Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Amerikassa. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat varteenotettava hoitovaihtoehto estämällä syövän kasvua. Kasvainspesifisen lääkeaineen voidaan saavuttaa käyttämällä näitä monoklonaalisia vasta-aineita kohdistaminen aineina. Tämäntyyppinen suunnittelija terapeuttinen kehittyy ja käyttämällä kultananopartikkeleilla se on lupaava lähestymistapa valikoivasti toimittaa kemoterapeuttisten pahanlaatuisia soluja.

Kultananohiukkasia (BKTL) osoittavat äärimmäistä lupaus nykyisen lääkkeiden tutkimukseen. BKTL on osoitettu ei-invasiivisesti tapon kasvainsolujen hypertermian avulla radiotaajuudella. Niitä on myös toteutettu varhaisen havaitsemisen aineina johtuen niiden ainutlaatuisen röntgen- kontrasti ominaisuuksia; menestystä paljastettiin rajattu selvästi verta kapillaareja prekliinisessä mallissa CT (tietokonetomografia). Perustavanlaatuinen parametrit älykkään suunnittelun nanoconjugates ovat eturintamassa. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on määritellä tarvittavat suunnitteluparametrit menestyksekkäästi kohdistaa haiman syöpäsoluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

nanoconjugates kuvattu tässä tutkimuksessa karakterisoitiin erilaisten fysikaalis-kemiallisia tekniikoita. Osoitamme, että määrä setuksimabin molekyylejä (kohdistamisaineena) on BKTL, hydrodynaaminen koko nanoconjugates, saatavilla reaktiivinen pinta-ala ja kyky nanoconjugates eristämään EGFR (epidermaalisen kasvutekijän reseptori), kaikki kriittisiä rooleja tehokkaasti kohdistaminen kasvainsolut

in vitro

ja

in vivo

käytettäessä potilaalle tehdä mallin haimasyövän.

Johtopäätös

tulokset viittaavat kohdentaminen kasvainsolujen riippuu on useita tärkeitä komponentteja 1) kohdistamisaineena nanohiukkasten suhde 2) saatavuus reaktiivisen pinnan alue nanohiukkasten 3) kyky nanoconjugate sitoa kohteena ja 4) hydrodynaaminen halkaisija nanoconjugate. Uskomme, että tämä tutkimus auttaa määrittelemään suunnittelun parametrit muotoilla paremmin strategioita erityisesti suunnattu kasvainten nanohiukkasten konjugaatteja.

Citation: Khan JA, Kudgus RA, Szabolcs A Dutta S, Wang E, Cao S, et al . (2011) Suunnittelu Nanoconjugates tehokkaasti Target haimasyöpäsoluissa

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e20347. doi: 10,1371 /journal.pone.0020347

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 joulukuu 2010; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2011; Julkaistu: 27 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Khan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health CA135011, CA136494, CA150190 ja MD Anderson Cancer Center Developmental Grant (UTMD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä vaatii lähes 25% kuolemista vuosittain. Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Amerikassa, sekä miehillä että naisilla. Huolimatta valtava pyrkimyksiä havaita ja hoitaa haimasyöpä, ilmaantuvuus ja kuolleisuus pysyy lähes samana. Varhainen diagnoosi ja tehokasta antamista terapeuttisten aineiden pahanlaatuisia soluja edelleen kaksi suurta haastetta syövän strategiat [1].

monoklonaalisia vasta-aineita vastaan, kasvutekijän reseptorit on osoitettu olevan kannattavaa hoitoja inhiboimaan syövän kasvua [2] . Hyödyntämällä näitä monoklonaalisia vasta-aineita kohdentamisaineita varten kasvainspesifin toimitus on kehittymässä lupaavaksi valikoivasti toimittamaan kemoterapeuttisia [3]. Epäorgaaniset nanomateriaalit tutkitaan kuin toimitus ajoneuvon kohdennettua lääkeannostelun. Gold nanomateriaalit ovat erityisen kiinnostavia johtuen ainutlaatuisesta fysikaalis-kemialliset ja optoelektroniset ominaisuudet, synteesin helppous ja pinnan muutos [1], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10], [11], [12], [13].

Kultananohiukkasia (BKTL) on hiljattain käytetty tappamaan kasvainsoluja kuume käyttämällä ei-invasiivisia radiotaajuisen [14]. Heidän apuohjelma varjoaineena on myös osoitettu rajattu selvästi verta kapillaareja prekliinisessä mallissa CT (tietokonetomografia) verrattuna tavanomaiseen jodia varjoaineilla [15]. Molemmat tutkimukset ovat toiveikkaita ja niiden hyödyllisyys on edelleen rohkaisevana turvallisuusprofiili [16], [17].

kasvutekijän reseptorin (EGFR) on tärkeä tavoite syöpätutkimukseen. Se on yli-ilmentynyt useissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien haimasyövän. Ihmisen EGFR on läpäisevä glykoproteiini [3], [18], [19], [20]. Se koostuu ekstrasellulaarisen ligandia sitova domeeni, hydrofobinen transmembraanidomeeni, ja solunsisäinen tyrosiinikinaasidomeeni. Ligandin sitoutumista EGFR indusoi reseptorin homo /heterodimerisaatio, joka johtaa fosforylaatioon tyrosiinitähteitä. Fosforylaatio EGFR aktivoi monimutkaisten alavirran signalointia johtavien tapahtumien jakaantumiseen, kulkeutumiseen, invaasio, ja estämällä apoptoosin syöpäsoluissa [21], [22], [23].

monoklonaalinen anti-EGFR-vasta-aine setuksimabi (C225), on ainutlaatuinen kohdentaminen aine kohdistaa EGFR-positiivisten syöpäsolujen. Setuksimabia hyväksynyt FDA hoitoon potilailla, joilla on EGFR positiivinen peräsuolen syöpä (CRC) [21], [22], [23]. On myös joko hyväksytty tai on eri vaiheissa kliinisten tutkimusten monissa muissa syöpäsairauksista, kuten NSCLC (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä), SCCHN (levyepiteelikarsinooma pään ja kaulan) ja haimasyövän [24], [25] , [26]. Setuksimabi on kimeerinen human:murine immunoglobuliini G1 (IgG1) monoklonaalinen vasta-aine (MoAb). Sitominen C225 on EGFR johtaa reseptoriin sisäistämistä ja hajoamista ilman reseptorin fosforylaation, estäen siten EGFR-liittyvä reittejä [24], [25], [26].

Huolimatta kehittyvien hyödyllisyyttä BKTL kohdistetuissa toimitus perustavanlaatuinen kysymykset jäävät vaille vastausta. Mitkä ovat mitoituskriteerit valmistamiseksi nanoconjugates että varmistetaan mahdollisimman otto syöpäsoluja? Tässä käytämme setuksimabi (C225) kohdistamisaineena ja BKTL mallina järjestelmän. Osoitamme, että määrä C225 vasta-aineiden bruttokansantuloon (C225:GNP suhde), hydrodynaaminen koko, käytettävissä oleva reaktiivinen pinta-ala ja kyky nanoconjugate eristämään EGFR, kaikki kriittisiä rooleja tehokkaasti kohdistaminen kasvainsoluissa

vuonna vitro

ja

in vivo

käytettäessä potilaalle tehdä mallin haimasyöpä. Otto tutkimukset isotyyppikontrollia, BKTL-IgG, osoittavat, että spesifisyys kasvainsolun kohdistaminen on riippuvainen nanohiukkasten pinnalle kattavuus C225. Epäspesifinen pienenee, kun C225 BKTL suhde kasvaa. Nämä tutkimukset ovat kriittisiä kehittää tehokas kohdennettu jakelujärjestelmä tulevaa kliiniseen käyttöön.

Työ Tässä esitetty osoittaa systemaattinen luonnehdinta BKTL-C225 nanoconjugates. Erityinen potentiaalisia tutkittiin, sekä

in vitro

ja

in vivo

käytettäessä potilaalle tehdä mallin haimasyöpä. Tuloksemme osoittavat, että hydrodynaaminen säde, pääsee reaktiivinen pinta-ala ja kuormauskapasiteetti C225 on BKTL kriittisiä rooleja tehokkaaseen kohdentamiseen syöpäsoluja. Nämä havainnot korostavat keskeisiä parametreja voidaan harkita lupaavana nanohiukkasten perustuva lääkeannostelun järjestelmä tulevia kliinisissä sovelluksissa.

Tulokset

karakterisointi nanoconjugates vaihtelevalla vasta-nanohiukkasten suhteet

jotta ymmärtää tarvittavia parametreja kohdentaminen nanoconjugates tuumorisoluihin, valitsimme setuksimabi (C225) kohdistamisaineena. C225 on kimeerinen ihmisen ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu solunulkoiseen domeeniin EGFR [3]. EGFR yli-ilmentyy useissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien haimasyövän, jolloin se houkutteleva kohde [18]. Määrittää optimaalisen valenssin C225 on BKTL (lukumäärä C225 molekyylien kohden BKTL ja siten C225:GNP suhde) solunsisäiseen oton, syntetisoimme erilaisia ​​nanoconjugates useita C225:GNP tunnusluvut. Luonnehdinta näiden nanoconjugates suoritettiin käyttämällä useita fysikaalis tekniikoita: UV-Visible (UV-Vis) spektroskopiaa, transmissioelektronimikroskopia (TEM), dynaaminen valonsironta (DLS) ja radiojodaus C225 kanssa

125I. BKTL: sta käytetään tässä tutkimuksessa syntetisoitiin pelkistämällä natriumboorihydridillä tetrakloroauraatti [27], [28]. Kuten aiemmin on raportoitu, että läsnä on pintaplasmoniresonanssilla kaista ca. 510 nm vahvistaa muodostumista pallomaisen kultananopartikkeleilla (kuva S1). Muodostumista pallomaisia ​​BKTL ja 5 nm: n halkaisija vahvistettiin edelleen TEM (tuloksia ei ole esitetty).

BKTL-C225-konjugaatit syntetisoitiin sitten käyttäen tätä paljaalla BKTL-liuosta ja puhdistettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät osiossa. Vasta-aine spontaanisti sitoutuu BKTL kautta Au-S ja Au-N liimaus [19]. Tuotanto BKTL-C225 seurattiin UV-Vis-spektroskopialla. On ilmeistä, että lisäämällä C225 on asteittain punaisen muutos SPR kaistan paljain kultaa, 510 nm 519 nm (kuvio 1 a). Tällainen punainen muutos SPR kaistan BKTL ehdottaa häiriön sähkö- kaksinkertaisen kerroksen, jonka vasta-aine, joka ympäröi BKTL ja siten osoittaa vasta-aineen sitoutumisen, että nanohiukkaset [29], [30].

. Muutos absorptiomaksimit funktiona lisääntyvä keskittyminen C225 puuttuessa (aloilla) ja NaCl: n läsnäolossa (kolmiot). b. Pitoisuus C225 sidottu BKTL funktiona lisääntyvä keskittyminen C225, määritetään mittaamalla pitoisuus vapaan C225 merkitty I125 supernatantissa, pelletoinnin jälkeen alas BKTL-C225 konjugaatteja ultrasentrifugaatiolla.

edelleen vahvistaa BKTL-C225 konjugaatio me haastoi nanoconjugates vastaan ​​suolan aiheuttamaa aggregaatiota (kriittinen hyytymistä pitoisuus). Lisäämällä 140 mM NaCl on raportoitu aiheuttavan yhdistäminen alasti tai osittain katettu hiukkasia esimerkiksi yhdistäminen johtaa dramaattiseen punainen muutos SPR kaistalla. Imeytymistä spektrit nanoconjugates rekisteröitiin 15 minuutin inkubaation jälkeen 140 mM natriumkloridia (NaCl). Kuten odotettua, paljaalla BKTL osoitti jyrkkä punainen muutos SPR kaistalla 510 nm noin 600 nm (kuva 1a) vahvistaa yhdistäminen kattamattoman nanohiukkaset [31]. Salt aiheuttama aggregaatio liittyy suoraan lisääntynyt lastaus C225 BKTL pinnalla, joten SPR bändi kokonaan hävinnyt klo C225 BKTL suhde 3 (kolme C225 molekyyliä BKTL), mikä viittaa puuttuessa käytettävissä reaktiivisen pinnan suolan aiheuttamaa aggregaatiota.

kvantifiointi C225 sitoutumisen kultaa nanohiukkasia -radiojodausreagenssi-

sitominen C225 ja BKTL kvantitoitiin käyttäen radioaktiivisesti

125I-C225. Kiinteä pitoisuus BKTL inkuboitiin

125I-C225 eri C225:GNP suhteissa. Konjugaatit sentrifugoitiin suurella nopeudella (45000 g) 1 tunnin ajan erottaa sitoutumattoman vasta-aineen nanoconjugates. Tehokkuus BKTL-C225-I

125 sitoutuminen määritettiin sitten mittaamalla päästöjen gammasäteily peräisin vapaan ja sitoutuneen

125I-C225 supernatantissa ja pelletti jakeet, vastaavasti. Kuten kuviossa 1b ja kuviossa S2, oli hyvin korkea sitoutuminen prosentteina C225 (~90%) ja BKTL jopa suhteessa 3 (3 C225 molekyyliä BKTL). Kuitenkin minimaalinen lisäys sitova havaitaan edellä suhteella 3. Tämä pieni nousu korkeissa vasta-aineiden pitoisuudet saattavat johtua heikko epäspesifinen proteiini-proteiini vuorovaikutukset sidotun ja vapaan vasta-aineen. Nämä tiedot vahvistavat edelleen tekemät havainnot UV-Vis-spektroskopialla edellä; jossa laajuus suolan indusoiman aggregaation havaittiin olevan vähäinen suhteessa 3.

Kohdennettu toimitus kultananopartikkeleilla haimasyövän soluja in vitro

roolin ymmärtämiseksi monivalenssinen on solunsisäisen otto ihmisen haimasyövän solulinjoissa vaihtelevalla EGFR, käsittelimme AsPC-1, PANC-1 ja MiaPaca-2-solujen BKTL-C225 tai epäspesifinen isotyyppikontrollia BKTL-IgG eri vasta BKTL (Ab:GNP) suhteet. EGFR näissä soluissa seuraa järjestyksessä AsPC-1≥PANC-1 MiaPaca-2 [19]. Määrä soluunottoa BKTL-C225 ja BKTL-IgG Eri solulinjojen kvantitoitiin määrittämällä kultapitoisuus soluissa kautta instrumentaalinen neutroniaktivointianalyysin (INAA). Kuviot 2a, 2b ja 2c ovat kultapitoisuus AsPC-1, PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa, vastaavasti. On ilmeistä luvuista, että otto nanoconjugates kaikissa kolmessa solulinjoissa vähitellen kasvaa yhä C225:GNP suhde (lisääntynyt valenssi). Suurin sisäänotto havaittiin 1,5 suhde (mustat palkit); pidemmälle suhde yleistyminen nanoconjugates vähitellen. Kertymäkäyrä trendi nanoconjugates noudattaa samanlaista mallia kaikissa kolmessa soluissa riviä. On myös tärkeää huomata, että laajuus otto oli paljon vähemmän vastaavan suhteet isotyyppikontrolleja, BKTL-IgG (harmaat palkit). Mielenkiintoista on, että epäspesifinen BKTL-IgG laski asteittain kasvaessa IgG:GNP suhde, jossa vähintään sisäänotto havaittiin suhde 3. On todennäköistä, että alemmalla Ab:GNP suhde, käytettävissä oleva vapaa reaktiivinen pinta-alue BKTL voivat epäspesifisesti sitoutuvat joko seerumin proteiineihin tai solukalvot tai molempia; mikä puolestaan ​​voi edistää epäspesifinen on nanoconjugates. Adsorptio seerumin komponenttien tiedetään vaikuttavan ottoa BKTL [32]. Lisääntyvä Ab:GNP suhteen olisi lisätä vasta kattavuus nanohiukkasten pinnan, mikä tarjoaa vähemmän avoin pinta-ala käytettävissä epäspesifisten vuorovaikutusten. Vähentäminen tällaisten epäspesifisten vuorovaikutusten voisi selittää imeytyminen vähentyneen BKTL-IgG konjugaattien havaittu suuremmilla suhteilla (kuvio 2).

a. AsPC-1 solut, b. PANC-1-solut, c. MiaPaca-2-soluissa, käsiteltiin BKTL-C225 (mustat palkit) tai BKTL-IgG (harmaat palkit) valmisteltu eri Ab:GNP suhteissa. Y-akseli edustaa Gold pitoisuus ppm koko kuivamassaa soluja.

sisäistäminen on nanoconjugates haiman syöpäsoluja in vitro

edelleen varmistamiseksi solunsisäistä ottoa ja lokalisointi BKTL, TEM-analyysi suoritettiin sen jälkeen, käsittelemällä solut samalla nanoconjugates käytetään oton tutkimuksia. Kuvio 3 esittää TEM micrographs AsPC-1-solujen hoidon jälkeen BKTL-C225 vaihtelevilla C225:GNP suhteissa. Pieni, keskisuuri ja korkea suurennus kuvia edustaa C225:GNPs suhteilla 0,38, 1,5 ja 3,0 (kuva 3). Nanoconjugates näkyvät sisällä vesicular rakenteiden solujen, vahvistaa solunsisäistä sisäänottoa nanoconjugates. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös PANC-1 ja MiaPaca-2-solut (kuviot S3, S4). Ero otto BKTL syöpäsolut, joilla on erilaiset C225:GNP suhde voi johtua ero affiniteetti nanoconjugates sitoa EGFR, tai koko nanoconjugates. Mielenkiintoista on, että kun sama solulinjoja käsiteltiin BKTL-IgG, isotyyppikontrollia, useimmat BKTL löytyvät kehällä solukalvon minimaalisella endosytoosin (kuvio S5). Tämä vastaa hiljattain raportin, jossa kuvataan kohdentaminen kiinteän kasvaimen transferriinin päällystetty BKTL [33].

TEM kuvia eri suurennoksilla, osoittaa sisäistäminen BKTL-C225. Katso kuviot S3 ja S4 TEM kuvia havainnollistaa BKTL-C225 sisäistämisen by PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa.

Hydrodynamic halkaisija nanoconjugates ja niiden kyky sitoa EGFR

yrittäessään saada mekanismi ero ottoa BKTL-C225, me arveltu, että erilaiset C225:GNP suhteet hallussaan ero kyky sitoa EGFR. Validoida Tämän hypoteesin, suoritimme western blot-analyysi. Eri BKTL-C225 ja BKTL-IgG-konjugaatteja inkuboitiin AsPC-1 solulysaateista 2 h, sitten sentrifugoitiin suurella nopeudella. Pelletti pestiin kerran, ja sitten supernatantti ja pelletti alistettiin western blot -analyysi havaita suhteellisen läsnäolon EGFR eri fraktioissa. Tulokset on esitetty kuviossa 4a. Tämä osoittaa selvästi on etenevä köyhtyminen EGFR supernatantissa kun yhä C225:GNP suhde (keskimmäinen paneeli). Myös mielenkiintoista huomata rikastuminen EGFR pellettifraktioon (ylempi paneeli) saavuttaa tasanteen suhteessa 1,5-2,29, todennäköisimmin funktiona C225 kuormituksen pelletin pinta. p-aktiini tasot käytettiin lastaus valvonta osoittavat yhtä suuri lastaus proteiinia eri kaistoilla. On myös tärkeää huomata, että kun sama lysaatit käsiteltiin BKTL-IgG, tuskin havaittavia EGFR havaittiin pellettifraktioon, useimmiten todettiin supernatanttifraktiossa, edelleen vahvistaa sitovan spesifisyyden BKTL-C225 on EGFR. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että BKTL-C225 konjugaatteja voidaan nimenomaan eristää EGFR solulysaateista ja Eristävän kyky kasvaa yhä enemmän C225 molekyylien BKTL pinnalla.

a. Sitovat BKTL-C225 ja BKTL-IgG EGFR tarkastettava Western Blot analyysi. Solulysaatteja AsPC-1-soluja inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa BKTL-C225 ja BKTL-IgG-konjugaattien kanssa eri suhteissa vasta-aineen pinnalla hiukkasen. Inkuboinnin jälkeen näytteet sentrifugoitiin suurella nopeudella, ja supernatantti otettiin talteen ja pelletti pestiin kerran ja sentrifugoidaan uudel- leen; nanoconjugate osa oli 20-kertainen pitoisuus supernatantissa. Pelletti ja supernatantti fraktiot ladattiin 7,5% SDS-PAGE-geelillä ja analysoitiin EGFR. b. Hydrodynaaminen halkaisija on BKTL-C225 mitattuna dynaamisella valonsironnalla spektroskopia.

Kyky nanoconjugates eristämään EGFR kanssa C225:GNP suhde 1,5-3 on samanlainen; kuitenkin

in vitro

solunsisäistä ottoa pienenee suhde muuttuu 1,5 3. selittää laskeva ottoa nanoconjugates kasvavalla C225:GNP suhde, tutkimme rooli hydrodynaaminen halkaisija on nanoconjugates . Hydrodynaaminen halkaisija (HD) konjugaattien määritettiin dynaamisella valonsironta-spektroskopia (DLS) mittaukset (kuvio 4b). Äskettäin HD on osoitettu olevan kriittisiä kasvaimeen kohdistaminen kvanttipisteiden [34]. Lisäksi on myös osoitettu, että

in vitro

soluunottokokeissa ja vastaus riippuu koosta nanoconjugates. Kun konjugaatio 0,38 C225:GNP suhde HD on BKTL heti nousee 7 nm 21 nm, edelleen vahvistaa sitoutuminen C225 BKTL pintaan [35]. HD edelleen noin 21 nm, kunnes suhde 2,29 sitten jyrkästi kasvaa suhteessa 3. On huomattava kuvioista 1b ja S2 että lähes kaikki vasta-aine-molekyylit pysyvät sitoutuneina BKTL pinta jopa suhde 3. Kuitenkin, siellä on vain asteittainen nostaminen sitova yllä tätä suhdetta, todennäköisesti johtuu epäspesifisen sitoutumisen. Tämä ei-spesifinen vasta-molekyylit voidaan aiheuttaa muodostumista löysä sekundäärikerroksen noin BKTL-C225 tuloksena jyrkkä nousu HD suuremmilla C225:GNP suhteilla. Tällainen jyrkkä nousu HD voisi johtua myös epäyhtenäisyyttä näytteen. Saamiseksi diskreetti määrä vasta-ainemolekyylien per BKTL on hyvin vaikea saavuttaa kokeellisesti. Suhde monivalenssinen nanohiukkasten niiden hydrodynaamisten halkaisijat on tutkittava tarkemmin. TEM-analyysi vahvisti, että jyrkkä kasvu HD ei johdu aggregaatiota nanohiukkasia. TEM micrographs ei osoittanut mitään merkittävää aggregoitumista nanohiukkasten eri C225:GNP suhteilla (kuvio S6).

Toimitus BKTL-C225 käytettäessä potilaalle tehdä malli haimasyövän

tutkimiseksi edelleen kyky näiden nanoconjugates nimenomaan kohdistaa kasvainsoluihin

in vivo

, käytimme ortotrooppinen haimasyöpä malli. Malli luotiin jälkeen kirurgisesti implantoida AsPC-1 solut, jotka ilmentävät lusiferaasia haimaan nude-hiirten ja annettiin kasvaa 12 päivää. Joka kolmas päivä hiiriin injektoitiin 200 ul: lla ketamiinia ja 100 ui lusiferiinia ja kuvattavan kasvaimen kasvun etenemisen bioluminesenssitekniikalla measurments. Tämä ortotooppisten malli pyrkii matkimaan ihmisen patogeneesissä haimasyövän [36] ja sallii kasvainsolujen kokea vaikutuksia mikroympäristön haimassa. Päivänä 12, BKTL-C225 ja BKTL-IgG annettiin i.p. tutkia kasvaimeen ja jakelu nanoconjugates, joilla on erilaiset Ab:GNP suhteet. Hiiret tapettiin 24 h kuluttua nanoconjugate injektion ja kasvaimia ja muita elintärkeitä elimiä kerättiin määrittämiseksi kultaa sisältöä INAA. Kuvio 5a esittää edustava esimerkki bioluminenssin kuvan hiirien 12 päivää sen jälkeen, kun potilaalle tehdä istutuksen kasvainsolujen haimaan (ylempi paneeli). Vahva bioluminesenssi ehdottaa muodostumista ja kasvua kasvain haimassa. Kasvaimen kasvu vahvistettiin lisäksi mittaamalla kasvaimen koko lopussa kokeiden jälkeen uhrataan hiiret (alempi paneeli). Kasvaimen koko mitattiin käyttäen kaavaa ab

2/2 (a = pituus, b = leveys) oli ~62 mm

3, kun nanoconjugates annettiin varten biologinen jakautuminen tutkimuksiin. Kuvio 5b esittää kasvaimen ottoa BKTL-C225 ja BKTL-IgG vaihtelevilla Ab:GNP suhteissa funktiona kultapitoisuus määritetään INAA.

in vivo

ja

in vitro

kasvaimeen otto nanoconjugates seurasi samaa kaavaa. Tilastollinen analyysi käyttäen kaksisuuntainen opiskelijoiden t-testi osoitti, että otto BKTL-C225 suhteella 0,76 ja 1,5 olivat huomattavasti korkeampia kuin suhde 3 (p 0,05). Lisäksi ottoa BKTL-C225 konjugaattien oli merkitsevästi korkeampi (p 0,05) kuin isotyyppikontrollia, BKTL-IgG ollenkaan suhteilla paitsi 3. Kuten aiemmin mainittiin, HD BKTL-C225 pysyi vakiona suhde 0,38 2,29 (noin 21 nm), mutta lisääntynyt dramaattisesti suhteessa 3 (134 nm). Teoriassa suurempi HD on nanoconjugates suhteessa 3 voisi osaltaan laskea levittämistä ja puolestaan ​​väheneminen oton [37]. Tämä osoittaa, että HD on kriittinen tekijä

in vivo

oton ja näin ollen keskeinen tekijä aktiivisen kohdentamista. Jotta voitaisiin edelleen tutkia kasvaimeen (solujen sisällä, tai verisuonistoon tai kapselin ulkopuolella kasvainkudoksen) sijainti nanoconjugates, teimme TEM kasvaimen kudokset kuviossa 5a, joka saatiin sen jälkeen, kun uhrataan hiiret 24 h post intraperitoneaalisesti eri nanoconjugates. Kuvio 6 esittää sijainnin BKTL eri alueilla kasvainkudoksessa tapauksessa BKTL-C225 (C225:GNP 3,0 (kuvio 6a ja b) ja 1,5 (kuvio 6c) käsiteltyjen ryhmien. On ilmeistä, että BKTL ovat solujen sisällä ( Kuva 6a, vasen ja oikea paneelit ovat kuvia samalla alueella, eri suurennus) sekä kapseli kattaa kasvainkudoksen (kuva 6b, vasen ja oikea paneeli ovat kuvia samalla alueella, eri suurennus). kuitenkin nanoconjugates ovat enimmäkseen lokalisoitu ulkopuolella kasvainkudoksen tapauksessa BKTL-IgG hoidetussa ryhmässä (IgG:GNP 1,5) (Kuva S7).

a. Bioluminescence kuvia päivä 12 kuvaa kasvaimen läsnäolo (yläpaneeli) ja digitaalikamera kuvat (pohjapaneeli) kasvaimen massojen irrotettiin päättymisen jälkeen hiirten edellä. hiiret tapettiin päivänä 13, 24 tunnin kuluttua nanoconjugate hoitoja. b.

In vivo kasvaimeen

ottoa BKTL-C225 ja BKTL-IgG konjugaattien on eri suhteissa vasta, 24 h sen jälkeen, kun intraperitoneaalisen injektion konjugaattien osaksi ortotooppisten mallin haimasyöpä. Ottoa määritettiin mittaamalla kullan pitoisuus kasvaimia INAA. Y-akseli edustaa kultapitoisuus ppm.

a ja b. BKTL-C225 kanssa 3.0 suhde Ab:GNP näkyvät vasemmalla on pieni suurennus näyttää suuren pinta-alan kasvainkudoksen ja oikealla suurennus kasvaa valaista sisäistämisen konjugaattien itse. c. BKTL-C225 kanssa 1.5 suhde Ab:GNP näkyvät vasemmalla matalan suurennos kertoo suuren pinta-alan kasvainkudoksen ja oikealla suurennus kasvaa paljastaa konjugaattien itse sisällä solujen tilaa.

läsnäolo ruiskutetaan konjugaatteja muiden tärkeiden elinten määritettiin myös INAA (kuvio S8). Kulta oton havaittiin myös muissa elimissä, kuten perna, maksa, keuhkot, munuaiset ja aivot [38], [39].

Keskustelu

Kohdennettu toimitus epäorgaanisten nanomateriaalien on keskeinen alue tutkimuksen varten nanolääketieteen. Ainutlaatuiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet epäorgaanisista nanomateriaaleja voidaan käyttää useita biolääketieteen sovelluksissa, kuten tunnistus /diagnoosin, hoidon ja kuvantaminen. Näin ollen on tärkeää määrittää suunnittelun parametrien erityisesti toimittaa nanoconjugates soluihin etua. On olemassa useita keskeisiä tekijöitä, jotka voivat määritellä onnistumisen kohdennettujen toimituksen; (I) valita sopiva malli tutkia toimituksen lähestymistapa; (Ii) valinta tehokas kohdentaminen agent; (Iii) optimointi määrää kohdentamisaineita kohti nanohiukkasten; (Iv) saatavuus vapaata reaktiivista alueen partikkelin pinnalla, joka voi käynnistää ei-spesifinen sitoutuminen; (V) kyky kohdistamisaineena sekvestroiden kohde ja (vi) hydrodynaaminen koko nanoconjugates.

Useimmat antostrategioita testataan kuin potilaalle tehdä malleja, joissa kasvaimet syntyvät kaukana alkuperäisestä sivustosta. Merkittävä etu tässä mallissa on kasvaimet ovat helppo kehittää ja kasvua voidaan seurata manuaalinen mittaus työntömitta. Haittana tässä mallissa on, että kasvainsolut eivät koe todellista kasvain mikroympäristön. Sen sijaan potilaalle tehdä malli implantit kasvainsolujen elin kasvain alkuperää, jolloin se realistisempi malli. Niinpä valitsimme potilaalle tehdä malli tutkia suunnittelun parametrit tarpeen nanoconjugates onnistuneesti ja kohdistaa kasvain.

Valitsimme setuksimabin kohdistamisaineena ja kultananopartikkeleilla kuin telineen kohdistamiseen toimitusta. Yksi suurimmista eduista hyödyntäen kultananopartikkeleilla on niiden muodostumista vakaa sidoksia biomolekyylien kuten organothiols, organoamines, proteiinit ja vasta-aineet [5]. Olemme osoittaneet merkittävää sitoutumista setuksimabin ja BKTL jopa suhde 3. (C225:GNP = 3), jonka jälkeen vain marginaalinen sitoutumisessa havaitaan. Tämä marginaalinen kasvu saattaa johtua puute vapaata reaktiivista pinta jäljellä BKTL. Luonne liimaus välillä kultaa ja proteiinien on tehty intensiivistä tutkimuksen viime vuosikymmenten. Nyt on yleisesti hyväksytty, että on olemassa kolme päätyyppiä vuorovaikutusta, joka syntyy välillä proteiini /vasta-aine ja kulta nanohiukkasten; (I) sähköstaattiset vuorovaikutukset negatiivisesti varautuneiden BKTL positiivisesti varautuneiden proteiinien; (Ii) kovalenttiset vuorovaikutukset tioli /amiiniryhmät läsnä aminohappotähdettä vasta-aineita ja BKTL; ja (iii) hydrofobisia vuorovaikutuksia proteiinien ja BKTL [19], [40]. X-ray fotoelektronispektroskopialla ja termogravimetrinen analyysi me aikaisemmin osoittaneet, että setuksimabi hyödyntää tiolia ja amiinifunktionaalisuuksia sitoutua pintaan kultananopartikkeleilla [19], [40].

On myös välttämätöntä vahvistaa suunnittelun parametrit eri solulinjat vaihtelevalla ilmaus tutkittavaa reseptoria. Tämä on erityisen tärkeää, kun otetaan huomioon epäyhtenäisyys kasvaimia. Näissä tutkimuksissa käytimme kolmea eri haimasyövän solulinjoissa vaihteleva ilmentyminen EGFR. Olemme myös osoittaneet, että solunsisäistä ottoa BKTL-C225 ei ole ainoastaan ​​riippuvainen määrä setuksimabin molekyylejä, mutta riippuu myös niiden kykyyn sitoutua EGFR, samoin kuin hydrodynaaminen koko nanoconjugates. On myös selvää, että epäspesifinen voidaan minimoida

in vitro

optimoimalla kattavuus kohdistaminen agentin nanohiukkasten pinnalle. Suurin erityisiä ottoa BKTL-C225 on havaittu, kun on kolme C225 molekyylien bruttokansantuloon, vaikka yleinen otto vähenee. Tämä data osoittaa edelleen yhdistetty merkitys useissa kohdentamisaineita hiukkasta kohti ja hydrodynaaminen koko nanoconjugates. Tämä heijastuu myös erotus tietty ottoa BKTL-C225 ja epäspesifinen bruttokansantuotteesta-IgG.

Viime aikoina useat ryhmät ovat keskittyneet ymmärtämään suunnittelun parametrit tehokkaasti kohdistamista kasvaimista nanoconjugates prekliinisessä mallissa. On myös raportoitu, että nanoconjugate, jonka koko oli 100 nm on tehokkaasti suunnattu tuumorisoluissa [41]. Vasta-aine kohdistettuja liposomeja on todettu aiheuttavan parantavan tehoa heidän ei-kohdennettu kollegansa [42]. Lisäksi toimitus siRNA käyttää siirtämistä kohdistettuja polymeerisiä nanohiukkasten osoitti parempaa tehoa, vaikka niiden kinetiikka, biologista jakaantumista ja kasvain otto oli samankaltainen [43]. Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin myös tutkimuksen transferriiniä päällystettyjä kultananopartikkeleita; on osoitettu, että ligandi sisällön nanopartikkelit ovat tärkeitä kohdistaminen [33]. Täällä me tutkia ortotrooppinen mallin haimasyövän ja puolestaan ​​osoittaa kriittinen roolit, että määrä vasta-molekyylien BKTL, kyky nanoconjugates sitoa kohteena reseptoria, saatavuus reaktiivisen pinnan epäspesifisen vuorovaikutuksen ja hydrodynaamista kokoa nanoconjugates kaikkien pelata malliltaan.

Yhteenvetona tuloksemme viittaavat siihen, että kohdentaminen kasvainsolujen riippuu useista tärkeistä tekijöistä; 1) kohdistamisaineena nanohiukkasten suhde; 2) saatavuus reaktiivisen pinnan alue nanohiukkasten; 3) kyky nanoconjugate sitoa kohteena ja 4) hydrodynaaminen halkaisija nanoconjugate. Siten älykkään suunnittelun onnistuneen kohdentamisen kasvainsolujen vaatii optimointia näitä ratkaisevia tekijöitä. Uskomme, että tämä tutkimus auttaa määrittelemään suunnittelun parametrit muotoilla paremmin strategioita erityisesti suunnattu kasvainten nanohiukkasten konjugaatteja.

Materiaalit ja menetelmät

synteesi ja karakterisointi BKTL-vasta-aineen konjugaatteja