Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenireseptorin on ensisijainen transkriptiotekijä mukana leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Siten hormonihoito käyttäen antiandrogeenit, kuten bikalutamidi, on ensilinjan hoitoon taudin. Vaikka hormonihoito ensin vähentämään tuumorikuorma, monet potilaat lopulta relapsi, kehittää kasvaimia, joilla on hankittu hormonitoimintaa vastarintaa. Selvittäminen molekyylitason mekanismeista hormonitoimintaa vastus on siis olennainen kysymys ymmärtämiseksi ja kehittämään vaihtoehtoisia hoitomuotoja edenneen eturauhassyövän. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme suoritettiin lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) -välitteisen funktionaalisen seulonnan tunnistamiseen liittyvien geenien bikalutamidi-välitteisen vaikutuksia LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Tällaisia ​​kandidaattigeenit valitaan seulomalla käyttäen tulivuori käyräanalyysillä, ribosomaalinen proteiini L31 (RPL31) todettiin olevan välttämättömiä solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen bikalutamidia kestävä LNCaP (BicR) soluja, jotka perustuvat Sirna (siRNA) – välittämä knockdown kokeiluja. Huomattavaa on, että

RPL31

mRNA runsaammin ilmaistu BicR soluissa kuin vanhempien LNCaP ja kliiniset tiedot ONCOMINE ja The Cancer Genome Altas osoitti RPL31 yliekspressoituu eturauhaskarsinoomien verrattuna hyvänlaatuinen eturauhasen kudosten. Kiehtovan, proteiini tasoilla kasvaimen p53 ja sen tavoitteet, p21 ja MDM2, lisättiin LNCaP ja BicR soluja käsiteltiin

RPL31

siRNA. Havaitsimme vähentynyt hajoaminen p53-proteiinin jälkeen

RPL31

knockdown. Lisäksi tukahduttaminen kasvun ja solukierron päälle

RPL31

Knockdown osittain talteen

p53

siRNA hoitoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että RPL31 on mukana bikalutamidi kestävä kasvu eturauhasen syöpäsoluja. ShRNA välittämä funktionaalisen näytön tässä tutkimus antaa uutta tietoa molekyylitason mekanismeja ja terapeuttisten kohteiden edenneen eturauhassyövän.

Citation: Maruyama Y, Miyazaki T, Ikeda K, Okumura T, Sato W, Horie-Inoue K, et al. (2014) Short Hairpin RNA kirjasto-Based Functional Screening Tunnistetut ribosomaalinen proteiini L31 moduloivan Eturauhassyöpä Cell Growth kautta p53 Pathway. PLoS ONE 9 (10): e108743. doi: 10,1371 /journal.pone.0108743

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2014; Hyväksytty: 25 elokuu 2014; Julkaistu: 06 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Maruyama ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. GEO liittymistä numero microarray data on GSE60382.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Cell Innovation Program, Grants-in-Aid, ja tukihanke Strategic Research Centerin Private korkeakoulut opetusministeriön, Kulttuuri, urheilu, tiede ja teknologia, Japani; avustuksilla Japanin Society for Promotion of Science, Japani; avustuksin-in-Aid alkaen terveysministeriön, työ- ja Welfare, Japani; jonka Advanced Research for Medical Products Mining ohjelmaansa National Institute of Biomedical Innovation, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhassyöpä on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien ja ilmaantuvuus eturauhassyövän Japanissa kasvaa, ja 11000 kuolemaa vuodessa taudista. Vaikka useimmat alkuvaiheen, paikallinen tauti voidaan menestyksellisesti hoitaa sädehoitoa ja /tai leikkaus, jopa 50%: a potilaista hoidettiin paikallinen tauti on paikallisen uusiutumisen eikä etäispesäkkeitä [1], [2]. Nykyinen ensilinjan hoitoja uusiutuva tai metastaattinen eturauhassyöpä ovat hormonihoidoissa, mukaan lukien ne, jotka kohdistuvat androgeenireseptorin (AR) signalointia kuten bikalutamidi, ja lääkkeitä, kuten gonadotropiinia vapauttavan hormonin agonistit, jotka estävät androgeenituotantoa kiveksissä ja lisämunuaisten. Vaikka hormonihoidoissa perin vähentää tuumorikuorma, monet potilaat tulevat vastustuskykyisiksi näihin hoitomuotoihin ja kehittää terminaali muodossa tauti, kutsutaan kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) [3]. Potilaat, joilla CpRC on huono ennuste, ja ne muodostavat suurimman osan kuolemista johtuu taudin.

CRPC, aktivoituminen AR signalointi on tunnustettu perustavanlaatuinen tapahtuma, joka johtaa uudistetun kasvaimen kasvun olosuhteissa androgeenideprivaatioterapian. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CRPC yleisesti liittyy lisääntynyt AR signaloinnin takia AR vahvistus, AR mutaatio, transkription kofaktori aktivointi, ligandi-riippumaton fosforylaatiota AR, ja muut prosessit [4] – [7].

Todellakin immunohistokemiallinen tutkimukset osoittavat, että yli-ilmentyminen AR proteiinin useimmissa tapauksissa CRPC [6] – [8]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että AR on keskeinen rooli kehitettäessä /kasvua sekä androgeeniriippuvaisissa eturauhassyövän ja CRPC [9] – [12]. AR uudelleenaktivointi on kliinisesti tärkeä, koska AR itse ja sen loppupään signalointireitille voisi olla terapeuttisia kohteita CRPC. Tarkka molekyylitason mekanismeja taustalla AR uudelleenaktivoitumiseen CRPC ovat kuitenkin epäselviä, koska vuorovaikutus AR-signaalin transduktioreitin muiden signaalinvälitysreittien.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme suoritettiin lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) seulonta tunnistaa uusia geenejä moduloimiseksi vasteena antiandrogeeni bikalutamidi eturauhassyöpäsoluissa. Vertailevassa tutkimuksessa bikalutamidia-testi- ja käsiteltyjen syöpäsolujen, tulivuori käyräanalyysillä [13], [14] käytettiin seulomaan geenejä, jotka osallistuvat bikalutamidi vastausta. Solu elinkelpoisuus määrityksessä käytetään pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) spesifisiä shRNA kohdistaminen kandidaattigeenejä paljasti, että ribosomaalinen proteiini L31 (

RPL31

), histoni klusteri 1 H2bd (

HIST1H2BD

), ja ADAM metallopeptidaasi kanssa trombospondiinipeptidi tyypin 1 motiivi 1 (

ADAMTS1

) olivat mukana leviämisen bikalutamidi-resistenttien syöpäsolujen. Erityisesti, RPL31, proteiinin, joka on osa 60S suuri ribosomialayksikköä [15] – [18], on osoitettu moduloivan ilmentyminen kasvaimen p53 [19] – [21] ja solusyklin säädin p21: [20] . Tämä tutkimus paljastaa uusia reittejä moduloimiseksi bikalutamidi vasteen ja terapeuttisia kohteita eturauhassyöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja antiandrogens

LNCaP, VCAP, ja 22Rv-1 eturauhasen syöpäsolut hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LNCaP-soluja viljeltiin RPMI, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 mg /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Vcap ja 22Rv-1-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 mg /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Bikalutamidi-resistenttien syöpäsolujen (BicR) on kuvattu aiemmin [22] – [24], ja nämä solut viljeltiin RPMI, jota oli täydennetty 1 uM bikalutamidin, 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 mg /ml) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Stabiilia transfektiota, LNCaP-solut transfektoitiin C-terminaalisesti Flag-merkityn RPL31 plasmidin tai tyhjän vektorin (pcDNA3, Invitrogen), ja valitaan elatusaineessa, joka sisälsi 0,1 mg /ml G418: aa (NACALAI TESQUE, Kioto, Japani). Vakaa transformantit LNCaP soluja, jotka ilmentävät RPL31-Flag (LNCaP-RPL31 # 39 ja # 63) ja tyhjän vektorin (LNCaP-vec # 19 ja # 22) kloonattiin. Bikalutamidia ja doketakseli ostettiin Sigma-Aldrich Japani (Tokio, Japani).

Screening bikalutamidin-vasteen liittyviä geenejä käyttäen lentiviraalinen shRNA kirjasto

Thermo Scientific Open Biosystems Decode RNAi Viral seulonta kirjastossa (RHS5339) ostettiin Thermo Scientific (Huntsville, AL, USA). ShRNA seulonta suoritettiin kuten muualla on kuvattu [1], [13], [14], [25]. Lyhyesti, transductions suoritettiin 100 mm: n maljoille siten, että kukin shRNA edusti, joissa on keskimäärin 100 kopiota, niin että tartunnan kerta- (M.O.I) oli 0,3 ja mediaani yhden kopion integraation kunkin shRNA. Infektion kohdesolujen M.O.I. ≤0.3 varmistettiin fluoresenssimikroskopialla ja fluoresenssiaktivoidulla solujen lajittelu (FACS) 48 h infektion jälkeen. LNCaP-soluja viljeltiin kasvatusväliaineessa, joka sisältää 1 uM bikalutamidia tai vehikkeliä (0,1% etanolia) ja 1 kuukausi.

mikrosirut

Genominen DNA eristettiin transdusoidut solut käyttäen DNeasy Purification Kit (QIAGEN; Tokio, Japani) mukaan valmistajan protokollaa. Integroitu shRNAs valmistettu LNCaP genomisten DNA monistettiin käyttämällä alukkeita (Decode RNAi-GIPZ, selityksin geenien seulonta kirjasto-negatiivinen valinta Kitin Thermo Scientific) spesifisiä viivakoodit kirjaston-DNA [13], [14], [25] . PCR-tuotteet puhdistettiin geelissä käyttäen QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Puhdistettu DNA-fragmentit (1,5 ug) peräisin LNCaP-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai bikalutamidin leimattiin syaniini-3 (Cy3) tai syaniini-5 (Cy5) väriaineen, vastaavasti, käyttäen genomista DNA: n entsymaattinen Labeling Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ja puhdistettiin poistamalla sitoutumattoman syaniiniväriaineet kanssa Ultracell YM-30 Microcon keskipako- suodatinlaitteen (Millipore Japani, Tokio, Japani). Microarray hybridisaatio suoritettiin käyttäen Oligo cDGH /ChIP-on-chip hybridisaatio Kit (Agilent). Agilent piirteenpoimija ohjelmaa käytettiin skannata microarray kuvia. GEO liittymistä numero microarray data on GSE60382. Tulivuori juoni syntyi Klusterointi perustuu antureista. Köyhdytettyä (kertainen muutos 0,5;

P

0,01) signaalit bikalutamidi käsiteltyjen LNCaP verrattuna ajoneuvon käsiteltyjä soluja valittiin bikalutamidia vastauksena liittyviä geenejä [23], [25], [26].

siRNA transfektion ja western blot analyysi

Äänenvaimennin valita valmiiksi suunniteltuja siRNA kohdistaminen kandidaattigeeneihin saatiin Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) (taulukko 1). siRNA kohdistaminen p53 (sip53: sc-29435) hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Kontrolli siRNA kohdistaminen lusiferaasigeeni (siLuc) ja ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (siControl), joilla ei ole homologiaa tunnetun geenin tavoitteet nisäkässoluissa saatiin RNAi (Tokio, Japani). LNCaP ja BicR solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 100,000 solua per kuoppa ja viljeltiin yön yli. Solut transfektoitiin siRNA lopullisessa pitoisuudessa 10 nM käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Pudotus tehokkuutta siRNA määritettiin qRT-PCR: llä käyttämällä RNA valmistettiin soluista 48 tuntia transfektion jälkeen ja normalisoitu että siControl. Western blot -analyysiä varten, bikalutamidi (1 uM) tai vehikkeliä lisättiin elatusaineeseen 12 h transfektion jälkeen. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin ja lyysattiin näytepuskurissa 100 ° C: ssa 15 min natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE). Solulysaatit eroteltiin 10% tai 15% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore Japani). Kalvot koetettiin jokin seuraavista ensisijaisen vasta: anti-RPL31 (Abcam, Tokio, Japani), anti-p53 (DO-7, LeicaBiosystems, Newcastle, UK), anti-MDM2 (SMP14; Santa Cruz Biotechnology), anti- p21 (C-19; Santa Cruz Biotechnology), ja anti-Flag (M2, Sigma-Aldrich). Sitten kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) tai anti-hiiri-IgG, ja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssia (GE Healthcare). Membraanit tislattiin ja uudelleenseulottiin hiiren anti-β-aktiini-vasta-aine (AC-74; Sigma-Aldrich) latauskontrollina [27].

Kvantitatiivinen PCR-analyysi

LNCaP ja BicR-solut transfektoitiin siRNA: lla (10 nM) 48 tuntia. Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Isogen reagenssia (Nippon Gene, Tokio, Japani). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä SuperScript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen) ja oligo (dT) 20-aluketta. qRT-PCR suoritettiin StepOnePlus välineen (Life Technologies) käyttäen FAST SYBR Green Master Mix (Life Technologies) ja 150 nM kutakin geenispesifisestä eteenpäin ja taaksepäin-aluketta (taulukko S1). Pyöräily olosuhteet olivat 95 ° C 2 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 2 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Suhteellinen erot PCR-tuotteen määrien määritettiin vertaileva syklin kynnys menetelmällä käyttäen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

) sisäisenä kontrollina [27], [28]. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastolliseen analyysiin, ja todennäköisyys arvo

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio arvioitiin käyttämällä kittiä, joka sisältää WST-8 ((2- (2-metoksi-4-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2,4-disulfofenyyli) -2H tetratsolium, mononatriumsuola suola, Nacalai Tesque, Kioto, Japani). BicR, LNCaP, Vcap, ja 22Rv-1-solut ympättiin 96-kuoppalevyille tiheyksinä 2000, 4000, 16000, ja 4000 solua per kuoppa, vastaavasti, elatusaineeseen, ja transfektoitiin siRNA kohdistamisen joko kandidaattigeenin tai lusiferaasin (siLuc) (10 nM kumpaakin) käyttäen Lipofectamine RNAiMAX päivänä 0. 12 h transfektion jälkeen solut siirrettiin elatusaineeseen, joka sisälsi 1 uM bikalutamidia tai ajoneuvon. Osoitetuilla aikapisteillä transfektion jälkeen, 10 ui reagenssia, joka sisälsi WST-8 lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin 2 h ajan 37 ° C: ssa. absorbanssiarvot kullekin kuopalle mitattiin 450 nm: ssä MULTISKAN FC ELISA-lukijaa ( Thermo Scientific; Ulm, Saksa) [23], [28]. Edustavia tuloksia 3 riippumattoman kokeen esitetään keskiarvona ± S.D. of kolmena rinnakkaismäärityksenä kaivoja. Opiskelijan

t

-testaukset käytettiin tilastolliseen analyysiin, ja

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Cell-kaarianalyysin

LNCaP ja BicR-solut transfektoitiin siRNA: lla (10 nM) 12 tuntia. Solujen väliaine vaihdettiin väliainetta, joka sisälsi bikalutamidia (1 uM) tai ajoneuvon, ja soluja viljeltiin vielä 36 tunnin ajan. Solut pestiin kerran PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolilla. Sitten ne pestiin kahdesti PBS: llä ja käsiteltiin 0,2 ug /ul RNaasi A: lla 30 min. Lopuksi ne värjättiin 5 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich). Näytteet kvantifioitiin käyttäen FACScalibur (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA), joka perustuu DNA-pitoisuus, ja tulokset analysoitiin CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson) määrittää prosenttiosuudet solut G0 /G1, S ja G2 /M vaiheet [28], [29].

Bioinformatics

ONCOMINE tietokanta on syöpä microarray tietokanta ja online tiedonlouhinnasta alustan tarkoituksena on helpottaa löytö genominlaajuisten ilmaisun analyysit [30]. ONCOMINE tietokanta (https://www.oncomine.org/resource/login.html) etsittiin kandidaattigeenejä jotka yläreguloituja eturauhassyövässä verrattuna normaalin eturauhasen kudosta vähintään 2-kertainen (

P

0,5-kertainen kynnyksen

P

0,01) verrattuna ajoneuvon käsittely, kuten on esitetty tulivuori käyräanalyysillä (kuvio 1 B ja taulukko 1). Tämä shRNA seulonta analyysi oli hyödyllistä poimia geenejä, jotka olivat oletettavasti mukana bikalutamidin vastarintaa.

(A) Kaavamainen esitys shRNA seulontaan. LNCaP-solut infektoitiin lentiviruksen shRNA kirjasto ja viljeltiin edelleen kanssa tai ilman bikalutamidin ja 1 kuukausi. Yksittäiset integroitu shRNA määrät kvantitoitiin mikrosirulla. (B) Volcano tontti microarray data, kuten tuottamat klusterointia perustuu antureista, jotka rikastettu tai tyhjentynyt (fold muutos 0,5;

P

0,01) bikalutamidi-käsitellyissä soluissa verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen .

Validation kandidaattigeenien

vaikutusten arvioimiseksi yksittäisten geenien valitaan shRNA seulonnan eturauhassyövän solu biologian pudotus tehoa käytettävissä siRNA: iden kohdistettu 19 25 kandidaattigeenit arvioitiin kvantitatiivisella käänteistranskriptio (qRT) -PCR. Kolmetoista 19 siRNA: iden vähentää ilmentymistä niiden vastaavien kohdegeenien mukaan 37-94% (taulukko 1). Seuraavaksi vaikutus näiden siRNA: iden solujen proliferaatiota bikalutamidi kestävä LNCaP (BicR) solut arvioitiin käyttäen WST-8-solujen lisääntymisen määrityksessä (kuvio 2). Tulokset osoittivat, että hiljentäminen

RPL31, HIST1H2BD

, ja

ADAMTS1

merkittävästi tukahdutettu soluproliferaatiota BicR soluissa 50% verrattuna kontrolliin siRNA.

kasvun inhibointi BicR soluissa siRNA kohdistus

RPL31

(siRPL31),

HIST1H2BD

(siHIST1H2BD), ja

ADAMTS1

(siADAMTS1) näytettiin. Solut transfektoitiin 10 nM siRNA viljelyalustassa. Kaksitoista tuntia transfektion jälkeen, solut olivat sitten edelleen viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi 1 uM bikalutamidia. WST-8 soluproliferaatiomääritykset suoritettiin osoitettuina ajankohtina transfektion jälkeen. Absorbanssi kuoppiin levyt mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa 450 nm: ssä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3, *,

P

0,05; **,

P

0,01).

voimistunut ilmentyminen

RPL31, HIST1H2BD

, ja

ADAMTS1

vuonna BicR soluissa

Seuraavaksi arvioitiin ekspressiotasot

RPL31, HIST1H2BD

, ja

ADAMTS1

mRNA: LNCaP ja BicR solujen qRT-PCR. Nämä kolme geeniä olennaisesti yli-ilmennetään BicR soluissa verrattuna emo-LNCaP-soluja (kuvio 3A). Tutkia, onko

RPL31, HIST1H2BD

, ja

ADAMTS1

ekspressiotasoja muutettiin kliinisissä eturauhassyöpänäytteissä, arvioimme ilmentymisen tila näiden geenien perustuu ONCOMINE microarray aineisto [30]. Kun verrataan eturauhasen syöpä yksilöiden ja normaalissa eturauhasessa näytteitä kynnys, joka on vähintään 2-kertainen muutos (

P

0,01) (kuvio 3B),

RPL31

kiihdytyssäätely havaittiin toteuttama tutkimus Tomlins ja työtovereiden [35]. In RNA-sekvensoinnin tutkimuksessa integroitu Cancer Genome Atlas [31], [32],

RPL31

ilmentyvän myös koholla eturauhassyövissä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten (kuvio 3C). Sillä

HIST1H2BD

ylössäätely on esitetty yksi aineisto, kun taas downregulation on esitetty toisessa (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi,

ADAMTS1

ilmentyminen väheni eturauhassyövän joissakin aineistot (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

RPL31

on rooli eturauhassyövän etenemiseen, kuten bikalutamidi vastus. Tutkia solun kasvua inhiboivia vaikutuksia siRPL31 eri eturauhassyövän soluissa, Vcap, 22Rv-1, ja LNCaP-solut analysoitiin käyttämällä WST-8-määrityksessä. siRPL31 tukahdutettu näiden solujen (kuvio S1).

(A) Expression tasot

RPL31

,

HIST1H2BD

, ja

ADAMTS1

mRNA arvioitiin kvantitatiivinen käänteinen-PCR-analyysi (qRT-PCR) geenispesifisillä alukkeilla. Aineisto on normalisoitu

GAPDH

ja esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3; **,

P

0,01). (B)

RPL31

mRNA ilmentyy runsaana kliinisissä prostatakarsinoomassa kudoksiin verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten (by 2-kertainen), kun noudetaan aineistoja mukaan Tomlins

et al.

Vuonna ONCOMINE tietokanta [30]. Normaali: normaali eturauhanen kudos PCA: eturauhassyöpä, PIN: eturauhasen intraepiteelisen neoplasia. (C)

RPL31

mRNA ilmentyminen on kohonnut kliinisissä eturauhassyöpänäytteissä

versus

normaalia näytteiden tutkimus RNA-sekvensointi The Cancer Genome Analysis [31], [32].

RPL31

säätelee solusyklin etenemisen

Näistä siRNA: t tutkittiin, si

RPL31

oli tehokkain at tukahduta BicR solujen lisääntymistä. Siksi olemme edelleen tutkineet patofysiologista roolia

RPL31

eturauhasen syöpäsoluja. Solusyklin analyysi BicR solujen paljasti, että

RPL31

pudotus merkittävästi kasvattanut solut G0 /G1 vaiheeseen ja vähentää osuus S-vaiheessa, kuin verrokkiryhmän siLuc hoitoon (kuvio 4A ja 4B).

RPL31

Knockdown myös indusoi samanlaisia ​​solusyklin profiilin muutoksia LNCaP (kuvio 4C ja 4D). Nämä tulokset osoittavat, että

RPL31

pudotus olennaisesti tukahdutti solusyklin etenemistä BicR solujen sekä LNCaP.

(A) knockdovvn

RPL31

vuonna BicR soluissa kasvattanut solujen G0 /G1 ja vähensi osuutta kuin S-vaiheessa. Solut transfektoitiin siRPL31 tai siLuc elatusaineeseen 48 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä, värjättiin propidiumjodidilla, ja altistettiin FACS-analyysiä. (B) prosenttiosuudet BicR solujen S, G0 /G1 ja G2 /M-vaiheen määritettiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa, ja ne esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3, *,

P

0,05; **,

P

0,01). (C) knockdovvn

RPL31

laski leviämisen LNCaP. Soluja käsitellään samalla tavalla kuin on kuvattu (A). (D) prosenttiosuudet LNCaP S, G0 /G1 ja G2 /M-vaiheisiin määritettiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa, ja ne esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3; **,

P

0,01).

RPL31 moduloi p53 ja MDM2 sekä p53-proteiinin hajoaminen

Valaistaan mekanismeista rooli RPL31 solusyklin etenemisen eturauhasen syöpäsolujen, tutkimme vaikutus

RPL31

pudotus n ekspressioon solun lukiertosäätelijöistä, mukaan lukien p53, MDM2, ja p21. Kiehtovan, proteiini tasoilla tuumorisuppressorigeenin p53 [19], [29], [36] – [40] ja sen loppupään solusyklin negatiivinen säätelijä p21 [20] parannettiin

RPL31

Knockdown in BicR soluissa ja LNCaP-soluja (kuvio 5A). Ilmaisu MDM2-proteiinin, joka on tunnettu E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla kohdistaminen p53 [21], [36], [37], oli myös parannettu upon

RPL31

knockdown.

(A) knockdovvn RPL31 lisää p53, MDM2, ja p21-proteiinin ilmentyminen. LNCaP ja BicR solut transfektoitiin siRPL31 tai siLuc 48 tuntia. Solu-uutteita alistettiin SDS-PAGE ja Western blot-analyysillä käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (B) RPL31 säännelty hajoamiseen p53-proteiinin. BicR solut transfektoitiin siRPL31 tai siLuc 60 tuntia ja käsiteltiin 50 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) ja ilmoitetun ajan. Solu-uutteet analysoitiin western-blottauksella. (C) p53-proteiini kvantitoitiin densitometrillä ja normalisoitiin tasot vastaavat β-aktiini-proteiinin ja esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 3, *,

P

0,05).

sitten arvioi,

RPL31

hiljentäminen vaikuttanut hajoaminen p53 eturauhasen syöpäsoluja. Proteiini tasot p53 kvantitoitiin western blot-analyysi BicR käsitellyissä soluissa

RPL31

siRNA ja sykloheksimidillä, joka on proteiinisynteesin inhibiittori (kuvio 5B). p53-proteiini tasot normalisoitiin tasot vastaavat β-aktiini, käyttäen tiheysmittaria (kuvio 5C). p53 stabiloitiin enemmän

RPL31

-silenced BicR soluissa kuin siLuc-käsitellyissä soluissa.

p53 osittain välittää solu vaikutuksia RPL31

vieressä tutki vaikutuksia

RPL31

knockdown on

p53

ja

MDM2

mRNA ekspressiotasot BicR ja vanhempien LNCaP.

p53

mRNA eivät suurentuneet BicR ja LNCaP jälkeen

RPL31

taintumisen (kuvio 6A, kuva S2). Tämä havainto viittaa siihen, että

RPL31

hiljentäminen ilmen- tymisen lisääntymisen p53 ilmentymistä proteiinitasolla. Sen sijaan

MDM2

ja

p21

mRNA kohoamiseen upon

RPL31

Knockdown vuonna BicR ja LNCaP-soluja (kuvio 6A, kuva S2), sopusoinnussa säätelyä näiden proteiinit molemmissa solulinjoissa (kuvio 5A).

(A) pudotus vaikutukset RPL31 ja p53 MDM2 ja p21-mRNA: n. BicR solut transfektoitiin siRPL31, sip53, siRPL31 plus sip53 tai siLuc. qRT-PCR RPL31, p53, MDM2, ja p21 mRNAwas suoritettu. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena; mRNA ilmaisu on normalisoitu GAPDH ja näytetään keskimääräisenä ± S.D. (N = 3; **,

P

0,01). (B) sip53 osittain peruuttanut tukahduttaminen solujen kasvun aiheuttama siRPL31. BicR-solut transfektoitiin 10 nM kutakin siRPL31, sip53, siRPL31 plus sip53 tai siLuc, ja viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi 1 uM bikalutamidia. WST-8-solujen lisääntymisen määritys suoritettiin osoitetuissa aikapisteissä. Absorbanssit kuoppien levyissä mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa 450 nm: ssä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 4; **,

P

0,01).

edelleen todennetaan, kun p53 merkittävästi toimintatapojen kasvun estäminen välittämää

RPL31

hiljentäminen . On huomattava, että RPL31 Knockdown välittämää säätelyä

MDM2

ja

p21

mRNA BicR soluissa väheni merkittävästi p53 Knockdown yhdistettynä RPL31 taintumisen (kuvio 6A). Näiden vaikutukset siRNA: iden on BicR soluproliferaatiota arvioitiin käyttäen WST-8 määrityksessä (kuvio 6B). Tulokset osoittivat, että

p53

ja

RPL31

pudotus osittain kasvanutta solujen verrattuna

RPL31

pudotus yksinään läsnäollessa bikalutamidi. LNCaP-solut, yhdistelmä sip53 ja siRPL31 myös osittain käänteinen vaikutukset siRPL31 on

MDM2

ja

p21

mRNA ekspressiotasot sekä solun kasvua (kuva S2). Sitten tutkittiin, mikä vaikutus kombinatorisista käytön siRPL31 ja sip53 solun sykliprofiilia BicR soluja (kuvio S3). Double knockdovvn

RPL31

ja

p53

kasvattanut solujen S-vaiheessa verrattuna

RPL31

pudotus yksin.

syntyy LNCaP solut, jotka ilmentävät eksogeenisiä RPL31 vakaa transfektion tutkia vaikutusta RPL31 ilmentymisen vaikutus p53-proteiinin (kuvio S4A). On todettu, että p53-proteiini stabiloidaan kemoterapiaa huume dosetakseliliuosta LNCaP [41]. Olemme tutkineet p53-proteiinin tasoa tässä tilanteessa ja totesi, että p53-proteiini-tasot laskivat RPL31 yli-ilmentäviä LNCaP-soluja verrattuna vektorin-ilmentävien solujen (kuvio S4b). Nämä vahvistus-of-function kokeet osoittivat myös, että RPL31 voi säädellä negatiivisesti proteiinin ekspressiotasot p53. Lisäksi tutkimme, onko RPL31 ilmentymistä säädellään bikalutamidin (kuva S5). Erityisesti on osoitettu, että bikalutamidi voimakkaammin indusoi RPL31 mRNA: n ekspression BicR soluissa kuin LNCaP-soluissa, koska 24 ja 48 tuntia sen jälkeen bikalutamidi käsittelyn RPL31 mRNA-tasot olivat merkitsevästi korkeammat BicR soluja kuin LNCaP-soluja (

P

0,01).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistimme geenejä modulointiin bikalutamidi vaste eturauhasen syöpäsolujen kautta funktionaalinen seulonta käyttäen lentiviraalinen shRNA kirjasto yhdistettynä siRNA kokeiluja. Out of ~10,000 shRNAs jotka transduktoitiin LNCaP, valitsimme pienen alaryhmä shRNAs huomattavasti matalammalla ilmentymistä soluissa jälkeen 1 kk bikalutamidin hoitoa. Vuodesta 13 geenien kohteena valitun shRNAs, olemme havainneet, että pudotus on

RPL31, ADAMTS1

, ja

HIST1H2BD

esti merkittävästi proliferaatiota BicR eturauhasen syöpäsoluja. Keskityimme luonnehdinta ribosomaalisen proteiinin RPL31 eturauhassyövän biologian vaimentaminen

RPL31

vähentää huomattavasti solusyklin etenemistä BicR soluja. Olemme havainneet, että ilmentymisen taso

RPL31

mRNA oli merkittävästi kohonnut BicR soluissa verrattuna LNCaP-soluja, ja kliiniset tutkimukset osoittavat, että RPL31 ekspressiota eturauhasen syöpä on korkeampi kuin hyvänlaatuinen eturauhasen kudoksissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että RPL31 positiivisesti vaikuttaa kehittämiseen ja fenotyypin eturauhasen syöpä.

pyrittiin määrittämään mekanismia, jolla

RPL31

pudotus ankarasti kasvua pidätettiin BicR eturauhasen syöpäsoluja. RPL31 on osa suuren alayksikön ribosomin eukaryooteissa [15], [17], [18], [42]. Koska bikalutamidi hoito eturauhasen syöpäsolujen heikentää ribosomaalisen RNA-synteesin [43],

RPL31

Knockdown voisi pahentaa dysregulaatio ribosomaalisen toiminto läsnäollessa bikalutamidi. Lisäksi

RPL31

Knockdown voisi välittää extraribosomal toiminnot ja mukauttaa reitin kasvaimen p53. Extraribosomal toiminnot ovat solujen toimissa kuin proteiinisynteesiä, kuten DNA: n kahdentuminen, transkriptio, korjaus, Silmukointi, solujen kasvuun, apoptoosin, erilaistuminen ja solujen transformaatio [33], [34], [42], [44] – [49] . Erityisesti merkitystä extraribosomal toimintoja solun kasvua ja solunjakautumisen vahvisti havainto, että heikentynyt näistä prosesseista ylössäätelee p53 ja aiheuttaa solusyklin pidätyksen [36], [37]. Esillä olevassa tutkimuksessa,

RPL31

pudotus huomattavasti proteiinin tasot p53, p21, ja MDM2. On myös huomattava, että RPL31 Knockdown kostutetulla hajoaminen p53-proteiinin sykloheksimidikäsittelylle. RPL31 Knockdown välittämää säätelyä

MDM2

ja

p21

mRNA tulee pääasiassa säätelee p53, koska se oli merkitsevästi pienempi p53 siRNA.