteenä ja voivat tarjota uusi terapeuttinen kohde.

Citation: Dharin G, Sen S, Chaudhuri G (2015) Acid Gradient poikki solukalvon Can aja Fosfaatti Bond Synthesis syöpäsoluissa: Hapan Kasvain Milieu mahdollisena energianlähteenä. PLoS ONE 10 (4): e0124070. doi: 10,1371 /journal.pone.0124070

Academic Editor: Marie-Joelle Virolle, University Paris South, RANSKA

vastaanotettu: 01 joulukuu 2014; Hyväksytty: 25 helmikuu 2015; Julkaistu: 15 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Dharin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat apurahoja GC päässä Carl ja Roberta Deutsch Foundation ja Kelly päivä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Warburg vaikutus on metabolinen tunnusmerkki aggressiivisinta syöpäsolujen jolloin suurin osa glukoosin muuttuu laktaatin hapen läsnäollessa [1, 2]. Aerobinen Glykolyysivaiheen liittyy happamoitumisen kasvain microenvironment [3, 4], että valikoivia kasvuetua syöpäsolujen metabolinen uudelleenohjelmointi [5-7], lisääntynyt invasiivisuus [8-10] ja sääntelyn solukierron [11]. Aggressiivinen syöpäsolut vaativat ATP tuottamaan riittävästi rakennuspalikat, kuten proteiineja, lipidejä ja DNA leviämistä. Glukoosin muuntaminen laktaatin tuottaa vain 2-molekyyliä ATP verrattuna 38-molekyylien ollessa kytkettynä oksidatiivisen fosforylaation [12]. Näin ollen vaikka aerobinen Glykolyysivaiheen ja solunulkoisen happamoitumisen valikoivia kasvuetua syöpä kuten edellä, miten syöpäsolut vastaamaan sen energiankulutus tässä tilanteessa edelleen paradoksi.

Acid kaltevuus tai protoni-vaikutin poikki kalvot on energianlähteenä jota käytetään mitokondriot kloroplastitransformaatio ja mikrobien maailma syntetisoida fosfaatti joukkovelkakirjoja [12-16]. Ehdotti ensimmäisenä Peter Mitchell kuuluisassa kemiallis-osmoottinen teoria [17], happo kaltevuus poikki kalvon pysyi yleisimmin käytetty menetelmä elävissä järjestelmissä varastoida energiaa metabolisen polttoaineiden sähkökemiallinen potentiaali energiaa. Solukoneisto myöhemmin hyödyntää tätä energiaa ajaa synteesin korkean energian fosfaatti joukkovelkakirjojen muodossa ATP ja muiden korkean energian molekyylien hyödyntäminen soluprosesseihin. [13, 16].

On mielenkiintoista huomata, että vaikka solunulkoinen pH syöpäsolujen on hapan, solunsisäinen pH on emäksinen verrattuna normaaleihin soluihin [3, 18, 19]. Emäksinen solunsisäisen pH: n ja happaman solunulkoisen pH solukalvon välillä on huomattava allas protoni-motiivi energiaa. Kasvaimet pysty hyödyntämään tämän tallennetun potentiaalienergian ajaa paljon energiaa fosfaatti-sidoksen synteesi soluissa edelleen mahdollisuus. On olemassa vahvaa fysiologinen näyttöä tärkeyttä hapon kaltevuus syövässä, jotka on jo perustettu muut tutkijat. Havaittiin, että lisäämällä solunulkoinen pH ruiskuttamalla emäspuskureista kasvaimeen ympäristöön vähentää kasvaimen kokoa ja esti myös etäpesäkkeiden [20, 21]. Lisäksi syöpäsolut osoittaa lisääntynyttä lisääntymistä ja invasiivisuus happamassa ulkoisen ympäristön [8-10, 22]. Tämä in vivo fysiologiset todisteet osoittavat, että happo kaltevuus, riippumaton tila hapon erityksen, stimuloi syöpäsolujen lisääntymistä ja myös tukea heidän energiantarpeesta. Kuitenkin suora biokemiallinen näyttö yhdistävät solunulkoisen happo kaltevuus polveen solunsisäisen ATP on puuttunut, ja tämä on painopiste nykyisen työn. On haastavaa vahvistaa ATP synteesi vastauksena happo kaltevuus varmuudella samalla poistaa osuudet Glykolyysivaiheen tai mitokondrioiden in vivo järjestelmässä. Esto Glykolyysivaiheen tai mitokondrioiden in vivo olisi tappava. Kuitenkin tämä voidaan tutkia käyttäen viljeltyjä soluja, ja puhdistettu solukalvon vesikkelit. Radioaktiivinen fosfaattia voidaan käyttää vahvistamaan, onko uusi fosfaatti sidoksia muodostetaan vapaa fosfaatti eikä fosfaattia bond vaihto. Työ esitetään tässä vahvistaa, että syöpäsolut voivat syntetisoida merkittäviä määriä fosfaatti joukkovelkakirjoja fosfaatin vastauksena hapon kaltevuus plasmamembraanin läpi.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Cell linjat käytetään saatiin ATCC ja viljeltiin ohjeiden mukaan. Solut kerättiin, kun 80-85% konfluentteja romuttamalla kylmällä PBS: llä, joka sisälsi 10% FBS, ilman hoitoa trypsiinillä, säilyttämiseksi pinnan proteiineja.

32P

i saatiin Perkin Elmer ja käsiteltiin katkaravun alkalisella fosfataasilla seurasi lämpöinaktivoinnilla poistamiseksi kontaminoivien PP

i. Kaikki muut kemikaalit, ellei toisin mainita hankittiin Sigma Chemicals.

määritys määriä ATP soluissa vasteena hapon kaltevuus

Solususpensioita (2-3 miljoonaa solua /ml) PBS: ssä tai bis-tris-puskuria, joka sisälsi 10% FBS: ää, ja saatetaan vakaan tilan inkuboimalla 37 ° C: ssa 20-30 minuutin ajan, tehtiin happamaksi joko lisäämällä 4 tilavuutta reaktiopuskuria (20 mM bis-tris, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 5 mM MgCI

2 tai lisäämällä pieniä eriä laimeaa HCI: a. reaktio pysäytettiin vorteksoimalla kloroformilla. vesipitoinen kerros käytettiin mittaamaan ATP käyttäen Luciferase luminesenssi iinianalyysikitissä (Promega).

määritys reaktion kertaluku (n) B

kaltevuus linjan log (A /A

o-1) tai log (A-A

o) vastaan ​​pH antaa järjestystä reaktio.

o ja A ovat määrät ATP ennen ja jälkeen happoa vastaavasti. tiedot matemaattisen mallin annetaan täydentää S1 Kuva.

lisäys solujen

32P

i ja vastaus acid

Noin 10-12 miljoonaa solut kerättiin viljelmälevyiltä romuttamalla kylmään PBS-20% FBS. Ne pestiin sitten solususpension puskurilla SB, joka on 50 mM Hepes-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 2 mM KCI, 2 mM MgCl

2, 0,2 mM CaCI

2, 0,4 mM spermiini (suhteellisen tuore), 0,25 mg /ml BSA: ta, ja suspendoitiin sitten 1 ml: aan samaa puskuria, inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuuttia sekoittamalla silloin tällöin. Solupelletti otettiin talteen ja suspendoitiin tuoreeseen 500 ui puskuria SB ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Tähän lisättiin 5 uM oligomysiini ja 1 uM atractyloside ja pidettiin jäillä 15 minuutin ajan. Ouabaiinin (0,2 mM) lisättiin ja inkuboitiin jäillä vielä 15 minuuttia. Paikallinen happamoituminen johtuu asettuminen Solujen välttää kaikki vaiheet varovasti kääntämällä putket satunnaisesti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 5 minuutin ajan, seos kylmään natriumfosfaatti, pH 7,5 ja radioaktiivisen fosfaatin (

32P

i), lisättiin siten, että lopullinen fosfaatin pitoisuus oli 1 mM, jossa on noin 0,20 mCi /ml radioaktiivisuuden . Tämä inkuboitiin sitten kylmässä 45 minuuttia kevyesti pyörimisen. Solupelletti kerättiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin 500 ul: lla pesupuskuria (WB), joka oli puskurissa SB, joka sisälsi 1 mM natriumfosfaattia, 0,2 uM bafilomysiini lisäksi oligomysiini, atractyloside ja ouabaiini kuin ennen. Solut suspendoitiin WB tiheyteen 10 miljoonaa solua /ml, ja pienet määrät noin 175 ui tehtiin erillisessä 1,5 ml: n putkissa. Kun oli inkuboitu 1 minuutti 37 ° C: ssa, solususpensiot happamaksi haluttuun pH-arvoon lisäämällä pieniä eriä laimeaa HCI: a, ja inkuboitiin 45 sekuntia 1 minuutin, jonka jälkeen solut pelletoitiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella, ja supernatantti poistettiin. Pellettiin lisättiin 75 ul: aan kloroformia ja sekoitettiin Vortex: illa. Pelletti pitäisi saada suspendoitiin kloroformiin tehokkaasti solun lyysin. Alkaen happoa saakka, kun kloroformi lisättiin pidettiin inkubointiaika hapon ja oli tyypillisesti noin 90 sekunnista 2 minuuttiin. 50 ui: aan uuttopuskuria (EB), joka oli 1 mM kaliumfosfaattia, pH 6,5, 0,2 mM EDTA: ta, lisättiin, vorteksoitiin ja pidettiin sitten värähtelijä 10-15 minuuttia. Tätä sentrifugoitiin ja vesipitoinen kerros varovasti otettu pois ja pidettiin -80 ° C: ssa. Analyysiä varten näyte, noin 20 ui vesiuute kuivattiin speed-vac ja analysoitiin TLC: llä. Eriä käytettiin myös arvioida absoluuttinen määrä ATP lusiferaasin luminesenssi iinianalyysikitissä (Promega).

entsymaattinen luonnehdinta tuotteiden

32P

i sisältävistä soluista

Vesi- ote happamoituminen solut laimennettiin 4 tilavuudella puskuria, joka sisälsi 10 mM Tris, pH 8,0, 0,2 mM EDTA, 1 mM MgCl

2. 10 ui tätä reaktioseosta käsiteltiin sitten eri entsyymit (1 yksikkö) yksittäin tai yhdistelmänä yhdessä lisätty alustoihin. Yhteensä 8 eri reaktiot tehtiin. Kukin reaktio oli erityinen tavoite tunnistamisessa luonteesta nukleotidin jäljempänä esitetyllä tavalla. Katoaminen bändi aikana luonteenomaisen reaktion osoitti identiteettinsä. 1. Alkalinen fosfataasi (P-ase, Promega) -removes terminaali fosfaatti ryhmiä monoesteri sidoksen. Joten se voi ilmoittaa, jos kaistojen on terminaali fosfaatin joukkovelkakirjoja. 2. Epäorgaaniset -pyrofosfa- (PP

i-ase, New England Biolab) -hydrolyses pyrofosfaatti (PP

i). GTP vaeltaa samassa paikassa kuin PP

i TLC, joten tämä reaktio voi erottaa PP

i ja GTP. 3. (PDE) -cleaves α-β fosfodiesteriliitos siksi se voi tuottaa PP

i päässä NTP ja fosfaattia NDPS. Joten bändejä NDP ja NTP katosi ilmestyi juova PP

i. 4. PDE seuraa PP

i-aasin-PP

i reaktiossa muodostuva PDE pilkottiin PP

i-ase, joka vahvisti, että se on PP

i eikä GTP. 5. adenylaattikinaasi (ADK) ja 1 mM AMP-se muuntaa ATP ADP, joten ATP bändi vähentynyt, kun taas ADP bändi kasvoi. GTP voi toimia myös heikko substraattina tätä reaktiota niin GTP bändi myös vähentynyt. 6. nukleotidi- diphospho kinaasi (NDK) ja 1 mM ATP-NDK voidaan siirtää terminaaliin fosfaatin ATP NDPS, joten ADP ja BKT bändejä katosi. 7. NDK ja 1 mM ADP-ADP muuntaa ATP: fosfaatin siirto GTP, niin GTP bändi katosi.

valmistaminen solukalvon

Plasma kalvo valmistettiin tavallisella menetelmällä turvotusta solujen vähäsuolaisessa puskurissa ja halkeamisen viemällä läpi kapean 25 gaugen neulaa. Puskurit ja ajoitus valittiin parhaiten säilyttää aktiivisuus. EDTA: ta ei lisätty puhdistuksen aikana. Tyypillisesti 200000000 solut romuttaa ja korjattu viljelmälevyiltä PBS-20% FBS: ää ja pestiin 5 ml: lla 2,5 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,5, ja suspendoitiin 10 ml: aan puskuria A, joka oli 10 mM Hepes-MES (1: 1), 100 mM NaCl, 2 mM KCI: a pH: ssa 7,0. Tähän lisättiin 0,1 mM PMSF ja 2% FBS: ää ja pidettiin jäillä 20 minuuttia, jonka jälkeen natriumfosfaatti, pH 7,5, lisättiin 1 mM. Solususpensio hajotettiin 20 täyttä iskua 10 ml: n ruisku on varustettu 25-neula säilyttäen kuitenkin jäällä. Lyysat- Suspensiota sentrifugoitiin 1000 x g 5 minuuttia poistamiseksi ehjien solujen ja tuman ja sitten 5000 x g: ssa 15 minuuttia poistamiseksi mitokondrioita. Suhteellisen kirkas supernatantti tästä vaiheesta sentrifugoitiin sitten 75000xg 40 minuutin ajan ultrasentrifugissa. Supernatantti valutettiin pois kokonaan ja pelletit yhdistettiin ja pestiin puskurilla B, joka oli puskuria A, joka sisälsi 1 mM natriumfosfaattia ja 0,5 mg /ml ultrapuhdasta BSA: ta (Invitrogen). Sitten pelletit suspendoitiin 300 ui: aan puskuria A, joka sisältää 0,5 mg /ml ultrapuhdasta BSA: ta ja pidettiin 75 ul: n näyte-erinä -80 ° C: ssa. Useita freeze-sulaa suuresti vaikuttanut entsyymien toimintaa. Säilyttää entsyymin, pelletit aikana muodostunut sentrifugointi aina suspendoitiin pipetoimalla varovasti ja vahva vorteksointi välttää kaikissa vaiheissa. Kaikki toiminnot tehtiin kylmässä tai jäällä.

proteiinipitoisuus membraanivalmistetta.

määrittämiseksi proteiinin pitoisuudet, kalvon valmisteet tehtiin ilman BSA: ta. Ne liuotettiin 0,5% SDS: ää ja proteiinin määrä arvioitiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit (Pierce). Tyypillisesti proteiini pitoisuudet olivat välillä noin 0,5 mg /ml. Kalvot vastaa noin 12-15 ug proteiinia kohti reaktiota käytettiin alkaen kalvokonsentraatio aikana rakkula valmistelun.

Kalvo puhtauden ja western blot.

immunoblottianalyysi hyödyntäen standarditekniikoita suoritettiin puhtauden osoittamiseksi solukalvon jakeet. Kalvon pelletit liuotettiin kuumentamalla 1% SDS 65 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Koko solu-uutteita kuumennettiin 1% SDS 65 ° C: ssa 10 minuutin ajan käytettiin kontrollina. Vasta-aineet Na-K ATPaasi (ab7671, Abcam Cambridge) ja E kadheriinin (ab15148, Abcam, Cambridge) käytettiin määrittämään rikastumista solukalvon proteiineja. Vasta-aineet VDAC (ab34726, Cambridge, MA) ja COXIV (ab124538, Abcam, Cambridge) käytettiin sulkea pois epäpuhtaudet mitokondrion membraanifraktioiden. Vasta-aineet GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge) käytettiin sulkea pois sytoplasman saastuminen.

valmistaminen rightside-out solukalvon vesikkelit ja hapan vastaus

Menetelmä totesi tässä prototyyppi ja useimmat ja, kun se on skaalattu tarpeen mukaan kokeen. Tyypillisesti 150 gl solukalvon valmiste laimennettiin 300 ui (riippuu tiheydestä membraanivalmistetta) puskurilla A, joka sisälsi 0,5 mg /ml BSA: ta ja suspendoitiin sitten hyvin soveltamalla 10 lyöntiä 1 ml: n ruiskulla, joissa on 25 G: n neulaa. Lopullinen tilavuus oli tarkastaa ja tarvittaessa säädettiin 300 ui samalla puskurilla. Seuraavissa vaiheissa, ainesosat on tiukasti lisättiin mainitussa järjestyksessä ottaen huomioon, että lopullinen tilavuus oli 400 ui. Ainesosat lisättiin peräkkäin loppupitoisuudeksi kuten: Hepes-MES (1: 1) pH 7,0-50 mM, KCI 20 mM, natriumfosfaatti 1 mM, ouabaiini 0,2 mM, oligomysiini 10 uM, bafilomysiini 200 nM , atractyloside 1 uM ja BSA: ta 1 mg /ml. ADP: n tai muita ainesosia, joita tarvitaan pakata vesikkelin myös lisätä tarpeen. Sen jälkeen pH säädettiin arvoon 7,6 1 N natriumhydroksidilla ja varmistettiin pH-elektrodi. Tilavuus tarkastaa ja tarvittaessa säädettiin vedellä saada lopulliseen tilavuuteen 400 ui lisäyksen jälkeen radioaktiivisuus. Tämä tehtiin sitten 10 lyöntiä 1 ml ruiskulla varustettu 25 G neulalla ennen lisäämistä radioaktiivisuus. 0,4 mCi /ml

32P

i lisättiin sitten ja pidettiin jäillä 20 minuuttia, jonka jälkeen 10 iskua levitettiin ruiskun. Vesikkelit olivat nyt suljettu seuraavalla peräkkäiset vaiheet. Suhteellisen tuore spermiiniä lisättiin 1,6 mM, sovelletaan 10 lyöntiä ruiskun, niin MgCl

2 lisättiin 4 mM, sovelletaan vielä 10 lyöntiä ruiskun ja pidettiin jäillä 20 minuutin ajan. Tähän lisättiin valinomysiiniä 10 uM, pidettiin jäillä 10 minuuttia, minkä jälkeen CaCl

2-0,4 mM ja inkuboitiin jäillä vielä 10 minuuttia. Magnesium yli 6 mM, spermiini yli 1 mM (lopullinen laimennuksen jälkeen) ja kalsium yli 1 mM esti toimintaa niin ylimääräinen lisäys oli aina välttää.

Sitoutuminen ConA helmiä.

300 ui ConA helmiä ( rad /GE Healthcare) pestiin kaksi kertaa 1 ml: ssa puskuria, joka sisälsi 10 mM Hepes-MES (1: 1) pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl

2, 0,25 mM BSA: ta (ei MnCl

2 lisättiin). Viimeisen pesun jälkeen kaikki neste imettiin pipetoitiin hienoilla geelillä latausvihjeitä (jotka eivät salli helmiä päästä) kastamalla se syvälle helmiä. Tämä suspendoitiin 2 ml: n putkessa 3 tilavuudella laimennuspuskuria (DB) suhteen vesikkelin valmiste, joka tässä tapauksessa olisi 1,2 ml. Koostumus DB oli 50 mM Hepes-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM natriumfosfaatti, 4 mM MgCI

2, 0,4 mM CaCI

2. Helmeen suspensioon lisättiin 400 ui suljetun vesikkelin valmisteen (ylhäältä). Laimennus kalium tässä vaiheessa auttaa sitoutumisessa ConA helmiä, jotka yleensä estyy suurella kaliumia. Putki suljettiin tiukasti ja pyöritetään hyvin varovasti kylmään 50 minuuttia sitoutumisen mahdollistamiseksi vahingoittamatta kalvoa. Helmet pestiin 3 kertaa 3 tilavuudella jääkylmää pesupuskuria (WB), sentrifugoimalla 1500 rpm 30 sekuntia. Pesupuskurilla sisälsi 50 mM Hepes-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM natriumfosfaatti, 2 mM KCI, 4 mM MgCI

2, 0,4 mM CaCI

2, 0,4 mM spermiini, 0,25 mg /ml ultrapuhdasta BSA: ta, 0,1 mM ouabaiinin, 2,5 uM oligomysiini, 100 nM bafilomysiini, 1 uM atractyloside. Aina kaikki nesteet imettiin pois sänkyyn hieno geelillä latausvihjeitä upottamalla se syvälle helmiä. Tehokkuutta pesu tarkistettiin pelkistämällä radioaktiivisuuden helmien peräkkäisten pestä käyttäen Geiger laskuri. Helmet suspendoitiin sitten noin 1 ml pesupuskuria, jaettiin osiin tasaisesti noin 6 putkiin (195 ui suspensiota) ja käytettiin välittömästi rakkulan määrityksessä jäljempänä esitetyllä tavalla.

Helmi sidottu vesikkelin määrityksessä.

helmisuspensiota inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 minuutin ajan ja se lisättiin mitattuja määriä 1 N HCI siirtää pH halutuiksi. Sen jälkeen kun haluttu aika (5 sekunnista 2 minuuttiin), se sentrifugoitiin 15 sekunnin ajan 1000 rpm: llä ja supernatantti poistettiin nopeasti hieno geelillä latausvihjeitä kastamalla se helmiin. 75 ui kloroformi-2,5% metanoli-seosta lisättiin sitten helmiä ja vorteksoitiin. Tähän lisättiin 50 ui: aan uuttopuskuria EB (1 mM kaliumfosfaattia, pH 6,5, 0,2 mM EDTA). Seosta pidettiin sitten hieromasauva 30 minuuttia, sentrifugoitiin 8000 rpm 10 minuuttia ja ylimmässä vesikerros huolellisesti otettu välttäen kloroformia käyttämällä hienoja geeliä latausvihjeitä. Helmet uutettiin uudelleen vielä 25 ui EB, vorteksoimalla 5 minuuttia ja sentrifugoimalla kuten ennen. Vesikerrokset tämän kahden vaiheet yhdistettiin ja sentrifugoitiin 10000 rpm: ssä 1 minuutti saostaa helmiä ja kirkas vesipitoinen kerros otettiin pois. Tämä pidettiin sitten -80 ° C: ssa. Analyysiä näytteen, noin 25-30 ui vesiuute kuivattiin speed-vac ja analysoitiin TLC.

Inside-out rakkula (IOV) määritys

membraanivesikkeli otettiin puskurissa, joka sisälsi 10 mM Hepes-MES-asetaattia (1,5: 1: 1) pH 6,34, 2 mM KCI: a, 150 mM NaCl, 10 uM oligomysiini ja suljettiin 6 mM MgCl

2. Lisättiin 10 uM valinomysiiniä seuraa neljäsosa tilavuuteen edellä mainitussa puskurissa, mutta joka sisälsi 150 mM KCI sijaan NaCl.

32P

i (0,2-0,5 mM, 0,3 mCi /ml) ja ADP (25 uM, jos tarpeen) lisättiin sitten. Lyhytaikaisessa Alkaloinnin 90 sekuntia lisäämällä alkalia, 20 uM pyrofosfaatti, ja /tai 20 uM ATP: tä lisättiin laimeaa (suojata) radioaktiivinen tuotteiden ja vorteksoitiin kloroformilla (joka sisälsi 2% metanolia). Vesikerros analysoitiin TLC: llä.

valmistaminen sytosolin uutteen

Solut (100000000 /ml) annetaan paisua 2 mM K

2HPO

4 pH 7,4 5 minuuttia, minkä jälkeen puskuri säädettiin 10 mM ja NaCI 100 mM. Tähän lisättiin 1 mM dietyylipyrokarbonaatilla, 50 uM vanadaatti-, 50 uM pyrofosfaatti ja hajotettiin viemällä läpi 25 guage neula. Tämä sentrifugoitiin kahdesti 13,000xg ssa 15 minuuttia ja sitten joko sentrifugoidaan 74000xg 40 minuutin ajan tai peräkkäin läpi 0,65 um, 0,22 um ja 0,11 um kalvon sarakkeen poistamiseksi kalvoja. Proteiinipitoisuus oli noin 3 mg /ml.

IOV ja sytosolin uute yhdistelmä määritys

sytosoliin (5 ug proteiinia) lisättiin IOV seokseen, joka sisältää

32P

i (0,2 mM , 0,3 mCi /ml) ja ADP (100 pM) ja nopeasti emäksiseksi 10 sekuntia. Reaktio pysäytettiin 2 mM dietyylipyrokarbonaatilla ja 1/1000

th fosfataasinestäjällä cocktail B (Santa Cruz Biotech), ja vorteksoimalla kloroformilla (joka sisälsi 2% metanolia). Vesikerros analysoitiin TLC: llä.

määritys muuntamiseksi

32PP

i ATP sytosolientsyymien uutetta

Sytosoliset uutteet (2 ug proteiinia), käytettiin per 50 ui reaktiota joka sisälsi 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM NaH

2PO

4, 100 mM NaCl: a,

32PP

i (200 uM, 30 uCi /ml), 1 mM MgCI

2 ja 250 uM ADP. Reaktiot pysäytettiin 1 mM NHS-biotiinia (Pierce) ja sitten analysoitiin TLC: llä.

ohutkerroskromatografialla (TLC) B

PEI-selluloosa-TLC-levyillä 250 um paksuus (JT Baker Inc.) käytettiin. Pilkut kehitettiin 0,75 M KH

2PO

4, pH 3,5.

Tilastot

Kaikki tulokset esitetään keskiarvoina esitetään keskiarvona ± 2.SD (SD: vakio poikkeama) kolmesta tai useammasta itsenäisestä kokeesta. Ellei toisin mainita, s-arvot laskettiin käyttäen Student kaksiosaisella testi: (p 0,05 pidettiin merkittävänä).

Tulokset

Solunulkoisilla happo kaltevuus on kriittinen korkean ATP-tasot aikana aerobinen glykolyysin

aikana aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsolujen kuluttaa glukoosia muodostamaan laktaatti ja samanaikaisesti suulakepuristamalla happo, joka heijastuu alentamalla pH ulkoisen väliaineen [23]. Aluksi halusimme tutkia kriittinen rooli happo kaltevuus ylläpitämisessä ATP-tasot aikana aerobinen Glykolyysivaiheen. Suunnittelimme kokeen mittaamaan samanaikaisesti ATP: n, laktaatin, glukoosi ja pH ulkoisen väliaineen reaaliajassa aikana aerobisen glykolyysin erittäin glykolyyttisten rintasyöpäsolujen MDA-MB-231 [24]. Lisäsimme myös 10pM oligomysiini, bonafide mitokondrioiden ATP-synteesin estäjä, poistaa kaikki panoksen mitokondrioiden ATP-synteesin. Glykolyysin aloitettiin lisäämällä 0,1% glukoosia. Alikvootit solususpensiot otettu 5 minuutin välein, lisättiin kloroformia ja välittömästi vorteksoitiin tehokkaasti solujen lyysin ja inaktivoitumisen entsyymejä. Vesikerros arviointiin käytetään vesiliukoisten metaboliittien, kuten ATP: tä, glukoosin ja laktaatin. Havaitsimme, että kuten glukoosi oli kulutettu muodostamiseksi laktaatti, oli jatkuva lasku pH ajan mukana samanaikainen kasvu vakaan tilan tasot ATP soluissa suhteessa lähtöarvoon (kuvio 1A). Solut kulutetaan glukoosia nopeudella 3,08 nmol /min /miljoona-soluja (sd = ± 0,24, 7 aineistoja) ja tuotti laktaattia nopeudella 4,95 nmol /min /miljoona-soluja (sd = ± 0,46, 7 aineistoja ) (kuvio 1B). Tämä merkitsee lähes 80,7% (S.D. = ± 8,78, 7 aineistoja) glukoosin muuntaminen laktaatti näissä olosuhteissa, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin nähdään Muut tutkijat [25, 26]. Toisaalta, kun suulakepuristettu happo jatkuvasti neutraloitiin lisäämällä pienissä erissä emästä, niin että solunulkoinen pH pysyi vakiona noin 7,4, ATP: n ei kasva ajan suhteessa lähtöarvoon (kuvio 1C). Kuitenkin hinnat glukoosin kulutuksen (3,46 nmol /min /miljoona-soluja, sd = ± 0,17, 3 aineistoja) ja laktaatintuotto (5,95 nmol /min /miljoona-soluja, sd = ± 0,50, 3 aineistoja) ei esiintynyt Merkittävin muutos (kuvio 1 D). Tämä koe osoitti, että solunulkoisen happo kaltevuus on kriittinen rooli edes aerobinen Glykolyysivaiheen ylläpitämisessä korkeita ATP syöpäsoluissa. Tämä kannusti meitä tutkimaan jos solunulkoiseen happo kaltevuus voi yksin ajaa ATP-synteesiin syöpäsoluja puuttuessa lisättyä glukoosia.

MDA-MB-231 solususpensioiden PBS-10% FBS, joka sisälsi 10 uM oligomysiini lisättiin 0,1% glukoosia varovasti mekaanisesti sekoittaen. PH väliaineen (solunulkoinen pH) seurattiin reaaliaikaisesti ATP, glukoosi ja laktaatti mitattiin (miljoonaa solua kohden) peräisin alikvootit otetaan ulos ilmoitettuina ajankohtina (virhepalkkien = 2.s.d., n = 3). (A) Vakaa tila ATP ja hapan puristamiseen (pH) glykolyysin aikana. ATP-arvot nousivat jatkuvasti suhteessa lähtöarvoon asteittain pH laskee ulkoisen väliaineen. (B) glukoosi kulutetaan (avoin ympyrä) ja tuotetun laktaatin (kiinteä ympyrä) kanssa aika kokeilu paneelissa A. (C) Vakaa tila ATP kun jatkuva neutraloidaan. Erittynyt hapan jatkuvasti neutraloitiin lisäämällä pieniä eriä emästä. ATP-arvot pysyivät lähes ennallaan suhteessa lähtöarvo tässä tilassa. (D) glukoosi kulutetaan (avoin ympyrä) ja tuotetun laktaatin (kiinteä ympyrä) varten kokeilu paneelissa C. Nämä kokeet toistettiin kolme kertaa.

Solunulkoisilla happo kaltevuus yksinään riittävä ajamaan ATP-synteesiä syöpäsolut

halusimme arvioida, solunulkoisen happo kaltevuus yksinään riittävä ajamaan ATP-synteesiä syöpä. Rintasyöpä MDA-MB-231 glukoosi-puskurissa käytettiin määrityksen standardoimiseksi ja ymmärtää perusominaisuudet reaktion. Solut otettiin glukoosi-free suspension puskuria ja pidettiin 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Tämä oli välttämätöntä, jotta solut kuluttaa sytosolisia glukoosia ja tuoda pohjapinta tasot ATP vakaan tilan ajaksi kokeiden. Ne tehtiin happamaksi ja sitten hajotetaan kloroformilla jälkeen ilmoitettuina ajankohtina (5 sekunnista 2 minuuttiin). ATP tuotettu arvioitiin vesikerroksesta lusiferaasianalyysissä. Havaitsimme, että ATP tuotanto vastauksena solunulkoiseen happo oli nopea ja kestävä. ATP: n pitoisuudet soluissa kasvoi nopeasti 20 sekunnissa ja saavutti vakaan tilan 1 minuutilla päälle siirtämällä pH 7,5-7,0 (kuvio 2A). Nopeus ATP synteesi laskettu 20 ensimmäisen sekunnin aikana oli noin 1,5 nmol /min /miljoona-soluissa. Nettolisäys ATP tasojen vakaassa tilassa oli noin 0,7 nmoolia kohden miljoonaa solua varten tässä esimerkissä. Tämä vastaa lisäystä 0,35 mM ATP soluissa [27]. Tämä osoittaa selvästi vankkaa synteesiä ATP ottaen huomioon, että vakaan tilan pitoisuus ATP soluissa on noin 1 mM. PH 6,7, nopeudella ATP synteesi oli liian nopea -sykevyön ennen kuin se saavuttaa vakaan tilan. Monitoroimme ATP: n määrä korotuksen jälkeen 5 sekunnin happamoitumisen ja arvioitu noin nopeudella noin 5,5 nmol /min /miljoona-soluja (S.D. = ± 1,3, 3 aineistoja). Solut säilyttivät elinkelpoisuus ja koskemattomuus näissä olosuhteissa määritettynä trypaanisiniekskluusiolla. Lähes kaikki ATP tuotettu ( 98%) havaittiin solupelletissä osoittaa yksinomainen solunsisäisen ATP: n. Nämä kokeet vahvistivat, että solunulkoinen happo kaltevuus itsessään riittävä ajamaan ATP synteesi syöpäsoluissa. Kalvo repeämä jäädytys-sulatus, mekaaninen homogenointi tai ultraäänihajoitusta myös poistettava tämä toiminta osoittaa, että ehjä kalvo oli välttämätön tämän ilmiön.

(A) aika kinetiikka ATP tuotanto pH: ssa 7,0. MDA-MB-231 (vakaan tilan), pH: ssa 7,5 glukoosi-puskurissa, tehtiin happamaksi pH-arvoon 7,0 37 ° C: ssa osoitetun ajan, sammutettiin kloroformilla ja määriä ATP määritettiin vesipitoinen fraktio. ATP-arvot ovat miljoonaa solua kohden (virhepalkkien = 2.s.d., n = 3). (B) suureneminen vakaassa tilassa tasot ATP pienentyessä solunulkoisessa pH. Solususpensiot (steady state) pH: ssa 7,5 glukoosi-puskurissa tehtiin happamiksi osoitettuun pH-arvoon 2 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sammutettiin kloroformilla. Määriä ATP soluissa määritettiin vesipitoinen fraktio. Lisäys ATP miljoonaa solua kohden näkyvät (virhepalkeilla = 2.s.d., n = 3). Asteikot pidettiin samanlainen rintasyövän MDA-MB-231 ja MCF-10A, ja keuhkojen soluja A549 ja Beas2 vertailuun. Järjestys reaktio (n) Tässä kokeessa käytetään vakaassa tilassa yhtälöä (katso menetelmät) näkyy täydennys (S2 Kuva). Keskimääräiset arvot n (kulmakerroin) useista tällaiset kokeilut ovat: MDA-MB 231, 0,89 (S.D. = ± 0,07, 7 aineistoja); A549, 0,79 (S.D. = ± 0,06, 4 aineistoja) ja PaCa-2, 2,12 (S.D. = ± 0,23, 6 aineistoja). (C) Käännettävä luonne hapon kaltevuus riippuvainen ATP muodostumista. MDA-MB-231-solususpensiota (steady state) pH: ssa 7,5 glukoosi-puskurissa tehtiin happamaksi vaihe vaiheelta pH 7,5-6,2 lisäämällä pieniä eriä happoa sekoittaen varovasti kunnossa 37 ° C: ssa. Kussakin vaiheessa pH: n solususpensiota merkille ja alikvootit otettiin pois 2 minuutin määritystä varten ATP (kiinteä ympyrä kiinteä viiva). Saavutettuaan pH 6,2, alikvootit emästä lisättiin vaiheittain saattamaan pH takaisin 7,5 (avoin ympyrä ja pisteviiva). Kasvusta ATP-tasot ovat miljoonaa solua kohden (virhepalkkien = 2.sd, n = 3).

Näiden Alkukokeissa vaikutus solunulkoisen pH: n vakaan tilan tasot ATP arvioitiin pH: ssa ”vaihtelevat 6,0-7,5. Käytimme paneeli aggressiivisen syövän saatujen solulinjojen eri kudostyypeistä, MDA-MB-231 (rintasyöpä), A549 (keuhkosyöpä) ja MIA-PaCa-2 (haimasyöpä, tästedes kutsutaan PaCa-2), jotta määrittää yleismaailmallisuuden ilmiö.