Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta merkittävää paranemista leikkauksen jälkeisen 5-FU-pohjainen adjuvanttihoitoa, relapsien mahasyövän potilailla, joille tehdään parantavaa resektion seuraa adjuvanttihoitoa edelleen merkittävä. Sen vuoksi on tärkeää tunnistaa ennusteen markkereina kemoterapeuttisen tehoa 5-FU. Olemme hiljattain tunnistettu NF-KB ehdokkaaksi uusiutumisen ennusteen biomarkkereiden mahasyövän. Arvioida biologista merkitystä NF-KB: n yhteydessä 5-FU kemoterapian, analysoitiin NF-KB-riippuvainen biologisen vasteen 5-FU: n hoitoon mahasyövän solulinjoissa. Seitsemän geenien aiheuttama 5-FU hoito NF-KB-riippuvaisella tavalla tunnistettiin, joista viisi tunnetaan p53 tavoitteita. Knockdovvn

RELA

, joka koodaa p65-alayksikköä NF-KB, laski sekä p53 ja p53 kohdeproteiinin tasolla. Sen sijaan NF-KB ei vaikuta

TP53

pudotus. Olemme myös osoittaneet, että solulinjat, joissa Pro /Pro homotsygoottisyyden in codon72 p53 exon4, joka on tärkeä NF-KB: n sitoutuminen p53: n, ovat resistenttejä 5-FU kuin ne, joilla on Arg /Arg homotsygoottisiksi. Voimme päätellä, että NF-KB on tärkeä rooli vastauksena 5-FU hoidossa mahalaukun syövän solulinjoissa, jossa mahdollinen korvaava p53. Nämä tulokset viittaavat siihen, että NF-KB on mahdollinen 5-FU-kemosensitiivisyys ennustuksen merkkiaine, joka voi heijastaa 5-FU-stressille-vasteen reittejä, mukaan lukien p53.

Citation: Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et ai. (2014) korvaava rooli NF-KB p53 vastauksena 5-FU-Based Chemotherapy mahasyövän Cell Lines. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10,1371 /journal.pone.0090155

Editor: Thomas G. Hofmann, Saksan Cancer Research Center, Saksa

vastaanotettu 17. lokakuuta 2013 Hyväksytty: 28 tammikuu 2014; Julkaistu: 27 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat MIAST (Medical Innovation Advanced Science and Technology) projekti Grant-in-Aid for Strategic Medical Science Research Center opetus-, kulttuuri-, Science and Technology of Japan, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); ja Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) (11863286) (S.S.N.), ja (12877914) (K.Ko.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurin osa mahasyöpä maailmassa on diagnosoitu Itä-Aasiassa [1], jossa standardin hoidon kehittynyt mahasyöpä edelleen leikkauksen ja kemoterapian. Äskettäin kehitetty adjuvantti solunsalpaajahoitojen jälkeen parantavaa gastrectomy pitkälle mahasyövän ovat edistyneet merkittävästi kannalta valvoa uusiutuminen ja tautivapaan elinajan, erityisesti Japanin väestöstä [2], [3]. Kuitenkin 30-40%: lla potilaista ilmenee edelleen uusiutunut huolimatta saavat kemoterapiaa jälkeen parantava gastrectomy [3], mikä viittaa siihen, että potilas valinta perustuu molekyylitason tietoa saattaa olla erittäin tehokas lisätä kemoterapian välittämä ei-uusiutumisen ja eloonjäämisen hinnat.

Jos haluat valita mahasyövän potilaille, jotka saattavat hyötyä kemoterapiaa, on tärkeää ymmärtää yksilölliseen herkkyyteen ennen kemoterapiaa [4]. Postoperatiivinen adjuvanttihoitoa mahasyövän tarjoaa mahdollisuuden testata potilaasta peräisin kasvaimia ennen he saavat kemoterapiaa. Yrittäessään tunnistaa mahdollisia biomarkkereita tässä tilanteessa on proteiini tasolla olemme aiemmin raportoitu solulinjaan paneeli seulonta, jossa käytetään määrällisiä proteiinin ilmentymisen profilointi Reverse-Phase Protein Arrays (RPPAs) [5], [6] yhdistettynä solu- pohjainen kasvun määritys, joka perustuu käsitteeseen NCI-60 solulinjan seulonta paneeli [7], [8]. Ehdokas biomarkkerit eristettiin perustuen korrelaatiokertoimet proteiinista ilmaisun ja huumeiden herkkyys matriisi ja sitten vielä validoitu käyttämällä kirurgisesti-poistettu yksilöt [9]. Tästä lähtökohdasta olemme määritelleet kaksi biomarkkereiden proteiinitasolla, kuten NF-KB ja JNK, jonka tasot oli hyvä korrelaatio kemoterapia-vasteen. Korkeampi ilmentyminen NF-KB näytti korreloivan huonompi ennuste, kun JNK osoitti käänteinen korrelaatio. Näitä markkereita myös validoitu molekyylitasolla käyttämällä maha syöpäsolun linjat. On osoitettu, että siRNA-välitteinen pudotus p65 lähes pelkästään 5-FU herkkyys keskuudessa tällä hetkellä käytetyt kemoterapeuttiset lääkkeet; mutta tämä ei päde JNK Knockdown [9]. Siksi, päättelimme, että NF-KB on hallitseva rooli 5-FU hoidossa ja JNK saattaa olla osoitus krooninen tulehdus mahalaukun tausta limakalvoille [10]. Jatkeena tämän validointitutkimuksella pyrimme tutkimaan näitä proteiineja toiminnallisesti ja selkeyttää roolia NF-KB rasittavana-indusoituvan transkriptiotekijä aikana 5-FU hoidossa. Arvioitiin myös rooli p53 jälkeen 5-FU-välitteisen transaktivaation NF-KB: n [10], [11], koska se on hyvin tunnettua, että p53 aktivoituu vasteena tähän genotoksinen [12]. Tässä tutkimuksessa ilmoita mahdollisesta korvaava rooli NF-KB: n p53 analysoimalla p53-NF-KB sitova polymorfisen, kodonissa 72 p53. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että NF-KB /p53-codon72 voisi olla vankka biomarkkeri 5-FU herkkyys.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Yhdeksän ihmisen maha- syöpäsolulinjoja, mukaan lukien Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY, ja MKN45 saatiin RIKEN Bioresource Centerin Cell Bank. IWT-1 oli

de novo

solulinja, joka perustettiin vuonna laboratoriossamme peräisin japanilainen mies mahasyövän potilas oli uusiutunut peritoniitti carcinomatosa. Käyttö IWT-1-solulinja on hyväksynyt Iwate Medical University Institutional Review Board (H25-116, ja HG H25-15) ja perhe luovuttajan potilas oli kuollut aikaan perustamisen solulinjan kanssa kirjallinen lupa suhteen ottamalla näytteitä ja tehdä solulinjan. Soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2.

valmistaminen Cell Lysate

Solut kerättiin sentrifugoimalla ja solupelletit hajotettiin käyttäen Pink puskuri, joka sisälsi 9 M ureaa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 4% 3 – [(3-kolamidopropyyli) dimetyyliammonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS; Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Saksa), 2% pH 8,0-10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Japani, Tokio, Japani), ja 65 mM DTT (GE Healthcare Japani, Tokio, Japani), kuten aikaisemmin kuvatulla tavalla [5], [13].

Western Blot

SDS-PAGE suoritettiin käyttämällä NuPAGE 4-12% bis-TrisGel elektroforeesi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell Sure Lock Mini-solujen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja Power PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Erotetut proteiinit geelin siirrettiin nitroselluloosamembraanille käyttämällä iBlot Kemiallinen Blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Saatu membraanit blokattiin 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) TBS: ssä (TBST) 1 h. Sitten kalvot inkuboitiin ilmoitetuilla ensisijainen vasta, kuten yleiseurooppalainen aktiini, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA); p21, Tigar, ja PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); ja NF-KB, α-tubuliinin, ja PCNA (Cell Signaling Technology Japani, Tokio, Japani). Seuraavaksi kalvot pestiin kahdesti 5 minuutin ajan TBST: ssä, inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan, ja sitten pestiin kahdesti 5 minuutin ajan TBST: ssä. Kemiluminesenssidetektiolla reagenssit inkuboitiin kalvojen kanssa 1-5 minuuttia ja sitten kuvat hankittiin käyttämällä Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japani). Arvioimaan proteiinin induktio 5-FU, western blotit kvantitoitiin käyttäen ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Immunosytokemia

Solut kasvatettiin 70-80 % konfluenssiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 4-kammiossa polystyreeni aluksen kudosviljelmässä käsitellyn lasilevyille ja käsiteltiin sitten 5-FU kuten kussakin kokeessa. Kun solut altistettiin 50 uM 5-FU 4 h nähdä varhaisen transkription vastaus, ne fiksattiin 4% paraformaldehydillä permeabilisoitiin 0,2% Triton X-100 PBS: ssä, ja värjättiin DAPI (0,6 uM DAPI, 50 ui RNaasia, ja 5 ml PBS) huoneenlämpötilassa 12 min. Soluja inkuboitiin sitten seuraavat primaaristen vasta-aineiden: anti-NF-KB: n p65: n, fosfo-NF-KB: n p65 (Ser536) ja fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japani, Tokio, Japani), ja p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, USA). Lopuksi soluja inkuboitiin joko Alexa Fluor488- tai 568-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Life Technologies Japan, Tokyo, Japani). BX43 fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) käytettiin kuvan hankinnan.

geeniekspressioprofilointi

MKN45 solut otettiin talteen sen jälkeen, kun hoidon kanssa tai ilman 50 uM 5-FU: ssa 4 tuntia . RNA uutettiin sitten korjatun solujen ja geeniekspressioprofilointi suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Toki Tulosta G3 Human GE8 x 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japani). Raakadataa normalisoitiin ensin jakamalla jokainen koetin signaali 75

persentiili koko signaalia. Kukin mikrosirujen koe suoritettiin kahtena tuloksena on kaksi ohjaus ja kaksi 5-FU hoidossa microarray aineistoja. Geenien tunnistamiseen, jotka ilmentyvät differentiaalisesti vastauksena 5-FU, kukin ohjaus datajoukko verrattiin erikseen jokaiseen 5-FU hoidossa set (4 vertailut). Ilmentyvät eri geenit olivat ne, jotka oli muutos ilmaisun 2-kertainen kussakin vertailussa. Havaitsimme viimeinen osuus 10 differentiaalisesti ilmentyvien geenien perustuu niiden taajuus 4 vertailuissa [14]. Vahvistaa toistettavuus näiden ilmentyminen muuttuu, kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä 5-FU: Käsitellyt näytteet 0, 4, 8, 12, ja 24 h suoritettiin kullekin geenille. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Geenejä aiheuttama 5-FU, analyysi promoottorin sitoutumiskohtien suoritettiin käyttäen Jaspar algoritmia (Jaspar, https://jaspar.genereg.net/). 1000 emäsparin promoottorin sekvenssin spesifisiä vastaavat geenit saatiin Transkription Regulatory Element Database (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Sitoutumiskohdat ennustettiin skannaamalla promoottorisekvenssit kanssa konsensussekvensseihin NF-KB: n ja p53 kanssa 70% profiilin pisteet kynnyksen.

RELA ja TP53 Gene knockdown

Solut kasvatettiin 70-80 % konfluenssiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 6-kuoppaisille soluviljelylevyille ja käsiteltiin sitten NF-KB: n p65: n tai p53: n siRNA (Cell Signaling Technology Japani, Tokio, Japani) 48 tuntia. Lyhyesti, pudotus suoritettiin käyttäen Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA), jonka konsentraatio on 3% 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sopivina pitoisuuksina siRNA: iden kunkin solulinjan sekoitettiin Trans IT-TKO ratkaisuja seurasi 20 min huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen. SiRNA pitoisuudet olivat seuraavat: 100 nM p65 siRNA varten MKN45, ja MKN74 soluja, ja 150 nM GSS ja Kato-III-solut; ja 100 nM p53 siRNA varten MKN45, ja GSS-solut, ja 50 nM MKN74 soluja. 48 tunnin kuluttua solut otettiin talteen ja proteiinin tasot tutkittiin Western blot. Kaksi siRNA konstruktioita jolla on erilaisia ​​sekvenssejä samaan kohde- geeniä käytettiin jokaisen geenin vahvistaa knockdown spesifisyyden. Solusyklin jakelu arvioitiin käyttäen Tali Image-pohjainen Cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Nähdä mahdollisimman tehokkaasti siRNA on 5-FU vastaus, lääke lisättiin 48 tunnin kuluttua siRNA transfektoitiin, ja kunkin solusyklin mitattiin 24 tunnin kuluttua inkubaation 5-FU. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

TP53 status ja Codon72 Variant

DNA uutettiin mahasyöpä solulinjoissa käyttäen QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japan, Tokyo, Japani). PCR-monistus, että

p53

exon4 codon72 variantti (taulukko S1) ja

p53

exon5-9 mutaatio suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15], [16]. Kukin PCR-tuote sekvensoitiin käyttämällä ABI PRISM 3030xl geneettistä analysaattoria (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan protokollan. Sekvensointi Tulokset analysoitiin FinchTV (PerkinElmer Japani, Tokio, Japani) ja MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Growth Suppression Pitoisuus

Kymmenen tuhannen solua kuoppaa kohti ympättiin 96 kuopan mikrolevyn. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin 5-FU: ssa 24 tuntia. Kun 5-FU hoitoa, osa elävien solujen mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japani) ja TriStar LB 941 mikrolevylukijalla (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa). Viisikymmentä prosenttia kasvun esto pitoisuus (GI

50) laskettiin käyttäen Prism-ohjelmistoa (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). GI

50 arvoja käytettiin määrittämään korrelaatioita 5-FU tehoa ja proteiinin tasot perustuvat Pearsonin tuote-tulomomenttikorrelaatiokertoimen (

r

).

Tulokset

fluorourasiilia indusoi NF-KB

vahvista tyypillinen NF-KB käyttäytymistään 5-FU hoidossa, me jäljittää solunosasijaintia NF-KB on MKN45 (p53 villityyppi), MKN74 (p53 mutantti ), GSS (p53 mutantti), ja Kato-III (p53 homozygously poistetaan) solulinjat. Western blot-analyysi ydin- ja sytoplasman jakeet osoittivat, että 5-FU aiheuttama NF-KB molemmissa osastoissa MKN45 mutta ei havaittu p53 mutantti solulinjoissa (Fig. 1A-D). Olemme myös tutkineet vaikutusta 5-FU on NF-KB: n lokalisointi soluissa immunosytokemialla (Fig. 1 E-H). NF-KB: n paikantuvat sytoplasmaan käsittelemättömän MKN45, kun taas 5-FU hoito aiheutti lisääntymisen NF-KB ydinvoiman lokalisointi (Fig. 1 E); ei kuitenkaan havaittiin kasvua p53-mutantin solulinjat (Fig. 1 F-H). Havaitsimme myös jyrkkä nousu fosforyloidun NF-KB (p65 Ser536) tumassa MKN45 käsiteltiin 5-FU, mikä osoittaa NF-KB on transaktivoidun 5-FU (Fig. 1 E). Konstitutiivinen ydinvoiman lokalisointi ja satunnaisia ​​fosforylaation p53 havaittiin MKN74, mutta ei näytä olevan indusoida 5-FU: ta (Fig. 1 G). Tumaanohjaussignaali p53 indusoitiin 5-FU: GSS, mutta aktivoitu signaali oli heikko (Fig. 1 H).

A-D, Western blot-analyysi NF-KB: n tumaan ja sytoplasmassa 50 uM 5-FU: ssa 4 h ilmoitettu solulinjat. PCNA ja α-tubuliinin käytettiin ydin- ja sytoplasmisen lastaus valvontaa, vastaavasti. E-H, Immunosytokemia p65 ja p53 induktio ja lokalisointi 5-FU hoito osoitetun solulinjat. p65 (punainen), fosfori-p65 (Ser536, punainen), p53 (vihreä), fosfo-p53 (Ser15; punainen), ja DAPI (sininen) värjäys tuman ilman (kontrolli) ja 5-FU hoitoon. I, Gene ilmentymisen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä ajan kuluessa 5-FU hoitoon. Tigar, PUMA, CDKN1A, ja BTG2 havaittiin 5-FU indusoi geenejä. Määrällinen arvot olivat suhteessa p-aktiinin ilme.

p53 Tavoitteet aiheuttama upon 5-FU hoito

Koska NF-KB on transkriptiotekijä (TF), sen tumaanohjaussignaali upon 5-FU hoidossa viittaa vahvasti siihen transaktivaation. Olemme tunnistaneet top 7 selostukset joukossa yli 60000, jotka aiheutettiin 4 h 5-FU kohtelu MKN45 geenien ilmentymisen profilointi (taulukko 1). Mielenkiintoista, viisi 7 selostukset, eli

BBC3

(joka koodaa p53 sääteli modulaattorin apoptoosin, PUMA),

BTG2, C12orf5

(joka koodaa todennäköinen fruktoosi-2,6-bisphosphatase Tigar),

CDKN1A, ja GPR87

, tunnetaan p53 tavoitteet [18] – [22]. Läsnä promoottorin sitoutumiskohtien ennustettiin skannaamalla promoottorisekvenssit kanssa konsensussekvensseihin NF-KB: n ja p53: n avulla Jaspar algoritmia (taulukko 1) [23].

Huomasimme, että p53 tasot indusoitiin ydin samanlaisia ​​kuin NF-KB: n vasteena 5-FU hoidon (Fig. 1 E). Hoito 5-FU myös nostivat p53 fosforylaation Ser15, viittaa sen transaktivaa- (Fig. 1 E, ref. [24]). Itse asiassa suurin osa koko p53 aiheuttama 5-FU näytti fosforyloitu. Havaitsimme myös ajasta riippuva geenien induktioon, kuten

C12orf5 (Tigar) B,

BBC3 (PUMA) B,

CDKN1A (p21) B, ja

BTG2

5-FU käyttäen RT-PCR: ää (Fig. 1 I). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että soluvasteen 5-FU hoidossa voi liittyä sekä NF-KB ja p53 transkription aktivaation tässä yhteydessä vuonna MKN45.

RELA knockdown on suurempi vaikutus p53 Target Proteiinit kuin TP53 Gene knockdown

arvioimiseksi sääntelyn vaikutusta NF-KB ja p53 vastauksena 5-FU hoidossa, olemme analysoineet proteiinin tasot p65, p53, sekä tunnettuja p53 tavoitteita, p21, Tigar, ja PUMA, western blottauksella seuraava

RELA

ja

TP53

knockdovvn vuonna MKN45, MKN74, GSS, ja Kato-III.

RELA

knockdown aiheutti vähentyneen merkittävästi p53 tasolla kaikissa solulinjoissa. Kuten odotettua, tasot p21, Tigar, ja PUMA oli myös vähentynyt (Fig. 2A). Kääntäen, kun taas

TP53

Knockdown vähentynyt p53 tasoilla, se ei vaikuttanut p65 tasoja. Kuten odotettua, tasot p53 Kohdeproteiinit laski

TP53

pudotus; kuitenkin, tämä vähennys oli pienempi kuin vähennys aiheuttaman

RELA

taintumisen (Fig. 2B). Vuonna solusyklin analyysi, MKN74, GSS, ja Kato-III solulinjojen kasvoi hieman S tai G2-faasin osa taas MKN45 näytteille kasvu G1 jae 24 tunnin altistusta 5-FU: n p65 ja p53 knockdown samanlainen kuin vastaava salaa (Fig. 2C). Nämä tulokset voivat osoittaa luotettavuutta solujen stressin vastaus koneita, joka ylläpitää solusyklin jakautumisen huolimatta knockdovvn p65 ja p53.

, Western blot-analyysi

RELA

Knockdown neljässä mahasyövän solulinjat. Lisäksi p53 ja p65-proteiineja, p53 tavoitteita, mukaan lukien p21, Tigar, ja PUMA, arvioitiin. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Tulokset soluista inkuboitiin RELA siRNA (siRNA) ja ilman kohde siRNA (kontrolli) on esitetty. B, Western blot-analyysi

TP53

pudotus kolmessa mahasyövän solulinjoissa. p53-alleelin Kato-III homozygously poistetaan niin TP53 Knockdown ei suoritettu. C, Drug aiheuttama solukierron analyysiin. Vaaka-akselin lujuus propidium- jodia (PI), ja pystyakseli osoittaa solujen määrä kunkin solulinjan.

TP53 Codon72 Pro Variant Näytteillä Low 5-FU: Herkkyys ja korkea NF-KB tasot

Gene pudotus kokeelliset tulokset osoittavat, että vuorovaikutus NF-KB: n ja p53-proteiinien voi olla tärkeää yhteydessä 5-FU hoitoon. Tutkimaan sitä mahdollisuutta, että

TP53

codon72 variantti voi vaikuttaa soluvasteita 5-FU hoidossa, sekvensoimme

TP53

codon72 sekä mutaatioita DNA: ta sitovan domeenin koodaavat alueet (ts eksonit 5-8) 9 mahasyövän solulinjoja (taulukko 2). Tila codon72 vaihtelu ja

TP53

mutaatiota ei osoittanut selkeää yhdistysten.

vieressä tutkineet yhdistyksen välillä 5-FU herkkyys ja

TP53

tila ( Fig. 3A), sekä endogeenisten tasojen NF-KB: n ja p53: n (kuva 3B). GSS, GCIY, ja MKN45 linjat, joilla Pro homotsygoottinen variantti, oli lieviä herkkyys 5-FU, kun taas KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, ja IWT1 linjat jolla Arg alleeli esiintyi suhteellisen suuri herkkyys. Kato-III, joka on suuri

TP53

poisto [25], on herkin 5-FU. NF-KB-proteiinin tasot olivat erityisen korreloivat 5-FU herkkyys (

r

= 0,68;

p

= 0,04; Fig. 3C); kuitenkaan ollut selkeää korrelaatiota p53 tasojen ja 5-FU herkkyys (

r

= -0,04;

p

= 0,95; Fig. 3d). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Pro homotsygootista liittyy 5-FU vastarintaa, kun taas kumpikaan p53-mutaation eikä endogeenisen p53 tasot vaikuttaa välittömästi 5-FU herkkyys.

, kasvu tukahduttaminen määritys 5-FU hoidossa mahalaukun syöpäsolun linjat. Vaaka-akselit esittävät GI

50 arvo on 5-FU. B, Endogeeninen proteiini tasot NF-KB: n, p53, ja aktiini Western blotilla mahasyövän solulinjoissa. Aktiini käytetään latauskontrollina. C, hajontakuvion jakelu-proteiinin tasojen NF-KB: n suhteen aktiini ja GI

50 5-FU kussakin solulinjassa. D, hajontakuvion jakelu p53-proteiinin tasoa ja GI

50 5-FU kussakin solulinjassa. Pearsonin tuote-tulomomenttikorrelaatiokertoimen (

r

) sekä

p

arvo näytetään kussakin hajontakuva.

Keskustelu

ovat aiemmin tunnistettu NF-KB mahdollisena ennuste merkkiaine leikkauksen jälkeisen 5-FU-pohjainen kemosensitiivisyys pitkälle mahasyövän [9]. NF-KB on indusoituva transkriptiotekijä käsittää p65 (RelA), c-Rel, Rel-B, p50 /NF-κB1, ja p52 /NF-κB2 [26], ja sillä on keskeinen rooli immuunivasteiden ja tulehduksellinen sytokiini asetuksen [27] – [29]. Chang et al aiemmin osoittaneet, että NF-KB: n indusoiman ylös tai alas säätely differentiaalisesti ilmentyvien geenien 5-FU-indusoi suolen mukosiitin indusoimalla proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL-6, TNF-α: n ja IL-1β [10]. Nämä 5-FU aiheuttama tulehdusreaktioita on katsottu olevan osa stressiin välttää prosesseja, jotka voivat johtaa siedätyshoito 5-FU teho mahan limakalvoa [30]. Vaikka on ehdotettu, että NF-KB: n ei ole suoraan liittynyt kasvaimen kehittymisen ja etenemisen [31], NF-KB: n on katsottu olevan merkittävä biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde [32]. Suoria todisteita alennetun chemoresistance 5-FU siRNA varten

RELA

yhdessä korkea erottelukyky NF-KB tumavärjäystä in hoitotulosten kirurgisesti poistaa kudosten sai meidät suorittamaan edelleen validointiin NF-KB maasta biologinen näkökulma.

transkription profilointi tulokset osoittivat, että useat p53 loppupään geenejä säädellään ylöspäin vasteena 5-FU, jossa transaktivaation NF-KB myös tapahtunut. Nämä kaksi suurta transkriptiotekijät on aiemmin osoitettu sovitettava säädellään vastauksena genotoksinen aineet [33] – [35] ja TNF-α [36], [37]. Lisäksi on ehdotettu, että co-aktivaatio p53 ja NF-KB: käsitellyt kasvaimet genotoksisia aineilla saattaa johtaa hoidon epäonnistuminen johtuu NF-KB-välitteisen selviytymisen signalointi [38].

Yksittäiset knockdovvn näiden transkriptiotekijöiden paljasti geenit alavirtaan p53 vaikuttivat p65 knockdown, kun taas vaikutus oli rajoitettu p53 knockdown. Aiemmat raportit ovat ehdottaneet osuuskunnan suhde p53 ja NF-KB: n yhteydessä autophagy, apoptoosin, ja S-vaiheen tarkastuspiste aktivointi [34], [39] – [41]. Tuloksemme osoittivat myös, että NF-KB voi kompensoida transkriptionaalista aktiivisuutta p53 kun ehjä toiminto katoaa vastauksena 5-FU hoidossa. Itse asiassa suurin osa mahasyöpä kantavat mutaatioita p53 DNA: ta sitovan domeenin, mikä tekee se transkriptionaalisesti aktiivinen [42]. Tuore tutkimus Frank

et al

. raportoitu, että codon72 polymorfismi

TP53

vaikuttaa merkittävästi p53 yhteistyötä NF-KB-geenin transaktivaatiota, erityisesti apoptoosin kautta kaspaasi 4/11 [40]. Yhdessä esillä olevan havainnon, että jotkut transkriptionaalista aktiivisuutta p53 edellyttää NF-KB: n vasteena 5-FU, p53-kodonin 72 polymorfismin sen NF-KB: n sitoutuminen voi olla vaikuttaja kuin mutaatiostatuksesta asema

TP53

tai proteiinin ilmentymisen tilan p53.

vaikutus codon72 polymorfismin spontaaniin syövän riski on aiemmin tutkittu, mutta ei lopullisesti vahvistettu johtuen vähäisestä väestön ja eläinmalleissa [40], [43] – [45]. Kuitenkin codon72 polymorfismi voi olla rooli ylläpitää perustettu syöpäsoluissa kuin liipaisu solun pahanlaatuisiin. Itse asiassa aikaisemmat tutkimukset ovat raportoineet, että Pro /Pro alleeli vastustuskykyä kemoterapiaa ja huonon ennusteen suuontelon [46] sekä paksusuolen ja peräsuolen [47], rintojen [48] ja mahalaukun [49] syöpien ja neuroblastoomat [ ,,,0],43]. Sarja

in vitro

tutkimukset tukevat tätä hypoteesia osoittaa, että Arg alleeli on voimakkaampi apoptoosin indusoija kuin Pro alleelin [40], [50], [51]. Apoptoosi on yksi tärkeimmistä mekanismeista aiheuttama 5-FU: n ja näin ollen se on kohtuullista oletuksen, että tehoa 5-FU-kemoterapian liittyy tiettyyn p53 polymorfismien [49]. Meidän

in vitro

havainnot tukevat näitä epidemiologiset ja kokeelliset tiedot ja ehdottaa mahdollisia mekanismi 5-FU-välitteisen p53-NF-KB vuorovaikutusta p53-codon72 sitoutumiskohtaa.

Kuten odotettua meidän tutkimus osoitti, että solulinjat, joissa Pro-alleeli olivat resistenttejä 5-FU kuin niitä, joilla on Arg-alleeli. Kasvu tukahduttaminen profiilia 9 mahasyövän solulinjoissa oli hyvä korrelaatio NF-KB-proteiinin tasot. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Arg /Arg genotyyppi on vahvempi apoptoosin induktioon kuin Pro /Pro genotyyppi: n läsnä ollessa 5-FU. Niistä solulinjat (kaikki johdettu Japanin mahasyöpäpotilaista), suhde Arg /Arg: Arg /Pro: Pro /Pro oli 04:01:03, kun taas terveiden japanilaisten potilaiden oli 4.5:4.4:1 [52] . Tämä saattaa kuvastaa valintaprosessi, joka tapahtuu kasvainten kehittymiseen ja perustamalla kuin solulinjan. Edellinen meta-analyysit syöpäriski ja p53-codon72 polymorfismien viittaavat siihen, että Pro /Pro genotyyppi on suurempi syöpäriski (alempi varten Arg /Arg genotyyppi) aasialaisilla [45], [53]. Kuitenkin merkitys ”syöpäriski” syövän maligniteetti tai hoitovaste on vielä selvittämättä, koska se on yleensä vaikea kliininen tutkimus hallitsevat geneettisten polymorfismien ja arvioimaan todellista geneettistä hoidon vaikutuksia. Tähän mennessä suurin osa kuvaavat raportit välisestä assosiaatiosta p53 codon72 polymorfismi ja kemoterapia-vasteet ovat osoittaneet, että Arg /Arg genotyyppi on suotuisa vaste monenlaisia ​​syöpiä hoidetaan perinteisellä genotoksinen lääkkeiden [49], [54], [55] . Ehdotamme oletetun mekanismin vaste 5-FU kautta NF-KB ja p53-proteiinin sitoutuminen liittyy p53 polymorfismi, ja siten monimuotoiset diagnoosi NF-KB-proteiinin ilmentymisen ja codon72 voi olla hyödyllinen indikaattori postoperatiivisen adjuvanttihoitoa. Lukuunottamatta muutamia suuren mittakaavan aineistot [52], [56], laajuutta demografista ja etnisten jakaumien polymorfismin jää epäselväksi. Kertyvät tietoja etnisistä eroista varten polymorfismi voi selittää erot syövän riskiä tai kemoterapeuttisen vasteasteen potilasryhmässä.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että NF-KB säätelee p53 transkriptioaktiviteettia vastauksena 5-FU, joka voi liittyä polymorfiselle p53 on codon72. Muita kliinisissä ja epidemiologisissa tutkimuksissa olisi arvioitava hyödyllisyyttä samanaikaisen patologisen /geneettinen arviointi NF-KB /p53-codon72 kirurgisesti-poistetun mahasyövän yksilöitä, jotta voidaan ennustaa tehoa postoperatiivisen 5-FU kemoterapiaa liitännäishoitona.

tukeminen Information

Taulukko S1.

alukesekvensseissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090155.s001

(DOCX) B