Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpäkuolemista Yhdysvalloissa ja muualla maailmassa. Kynnyksellä molekyyli- suunnattu hoitoja lupaava parantamisen terapeuttisen tehon. Soluliman fosfolipaasi A2 (CPLA ​​

2) liittyy syövän etenemiseen ja radioresistance hiiren kasvainmuodoista. Hyödyntämällä CPLA

2 spesifinen estäjä PLA-695, päätimme jos cPLA2 esto herkistää säteilylle ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin ja kasvaimiin. Hoito PLA-695 heikennetty säteilyn aiheuttamien kasvaa fosfo-ERK ja fosfo-Akt endoteelisoluissa. NSCLC-solut (LLC ja A549) viljeltiin yhdessä endoteelisolujen (bEND3 ja HUVEC) ja esikäsitelty PLA-695 osoitti säteilylle herkäksi. PLA-695 yhdistettynä säteilytys (IR) vähensi muuttoliikettä ja lisääntymistä endoteelisoluissa (HUVEC bEND3) ja solukuolema ja heikennettyjä hyökkäystä kasvainsolujen (LLC A549). Vuonna heterotooppi- kasvain malli, yhdistelmä PLA-695 ja säteily hidastunut kasvu sekä LLC ja A549 kasvaimia. LLC ja A549 kasvaimia hoidettiin yhdistelmällä PLA-695 ja säteily näytetä vähensi kasvainten verisuonistossa. Vuonna selkä ihopoimun mallin LLC kasvainten, estämällä CPLA

2 yhdistettynä säteilyn johti tehostetun tuhoutumiseen kasvaimen verisuonten. Antiangiogeenisiä vaikutuksia PLA-695 ja sen parantaminen tehoa sädehoidon hiirimalleissa NSCLC mukaan kliinisissä tutkimuksissa sen kykyä parantaa sädehoidon tulokset ovat perusteltuja.

Citation: Thotala D, Craft JM, Ferraro DJ, Kotipatruni RP, Bhave SR, Jaboin JJ, et ai. (2013) Sytosoliset PhospholipaseA2 esto PLA-695 herkistää säteilylle kasvaimia Keuhkosyöpä eläinmalleissa. PLoS ONE 8 (7): e69688. doi: 10,1371 /journal.pone.0069688

Editor: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Ranska

vastaanotettu: 31 lokakuu 2012; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 19 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Thotala et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NIH apurahat R01-CA12575706 ja R01-CA14022002, Startup varoja Thotala laitokselta Radiation Oncology, Siteman Cancer Research Fund alkaen Washington University in Saint Louis ja Grant Pfizer Inc. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, tai valmisteen käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: PLA-695 saatiin Pfizer Inc. Pfizer-Washington University biolääketieteen sopimus. Kuten kohti Pfizer-Washington University biolääketieteen sopimus käsikirjoitus toimitettiin Pfizer Inc selvitetty julkaistavaksi. Kumpikaan laatijat eikä heidän perheenjäsentensä ole taloudellisia tai muita taloudellisia kilpailevien etujen PLA-695 tai Pfizer Inc Kirjoittajat myös vahvistaa, että se ei vaikuta ja noudattaa kaikkia PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa. American Cancer Society arvioiden vuonna 2012 osoittavat, että siellä oli yli 225000 uutta tapausta ja yli 160.000 kuolemat keuhkosyöpään Yhdysvalloissa [1]. Sädehoitoa (RT) on edelleen kiinteä osa keuhkosyövän hallinta [2]. Viime vuosikymmenen aikana on ollut huomattavaa parannusta sädehoitoa tulosten johtuvan kehitys kliinisiin, fysiikan, ja biologian tutkimus [3]. Huolimatta näistä parannuksista terapeuttisissa hoito, paikallinen uusiutuminen keuhkosyöpä on edelleen jatkuva ongelma [4]. Useimmat potilaat, joilla leikkaushoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on huono ennuste, jossa mediaani jäänteitä noin 18 kuukauden kuluttua, vaikka aggressiivinen hoito [5], [6]. Näin ollen on kiireellinen tarve kehittää tehokkaampia lähestymistapoja hoitoon NSCLC.

Ionisoiva säteily (IR) ei vahingoita ainoastaan ​​tuman DNA, mutta myös aktivoi joukko signalointi solunsisäiseen [7], [8]. Fosfolipaasi A2 (PLA

2, katalysoi kalvon fosfolipidien SN-2-asemassa vapauttaa rasva-toisiolähettien [9]. Ionisoiva säteily aktivoi sytosolin fosfolipaasi A2: n (CPLA ​​

2) endoteelisoluissa [10]. aktivoinnin jälkeen CPLA

2 lohkaisee palmitiinihappo muodostaa fosfatidyylikoliini (PC) [11], [12], [13], [14], joka puolestaan ​​johtaa tuotannon lysofosfatidyylikoliinin (LPC), lysofosfatidihappo (LPA), prostaglandiini E

2 (PGE2) ja arakidonihapon [15], [16], [17], [18]. arakidonihapon ja LPA olla tärkeä rooli hyökkäyksen ja signaloinnin aikana syövän etenemisen [14], [19], [ ,,,0],20], [21]. aktivointi CPLA

2 stimuloi endoteelisolujen proliferaatiota ja edistää muodostumista verisuonten verkkojen [16], [17]. LPC laukaisee alavirran aktivaation fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAP) /solunulkoisen signaalin säännelty kinaasi (ERK), joka. johtaa lisääntynyt solujen elinkelpoisuus endoteelin kasvaimen mikroympäristössä [16], [17], [22]. Aktivointi CPLA

2 kasvaimen mikroympäristössä johtaa lisääntyneeseen verisuonistoon ja parannettu tuumorigeneesissä johtaa radioresistance kasvain ja vähentäen tehoa sädehoidon [23], [24]. Yhdistelmä säteilytys eston CPLA

2 prekliinisissä keuhkosyövän kasvainmuodoista on osoitettu tukahdutti kasvaimen kasvua ja vähentää angiogeneesiä [25], [26].

Aiemmat tutkimukset ovat käyttäneet CPLA

2 estäjät sovellu käännettäväksi klinikalle, koska niiden myrkyllisyys [17]. Tutkimme vaikutukset PLA-695, joka on CPLA

2-estäjä, joka on jo testattu kliinisissä kokeissa. Faasin I tutkimuksessa (NCT00366262) turvallisuuden arviointiin PLA-695 lumelääkkeeseen verrattuna ja naprokseeni on valmis (kliininen trials.gov). Myöhemmin, vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa (NCT00396955) verrattuna 4-annosten PLA-695, naprokseeni, ja lumelääkettä henkilöillä, joilla on nivelrikon (kliininen trials.gov). Tässä tutkimuksessa määritettiin tehoa PLA-695 yhdistettynä säteilytys hoitoon hiiri malleja keuhkosyöpään.

Huomasimme, että PLA-695 estää säteilyn aiheuttamien fosforylaatiota ERK ja Akt viljellyissä endoteelisoluissa. PLA-695 yhdistettynä säteilytys esti endoteelisolujen migraatiota. PLA-695 parannettu säteilyn aiheuttaman solukuoleman ja heikennettyjä hyökkäys keuhkosyöpään solujen. PLA-695 inhiboi uusien verisuonten ja angiogeneesi [26]. Lisäksi PLA-695 parantaa tehoa säteilyn kahdella hiiren mallia keuhkosyöpään.

Methods

Soluviljely ja hoito

primaariviljelmä Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) koota moninaisista luovuttajien saatiin Cambrex (East Rutherford, NJ, USA) ja pidettiin täydellisessä EBM-2 väliaine (Cambrex). Solut kohdista 2-5 käytettiin tässä tutkimuksessa. HUVEC olivat ilman ravintoa 1 tunti ennen käsittelyä lisäaineettomat EBM-2 väliaine. 3B11 microvascular-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja pidettiin DMEM: ssä, jossa oli 5% naudan sikiön seerumia (FBS). Solut kohdista 3-6 käytettiin tässä tutkimuksessa. 3B11s nälkiinnytettiin DMEM + 1% FBS: ssa 3 tuntia ennen kaikissa tutkimuksissa. PLA-695 saatiin Pfizer Inc alle Pfizer-WU biolääketieteen sopimus. Säteilyttämistä varten soluja, Therapax 250 röntgenlaitteen (Pantak Inc., East Haven, CT, USA) tuottaa 2,04 Gy /min 250 kVp käytettiin. Suuren herkkyyden HUVEC lämpötilan ja pH: ssa, soluja pidettiin inkubaattorissa vieressä säteilytysuunin ennen käsittelyä ja sen jälkeen. Kokeissa PLA-695 soluja käsiteltiin 45 minuuttia ennen IR (3 Gy) joko (DMSO, vehikkelikontrolli) tai vaihtelevat lääkkeen konsentraatio DMSO: ssa (10-600 nM).

Co -Kulttuuri klonogeeninen eloonläämismääritys

HUVEC (1,0 x 10

6) ja bEnd.3 soluja (1,0 x 10

6) maljattiin 100 mm: n maljoille ja 24 tunnin kuluttua, A549 (2 x 10

6) ja LLC (2 x 10

6) maljattiin transwell-irto-(Corning Inc., Corning, NY). Sen jälkeen kun co-viljellään 24 tuntia, soluja käsiteltiin 300 nM PLA-695 tai ajoneuvon hallinnan DMSO: ssa 45 minuuttia ennen IR 0, 2, 4, 6 tai 8 Gy. Kun hoitoja rinnakkaisviljelemällä joko PLA-695 tai DMSO laskettu määrä LLC ja A549-solut maljattiin jotta normalisointi pinnoitus tehokkuutta. Klonogeeniset määritykset suoritettiin myös LLC ja AF549 yksin. Kiinteät numerot soluja maljattiin jotta normalisointi pinnoitus tehokkuutta. Solujen annettiin kiinnittyä 5 tuntia ja sitten käsiteltiin 300 nM PLA-695 tai ajoneuvon hallinnan DMSO: ssa 45 minuuttia ennen IR 0, 2, 4, 6 tai 8 Gy. 7-10 päivän inkubaation levyt kiinnitettiin 70% EtOH ja värjättiin 1% metyleenisiniä. Pesäkkeitä, jotka sisälsivät 50 solut laskettiin katsomalla levyt mikroskoopilla. Selviytymisen jakeet laskettiin (pesäkkeiden määrä /solujen määrä päällystetty) /(pesäkkeiden määrä vastaavia ohjaus /solujen lukumäärä päällystetty).

Kolorimetrinen proliferaatiomääritystä

Solulisääntyminen määritetään solujen tiitteri 96 Aqueous Non-Radioactive proliferaatiomääritystä (Promega). Määritys suoritettiin seuraavasti valmistajan protokollan. Lyhyesti soluja käsiteltiin joko DMSO-kontrollin tai 300 nM PLA-695 45 minuuttia ja säteilytetään 3 Gy. Väliaine vaihdettiin 1 tunnin kuluttua, ja levyjä inkuboitiin 96 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin kolorimetrisesti kuluttua 96 h mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskivirheet laskettiin.

morfologinen analyysi värjättyjen solujen DAPI

LLC ja A549-soluja kasvatettiin kammiossa dioja ja käsiteltiin joko DMSO tai 300 nM PLA-695 45 minuuttia ja säteilytettiin sitten 3 Gy. Klo 96 h jälkisäteilyttämiseksi, solut kiinnitettiin 4 paraformaldehydillä ja värjättiin sitten 2,5 ugml- 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Mikrovalokuvista otettiin käyttäen Olympus BX60 fluoresenssimikroskoopilla varustettu digitaalikamera. Monitumaisia ​​soluja ja soluja, jotka sisältävät jättiläinen tumat laskettiin useilla satunnaisesti valituilla aloilla. Keskimääräinen prosenttiosuus tällaisten solujen yli solujen kokonaismäärä laskettiin kolmen kokeen.

Kasvain TranswellTM invaasiomääritys

Kasvain TranswellTM Matrigel invaasiomääritys tarkkailuun käytettiin kasvaimeen endoteelin vuorovaikutusta ja solujen vaeltamiseen. Tämä määritys käyttää yksinkertaistettua Boyden chamber kaltainen muotoilu on kaksi kamaria erotettu suodatin päällystetty Matrigel. A549 (1,0 x 10

6 solua /kuoppa) tai LLC (0,6 x 10

6 solua /kuoppa) suspendoitiin seerumittomassa alustassa ja lisätään päälle 24 kuoppalevyille 8 um tyvikalvon matriisikoodattua päällystetyn polykarbonaattikalvon insertit (Bedford, MA, USA). 500 ui tuoretta väliainetta lisättiin alaosaan, kuten kemiallis-houkutinta. Sillä säteilylle herkäksi tutkimuksia, molemmat kammiot käsiteltiin sitten ajoneuvon DMSO tai 300 nM PLA-695 45 minuuttia ennen IR 4 Gy. Vaeltaneet solut ylhäältä kammiosta pinnoitetun suodattimen huokosten pohjalle suodattimen. 24 tunnin kuluttua jäljellä solut ylemmässä kammiossa kalvon insertit poistettiin käyttäen märkää pumpulipuikolla. Solut, jotka tarttunut ulkopinnalle transwell-insertin kalvon, jonka olivat tunkeutuneet läpi Matrigel kiinnitettiin 100% metanolilla ja värjättiin. Solut, jotka olivat tunkeutuneet 7-10 suuritehoiset kenttä (HPF) kustakin näytteestä laskettiin käyttäen Image J ohjelmisto (NIH, Bethesda, MD), ja keskimääräinen solujen hyökkäsi kalvon läpi kohti HPF laskettiin. Keskiarvo ja keskivirhe kussakin testiryhmässä laskettiin kullekin ryhmälle.

signaalinvälitysreitin Analysis

Käsittelyn jälkeen HUVEC-solut kerättiin osoitetussa aikoina. Kokonaisproteiinin uutto suoritettiin käyttäen M-PER-reagenssia (Pierce, Rockford, IL, USA), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ja fosfataasi-inhibiittorit II ja III (Sigma, MO). Proteiini kvantifioitiin käyttämällä BCA Reagent (Pierce). Proteiini uutteet (40 ug) tehtiin Länsi-immunoblot-analyysillä käyttäen vasta-aineita havaitsemiseksi fosfo-Akt (Thr308 /Ser473), fosfori-ERK1 /2, (Thr202 /Tyr204), yhteensä Akt, ja yhteensä ERK1 /2 (kaikki Cell Signaling Technologies.

Danvers, MA, USA). Vasta-aine aktiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) käytettiin arvioimaan proteiinin lastausta kunkin kaistan. Immunoblotit kehitettiin käyttäen Western Lightning kemiluminesenssin Plus tunnistusjärjestelmä (PerkinElmer, Wellesley, MA, USA) valmistajan protokollan.

Cell Migration

HUVEC ja bEND3 soluja kasvatettiin 70% – 80% yhteensulautumisesta 60 mm levyille. Kolme rinnakkaista haavat luotiin kullekin levylle raaputtamalla yksisolukerros 200 ui pipetin kärki, ja rajat haavat oli merkitty. Soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan vehikkelillä (DMSO) tai 300 nM PLA-695, jota seurasi 3 Gy IR. 24 tunnin kuluttua solut valokuvattiin, ja soluja löytyy sisältä ja ulkopuolelta haavan rajojen laskettiin kuudesta HPFS- näytettä kohti. Solut, jotka jakautuivat rajat luokiteltiin ei-siirretyn soluja. Solutiheys sisällä haavan esitetään prosentteina koko solutiheyden levyyn. Tulokset ovat peräisin triplikaattinäytteet kolmessa riippumattomassa tyhjästä määrityksissä.

Tumor Growth Delay

Institutional Animal Care ja käyttö komitean Washington University, St. Louis erikseen hyväksynyt tämän tutkimuksen. LLC (10

6) tai A549 (10

6) soluja istutettiin oikeaan polkuanturaan C57 /BL6-hiirissä. Kun kaikki kasvaimet tuli mitattavissa plethysomography, määritettynä tilavuus kasvain footpad miinus tilavuus kontralateraalisten footpad, hiiret olivat kiemurteleva lajitellut ryhmiin kuudesta seitsemään eläimiin, jotka edustavat vastaavia jakaumia kasvaimen kokoa (alue = 40-70 mm

3). Kasvain hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti vehikkeliä (DMSO) tai PLA-695 7,5 mg kehon painokiloa kohti kerran päivässä viiden peräkkäisen päivän ajan. Kolmekymmentä minuuttia lääkkeen injektion hiiret nukutettiin isofluraanilla ja sijoitettu Pantak Säteilyttäjää ja säteilytetään 2 Gy päivittäin viitenä peräkkäisenä päivänä yhteensä 10 Gy. Lyijy lohkot (10 mm) käytettiin suojaamaan pään, rintakehän ja vatsan. Kasvaimen koko seurattiin pitkittäisesti pletysmografia. Hiiret tapettiin CO

2 tukehtumisen kerran kasvaimet saavuttivat tilavuuden noin 700 mm

3 tai haavaumia tulivat ilmi jalkatyynyyn kohden Animal Care ohjeita.

In vivo angiogeneesimääritys Dorsal Skin-kertainen kammion Model

istutusta tekniikka selän ihon-kertainen kammion mallia on kuvattu aiemmin [27]. Lyhyesti, diffuusiokammiot sisältävä LLC soluja (1 x 10

6 solua per säiliö) on asetettu selkä Ilmapussi hakea tekemällä pinnallinen viilto vaakasuoraan reunaan selkä Ilmapussi. Iho oli huolellisesti ommeltiin saattamisen jälkeen kammiot alla hiiren ihon. Hiiret käsittelyt tehtiin 5-7 päivää kirurgisen insertion diffuusiokammiot. Ihopoimua kattaa kammiot poistettiin varovasti jälkeen euthanizing hiiret ja valokuvattiin näkyvää valoa. Määrä kasvaimen aiheuttama verisuonten laskettiin kymmenessä eri aloilla kammiossa alueella ilmarakon kojelauta.

Histologinen analyysi verisuonien

Kasvain kantavia hiiriä uhrattiin 24 tuntia kun lopullista käsittelyä ja kasvaimet resektoitiin, kiinnitettiin formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja leikattiin. Osaa (5 pm paksu) käsiteltiin 20 ug /ml proteinaasi K: ssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin yön yli kanin polyklonaalisella vasta-aineella ihmisen von Willebrand -tekijän (vWF) (1:100 laimennus; Dako, Carpinteria, CA ). Kudosleikkeet jälkeen sitä inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG: tä (1:500 laimennus; Invitrogen Molecular Probes) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Alexa Fluor 488-värjättyä alusta laskettiin kolme satunnaisesti valittua HPFS- kustakin kolmesta osasta kohti kasvain. Verisuonisto määritettiin keskimäärin värjättyä aluksia kohti HPF. Kasvaimen verisuonen poikkipinta-ala määritettiin samalla tavalla, käyttäen NIH Image J ohjelmisto, jossa rajaavat aluksilta jaettiin kokonaisalasta HPF määrittää prosenttiin verisuonten alueella.

Tilastollinen analyysi

keskiarvoa ja standardipoikkeamaa keskivirhe (SEM) kunkin ryhmän laskettiin kaikissa kokeissa. Näytteiden määrä on ilmoitettu kuvauksessa kunkin kokeen. Opiskelijat T-testi oli käyttää verrata kahta hoitoryhmissä. Varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin vertaamaan hoitoa tehokkuutta kasvaimen kasvun viivästyminen tutkimuksissa.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Effect of PLA-695 on Pro-selviytymisen signalointi jälkeen Radiation

aktivointi ERK ja Akt tapahtuu nopeasti seuraavat säteilyä HUVEC-soluissa (kuvio. 1). Hoidon PLA-695 vaimentaa IR indusoi ERK-fosforylaation annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1 A). ERK aktivointi vähenee lähtötasoon (vale-käsitellyissä soluissa) 300 nM PLA-695. Suuremmilla pitoisuuksilla (600 nM), tasot ERK-fosforylaation alittaa lähtötasolle. IR indusoidun Akt-fosforylaation myös kumottu, kun HUVEC-soluja käsiteltiin 300 nM PLA-695 (Fig. 1 B). Löydettiin samankaltaisia ​​tuloksia 3B11 soluissa, joita käsiteltiin 300 nM PLA-695 (Fig. 1 C ja D).

HUVEC-soluja (A) käsiteltiin eri pitoisuuksilla PLA-695 kuten on osoitettu 45 min ennen käsittelyä 3 Gy solut lyysattiin 5 minuutin kuluttua IR. HUVEC (B) ja 3B11 (C 0,001, 6 Gy P 0,001, 8 Gy P = 0,012) ja A549-solut (2 Gy P = 0,163, 4 Gy P 0,001, 6 Gy P 0,001, 8 Gy P = 0,031) verrattuna soluihin saaneet sädehoitoa yksinään (Fig. 2B). Annoksen lisälaite tekijät laskettiin 10% solujen selviytymistä jakamalla säteilyannoksen säteilyltä vain selviytymisen käyrä vastaavaan annos PLA-695 plus säteilyä käyrä. Annos lisälaite tekijät olivat 1,17 ja LLC-soluja, 1,28 ja A549-solut (Fig. 2B).

LLC ja A549-soluja kasvatettiin erikseen (A) tai co-viljelmät (B), jossa bEND3 ja HUVEC-soluja ja käsiteltiin DMSO tai 300 nM PLA-695 seerumittomassa mediassa 45 minuuttia ennen IR. Sitten solut säteilytettiin 0, 2, 4, 6 ja 8 Gy, ja levyille klonogeenisten -eloonjäämiskoe. Jälkeen 7-10 päivää, solut värjättiin 1% metyleenisinistä ja pesäkkeitä, jotka sisälsivät 50 solut laskettiin mikroskoopilla. Elossa pesäkkeet normalisoitiin pinnoitus tehokkuutta. Näkyy ovat keskimäärin hengissäsäilymisosuudet ja SEM.

PLA-695 Vähentää leviämisen endoteelin ja Lung Cancer Cells jälkeen Säteilytys

Valaistaan ​​roolin CPLA

2 sekä endoteelin solut ja keuhkosyövän soluja, tutkimme kuinka PLA-695 vaikuttaa lisääntymistä LLC, A549, bEND3 ja HUVEC-soluja (kuvio. 3A). Yhtä suuret määrät LLC, A549, bEND3 ja HUVEC-soluja maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 300 nM PLA-695: ssa 45 minuuttia ennen IR. Levyt luettiin 24, 48, 72, tai 96 h käyttämällä kolorimetristä solulisäkasvumääritykselle mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä. bEND3 solut käsiteltiin PLA-695 yksinään oli merkittävä väheneminen solujen lisääntymisen verrattuna DMSO: ssa 24 h (P 0,001), 48 h (P = 0,002) ja 96 h (P 0,001) ja 72 h (P = 0,047). bEND3 solut käsiteltiin yhdistelmällä hoitoon PLA-695 IR osoitti merkittävää vähenemistä solujen lisääntymisen verrattuna IR yksin 72 h (P = 0,001) ja 96 h (P = 0,002) ja vähensi lisääntymistä 24 tunnin (P = 1,0) ja 48 h (P = 0,023). HUVEC-solut käsiteltiin PLA-695 yksinään oli merkittävä väheneminen solujen lisääntymisen verrattuna DMSO: ssa 24 h (P = 0,003), 48 h (P = 0,016), 72 h (P = 0,013), ja 96 h (P 0,001). HUVEC-solut käsiteltiin yhdistelmällä hoitoon PLA-695 IR osoitti merkittävää vähenemistä solujen lisääntymisen verrattuna IR yksinään 24 tunnin (P = 0,004) 72 h (P = 0,002) ja 96 h (P 0,001). LLC-solut käsiteltiin PLA-695 yksinään osoitti vähenemistä solujen lisääntymisen verrattuna DMSO: ssa 24 h (P = 0,076), 48 h (P = 0,017), 72 h (P = 0,028) ja 96 h (P = 0,175). LLC-solut käsiteltiin yhdistelmällä hoitoon PLA-695 IR osoitti merkittävää vähenemistä solujen lisääntymisen verrattuna IR yksinään 24 tunnin (P = 0,001), 48 h (P = 0,010), 72 h (P 0,001) ja 96 h (P 0,001). A549-soluja käsiteltiin PLA-695 yksinään vähensi solujen lisääntymistä verrattuna DMSO: ssa 24 h (P = 0,017), 48 h (P = 0,008), 72 h (P = 0,070) ja 96 h (P = 0,079). A549-soluja käsiteltiin yhdistelmällä hoitoa PLA-695 IR osoitti merkittävää vähenemistä solujen lisääntymisen verrattuna IR yksin 72 h (P = 0,003) ja 96 h (P = 0,003).

Yhtä suuret määrät bEND3 HUVEC, LLC ja A549-solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja käsiteltiin 300 nM PLA-695: ssa 45 minuuttia ennen käsittelyä 3 Gy. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen kolorimetristä soluproleferaatiomäärityksessä 24, 48, 72 ja 96 tunnin käsittelyn jälkeen. Kuviossa esitetään absorbanssi 490 nm: ssä. B. PLA-695 parantaa solukuolemaa säteilytettyjen keuhkosyövän soluja. LLC: n ja A549-soluja käsiteltiin 300 nM PLA-695: ssa tai DMSO: ssa 45 min ennen käsittelyä 3 Gy. Solut värjättiin anneksiini V-APC: n ja propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla 24, 48, 72 tai 96 tunnin säteilytyksen jälkeen. Siinä on esitetty linja kaavioita osoittaa kertainen solukuoleman yli käyttölukituksen hoidon SEM kolmesta kokeesta.

PLA-695 Parantaa solukuoleman Irradiated Lung Cancer Cells

CPLA

2 on osoitettu aktivoivan signaloinnin kautta Ras /Raf /ERK-reitin [10], [28]. Aktivointi fosfolipaasi A2 on myös osoitettu olevan syynä viivästyneen solukuoleman aiheuttama H

2O

2 [29]. Tutkimme solukuolemaa LLC ja A549 värjäämällä anneksiini V: n ja PI virtaussytometriaa käyttämällä 24, 48, 72 ja 96 h sen jälkeen, kun IR (Fig. 3B). PLA-695 hoitoon LLC soluja ei aiheuttanut merkittävää solukuoleman lainkaan testattujen ajankohtina. A549-soluja käsiteltiin PLA-695 kasvoi hieman solukuoleman ajan. IR yksinään indusoi tason solukuoleman sekä LLC: n ja A549-soluja, jotka oli samanlainen kaikissa testattuina ajankohtina (24, 48, 72 ja 96 h). Yhdistetty hoito PLA-695 ja IR ei aiheuttanut lisääntynyt solukuolemaa verrattuna IR yksinään 24 tunnin molemmissa LLC soluissa (P = 0,831) ja A549-soluja (P = 0,192). 48 tuntia kombinaatio osoitti vaatimaton solukuoleman LLC soluissa (P = 0,100) ja merkittävät solukuoleman A549-soluja (P 0,001). 72 h ja 96 h, yhdistetty hoito osoitti merkittävää solukuoleman molemmissa LLC-soluissa (P 0,001) ja A549-solut (P 0,001).

vieressä arvioitiin ydin- morfologia säteilytettyjen soluihin käyttämällä DAPI-värjäyksellä (kuvio. 4); tulokset olivat samanlaisia ​​kuin arviointia tehdään anneksiini V /propidiumjodidivärjäys. 96 tunnin kuluttua säteilytyksen, yhdistetty hoito PLA-695 ja IR johti merkittävästi enemmän multinucleate soluja ja solujen laajentuneen ytimet (ominaisuus mitoosi katastrofin) sekä LLC-soluissa ja A549-soluja (P 0,006), verrattuna IR yksinään ( LLC, P = 0,001; A549, P = 0,006) ja PLA695 yksinään (LLC, P = 0,001; A549, P = 0,002).

LLC ja A549-soluja kasvatettiin kammiossa levyt käsiteltiin 300 nM PLA -695 tai DMSO: ssa 45 minuuttia ennen säteilytystä 3 Gy. Solut kiinnitettiin 96 h myöhemmin ja värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-phenyllindole (DAPI). Näkyy ovat mikrokuvia DAPI värjättyjen solujen, nuolet osoittavat multinucleate solut ja jättiläinen soluja. Monitumaiset ja jättiläinen solut laskettiin viidellä satunnaisesti valituilla aloilla. Pylväsdiagrammi, joka esittää keskimääräisen prosenttia multinucleate /jättisolut kullekin käsittelylle on esitetty.

PLA-695 Vähentää endoteelisolujen migraatiota jälkeen Säteily

Suoritimme viiltää sulkeminen määrityksiä kanssa HUVEC ja bEND3 solujen vaikutuksen määrittämiseksi PLA-695 (Fig. 5). Tässä määrityksessä, haavan luotiin soluviljelmässä (perustason) ja soluja käsiteltiin vehikkelillä (DMSO), ajoneuvon ja 3 Gy (DMSO + IR), PLA-695 (300 nM), tai yhdistelmä PLA-695 ja 3 Gy (PLA-695 + IR). Solumigraation laskettiin laskemalla solujen lukumäärä siirtymässä haavan (Fig. 5). Huomasimme, että 24 tunnin käsittelyn jälkeen viiltää oli lähes kokonaan peitossa HUVEC ja bEND3 käsitellyt viljelmät DMSO. Säteilytys yksinään johti vähenemiseen muuttoliikettä HUVEC (82%) ja bEND3 (77%) soluista. Samanlaisia ​​väheneminen havaittiin soluissa, joita käsiteltiin PLA-695 yksin sekä HUVEC (74%) ja bEND3 (62%). Yhdistelmä PLA-695 ja IR johti huomattavaan vähenemiseen migraatio HUVEC (61%; p = 0,003) ja bEND3 (48%; p = 0,012) soluja verrattuna IR yksinään (Fig. 5).

HUVEC ja bEND3 solut maljattiin 60 mm: n maljoille ja niiden annettiin kasvaa 80%: n konfluenssiin. Puoliksi yhtenäinen so- kerros raaputettiin käyttäen 200 ui steriiliä pipetin kärki luoda tyhjästä /haava vailla soluja. Jäljelle jääneet solut käsiteltiin ajoneuvon ohjaus- tai 300 nM PLA-695: ssa 45 minuuttia ennen IR 3 Gy. Muuttoliike arvioitiin 24 tunnin kuluttua hoidon. Solujen lukumäärä vaelsivat naarmu /haavan laskettiin ja normalisoidaan ympäröivä solutiheyteen per HPF. Esitetyt tulokset edustavat mikrovalokuvia ja pylväskaaviot edustavat keskimääräistä prosenttiosuudet vaeltavien solujen suhteessa vastaaviin säätimet SEM kolmesta kokeesta.

PLA-695 Vähentää Kasvainsolun Invasion jälkeen Säteily

CPLA

2 on liitetty solujen vaeltamiseen, kiemuratiehyessä muodostuminen [26] ja hyökkäys [30]. Olemme tutkineet vaikutus PLA-695 kasvainsolujen invaasio LLC ja A549 solulinjoissa käyttäen siirtokuoppaan-invaasio määrityksissä. LLC, havaitsimme 24%: n lasku solujen invaasiota, kun soluja säteilytettiin 4 Gy; kuitenkin, esikäsittely 300 nM PLA-695 ennen IR johti 56% edelleen vähentää solujen invaasiota (P = 0,003; Kuva. 6). Hoito LLC solujen PLA-695 yksinään osoitti 63%: n vähennys invaasio vertailuryhmän. Samoin A549-soluja, säteily yksinään aiheutti 30% vähennys invaasio, kun taas esikäsittely 300 nM PLA-695 ennen IR alennetaan hyökkäystä edelleen 37% (P 0,001; Fig. 6) Hoidon tarve A549-solujen kanssa PLA-695 yksinään tuotti 58%: n vähennys invaasio kontrolliin verrattuna.

LLC ja A549-soluja lisättiin 8 mikronin insertit ja käsiteltiin 300 nM PLA-695: ssa tai DMSO: ssa 45 minuuttia ennen 3 Gy säteilytys. Solujen annettiin tunkeutua /siirtyä ylhäältä kammiosta pinnoitetun suodattimen huokosten koko väliaineen alareunassa inserttien 48 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin sitten, värjätään ja solujen tunkeutuu kalvon läpi laskettiin laskemalla solujen lukumäärä per HPF. Esitetyt tulokset edustavat mikrovalokuvia ja pylväskaavio edustaa useita invasiivisia solujen SEM; * P 0,05.

PLA-695 herkistää säteilylle kasvaimia eläinmalleissa NSCLC

tehokkuuden määrittämiseksi PLA-695 kuin radiosesitizer NSCLC, käytimme heterotooppinen LLC ja A549 kasvainmuotoja kasvatettu C57 ja nude-hiirissä, vastaavasti. Kun LLC ja A549 kasvaimet olivat kouraantuntuva (vaihteluväli 40-70 mm

3), hiiret käsiteltiin viiden peräkkäisen päivän DMSO (ajoneuvo), säteilytys (IR) yksin (10 Gy yhteensä, 5 jakeet 2 Gy ), PLA-695 yksin (7,5 mg /kg /vrk, vatsaonteloon), tai yhdistelmä PLA-695 ja IR. Myöhemmät kasvaimen kasvua seurattiin käyttäen pletysmometriä. Analysoimme kasvaimen kasvun viivästyminen näissä kokeissa kahdella tavalla. Ensinnäkin aika kasvaimen saavuttaa koko 0,25 cm

3 määritettiin. Toiseksi, olemme analysoineet kasvaintilavuudet päivänä 7 LLC kasvaimia ja päivä 15 A549 kasvaimia (Fig. 7). LLC kasvaimet kasvavat paljon nopeammin kuin A549 kasvaimia. Hoitamaton kasvaimet ja IR käsitellyt tuumorit kesti 7 päivää päästä kasvaimen tilavuus 0,25 cm

3, kun taas PLA-695 käsitellyt tuumorit kesti 7,5 päivää. Kasvaimet käsiteltiin yhdistelmällä PLA-695 ja IR kesti 9,5 päivää päästä tilavuuteen 0,25 cm

3. Päivänä 7 käsitellyt kasvaimet yhdistelmä PLA-695 ja IR olivat pienempiä (0,13 cm

3) verrattuna hoitamattomiin (0,27 cm

3, P = 0,019), IR yksinään (0,24 cm

3 ; P = 0,038) ja PLA-695 yksin (0,22 cm

3, P = 0,100).

LLC tai A549-solut istutettiin oikean polkuanturaan C57 /BL6-hiirissä. Kasvaimet säteilytettiin 2 Gy 5 peräkkäisenä päivänä yhteensä 10 Gy. Hiiriä hoidettiin 7,5 mg /kg kehon painoa tai ajoneuvon hallinnan 30 minuuttia ennen IR päivinä 1, 3, 5, 7 ja 9. Kuvassa on kasvaimen keskimääräinen volyymit LLC ja A549 SEM kustakin hoitoryhmässä hiirillä. Kasvaimen kasvun viive LLC ja A549 kasvaimet laskettiin päivien kasvain saavuttaa 0. 25 cm

3 (B). Näkyy on pylväsdiagrammi, joka edustaa keskimääräistä kasvaimen kasvun viive SEM kummassakin hoitoryhmässä 7 hiirillä; * P 0,05. Kasvaintilavuudet analysoitiin päivänä 7 LLC kasvaimia ja päivä 15 A549- kasvaimia. Näkyy on pylväsdiagrammi, joka edustaa kasvaimen kasvu päivänä 7 LLC kasvaimia ja päivä 15 A549- kasvaimia SEM kummassakin hoitoryhmässä 6-hiirten;