Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka joissakin tutkimuksissa kuvatut ominaisuudet paksusuolensyöpä kantasolujen (CSCS) ja rooli endoteelisolujen kantasolujen (EPC) vuonna uudissuonittumista, se on yhä kiistanalainen, onko vuorovaikutus olemassa vai ei välillä CSCS ja EPC. Esillä olevassa tutkimuksessa, HCT116 ja HT29 alalla malleja, joiden tiedetään olevan solujen rikastamiseksi CSCS, perustettiin tutkimaan roolit tämän vuorovaikutuksen kehittämiseen ja etäpesäkkeiden paksusuolen syöpä. Verrattuna vanhemman kollegansa, pallojakaantuminen solut osoittivat suurempi kapasiteetti hyökkäyksen, korkeamman tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalia. Sitten in vitro ja in vivo suhde CSCS ja EPC tutkittiin käyttämällä kapillaariputki muodostumisen määritys ja ksenograftimalleissa. Tuloksemme osoittivat, että sferoidiviljelmiä solut voivat edistää solujen lisääntymisen, migraation ja putken muodostumiseen EPC kautta eritystä verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF). Samaan aikaan EPC voisi lisätä tuumorigeenistä kapasiteettia sferoidiviljelmiä solujen läpi angiogeneesiä. Lisäksi suurempi mikroverisuonitiheys havaittiin alueella rikastuttaa syövän kantasoluja ihmisen paksusuolisyöpäkudoksessa. Tuloksemme osoittavat, että pallomainen solut ominaispiirteitä syövän kantasoluja, ja toimimaan yhdessä sekä CSCS ja EPC voi olla tärkeä rooli kehitettäessä paksusuolen syöpä.

Citation: Wei B, Han XY, Qi CL, Zhang S, Zheng ZH, Huang Y, et ai. (2012) toimimaan yhdessä ja Sferoidiviljelmiä-Derived Stem-Like Solut ja endoteelisolujen kantasolut Edistää kehittäminen paksusuolen syövän. PLoS ONE 7 (6): e39069. doi: 10,1371 /journal.pone.0039069

Editor: Giovanni Camussi, University of Torino, Italia

vastaanotettu: 25 joulukuu 2011; Hyväksytty: 18 toukokuu 2012; Julkaistu: 26 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Wei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science Foundation of China (nro 30872462 Hong-Bo Wei, ja nro 81000960 Bo Wei). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti ja 5 vuoden suhteellinen pysyvyys on vain 53,8-65,2% huolimatta diagnostiikan ja hoidon edistysaskeleet [1], [2]. Kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke on kaksi kriittistä selviytymisen-vaikuttavia tekijöitä paksusuolisyövän.

Äskettäin yhä näyttöä siitä, että kasvaimen aloittaminen ja etäpesäkkeitä riippuvat pienen väestöryhmästä kasvainsolujen kutsutaan syövän kantasolut (CSCS) laakerin ääretön itseuudistumiseen potentiaalia ja kyky erilaistua eri väestöryhmien käsittää kasvain [3]. Tämän mallin mukaan, syövän kantasoluja havaittiin yllä karsinogeneesin etäpesäke, ja toistumisen peräsuolen syövän.

olemassaolo syövän kantasoluja ensimmäisen kerran osoittautunut yhteydessä akuutin myelooisen leukemian [4]. Tämä periaate ulotettiin lisäksi joitakin kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien paksusuolen syöpä, rintasyöpä, aivokasvaimet, ja keuhkosyöpä [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Cell lajittelu on väestöryhmästä perusteella solunpintamarkkereiden ja vahvistus niiden kasvainta aloittamaan toiminnan vierassiirrekokeissa elinsiirtoja määrityksissä käytetään yleisesti menettelyt eristämistä ja tunnistamista CSCS kasvaimen kudoksista tai solulinjoista [11]. Vaikka CD133, CD44, EpCAM käytettiin laajasti solunpintamarkkereiden paksusuolen syövän kantasoluja, oli vielä epäilee seuraavilla solunpintamarkkereiden [12], [13]. Side väestöstä (SP) solut eristäminen olivat aikoinaan rikastuttaa syövän kantasoluja. Mutta useat tutkimukset osoittivat todisteita vastaan ​​välisestä assosiaatiosta SP solujen ja syövän kantasolut [14], [15], [16], [17]. Viime aikoina yhä tutkijat ovat raportoineet, että tarttumaton, kolmiulotteinen (3D) kasvain pallot seerumittomissa olosuhteissa voisi tehokkaasti rikastuttaa syövän kantasoluja [18], [19], [20]

in vitro

. Näin ollen, tätä menetelmää on sovellettu rikastuttaa paksusuolen syövän kantasoluja esillä olevassa tutkimuksessa.

endoteelisolujen kantasolujen (EPC), pieni alapopulaatio mononukleaaristen solujen fraktio ääreisverenkierrossa, pääasiassa peräisin luuytimestä peräisin solut, joilla on kyky erilaistua kypsiksi endoteelisolujen [21], [22]. EPC jättää luuytimen ja rekrytoida sivustoille vaativat verisuonten korjausta seuraavat kaltevuudet kasvutekijöiden ja sytokiinien, joita vapautuu verenkiertoon mukaan loukkaantunut kudosten tai kasvainten, ja sitten edistää verisuonten muodostumiseen [23], [24]. Viimeaikaiset todisteet osoittivat, että kiertävä EPC tärkeä rooli tuumorin uudissuonittumisen, kasvaimen kasvu, ja etäpesäkkeiden [25], [26], [27], [28], [29].

Vaikka osuus EPC tuumorin neovaskularisaatio on osoitettu useiden syöpätyyppien, vuorovaikutus EPC ja paksusuolen syövän kantasoluja ei ole raportoitu. Tarkoituksena oli selvittää selvittää bionomics paksusuolen syövän kantasoluja ja rooli toimimaan yhdessä sekä CSCS ja EPC: kasvun ja etäpesäkkeiden paksusuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki kokeet, joihin liittyy ihmisen osallistujaa (mukaan lukien kokoelma ihmisen napanuoran verestä ja paksusuolensyöpä näytteet) on hyväksynyt Medical Research Ethics komitean Sun Yat-sen University, ja johdetaan periaatteiden mukaisesti ilmaistu julistuksessa Helsingin. Kaikki osallistujat mukana tutkimuksessa allekirjoitti tietoisen suostumuksen muotoja ja kaikkia eläinkokeet suoritettiin noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita. Ja tämä projekti hyväksyi Medical Research Animal Ethics komitean Sun Yat-sen University.

Cell Culture

HCT116 (ATCC, CCL-247) ja HT29 (ATCC HTB-38) paksusuolen syöpä solulinjoja ylläpidettiin DMEM /F12, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 200 U /ml penisilliiniä, 200 ug /ml streptomysiiniä. Tumorsphere media (kutsutaan myös seerumittomalla väliaineella, SFM) koostui DMEM /F12-alusta täydennettynä 1 x B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), rutiini insuliinin (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml penisilliiniä ja 200 ug /ml streptomysiiniä. 3D suspensioviljelmäolosuhteissa, HCT116 ja HT29 kasvatettu kaksiulotteinen yksikerroksista pilkottiin trypsiinillä, suspendoitiin uudelleen, ja sitten ympättiin tiheydellä 2 x 10

6 solua SFM 100 mm ultra-low kiinnitys astiat (Corning) at 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO2:? 95% ilma-atmosfäärissä.

havaitseminen CD133 Expression virtaussytometrialla

Solut peräisin yksikerrosviljelyissä ja jousitus aloilla 7. päivänä sen jälkeen primääriviljelmässä havaittiin ekspressiota varten CD133. Solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, ja sen jälkeen solun suspensioita inkuboitiin 4 ° C: ssa 01:10 FITC-konjugoitua hiiren monoklonaalinen anti-ihmis-CD133 Ab (Miltenyi Biotec) 45 minuutin ajan pimeässä. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: 1% BSA ja uudelleensuspendoitiin 400 ui kylmää PBS 1% BSA virtaussytometriseen analyysiin 1 tunnin kuluessa.

Self-uudistaa ja Multi-erilaistuminen määritys

sferoidi solut hajotetaan yksittäisiksi soluiksi ja maljattiin 6-kuoppaisille levyille 100 solua per kuoppa 2 ml SFM. Arvioidaan itse uudistaa kapasiteetti pallomaisten solujen solu immunofluoresenssivärjäyksen of Lgr5 ja CK20 tehtiin 7 päivän kuluttua ”viljely. Solujen erilaistuminen indusoitiin viljelemällä DMEM /F12, johon oli lisätty 10% FBS: ää yhteistä pulloihin. Neljä viikkoa myöhemmin, saman solun immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin, ja ilmaus CD133 määritettiin FCM edellä kuvatulla tavalla.

Cell Proliferation ja pesäkemuodostusta

yksisoluiset suspensiot pallomaisten ja kiinnittymättömät solut valmistettiin ja ympättiin 1 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja viljeltiin joko SFM tai seerumia sisältävässä väliaineessa 24 tunnin ajan. Solujen lisääntymisen suoritettiin päivänä 1, 2, 3, 4, 5, 6, ja 7, käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Levy pesäkemuodostusta suoritettiin määrittämiseksi pesäkemuodostuksen tehoa solun neljään ryhmään. Yksisoluiset suspensiot maljattiin 1 x 10

2 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille, ja niitä viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa 37 ° C: ssa 5% CO 2: ssa 2 viikkoa. Sitten levyt värjättiin Giemsa-Wrightin tahra. Pesäkkeiden lukumäärä kussakin kuopassa laskettiin ja kuvattiin. Kokeet suoritetaan itsenäisesti vähintään kolme kertaa.

tasalaatuisuuden ja heterogeenisuus Adhesion Pitoisuus

adheesio solujen kyky ECM testattiin fibronektiinin (FN) pinnoitettu 96-kuoppaisille levyille (Corning) . Yksisoluiset suspensiot pallomaisten ja kiinnittyneet solut maljattiin (10

5 /kuoppa), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 h, pestiin sitten PBS: llä poistamaan ei-liima-soluja. Delt OD 570 nm: n aallonpituudella määritettiin vastaamaan FN tarttumattomat solut käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Adheesiota solujen kyky homogeeninen soluihin testattiin käyttäen yksikerrossoluissa-päällystetty 96-kuoppalevyille. Sferoidi ja kiinnittyneet solut maljattiin 10

5 per kuoppa, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min, 90 min, ja 120 min. Sitten ei-liima solut laskettiin ja homotyyppisessä liima aktiivisuus laskettiin käyttämällä kaavaa: homotyyppisessä tarttuvuus (%) = (solujen kokonaismäärä – tarttumaton solua) /solua yhteensä x 100%.

Migration ja Invasion analyysit

Muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin 24-kuoppaisella levyllä siirtokuoppaan jaostoa 8 um huokosia polykarbonaatti suodatin insertit (Corning). Kaikkiaan 5 x 10

4 tai 10

5 erottaa sferoidiviljelmiä tai kiinnittyneitä soluja ympättiin päällystämättömiä tai Matrigel kuorrutettu insertit 100 pl seerumia insertit kulkeutumista tai invaasion määritykset vastaavasti. Alakammioissa täytettiin 0,5 ml: lla 10% FBS: ää täydennetyssä DMEM /F12-elatusaineessa. 24 tunnin kuluttua ja /tai 48 h, solut yläpuolella suodattimen poistettiin ja solut alemmalla pinnalla insertin kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla. Määrä värjäytyneiden solujen laskettiin valomikroskoopilla. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot -analyysi

Yhteensä solu-uutteita erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (Millipore) ja ICAM-1, CXCR4 ja VEGF tunnistus. Membraanit pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween (TBST, joka koostuu 10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20), estetty 1 h huoneenlämmössä 5% rasvaton maito TBST: ssä, ja tutkitaan sitten 1 h huoneenlämmössä anti-ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnologies), anti-CXCR4 (Abcam), anti-VEGF (BD Pharmingen) ja anti-GAPDH (Peprotech). Inkuboinnin jälkeen piparjuuren peroksidilla konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, immunoreaktiivisia proteiineja havaittiin ECL havaitsemisjärjestelmä (Millipore). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA-proteiinin iinianalyysikitissä (ThermoScientific Biosciences).

eristäminen ja arviointi EPC

Mononukleaariset solut eristettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla ihmisen napanuoran verestä ja viljellään fibronektiinin -päällystettyihin pulloon käyttäen M199 täydennetty 20% FBS: ää ja 1% otteita hiiren aivokudokseen. EPC puhdistettiin perustaen eri sitoutumista korko, ja tarttumattomat solut 24 tunnin siirrettiin toiseen fibronektiiniä päällystetty pulloon. 14 päivän kuluttua ”Viljelyn EPC inkuboitiin PE-CD133, FITC-CD34, PE-VEGFR2 tai isotyypin IgG valvontaa ja tunnistetaan virtaussytometrialla edellä kuvatulla tavalla.

Cell Proliferation ja muutto EPC

Single-solususpensiota EPC siirrostettiin 2 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja viljeltiin M199: ssä, joka sisälsi 0, 20%, ja 40% supernatantista pallomaisten tai kiinnittyneitä soluja. Solujen lisääntymisen suoritettiin päivänä 1, 2, 3, 4, 5, 6, ja 7, käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Migration analyysit suoritettiin arvioimiseksi rekrytointia EPC mukaan pallomainen tai kiinnittyneitä soluja. Single-solususpensiota EPC ympättiin 5 x 10

4-soluja kuoppaa kohti insertit 100 ui seerumia. Alakammioissa täytettiin 0,5 ml: lla DMEM /F12, joka sisälsi 40% supernatanttia pallomaisten tai kiinnittyneitä soluja. 24 tunnin kuluttua, siirtyneet solut laskettiin, kuten kuvataan aikaisemmin. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

In vitro

kapillaariputki Formation

supernatantteja HT29, HT29 Sphere, HCT116 ja HCT116 Sphere lisättiin 24-kuoppaisille levyille (Corning Inc ) päällystetty kasvutekijän vähensi matrigeelin (BD Biosciences). Kuvaamaan, jos putken muodostumiseen kapasiteetti EPC voidaan vaikuttaa estämällä VEGF, bevasitsumabi (Avastin, VEGF monokloonausta vasta-aine, Genentech Inc.) lisättiin supernatanttiin pallomaisten solujen konsentraationa 0,25 mg /ml kaksi muuta ryhmää [30], [31]. Sitten yhteensä 5 x 10

4 EPC ympättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO2 3-30 h. 24 tunnin kuluttua, kapillaariputket laskettiin sattumanvaraisesti aloilla kustakin kuopasta. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

ELISA

osoittamiseksi paracrine vaikutus syövän kantasoluja ja tuloksen vahvistamiseksi VEGF tunnistusta Westerm Blot -analyysillä, tutkimme VEGF eritystä syövän kantasoluja käyttämällä kvantitatiivinen menetelmä. VEGF-pitoisuus supernatantissa pallomaisten /kiinnittyneet solut määritettiin ELISA: lla (R 0,05 tai 0,01 katsottiin merkitseväksi tai erittäin merkittäviä tilastollisesti.

Tulokset

Generation ja karakterisointi Colonospheres

Sekä HCT116 ja HT29 koolonkarsinoomasoluissa kasvoi suuri pyöreä, irrallinen kelluva pallomainen pesäkkeet (kutsutaan colonospheres), kun ne viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa, jota oli täydennetty 1 x B27, 20 ng /ml EGF: ää, 10 ng /ml bFGF: ää (kuvio 1). Taajuus pallo muodostavien solujen määritettiin suorittamalla äärimmäinen rajoittavan laimennuksen analyysi (ELDA) vanhempien ja colonospheres johdettuja HCT-116-soluissa. Taajuus muodostaa palloja havaittiin olevan 5,5 kertaa korkeampi soluissa, jotka ovat peräisin colonospheres kuin niillä, kantasolulinjoista.

Sekä HCT116 ja HT29 voivat muodostaa suuri pyöreä, irrallinen kelluva colonsphere 50-100 um, kun viljellään SFM. Kun sferoidi soluja viljeltiin 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa, kelluva pallomainen solujen kiinni muovi-, vähitellen siirtyneet colonspheres ja muuttuu kiinnittyneitä soluja.

Rakeiden solut osoittivat korkeampaa CD133 ja Lgr5 (tunnetaan paksusuolen CSC markkereita), mutta alemmilla tasoilla eriytetyn epiteelisolujen merkki CK20 kuin vastaava vanhempien soluja. Osuus CD133-positiiviset solut havaittiin olevan vähemmän kuin 1% vanhempien solulinjoissa, mutta yli 80% havaittiin sferoidin soluissa (kuvio 2). Kun colonospheres alistettiin immunofluoresenssivärjäystä Lgr5 selvää Lgr5 värjäytyminen havaittu pinnalla kaikkein sferoidi solujen, että niissä on CSCS in colonosphere (kuvio 2). Kun sferoidi soluja viljeltiin 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa, ne kiinni muovi-, vähitellen siirtyneet paksusuolen aloilla ja muuttunut tarttuneet solut morfologisesti. Virtaussytometria ja immunofluoresenssilla tutkimus osoitti alassäädetty CD133 ja Lgr5 ilmaisutapoja sääteli CK20 kuluttua 4 viikon viljelemisen (kuva 2). Tulokset viittaavat siihen, että CSCS oli tehokkaasti rikastuneet pallomainen soluissa, ja heillä on kyky itsensä uudistaa ja multi-erilaistumista.

CD133 (tunnetaan syövän kantasoluja markkeri) ilmaisu nousee ≤1.2% jopa 60 % -80%, kun viljellään SFM, mutta alennettu 5% -10%, kun colonsphere muuttui takaisin tarttuneet solut. Sama muutos Lgr5 (tunnetaan krypta kantasolu markkeri) lauseke löytyy taas CK20 ilme, markkeri eriytetyn epiteelisolujen, osoitti haitalliset muutokset.

Sferoidiviljelmiä Solut Näyttö Suurempi kapasiteetti leviämisen ja klooni Formation

täsmentyvät onko pallomainen solut ovat kapasiteettia suurempi solujen lisääntymistä käyttämällä CCK-8 määrityksessä. Planktonin kasvu pallomaisten soluista oli suurempi kuin niiden vanhempien vastine ajan jälkeen sopeutumisen seerumin sisältävässä alustassa (kuvio 3A ja 3B). Ja kapasiteettia pesäkkeenmuodostusta sferoidiviljelmiä soluissa ryhmissä oli suurempi kuin niiden vanhempien vastine (Kuva 3C ja 3D).

(A-B) leviämisen HCT116 ja HT29 sferoidiviljelmiä solut olivat korkeampia kuin niiden vanhempien kollegansa ajan jälkeen sopeutumisen seerumin sisältävässä väliaineessa. (C-D) kapasiteetti pesäkkeenmuodostusta sferoidiviljelmiä soluissa ryhmissä oli suurempi kuin niiden vanhempien vastine.

Sferoidiviljelmiä Solut Display Ala Adhesion mutta Korkeampi

in vitro

muuttavien /invasiivisia kapasiteetti

tutkimiseksi pahanlaatuinen profiilia pallomainen solujen teimme in vitro arvioimiseksi tarttumista ja muuttavien /invasiivisia kapasiteetti sferoidiviljelmiä solujen verrattuna niiden kiinnittynyt kollegansa. Tulokset soluadheesioanalyysissä osoitettu, että pallomainen soluilla on alhaisempi kapasiteetti sekä tarttumisen FN (yksi keskeinen ECM komponentit) ja tarttuvuus niiden homogeeninen naapureita, verrattuna niiden vanhempien soluja (kuvio 4A ja 4B). Sitten CXCR4 ja ICAM-1 ilmentymisen HCT116 /HT29 sferoidiviljelmiä solut tutkittiin ja verrattiin niiden vanhempien soluihin. ICAM-1 taso oli vaatimattomasti alassäädetty, kun CXCR4 ilmaisu oli säädellään ylöspäin HCT116 /HT29 sferoidiviljelmiä soluja verrattuna HCT116 /HT29 yksikerrossoluissa (kuvio 4C).

(A-C) Sferoidiviljelmiä solut ovat pienemmät kapasiteetit molempien kiinnikkeistä FN (A) ja niiden homogeeninen naapurit (B), verrattuna niiden vanhempien soluihin. ICAM-1 ilmentymisen speroid soluissa oli vaatimattomasti alassäädetty, kun CXCR4 ilmentyminen oli säädelty verrattuna HCT116 /HT29 yksikerrossoluissa vastaavasti (C). (D ja E) HCT116 /HT29 sferoidiviljelmiä solut osoittivat 3,8-kertainen (p 0,01) ja 4-kertainen (p 0,001) nousu kemotaktinen potentiaali 24 h (D). Enemmän sferoidiviljelmiä solut ilmeisesti havaittiin hyökätä matrigeelin verrattuna niiden vanhempien kollegansa (p 0,001 ja p 0,05, vastaavasti, E).

Käyttämällä TranswellTM muuttoliike kammioita, huomasimme, että sferoidiviljelmiä solut näyttää merkittävä kasvu solun liikkuvuus. Verrattuna HCT116 /HT29 kiinnittyneet solut, HCT116 /HT29 pallomainen solut osoittivat 3,8-kertaisesti (p 0,01) ja 4-kertaisesti (p 0,001) nousu kemotaktinen potentiaalia 24 h, vastaavasti (kuvio 4D). Nämä solut osoittivat myös suurempi kyky hyökätä Matrigel päällystettyjä teriä TranswellTM muuttoliike kammioissa. Enemmän HCT116 /HT29 sferoidiviljelmiä soluja ilmeisesti havaittiin hyökätä matrigeelin verrattuna vastaaviin kiinnittyneitä soluja (p 0,001 ja p 0,05, vastaavasti) (kuvio 4E). Nämä tulokset osoittavat, että sferoidiviljelmiä solut ovat varustettuja pienempi tarttuvuus, mutta korkeampi muuttavien /invasiivisen kapasiteetti, toiminnallinen liittyvä fenotyyppi kasvaimen aggressiivisuus.

Sferoidiviljelmiä Solut Edistää leviämisen, Migration and Tube muodostuminen EPC Through Up-säätelevä VEGF Expression

Puhdistetut EPC saatiin ihmisen napanuoran verestä. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että EPC myöhemmässä vaiheessa näytetään tietty ilmentymisen CD34 ja CD133, mutta korkean tason ekspressiota VEGFR2 (kuvio 5A-5C). Solujen lisääntyminen ja migraatio EPC aiheuttama supernatantteja pallomaisten solujen olivat korkeammat kuin heidän kollegansa (kuvio 5D ja 5E). Putki muodostuminen määrityksessä osoitti, että enemmän putkia muodostunut pallomainen soluissa ryhmässä kuin tarttuvien solujen ryhmä. Lisäksi, kun 0,25 mg /ml bevasitsumabi (Avastin, VEGF monoklonaalinen vasta-aine) lisättiin supernatanttiin pallomaisten solujen putken muodostumiseen kapasiteetti EPC tukahdutettiin (kuvio 6A). Sitten VEGF eritteiden supernatanteissa sferoidiviljelmiä /kiinnittyneet solut havaittiin käyttämällä ELISA. Tulokset osoittivat, että VEGF: n pitoisuus supernatantissa kiinnittyneitä soluja oli vähemmän kuin pallomainen solut (kuvio 6B). Ilmaisu pallomaisten /tarttuneet solut arvioitiin Western blot (kuvio 6C). Tulokset osoitti, että VEGF voi olla tärkeä rooli vaikutus pallomainen solujen EPC, joka ehdotti, että sferoidiviljelmiä solut voivat edistää angiogeneesiä ja EPC kautta ylä- säätelevät VEGF ilme.

(AC) EPC noudattaa Fn päällystetty pulloon jälkeen 72 tunnin ja EPC: klooneja voidaan nähdä viikon kuluttua (A), ja läsnä cobbles kaltainen merkki kahden viikon jälkeen (B). EPC myöhemmässä vaiheessa näyttää tiettyä ilmaisua CD34 ja CD133, mutta korkea ilmentymisen VEGFR2 (C). (D, E) Solulisääntyminen (D) ja muuttoliike (E) EPC käsiteltiin supernatantteja pallomaisten solujen olivat korkeammat kuin niiden vastine.

(A) Tube muodostumista EPC käsiteltiin supernatantteja pallomaisten solut oli suurempi kuin heidän kollegansa. Ja putken muodostumiseen EPC tukahdutettiin kun tukkia toiminto VEGF bevasitsumabi. (B) VEGF-pitoisuudet supernatanteissa pallomaisten solujen olivat korkeammat kuin tarttuvien solujen. (C) Korkeampi VEGF ilmentymistä havaittiin pallomainen soluissa verrattuna heidän kollegansa.

Sferoidiviljelmiä soluilla Korkeampi Kasvaimia synnyttävä ja Metastaattinen Mahdolliset

in vivo

ja EPC voi lisätä nämä Valmiudet

sferoidiviljelmiä solut osoittivat merkitsevästi korkeampi tumorigencity kuin kiinnittyneitä soluja (kuvio 7A, 7B ja 7E). Kun 2 x 10

6 solua ympättiin nude-hiiriin, kaikki hiirille kehittyi kasvaimia. Siirrettyjen kasvainten vahvistettiin, kuten paksusuolen syöpiä värjäys hematoksyliini-eosiinilla. Ja tilavuudet ihonalainen kasvain sferoidiviljelmiä soluissa ryhmät olivat huomattavasti korkeammat kuin tarttuvien solujen ryhmiä. Lisäksi määriä ihonalaisen kasvaimen pallomainen solujen plus 1/10 EPC ryhmät olivat korkeampia kuin puhtaan pallomainen solujen ryhmien (kuvio 7C, 7D ja 7F). Mutta ei havaittu merkittävää eroa puhtaiden pallomainen solujen ja pallomainen soluja plus 1/100 EPC: (tietoja ei näytetty). Sitten verisuonet tiheys kasvainkudoksissa arvioitiin käyttämällä CD31 immunofluoresenssivärjäyksen. Enemmän verisuonia löytyivät sferoidiviljelmiä soluissa ryhmässä verrattuna kiinnittyneet solut ryhmä ja vielä angiogeneesiä kasvainkudoksessa havaittiin yhdistetyssä ryhmässä HCT116 pallo plus 1/10 EPC (kuva 7G-7J). Ja MVD laskettiin mukaan ei-spesifisen polyklonaalisen CD31-vasta-aine. Jotta määrittämiseksi EPC osuus, teimme IF värjäystä käyttäen ihmisen spesifisellä monoklonaalisella CD31-vasta-aine. Tulos osoitti enemmän verisuonia yhdistetyssä ryhmässä HCT116 pallo plus EPC kuin puhdas sferoidiviljelmiä soluja (kuvio 7K-L).

(A-F) Rakeiden solut osoittivat merkitsevästi korkeampi tumorigenecity kuin kiinnittyneitä soluja (A, B, E). Määrät ja ihonalaisen kasvainten pallomainen Solut ja EPC ryhmät olivat suurempia kuin pallomaisten solujen ryhmien (C, D, F). (G-J) mikroverisuonitiheys (MVD) kasvaimen kehittämä HCT116 pallomainen soluja (H) oli suurempi kuin HCT116 (G). Korkein MVD näistä ryhmistä havaittiin kasvainkudoksessa kehitetty HCT116 alalla plus 1/10 EPC: (I, J). Ja lisää verisuonten kehittynyt ihmisen EPC in HCT116 alalla plus EPC ryhmä (L) havaittiin kuin puhtaan sferoidiviljelmiä solujen ryhmän (K). (M) HCT116 sferoidiviljelmiä solut kehittyi maksan metastaasipesäkkeiden kuin HCT116.

Koska maksa etäpesäke koski, neljä hiirtä (4/5) kehittyi maksan etäpesäke pallomainen soluissa ryhmässä, mutta vain yhdellä hiiren (1/5) teki kiinnittynyt ryhmään. Etäpesäkkeitä vahvistettiin myös, kuten paksusuolen syöpiä värjäys hematoksyliini-eosiinilla (kuvio ei ole esitetty). Tuloksena maksan metastaasipesäkkeiden laskenta osoitti samanlaisia ​​tuloksia (kuvio 7M). Yleinen olosuhteet hiiristä pallomainen soluissa ryhmässä ovat huonommin kuin kiinnittyneet solut ryhmässä, ja jotkut heistä kehittyi vatsaonteloon sekä voimakas laihtuminen. Ja ei ollut merkittävää eroa sferoidiviljelmiä solujen plus EPC (suhteella 10:01 ja 100:1) ryhmiä ja sferoidiviljelmiä solujen ryhmiä (tuloksia ei ole esitetty).

Clinical Evidence for Cancer Kantasolut edistää Angiogeneesi in Human Colon syövät

Tukeaksemme kokeellisia havaintoja, tutkimme onko paksusuolensyöpä kantasolut edistävät angiogeneesiä sisällä ihmisen paksusuolen syöpiin, ja normaali limakalvo samasta potilaasta kuin kontrolli. Immunofluoresenssivärjäyksellä on CD133 /Lgr5 (paksusuolen syöpä kantasolujen merkkiaine) ja verisuonen EY markkeri CD31 tehtiin. Kuten me kaikki tiedämme, on enemmän pienten verisuonten syöpäkudoksessa kuin terveessä kudoksessa. Tämän lisäksi olemme havainneet, että suurempi mikroverisuonitiheys alueella rikastuttaa syövän kantasoluja tuore näyte ihmisen paksusuolen syövän (kuvio 8).

(A) Lisää pienten verisuonten syöpäkudoksessa kuin normaali kudos havaittiin immunofluoresoivalla värjäys CD133 ja CD31 normaalin limakalvon ja paksusuolen syöpä. Ja korkeampi MVD löytyivät alueella rikastaa CD133

+ syövän kantasoluja paksusuolisyöpäkudoksessa. (B) Korkeampi MVD (CD31

+) havaittiin alueella rikastaa Lgr5

+ syövän kantasoluja paksusuolisyöpäkudoksessa.

Keskustelu

70-luvulla viime vuosisadan, Fidleriltä IJ et al. [32] ehdotetaan käsite kasvaimen heterogeenisyys, joka olettaa oli erilaisia ​​fenotyyppejä kasvainkudoksessa. Syöpä kantasolujen teoria muotoiltu perustuu tähän käsitteeseen. Syöpä kantasolujen määritellään yleensä pieni osa-populaatio kasvainsoluja itseuudistumiseen ja monisuuntainen erilaistuminen potentiaalia [11]. Tähän asti olemassa syövän kantasoluja on vahvistettu useissa kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien paksusuolen syöpä. Tämän hypoteesin, pieni alapopulaatio syövän kantasoluja oli joissa koko ominaisuus maligniteetti, mukaan lukien ääretön proliferaatiota, invaasio ja metastaasi, uusiutumisen ja kestävyys hoidon.

Nykyisin laajasti käytetty menetelmä eristää tai rikastaa paksusuolen syöpä kantasolut on solulaji perustuu solupinnan, kuten CD133, Musasai-1, CD44, EpCAM, Lgr5 jne Ricci-Vitiani L et al. raportoi CD133

+ solujen mikä on noin 2,5% kasvaimen solut ovat tumorigeeniset soluja paksusuolensyöpä [33]. Ihonalaisen paksusuolensyöpä CD133

+ solujen helposti jäljentää alkuperäisen kasvaimen immuunivajaissa hiirissä, kun taas CD133

– soluja ei kehittynyt kasvaimia. Kuitenkin oli vielä monia erilaisia ​​lausuntoja näistä syövän kantasolujen merkkiaineita. Esimerkiksi, Shmelkov SV ehdotetaan, että CD133 ilmentyminen ei rajoitu kantasoluja, ja molemmat CD133

+ ja CD133

– metastaattinen paksusuolen syöpäsoluissa aloittaa kasvaimia [12]. Jotkut tutkijat raportoivat väriaine-effluxing puolella väestöstä soluja, jotka ilmentävät ABCG2, ATP-sitova kasetti puoliksi kuljettaja, voitiin eristää syövän kantasoluja [34], [35], [36]. Kuitenkin useissa tutkimuksissa ilmeni merkkejä vastaan ​​välisestä assosiaatiosta SP väestöstä ja syövän kantasoluja. SP-soluja eristettiin MKN28 mahasyöpä solut eivät tuottaneet kasvaimen ksenograftimallia [37]. Lisäksi SP ja ei-SP solut koolonsyöpäsolulinjaa osoittamaan vastaavaa multipotentti erilaistumista kapasiteettia ja vastaavia tuumorigeenisyystesti vierassiirrekokeissa malli [38].

Tässä tutkimuksessa saimme kasvain pallojen HCT116 ja HT29 paksusuolisyöpäsolulinjassa linjat viljelemällä näitä soluja seerumittomassa elatusaineessa [39], [40]. Ja seuraava analyysi osoitti, että CD133 ja Lgr5 ilmentymistä näiden sferoidiviljelmiä solujen oli suurempi kuin niiden vanhempien vastine, kun CK20 ilmentyminen oli alempi joka edustaa eriytettyä endoteelisolujen. Ristiriitaiset fenotyypit havaittiin, kun pallomainen solut indusoitiin erilaistumaan in FBS sisältävässä alustassa.