Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kehitetään sero-diagnostisia merkkiaineita keuhkosyövän, me tuotetaan monoklonaalisia vasta-aineita käyttämällä keuhkojen adenokarsinooma (AD) -johdannainen A549-soluja kuten antigeenejä käyttämällä satunnainen immunisaatiomenetelmässä. Hybridoomasupernatantteja immunohistokemiallisesti seulottiin vasta-aineiden Amex-kiinteä ja parafinoidut A549 soluvalmisteilla. Positiiviset kloonit monocloned kahdesti rajoittamalla laimennoksia. Saadusta monoklonaalisia vasta-aineita, valitsimme vasta-nimetty KU-Lu-5, joka osoitti intensiivistä kalvo värjäytymistä A549-solut. Joka perustuu immunosaostus ja Madli TOF /TOF-MS-analyysi, tämä vasta-aine on tunnustettu hiilihappoanhydraasi XII (CAXII). Arvioidaan hyödyllisyys Tämän vasta-aineen kuin serologisen diagnostinen markkeri keuhkosyöpä, suoritimme dot blot-analyysi harjoittelukumppanin joukko koostuu seerumeista 70 keuhkosyöpäpotilaita ja 30 tervettä verrokkia. CAXII ekspressiotasot olivat merkittävästi korkeammat keuhkosyöpäpotilaita kuin terveillä verrokeilla koulutukseen set (P 0,0001), ja pinta-ala käyrän ROC oli 0,794, jossa 70,0% tarkkuus ja 82,9% herkkyys. Vuonna keuhkosyövässä, ekspressiotasot CAXII olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla levyepiteelisyöpä (SCC) kuin AD (P = 0,035). Lisäksi CAXII oli merkitsevästi korkeampi hyvin ja kohtuullisesti erilaistunut SCC kuin heikosti erilaistuneet (P = 0,027). Edelleen vahvistavat hyödyllisyys seerumin CAXII tasoilla kuin sero-diagnostinen markkeri, ylimääräinen koostuu seerumeista 26 keuhkosyöpäpotilaita ja 30 terveen kontrollin tutkittiin myös täpläbloteissa analyysin validointitutkimuksessa. Seerumin CAXII tasot olivat myös merkitsevästi suurempi keuhkosyöpäpotilaita kuin terveillä valvonnan validointi set (P = 0,030). Siten seerumin CAXII tasojen pitäisi soveltaa markkereita erotteleva keuhkosyöpä potilaita terveisiin kontrolleihin. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, joka sisältää todisteen CAXII ehkä innovatiivinen sero diagnostiset markkeri keuhkosyöpään.

Citation: Kobayashi M, Matsumoto T, Ryuge S, Yanagita K, Nagashio R, Kawakami Y , et ai. (2012) CAXII Onko Serologinen Diagnostic Marker for Lung Cancer. PLoS ONE 7 (3): e33952. doi: 10,1371 /journal.pone.0033952

Editor: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 23 syyskuuta 2011; Hyväksytty: 20 helmikuu 2012; Julkaistu: 16 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Kobayashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Grant-in-tuki Scientific Research Council (23590414) päässä Japanin Society for Promotion of Science, avustuksia Third Term Kattava ohjaus Tutkimus syövän suorittaman terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan , samoin kuin tutkimushankkeen (nro 2011-1006) School of Allied Health Sciences, Kitasato yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolema käsittäen 13% (1,6 miljoonaa) koko syöpätapauksista ja 18% (1,4 miljoonaa) ja syöpäkuolemista maailmassa vuonna 2008 [1], [2].

kasvainmerkkiaineet on havaittu seerumeissa , virtsa, ja kudoksia potilailta, joilla pahanlaatuisia kasvaimia, ja voidaan käyttää tarkka diagnoosi, syrjintä hyvänlaatuisia tai pahanlaatuisia kasvaimia, seuranta jälkeen hoitoja, ja ennustaminen potilaan lopputulokseen. Tällä hetkellä noin sero-diagnostisia markkereita käytetään keuhkosyövän, kuten syöpä -antigeeni (CEA) ja sialyyli Lewis X-antigeeni (SLX) varten adenokarsinooma (AD), ja sytokeratiinin 19 fragmentti (CYFRA) ja okasolusyöpä antigeeni (SCCA) okasolusyöpään (SCC) [3]. Positiivinen hinnat CEA, SLX, CYFRA, ja SCCA ovat tiettävästi 57, 40~50, 50~60, ja 60~80%, tässä järjestyksessä. Kuitenkin on raportoitu, että nämä merkit eivät ole riittävän kasvaimen tai elimen erityispiirteet; Esimerkiksi SLX voi näyttää vääriä positiivisia tuloksia, kun läsnä on keuhkotuberkuloosi ja keuhkofibroosi, ja CYFRA voi nostaa kanssa interstitiaalipneumoniaa ja munuaisten vajaatoiminta.

Vasta kehitetään yleensä käyttämällä puhdistettuja proteiineja tai synteettisiä peptidejä. Olemme tyhjentävästi tuotettu monoklonaalisia vasta-aineita (MoAb: t) vastaan ​​erilaisia ​​kasvaimeen liittyviä proteiineja käyttäen keuhkojen AD-johdetut A549-solun antigeenin kanssa satunnainen immunisoinnin menetelmä [4], ja yli 1000 MoAbs on saatu [5]. Tämä menetelmä odotetaan tuottavan vasta-aineita proteiineja vastaan, joilla oli kasvaimen tietyn translaation jälkeiset modifikaatiot, jotka ovat vaikea saada tavanomaisilla immunisaatio menetelmillä.

Hiilihappoanhydraasi XII on transmembraaninen sinkki metalloenzyme joka katalysoi palautuvia hydraation hiilidioksidin muodostamaan bikarbonaatin (H

2O + CO

2⇔H

++ HCO

3

-), ja kuuluu alfa hiilihappoanhydraasi (CA) perhe. CAXII on ehdotettu olevan osallisena happamoituminen solunulkoisen mikroympäristön, joka soveltuu nopeaan kasvaimen kasvua. CAXII yliekspressio alun perin havaittiin munuaissolukarsinooma, ja sen jälkeen tehdyt tutkimukset vahvistivat sen ilmentymistä erilaisissa ihmisen syövissä, kuten levinnyttä astrosytooma, rinta-, haima- ja munasarjasyövän sekä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [6] – [11]. Sen ilmentyminen vaikutti sekä tekijät, jotka liittyvät erilaistumiseen ja hypoksia rintasyövän

in vivo

, ja liittyi edullisemman ennusteeseen invasiivisia rintasyöpä potilailla [12]. Korkeampi CAXII ilmentyminen korreloi myös paremman yleiskuvan ja tautikohtaista eloonjäämisen potilailla, joilla kokoisen NSCLC [13]. Kuitenkaan mikään tutkimus on selvittänyt CAXII seerumeista ja sen kliinistä hyötyä kuin serologisen diagnostinen markkeri potilaille, joilla pahanlaatuisia kasvaimia.

Tässä tutkimuksessa spesifisyys saadun anti-CAXII-vasta varmistettiin immunohistokemiallinen (IHC ) ja immunoblottaus keuhkosyöpä solulinjat ja keuhkosyöpä kudoksia. Edelleen vahvistaa hyödylliseksi sero-diagnostinen markkeri, CAXII tasot potilaiden seerumeista keuhkosyöpä tutkittiin täpläbloteissa analyysi.

Materiaalit ja menetelmät

1. Solulinjat

A549 ja LC-2 /mainos soluja on peräisin keuhkojen AD ostettiin Japani Cancer Research Resources Bank (Tokio, Japani) ja RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japani), tässä järjestyksessä. Rerf-LC-AI-solut on peräisin keuhkojen SCC ostettiin RIKEN Bioresource Centerin. N231-solut, jotka ovat peräisin SCLC hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). LCN1, suuri solu neuroendokriini karsinooma (LCNEC) linja, perustettiin vuonna laboratoriossamme [14]. Nämä solut kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa (Sigma, Steinheim, Saksa), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Biowest, Miami, FL, USA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä ( GIBCO, Auckland, Uusi-Seelanti). Sadonkorjuun jälkeen ja pesun kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ilman kaksiarvoiset ionit (PBS: llä), subkonfluenteista soluja säilytettiin -80 ° C: ssa proteomiikan analyysiä tai kiinnitetty 10% formaliiniin ja upotettiin parafiiniin immunohistokemiaa. A549-solut myös Amex-kiinteä [15] immunohistokemiallista seulontaan. SP2 /O-Ag14-soluja, jotka ovat peräisin hiiren myelooma ostettiin RIKEN Bioresource Center ja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 1 x 8-atsaguaniinille (50 x Hybri-Max, SIGMA), 10% FBS: ää, penisilliini ja streptomysiiniä.

2. Etiikka selvitys

Kaikki näytteet kerättiin mukaisesti eettisten ohjeiden ja kirjallinen suostumus valtuudet, ja tämä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Kitasato University School of Medicine. Kaikki potilaat ja terveillä verrokeilla lähestyttiin perustuvat hyväksyttyjen eettisten ohjeiden, ja ne, jotka suostuivat osallistumaan tähän tutkimukseen oli allekirjoitettava suostumuslomakkeet. Potilaat voivat evätä pääsyn ja keskeyttää milloin hyvänsä. Kaikki osallistujat toimitti kirjallisen suostumuksen.

2.1. Sera.

Sera 70 sairastavilla potilailla keuhkosyöpä (AD: 29, SCC: 21, SCLC: 17, ja LCNEC: 3) ja 30 tervettä verrokkia käytettiin harjoitussarjassa. Lisäksi validointi määrittää koostuu seerumeista 26 potilailla, joilla on keuhkosyöpä (AD: 20, SCLC: 5, ja LCNEC: 1) ja 30 terveen kontrollin tutkittiin myös. Kliinis ominaisuudet potilaiden tiedoista esitetään yhteenveto taulukossa 1.

Potilaan seerumit kerättiin Kitasato University Hospital, ja terveisiin seerumit toimittanut Kyowa Medex Co., Ltd (Tokio, Japani) ja pidettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

3. Monoklonaalisten vasta-aineiden

A549 solulysaatti valmistettiin PBS: llä (-) käyttäen ultra-sonic homogenisaattoria (HY-50, SMT Company, Tokio, Japani). Viisi viikkoa vanhoja BALB /c-hiiret immunisoitiin intraperitoneaalisesti 50 mg märkä- paino A549 solulysaattia 500 ul: aan PBS: ää (-) 3 kertaa kahden viikon välein. Vasta-ainetiitteri testattiin IHC käyttämällä 100-kertaa laimennettu seerumit immunisoiduista hiiristä ensimmäisenä vasta-aineena Amex-kiinteä A549-solut. Kolme päivää ennen solufuusio, eläin, jolla on korkein tiitteri oli intraperitoneaalisesti kasvatti sama määrä A549 lysaattia. Hybridooman valmistelu ja IHC seulonta kanssa Amex-kiinteä A549-solut aiemmin kuvattu [4], [5].

4. Proteomiikka analyysi

4.1. Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE).

proteiinit uutettiin kustakin A549, LC-2 /ad, rerf-LC-AI, N231, ja LCN1 solut pesuaineen kanssa lyysipuskuria [16 ] käyttäen ultra-sonic homogenisaattorilla. Kymmenen ug kutakin uutettiin proteiineja keitettiin ja erotettiin SDS-PAGE: lla 10% polyakryyliamidigeelillä vakiovirralla 20 mA. SDS-PAGE, proteiinit geelit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) ja immunoblottauksella.

4,2. Immunoblottauksella.

pyyhkinyt membraanit blokattiin 0,5% kaseiinia naudan maitoa (Sigma, St. Louis, MO, USA) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kalvot sitten reagoimaan ei-laimennetun hybridoomasupernatantista 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen inkuboitiin 1000-kertaa laimennettu piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua kanin anti-hiiri-IgG polyklonaalisella vasta-aineella (Dako, Glostrup, Tanska), jossa 0,025% kaseiini 45 min huoneenlämpötilassa. Lopuksi signaaleja kehitettiin käyttämällä Immobilon Western HRP reagenssia (Millipore Corp.).

4.3. Määritys vasta-isotyypin.

määrittämiseksi isotyypin vakiintuneiden KU-Lu-5-vasta-aineen, käytimme IsoStrip ™ Mouse Monoclonal Antibody isotyypityskittiä (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden.

4.4. Immunosaostus.

immunosaostuksella menetelmää käytettiin tässä tutkimuksessa on aiemmin kuvattu [17]. Lyhyesti, A549-solut pestiin PBS: llä (-) ja käsiteltiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA), joka sisälsi Complete-Mini EDTA-vapaan (Roche Diagnostics), jäillä 30 minuutin ajan. Kun oli sentrifugoitu 15000 rpm: ssä 30 min ajan 4 ° C: ssa, supernatantti otettiin talteen ja esikirkastettiin proteiini G sepharose (50% liete) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) 4 ° C: ssa yön yli. Konjugoida ensisijainen vasta-aine, 250 ui primaarista vasta-ainetta (KU-Lu-5 hybridoomasupernatantista) ja 20 ui proteiini G Sepharose-helmiin suspendoitiin RIPA-puskurissa inkuboitiin sekoittaen 4 ° C: ssa yön yli. Sentrifugoinnin jälkeen vasta-aine-Sepharose-konjugaattia ja 500 ug solun kokonais-proteiinin esiselkeytettiin supernatantista inkuboitiin sekoittaen 4 ° C: ssa 4 tunnin ajan. Immunopresipitaatit kerättiin sentrifugoimalla 15000 rpm: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kun oli pesty neljä kertaa RIPA-puskurilla, supernatantti poistettiin huolellisesti, ja pelletit suspendoitiin uudelleen 15 ul: aan 1 x Laemmili puskurissa. Sitten, 15 pl näytettä keitettiin ja erotettiin SDS-PAGE: lla 10% polyakryyliamidigeelillä. SDS-PAGE, geelit olivat Zn-värjättiin Negative Gel Stain MS Kit (Wako Pure Chemical, Tokio, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden.

4.5. Tunnistaminen antigeenin proteiinin.

4.5.1. Geelissä ruoansulatusta.

Proteiini paikalla leikattiin irti SDS-PAGE-geelillä ja jauhettiin 1 mm

3, väri poistettiin värinpoistoliuos (Wako Pure Chemical), kuivattu 100% (v /v) ACN, ja kuivattiin tyhjiössä. Tryptinen digestio suoritettiin pieneen tilavuuteen ruoansulatusta, joka sisälsi 20 ng /ul trypsiiniä (Trypsin Gold, massaspektrometria Grade, Promega, Madison, WI, USA) ja 25 mM NH

4HCO

3: ssa 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen, sulaneen proteiinin fragmentit eluoitiin liuoksesta kerättiin, ja geelit pestiin kerran 5% (v /v) trifuloroacetic happoa /50% (v /v) ACN ja kerättiin samaan putkeen.

4.5.2. Proteiini tunnistaminen.

Kerätään peptidin fragmentit analysoitiin käyttämällä AUTOFLEX III matrix-liittyvä laserdesorptio /ionisaatio-lentoaika /lentoaika (MALDI-TOF /TOF-MS; Bruker Daltonik, Bremen, Saksa). Kertakäyttöinen levy, täplikäs α-syaani-4-hydroksikanelihappomatriisi näytteitä, ja PAC peptidi Calibstandard kalibrointia (Prespotted AnchorChip 96 asetettu Proteomiikka, Bruker Daltonik) käytettiin. Peptidi massa sormenjälkien (PMF) mitattiin, ja sitten muutama huiput saatu PMF oli edelleen mitattiin niiden tandem massaspektrit kuin vanhemman massoja. MASCOT (https://www.matrixscience.com) käyttäen IPI Human tietokanta (93289 sekvenssit; 36994704 jäämät), julkaistiin 03 toukokuu 2011 (https://www.matrixscience.com), käytettiin määrittämään proteiinien PMF ja tandem massa tiedot.

5. Immunoblot-analyysi yhdistelmä-CAXII proteiinin

Rekombinantti CAXII proteiinin ja Venus proteiini negatiivisena kontrollina GST-tag valmistettiin käyttäen vehnänalkion cell-free järjestelmä [18]. Neljätoista ug kutakin rekombinantti-CAXII ja Venus proteiinit keitettiin ja erotettiin SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus KU-Lu-5-vasta-aineen, kuten edellä 2.4.1.

6. Immunohistokemiallinen värjäys

Kolmen pm paksun kohdat, jotka on valmistettu 10% formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut keuhkosyövän solulinjat ja 37 kirurgisesti resektoitiin keuhkosyövässä (AD: 28, SCC: 9) poistettiin parafiini ksyleenillä, kostutetaan laskeva etanolissa, ja sitten käsiteltiin 3% vetyperoksidilla 20 min ajan. Sen jälkeen, kun antigeeni oli haettu autoklavoimalla 0,01 mol /l sitraatti- puskuria (pH 6,0), jossa oli 0,1% Tween 20 121 ° C: ssa 10 minuuttia, leikkeet saatettiin reagoimaan non-laimennettiin KU-Lu-5 hybridoomasupernatantista 16-18 h huoneenlämpötilassa (RT). Huuhtelun jälkeen TBS kolme kertaa 5 minuutin ajan kutakin, leikkeet saatettiin reagoimaan ChemMate Envision reagenssia (Dako) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Lopuksi leikkeet näkyviksi Stable DAB-liuoksella (Invitrogen Corp.) ja vasta- värjättiin Mayerin hematoksyliinillä.

7. Dot blot analyysi

7.1. Näytteen valmistus.

7.1.1. Poistamalla albumiinin ja IgG: n seeruminäytteistä.

Poistaminen albumiinin ja IgG seerumista suoritettiin käyttäen ProteoExtract Albumiini /IgG poisto kit (Merck, Darmstadt, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 60-ul: n näyte kutakin seerumia laimennettiin 540 ul: aan sitoutumispuskuria ja annettiin kulkea pylvään painovoimavirtauksella. Läpivirtaus kerättiin kokoelmaan putkeen. Pestä pylväs, sitomispuskuria annettiin kulkea kolonnin painovoimaista virtausta. Läpivirtausfraktio kerättiin samalla keruuputki.

7.1.2. Suolan poisto ja ultrasuodatuksella.

Albumin- ja IgG-köyhdytettyä näytteet olivat puskurivaihto ja konsentroidaan käyttäen 10 kDa molekyylipainoltaan cut-off ultra-suodatus VIVASPIN 2 (Sartorius, Göttingen, Saksa). Näytteitä sentrifugoitiin 6000 x g 4 ° C: ssa, kunnes alle 100 ui, ja sitten puskuri vaihdettiin PBS: llä (-), jossa pitoisuus on 6000 x g 4 ° C: ssa, kunnes konsentroitiin alle 50 ui. Konsentroitu näytteet säädettiin lopulliseen tilavuuteen 60 ui PBS: llä (-).

7,2. Dot blot-analyysi.

Yksi ui kutakin albumin- ja IgG-köyhdytettyä näytteitä laimennettiin 1:20 PBS: llä (-) ja hiiren IgG: tä (puhdistettu meidän laboratoriossamme) ja positiivisena kontrollina täpliksi PVDF-kalvolle (Millipore Corp.) automaattiset täpläbloteissa järjestelmä, jossa 256-kiinteä pin kokoonpano (Kakengeneqs Inc., Chiba, Japani). Kaksi arkkia kalvo valmistettiin yhdet kokeessa. Laikullinen kalvot pestiin TBS: ssa 10 minuuttia, ja blokattiin 0,5% kaseiinia (Sigma) 1 tunnin ajan RT: ssä. Yksi kalvo saatettiin sitten reagoimaan ei-laimennetun KU-Lu-5 hybridoomasupernatantista, ja toinen kalvo saatettiin reagoimaan vasta-aineen laimentavaa liuosta [20-kertaa laimennettuna 0,5% kaseiinia ja 0,1% Tween 20 lisättiin TBS (TBS-T)] 30 min huoneenlämpötilassa. Huuhtelun jälkeen TBS-T: 3 kertaa 5 minuutin ajan kutakin, membraaneja inkuboitiin 1000-kertaa laimennettu piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua kanin anti-hiiri-IgG-polyklonaalista vasta-ainetta (Dako) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Lopuksi signaaleja kehitettiin Immobilon Länsi reagenssilla (Millipore Corp.). Aineisto analysoitiin käyttämällä DotBlotChipSystem Ver. 4.0 (DYNACOM Co., Ltd., Chiba, Japani). Kukin normalisoitu signaali esitettiin suhteena positiivisen voimakkuuden verrattuna negatiiviseen taustan intensiteettiä.

8. Tilastollinen analyysi

Serum CAXII määrinä potilailla, joilla keuhkosyöpä ja terveillä verrokeilla analysoitiin tilastollisesti käyttämällä Mann-Whitney

U

-testissä. Herkkyys, spesifisyys ja ennustavan arvot laskettiin kanssa hautauspaikkoja ohjelmistopaketti (Ver. 9,42 for Windows) kunkin muuttujan vastaavan cut-off. Diskriminanttifunktio analyysi tehtiin luokitella potilaita ”keuhkosyöpää” vs. ”terve ohjaus” ryhmä, mukaan tilan biomarkkereiden käyttäen hautauspaikkoja ohjelmistopaketti. Alue käyrän alla (AUC) ja parhaiten rajakohta laskettiin käyttämällä vastaanotin toimii (ROC) analyysi. Tulokset pidettiin merkittävinä, kun

P

0,05.

Tulokset

1. Vahvistus vasta-ainetiitteri hiiren seerumeissa

vasta-ainetiitteri testattiin IHC kanssa 1000-kertaa laimennettu immunisoitujen hiirien seerumeissa, kun ensimmäinen vasta-aine on Amex-kiinteä A549-solut. Tämän seurauksena immunisoitujen hiirien seerumeista sisälsi vasta-aineita, jotka reagoivat eri komponenttien A549-solut.

käyttäminen Amex-kiinteä A549 valmisteet immunohistokemiallista hybridoomien seulonta, vihdoin perustettu 188 MoAbs yhteensä ja edelleen tutkimus suoritettiin KU-Lu-5-klooni, joka osoitti voimakasta värjäytymistä A549-solut (Fig. 1 A).

(A) Vasta-aineen tiitteri testattiin immunohistokemiallisesti käyttäen 1000-kertaa laimennettu immunisoitujen hiirien seerumeissa ensimmäisenä vasta-aineena Amex-kiinteä A549-solut, joita käytettiin immunogeeninä. Seerumeista immunisoitujen hiirien sisälsivät vasta-aineita, jotka reagoivat eri solun komponentteja, kuten nucleus (↑), solukalvon (▴), ja sytoplasmassa (↑↑). (B) Immunosaostus KU-Lu-5-vasta-aineen. Immunoblot-analyysillä käyttäen KU-Lu-5 hybridoomasupernatantista kuin ensimmäinen vasta-aine [kaista 1: A549-lysaattia, kaista 2: A549 lysaattia yhdistetty proteiini G, kaista 3: KU-Lu-5-vasta-aineen yhdistetty proteiini G, kaista 4: A549 lysaattia yhdistettynä KU-Lu-5-vasta-aineen]. Kaistat 2-3 ovat negatiiviset kontrollit, ja immunosaostettiin tuote KU-Lu-5-vasta-aineen havaittiin kaista 4 (↑). (C) Vahvistus tunnistettujen antigeenin proteiinin. KU-Lu-5-vasta-aineen reagoida rekombinantti CAXII proteiinia (64 kDa), mutta ei rekombinantilla Venus proteiinia.

2. Tunnistaminen antigeeniproteiinin

Jotta voitaisiin tunnistaa antigeeni proteiini tunnustettu KU-Lu-5-vasta-aineen, suoritimme IP kanssa lysaatti A549-soluja. Tulokset IP on esitetty kuviossa. 1 B, C. antigeeniproteiini havaittiin noin 40 kDa. Määrittämään antigeeniproteiini tunnustettu KU-Lu-5-vasta-aineen, me leikattiin ja keräsi paikalla Zn-värjättyä geeliä, ja eteni geelissä ruoansulatusta. Kun analyysi käyttäen MALDI-TOF /TOF MS ja MASCOT haku proteiini määritettiin isoformia 2 hiilihappoanhydraasi XII (CAXII, liittyminen: IPI00221392), joka koostuu 343 aminohaposta, jonka ennustettu molekyylipaino on 38384 Da. Tuloksena vahvistettiin immunoblot-analyysillä, jossa yhdistelmä-DNA-CAXII proteiini käyttäen KU-Lu-5 hybridoomasupernatantista ensimmäisenä vasta-aineena (Fig. 1 D). Immunoglobuliini isotyyppi KU-Lu-5-vasta-aineen määritettiin IgG

1, κ.

3. Immunoblot-analyysillä

Expression of CAXII havaittiin vain A549-soluja kuin noin 40 kDa: n proteiini, ja ei ole selvää detektoitiin muihin soluihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa (Fig. 2).

(A) immunoblottianalyysi CAXII keuhkosyövässä solulinjoissa. CAXII detektoitiin noin 40 kDa: n proteiini, jolla on A549-soluja. (B) immunovärjäys CAXII A549-solut (a), adenokarsinooma (b), ja okasolusyöpä (c) keuhkojen, ja jokainen osoitti kalvo värjäytymistä CAXII.

4. Immunohistokemiallinen värjäys CAXII

immunohistokemiallisesti, kalvo ilmentyminen CAXII havaittiin vain A549-solut (Fig. 2 B). Kalvomainen värjäytyminen havaittiin 2 28 ADs (7,1%) ja 2 9 SCC (22,2%) (Fig. 2 C, D).

5. Seerumin CAXII potilailla keuhkosyöpä

Seerumin CAXII tasot olivat merkitsevästi korkeammat keuhkosyöpäpotilaita kuin terveillä verrokeilla koulutukseen set (P 0,0001). Suhteelliset arvot seerumin CAXII vaihtelivat 0,101-4,01 (mediaani: 1.520) in keuhkosyöpäpotilaita, mutta 0,006-1,679 (mediaani: 0,290) myös terveiden (Fig. 3A). Keuhkosyövän, CAXII seerumin SCC potilailla olivat merkittävästi korkeammat kuin AD-potilaiden (P = 0,03) (Fig. 3 A). Alue ROC-käyrän alla (AUC) välillä keuhkosyövässä ja terveillä verrokeilla oli 0,794 (Fig. 3 B). Kun optimaalinen raja-arvo 0,387 varten CAXII haettiin, diagnostinen herkkyys ja keuhkosyöpään olivat 82,9 ja 70,0, vastaavasti, ja negatiivinen ja positiivinen ennustearvo arvot olivat 0,617 ja 0,863, tässä järjestyksessä. Lisäksi sisällä SCC, seerumin CAXII tasot olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla hyvin ja kohtuullisesti erilaistunut kasvaimia kuin huonosti erilaistuneet (P = 0,027) (Kuva. 4 A), ja näyttivät olevan suurempi potilailla, joilla on kasvaimen kokoa alle 3 cm sijaan yli 3 cm (P = 0,0538). Kuitenkin, ei ollut eroa tupakoinnin potilastietojen (Fig. 4 B). CAXII tasot vaiheen I, II ja III mainokset 1,501, 0,704, ja 1,001, vastaavasti, ja CAXII tasot vaiheen I, II ja III SCC olivat 1,764, 2,093 ja 1,854, tässä järjestyksessä. Nämä tiedot yhteenveto taulukossa 2. Ei suhteiden CAXII seerumin ja kasvaimen vaiheesta tai esiintyminen etäpesäkkeiden tunnistettiin joko mainosten tai SCC. Edelleen vahvistavat hyödyllisyys seerumin CAXII tasoilla kuin sero-diagnostinen markkeri, 56 lisänäytteitä seerumeista analysoitiin dot blot analyysin validointitutkimuksessa. Seerumin CAXII tasot olivat myös merkitsevästi suurempi keuhkosyöpäpotilaita kuin terveillä valvonnan validointi set (P = 0,030). Suhteelliset arvot seerumin CAXII vaihtelivat +0,000-+8,023 (mediaani: 3,921) in keuhkosyöpäpotilaita, mutta 0,000-8,331 (mediaani: 2,806) myös terveiden (Fig. 5). Kun optimaalinen raja-arvo 3,086 soveltavan, diagnostisen herkkyyden ja spesifisyyden keuhkosyövän olivat 65,4 ja 70,0, vastaavasti.

Serum CAXII määrinä potilailla, joilla keuhkosyöpä ja terveillä verrokeilla. (A) mediaani CAXII tasolla seerumeista terveillä verrokeilla oli 0,29, ja että seerumeista keuhkosyöpäpotilaiden oli 1,52. Seerumin CAXII tasot olivat merkitsevästi korkeammat keuhkosyöpäpotilaita (* P 0,001). Lisäksi seerumin CAXII tasot olivat korkeampia SCC kuin ADs (** P = 0,0381). (B) vastaanotin-ominaiskäyrän käyräanalyysi CAXII kuin seerumimarkkerina keuhkosyöpä. Vastaavat alueet käyrien alla olivat 0,794 varten CAXII. Kanssa 70,0% spesifisyys, herkkyys CAXII keuhkosyöpä oli 82,9%, klo raja-arvo, joka vastaa 0,387.

(A) CAXII tasot potilaiden seerumeista mainoksia ja SCC kanssa keskitytään lavalla ja erilaistumista. Vuonna SCC, CAXII tasot olivat merkitsevästi korkeammat hyvin ja kohtuullisesti erilaistunut kasvaimia kuin heikosti erilaistuneet (*** P = 0,0272). ADS, ei merkittävää eroa perustuu erilaistumiseen määrin havaittiin. (B) Tupakointi historia keuhkosyöpäpotilaita. Mediaani CAXII tasolla seerumeista tupakoimattomia oli 1,56, ja että tupakoitsijoilla oli 1,54, ei ilmene merkittävää eroa.

Vahvista hyödyllisyys seerumin CAXII tasoilla kuin sero-diagnostinen markkeri, 56 ylimääräistä seerumit analysoitiin dot blot analyysin validointitutkimuksessa. Seerumin CAXII tasot olivat myös merkitsevästi suurempi keuhkosyöpäpotilaita kuin terveillä verrokeilla (p = 0,030). Suhteelliset arvot seerumin CAXII vaihtelivat +0,000-+8,023 (mediaani: 3,921) in keuhkosyöpäpotilaita, mutta 0,000-8,331 (mediaani: 2,806) myös terveiden.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa, jonka tavoitteena on löytää käyttökelpoisia sero diagnostiset merkkiaineita keuhkosyövän, me tuotetaan monoklonaalisia vasta-aineita käyttämällä keuhkojen AD johdettuja A549-solut antigeeneinä. Saaduista 188 vasta, keskityimme tunnistavaa vasta-ainetta CAXII, ja tutkitaan sen kliinistä hyötyä kuin serologisen diagnostinen markkeri keuhkosyöpään. Tämä satunnainen immunisoinnin menetelmä odotetaan tuottavan vasta-aineita tuumoriin-spesifisten proteiinien translaation jälkeisiä modifikaatioita, joita on vaikea saada tavanomaisilla immunisaatio menetelmillä. Itse asiassa, useita tekijöitä ovat raportoineet, että monoklonaalisia vasta-aineita syntyy tällä menetelmällä, ovat käyttökelpoisia diagnostisia ja prognostisia markkereita syöpien [5], [17], [19]. Battke

et al.

[20] perustettiin 6A10 tunnistavaa vasta-ainetta CAXII käyttäen samanlaista immunisaation menetelmää. Kuitenkin saadut vasta-aineet rajoitu niihin vain reagoida solun pinta-antigeenit, koska käyttämällä virtaussytometria varten hybridoomien seulonta. Esillä olevassa tutkimuksessa, hybridoomat immunohistokemiallisesti seulottiin mikä helpotti saada vasta-aineita, jotka reagoivat kasvaimeen liittyvien proteiinien lokalisoitu useita sisäisiä soluosastoihin. CAS muodostavat perheen arjen entsyymien tärkeä rooli monissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa, jotka käänteisesti katalysoivat CO

2 + H

2O ja HCO

3

– ja H

+ , edistää sääntely solunsisäisen pH: [6] – [11], [19]. Useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet selkeä suhde korkea CAXII ekspressiotasot kasvainsoluissa sekä suotuisa ennuste.

Watson

et al.

[12] kertoi, että CAXII ilmaistiin 75% invasiivisen rintasyöpä tapauksissa ja merkitsevästi liittyä pienempi histologinen arvosana (P = 0,001), positiivinen estrogeenireseptorin tila (P 0,01), ja negatiivinen epidermaalisen kasvutekijän reseptori yliekspressio (P 0,001). Käyttämällä univariate analyysi, CAXII-positiiviset kasvaimet olivat yhteydessä vähemmän relapseja (P = 0,04) ja parempi käyttöjärjestelmä (P = 0,01). Toisaalta, vaikka 98% astrocytomas oli immunohistokemiallisesti positiivisia CAXII korkeampi CAXII ilmentymistasot korreloivat korkeammalla histologinen arvosana ja huonompi potilaiden hoitotuloksiin joko yhden muuttujan (P = 0,010) tai monimuuttuja (P = 0,039) eloonjääminen analyysi [ ,,,0],9].

immunohistokemiallisessa tutkimuksessa ilmentymisen CAXII keuhkosyövän raportoitiin Ilie

et al.

[13]. CAXII yli-ilmentyminen havaittiin 105/555 tapauksissa ja merkitsevästi liittyvä parempi eriyttäminen (P = 0,015) ja SCC histologinen tyyppi (P 0,001). Lisäksi korkea CAXII ilmentyminen myös korreloi merkitsevästi paremmin yleistä ja tautikohtaista selviytymistä. Meidän tulokset, CAXII tasot olivat korkeammat seerumeista SCC potilaista kuin ADs (Fig. 3A). Lisäksi ne korreloivat suotuisammin kanssa erilaistumista (Fig. 4). Integrointi nämä tulokset, CAXII voi paitsi olla ehdokkaana kudos merkki, mutta myös serologisen diagnostinen markkeri keuhkosyöpään.

Vaikka yhdistyksen CAXII ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä ja potilaiden hoitotuloksiin eri kasvaimissa on raportoitu, tietojemme mukaan mikään tutkimus koskee seerumin CAXII proteiinin tasot tai sen autovasta tasot potilailla, joiden kasvaimissa on raportoitu.

vahvista mahdollisuutta CAXII kuin sero-diagnostinen markkeri, mittasimme sen seerumin potilailla keuhkosyöpä ja terveillä verrokeilla. Olemme osoittaneet, että CAXII proteiini virtasi ulos seerumista ja sen tasoa potilailla, joilla on keuhkosyöpä oli merkittävästi korkeampi kuin terveillä verrokeilla sekä harjoitussarjassa (P 0,0001) ja validointi setti (P ​​= 0,030). On mahdollista, että aukon P-arvon välinen koulutuksen asetettu ja validointi asettaa johtuu siitä, että seerumin CAXII SCC potilaat olivat yleensä suuremmat kuin potilailla, joilla muiden histologialtaan, ja validointi joukon mukana ei SCC tapauksessa . Yhdessä seerumin CAXII tasojen pitäisi soveltaa markkereita erotteleva keuhkosyöpä potilaita terveisiin kontrolleihin. Tällä hetkellä, CT tai rintakehän röntgenkuvaus on tärkein menetelmä keuhkosyövän seulonnan [21]. Mazzone et ai. ehdotti, että veri ja hengitys testejä olisi sisällytettävä myös keuhkosyövän seulontaa, koska molemmat ovat helppoja suorittaa ja ilman riskejä testi hallinto [21], [22]. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin CAXII tasot seerumista keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla käytetään monoklonaalista, ja tuloksemme ehdotti, että seerumin CAXII taso oli hyödyllinen sero-diagnostisen markkerin keuhkosyöpään.