Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

hoito potilailla, joilla on edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) määräytyy usein läsnäolo ennakoivia biomarkkereita, vaste tekijöille suunnattu tietyille molekyyli polkuja. Vaatimukset multiplex analyysi geenien patogeneesiin NSCLC kasvavat.

Methods

validoitu Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) järjestelmän avulla Ion AmpliSeq Cancer hotspot Panel ja verrattiin tulokset, jotka on saatu käyttämällä kulta standardimenetelmiä, tavanomainen PCR ja Sanger sekvensoinnilla. Cycleave PCR menetelmää käytettiin tulosten todentamiseksi.

Tulokset ja päätelmä

Ion Torrent PGM johti sama tarkkuustaso tunnistamisessa useita geneettisiä mutaatioita rinnakkain, verrattuna tavanomaisiin PCR ja Sangerin sekvensointia; kuitenkin Ion Torrent PGM oli ylivoimainen muihin sekvensointimenetelmiin lisääntymisen suhteen helppokäyttöisyys, vaikka otetaan huomioon pieni määrä DNA saatiin formaliinikiinnitetyt parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäytteistä.

Citation: Fujita S, Masago K, Takeshita J, Okuda C, Otsuka K, Hata A, et al. (2015) validointi Ion Torrent sekvensointialustamme havaitsemiseksi geenimutaatioita biopsianäytteistä välillä, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 10 (6): e0130219. doi: 10,1371 /journal.pone.0130219

Academic Editor: Anthony W. I. Katso, Queen Mary Hospital, HONGKONG

vastaanotettu: 28 joulukuu 2014; Hyväksytty: 17 toukokuu 2015; Julkaistu: 15 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Tietoja on saatavilla alkaen Ibri Institutional Data Access /eettisen komitean johtuen eettisistä rajoituksista, jotka koskevat potilaiden yksityisyyttä. Tapauksissa tietojen pyynnön, hallituksen jäsenet päättää vapauttaa tiedot.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

hoito potilailla, joilla on edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) määräytyy usein, kuten on asianlaita muiden ihmisten syöpiin, läsnäolo ennakoivia biomarkkereita, vaste tekijöille suunnattu tietyille molekyyli reittejä pahanlaatuisia soluja. Myönteinen vastaus tyrosiinikinaasi (TK) estäjät kohdistaminen kasvutekijän reseptorin (EGFR), tapauksissa NSCLC, joissa mutaatiot ovat läsnä EGFR geenin merkitystä kuvastaa tunnistamisen molekyyli biomarkkereiden, ja useita tällaisia ​​onkogeenisten muutoksia on ollut raportoitu tähän mennessä [1-3]. Nämä molekyyli- muutokset voidaan jakaa kahteen ryhmään; geneettisiä uudelleenjärjestelyjä, jotka vaativat RNA-analyysiä ja /tai fluoresenssi in situ -hybridisaatio niiden tunnistamiseksi, ja geenin mutaatiot (mukaan lukien pieni insertio tai deleetio tapahtumat), jotka tutkittiin käyttämällä DNA-analyysi. Mutaatioita on löydetty useita geenejä lisäksi

EGFR

, jotka ovat mukana patogeneesissä NSCLC (eli

KRAS

,

sääntelyviranomaisten

,

HER2

AKT1

,

BRAF

,

PIC3CA

) ja kysynnän multiplex analyysi näistä geeneistä on kasvussa.

ainoa kudosnäytteet, jotka ovat yleensä käytettävissä mutaatioanalyysiin kliinisessä ympäristössä ovat kudosnäytteistä saadaan transbronchially tai transkutaanisesti. Nämä näytteet ovat yleensä pieniä ja alistetaan formaliinilla fiksaatioprosessi. Havaitseminen mutaatioita suorittamalla PCR ja Sanger sekvensointia rinnakkain on aikaa vievää ja vaatii huomattavan määrän DNA, joka on usein käytettävissä johtuen pienestä näytteen koosta. Äskettäin kehitetty tekniikka, massiivisesti rinnakkaisen DNA: n sekvensointi, mahdollistaa nopean, herkkä ja erittäin spesifinen havaitseminen geenimutaatioita yhdessä kokeessa, kohtuullisin kustannuksin.

Tässä käytimme Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) järjestelmä (Thermo Fisher Scientific) yhdessä Ion AmpliSeq Cancer hotspot Panel, versio 2 ja vertasivat tuloksia saadut kultakantaan menetelmät mutaatioanalyysiin, tavanomainen PCR ja Sanger sekvensoinnilla. Lisäksi erittäin herkkä PCR menetelmässä cycleave PCR-menetelmällä, käytettiin keskittyen EGFR ja KRAS-geenin mutaatiot sanottuna tarkistaa saadut tulokset sekä perinteisen PCR ja Ion Torrent PGM järjestelmä.

Methods

Ethics

Tämä hyväksyi tutkimuksen Institute of Biomedical Research ja innovaatio Hospital Institutional Review Board. Kaikki potilaat edellyttäen kirjallista, tietoon perustuva suostumus. Tutkimus suoritettiin noudattaen eettisiä periaatteita Helsingin julistuksen.

Potilastiedot

Kasvain näytteitä käytettiin tutkimuksessa kerättiin Institute of Biomedical Research ja innovaatio sairaala, Japani. Mukaisesti nykyisten suuntaviivojen, kaikki FFPE kasvain näytteissä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä sairastavilla potilailla ei tunneta genotyyppi (

EGFR

ja

KRAS

) analysoitiin tavanomaisella PCR: llä ja Sanger sekvensoinnilla määrittää jatkokäsittelyä. Vertailun, yhteensä 21 tuumorinäytteet analysoitiin Ion PGM järjestelmä ja cycleave PCR-menetelmällä.

Analysoitiin geenien

EGFR

: Eksoni 19 deleetio (mukaan lukien E746 -A750), eksoni 21 L858R, eksoni 21 L861Q

KRAS

: n eksonin 2 G12X

kudosnäytteitä ja DNA Eristykset

Vain biopsianäytteistä joka paljasti NSCLC patologisesti analysoitiin. Kaikissa tapauksissa, bronkoskooppiset biopsia tai ydin neula tehtiin biopsia (kuvio 1A ja 1 B). Erillinen 21-numeroista neulaa käytettiin saamiseksi histologista ydin. Histologinen ytimet kiinnitettiin formaliinilla ja käytettiin patologinen diagnoosi. Sen jälkeen histopatologinen diagnoosi, FFPE näytettä (1-3 näytteitä 5 um paksu osa) poistettiin parafiini käyttäen ksyleeniä. DNA eristettiin osat käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mittasimme DNA keskittymän NanoDrop Lite Spektrofotometri (Thermo Fisher Scientific).

(A) Formaliinifiksoidusta parafiiniin yksilö. (B) Yksi näyte 5-pm paksu kohta.

Perinteiset PCR ja Sangerin sekvensoinnilla

eksonit 18.-21 monistettiin PCR: llä ja analysoitiin. Alukkeita ja pyöräily olosuhteet PCR-monistamiseen oli muokattu menetelmistä julkaistu aiemmin [4]. Sekvenssointireaktiot elektroforeesi ABI PRISM 3100 (Thermo Fisher Scientific). Suora sekvensointi PCR-tuotteiden tehtiin sekä sense- että antisense-suuntaan.

Euroopan cycleave PCR-menetelmällä

käytetty kimeerinen DNA-RNA-DNA-koetinta, joka on leimattu fluoresoivalla värillä ja sammuttaja on kumpikin pää [5]. -A-RNA-sekvenssi koettimien vastaa, että villin tyypin ja pistemutaatio (eksoni 21 L858R, eksoni 21 L861Q) leimattu FMA ja ROX, vastaavasti. Kun mutantti-molekyylit ovat läsnä näytteessä, ja PCR-monistettu DNA tuottaa täydellisen hybridin RNA-osan mutantti koetin, RNaasi-H pilkkoo koettimen RNA-DNA-heterodupleksi kahteen osaan, mikä johtaa merkittävään kasvuun fluoresenssin intensiteetissä erottamalla fluoresoivan väriaineen sammuttaja.

havaitsemiseksi deleetion eksonissa 19 EGFR-geenin, yhteinen fragmentti analyysiä käytettiin. Näyte-DNA monistettiin kanssa FAM-leimattua aluketta set ja PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla. PCR-monistettiin lyhyempi DNA-segmentti, luodaan uusi huippu elektroferogrammi kun deleetiomutaatio oli läsnä [5].

Ion Torrent PGM Kirjasto valmistelu ja Sequencing

ioni Torrent adapteri-ligatoitu kirjasto valmistettiin noudattamalla valmistajan Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 protokollaa (Thermo Fisher Scientific, Rev. 5, MAN0006735). Lyhyesti, 50-ng yhdistettiin amplikoneihin olivat lopussa korjattu, ja Ion Torrent sovittimet P1 ja A liitettiin DNA-ligaasilla. Sen jälkeen AMPure helmi puhdistus (Beckman Coulter), pitoisuus ja koko kirjaston määritettiin käyttämällä Life Technologies StepOne järjestelmä (Thermo Fisher Scientific) ja Ion Library TaqMan kvantitointi Assay Kit (Thermo Fisher Scientific).

Sample emulsio PCR, emulsio rikkomatta, ja rikastus suoritettiin käyttäen Ion PGM IC 200 Kit (Thermo Fisher Scientific), mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, tulo pitoisuus yhden DNA-templaatin kopion /Ion Sphere Hiukkaset (ISP) lisättiin emulsioon PCR Master Mix ja emulsio tuotetaan käyttäen Ion Chef (Thermo Fisher Scientific). Template-positiiviset Internet rikastettiin ja sekvensointi suoritettiin käyttäen 314 BC pelimerkit Ion Torrent PGM 65 kierrosta ja viivakoodaus suoritettiin käyttäen Ion DNA Barcoding Kit (Thermo Fisher Scientific).

Variant kutsuvan

tiedot PGM kulkee alun perin käsiteltiin käyttämällä Ion Torrent alustakohtaisia ​​putki ohjelmisto, Torrent Suite, tuottaa järjestyksessä lukee, leikata adapteri sekvenssit, suodata ja poista huono signaali-profiilin lukee. Alustava variantti soittajat Ion AmpliSeq sekvenointitulosten luotiin käyttäen Torrent Suite Software v4.0 kanssa plug-in ”” variantti soittaja ”ohjelma. Poistamaan virheelliset base calling, kolme suodatus vaiheet käytetään tuottamaan lopullinen muunnos calling. Ensimmäinen suodatin asetettiin keskisyvyys yhteensä kattavuuden 100, joka on kunkin variantin kattavuus 20 ja P-arvo 0,01. Toinen suodatin työskenteli visuaalisesti tutkimalla mutaatioiden avulla genomiikkaa Viewer ohjelmisto (https://www.broadinstitute.org/igv) tai CLC Genomics Workbench versio 7.5.1 (Qiagen), sekä suodattamalla pois mahdollinen säikeen koskevat virheet ; eli mutaatio havaittiin ainoastaan ​​joko ” plus ’tai’ ’miinus ”lohkon, muttei molempien DNA-säiettä.

Tulokset ja keskustelu

Yhteensä 21 kasvainnäytteestä (10 maasta bronkoskooppiset transbronchial koepala, 6 CT-ohjattu Tuumorinäytteiden ja 5 core-neula pinnallinen imusolmuke biopsia) analysoitiin. Mediaaniarvon uutettu DNA-pitoisuus oli 115,2 ng /ul (vähintään 29,3, maksimi 786,1), ja sopiva määrä DNA: ta käytettiin analyysiä varten. Kuten on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa 2, tulokset geenin mutaation analyysien saatu Sangerin sekvensoinnilla oli sama kaikissa tapauksissa, jotka ovat peräisin analyyseistä käyttäen Ion PGM-järjestelmän. Mitä EGFR, analyysitulosten saatu Sangerin sekvensoinnilla täysin sovitettu jotka on saatu cycleave menetelmällä ja Ion PGM järjestelmä. Mikään kasvainten tutki oli mutaatiot sekä EGFR TK domain ja KRAS-geenin.

(A) KRAS-mutaatio (G12V) tunnistetaan cycleave tekniikkaa. (B) EGFR-mutaatio (eksoni 19 t) tunnistetaan fragmenttianalyysi (C) KRAS-mutaatio (G12V) havaittiin Ion PGM tekniikkaa. C: n transversio todettiin. (D) EGFR-mutaatio (eksoni 19 poistetaan) havaittiin Ion PGM tekniikkaa.

Toinen EGFR mutaatio, jossa metioniini on korvattu treoniini asemassa 790 (T790M) korreloi hankittu resistenssi EGFR tyrosiinikinaasin estäjät [6]. Meidän sarja, 3 potilaalle tehtiin toinen koepala etenemisen jälkeen hoidosta EGFR tyrosiinikinaasiestäjiksi. DNA-sekvenssi näiden biopsianäytteistä tavanomaisilla Sangerin sekvensoinnilla osoitti T790M mutaatio kahdessa tapauksessa. Sekvensointi käyttämällä Ion PGM paljasti T790M mutaatio myös kahdessa tapauksessa. Lisäksi joukossa 900 lukee saavuteta, T790M mutaatio havaittiin 53 lukee (5,9%) kolmannella potilaalla. Vaikka havaitut määrä lukee oli alle kynnysarvon, on mahdollista, että syntyminen T790M on ensisijainen syy resistenssin EGFR tyrosiinikinaasin estäjä hoitoa tässä tapauksessa.

Vaikka tapausten pieni määrä analysoidaan, tulokset viittaavat siihen, että Ion Torrent PGM on käytännöllinen ja herkkä menettely, joka soveltuu kliiniseen käyttöön, kun vain pieni määrä pahanlaatuinen kudos on saatavilla ja multiplex analyysit geenit ovat välttämättömiä hoidon suunnittelussa. Lisäksi tutkinnassa geenimutaatioita suorittaa täällä, lisätietoja geneettisiä uudelleenjärjestelyjä olisi sisällytettävä nykyistä tietämystä hoidon parantamiseksi NSCLC ja helpottaa jatkotutkimuksia.