Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikutus kultananopartikkeleilla keuhkosyöpään solujen ei ole vielä selvä. Tässä tutkimuksessa selvitimme sytotoksisuus ja solujen invaasiota aktiivisuuden keuhkosyövän soluista hoidon jälkeen kultananopartikkeleista ja osoitti, että pienet kultananopartikkeleilla voidaan endosytoidut keuhkojen syöpäsoluja ja että ne helpottavat soluinvaasiota. Kasvu A549-solut estettiin hoidon jälkeen 5 nm kultananopartikkeleilla, mutta soluinvaasiota lisääntynyt. Endosytoidut kultananopartikkeleilla (koko, 10 nm) erityisesti edisti hyökkäyksen aktiivisuutta 95D soluja. Kaikki nämä vaikutukset kultananopartikkeleilla ei havaittu hoidon jälkeen suurempia hiukkasia (20 ja 40 nm). Tehostettu hyökkäys aktiivisuus voi liittyä lisääntynyt ekspressio matriksimetalloproteinaasi 9 ja solujen välinen adheesiomolekyyli-1. Tässä tutkimuksessa saimme todisteita vaikutuksesta kultananopartikkeleilla keuhkosyöpään solujen invaasiota in vitro. Lisäksi matriksimetalloproteinaasi 9 ja solujen välinen adheesiomolekyyli-1, keskeiset modulaattorit soluinvaasiota, todettiin säänneltävä kultananopartikkeleita. Nämä tiedot osoittavat myös, että vasteet A549 ja 95D solujen kultananopartikkeleilla on merkittävä suhde niiden ainutlaatuinen koko riippuvia fysikokemialliset ominaisuudet. Siksi tämä tutkimus tarjoaa uuden näkökulman solubiologian tutkimukseen nanolääketieteessä.

Citation: Liu Z, Wu Y, Guo Z, Liu Y, Shen Y, Zhou P, et al. (2014) Effects of sisäistetty kultananopartikkeleilla kanssa Osalta Sytotoksisuus ja Invasion aktiivisuus Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (6): e99175. doi: 10,1371 /journal.pone.0099175

Editor: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 helmikuu 2014; Hyväksytty: 12 toukokuu 2014; Julkaistu: 05 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat avustusta National Science Foundation of China (No.81270428 ja 81300999). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aiemmat tutkimukset tunnistettu että kultananopartikkeleilla (Au-NP) osoittaa vähän sytotoksisuus huolimatta tehokas sisäänottoa ihmisen soluihin endosytoosin [1], [2], mikä tekee niistä sopivia ehdokkaita nanolääketieteeseen. Sitä paitsi niiden biologinen yhteensopivuus, että ne on helppo syntetisoida, luonnehtia ja pinta muokkaamaan osaltaan houkutella paljon huomiota erilaisissa biolääketieteen sovelluksissa. Au-NP on tutkittu lääkeannostelun ajoneuvot ja photothermal hoito ja molekyylikuvantaminen työkaluja mahdollisille biodiagnosis [3], [4]. Nanoparticle perustuvia terapeuttisia strategioita syövän hoidossa perustuvat pääasiassa toimittamisesta kemoterapeuttisten aineiden apoptoosin [5]. Ensisijainen syitä käyttää nanohiukkasia kantajina terapeuttista toimitus on luoda multimodaalisia toimintoja, kuten kuvantaminen tai kohdistamisesta lisätä kudosten läpäisevyyttä ja paikkasidonnainen lääkkeen kertymistä ja vähentää sivuvaikutuksia terveisiin kudoksiin [6]. Tällä hetkellä Au-NP käytetään eri biolääketieteen sovelluksissa: ei vain voi niitä käyttää tukirunkoja varten yhä voimakas syövän lääkeannostelun mutta ne voivat myös toimia transfektioaineille valikoivaan geeniterapiaa ja kiinteäksi syöpälääkkeet [7] – [9] . Dreaden et ai. [8] ovat osoittaneet, että kohdennettu Au-NP ovat omiaan muuttamaan solusyklin, kuten solunjakautumista, signalointi, ja leviämisen.

Huolimatta laajasta soveltamisesta Au-NP, selkeä käsitys siitä, miten biologisten järjestelmien vastata että nanohiukkaset on elintärkeää, ja luonnehdinta ainutlaatuinen koko riippuvia fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien Au-NP on kriittinen osa. Aikaisempi tutkimus osoitti, että pinnan koko Au-NP: itä on suuri rooli niiden terapeuttista vaikutusta [10]. Au-NP on hyvin pieni halkaisija (alle 2 nm) voivat tunkeutua soluihin ja solun osiin, kuten tumaan ja olla erittäin myrkyllisiä [11]. Esimerkiksi havaittiin, että pallomainen Au-NP: itä, joiden halkaisija on 1,4 nm aiheuttaa nekroosia ja mitokondriovaurioita erilaisissa solulinjoissa kautta oksidatiivisen stressin mekanismeja, jotka voivat liittyä niiden tunnettujen katalyyttinen, että koko [12]. Tuore tutkimus Connor et al. [1] kertoi, että merkittäviä määriä suurempien Au-NP (esim 18 nm halkaisijaltaan) tunkeutuvat soluihin, mutta että nämä Au-NP eivät luonnostaan ​​myrkyllisiä ihmisen soluihin. Chithrani et ai. [13] tutkittiin suhdetta Au-NP: itä ja HeLa-soluissa, ja ehdotti, että Au-NP: tä tuli soluihin reseptorivälitteisen endosytoosin on kynnys kooltaan noin 50 nm. Koska ei ole turvallisuusmääräyksiä vielä, vaikutus Au-NP soluihin vaatii vielä lisätutkimuksia.

Invasion ja etäpesäkkeiden ovat tärkeitä patologinen ominaisuuksia syöpäsoluja. Invasiivinen kapasiteetti on tärkein yksittäinen piirre, joka erottaa hyvänlaatuista pahanlaatuisten vaurioiden [14]. Todellakin, invasiivisia tuumorisolut voivat välttää kirurginen resektio ja vastaa kasvaimen uusiutumisen. Edistysaskelista huolimatta leikkauksen, kemoterapian ja sädehoidon, uusiutuminen on lähes väistämätöntä läsnäollessa aggressiivisen metastaaseja [15], [16]. Prosessi ja metastaasit sisältää solujen lisääntymistä, irtaantuu ensisijainen vaurioista, hajoaminen, ja tunkeutumista soluväliaineen (ECM), muuttoliikkeen veren tai imunesteen stream, tarttuvuuden ja kasvu toissijainen elimessä [17]. Aiemmat raportit ovat kuvanneet, että solujen välinen adheesiomolekyyli-1 (ICAM-1) ja matriisimetalloproteinaasi 9 (MMP-9) osallistuvat syöpäsolujen tarttuvuus, invaasio, ja muuttoliike, jotka edistävät syövän etäpesäkkeiden [18]. Nämä tekijät on pidetty prognostisia biomarkkereita keuhkosyövän etenemisen [19]. Lisätutkimukset vaikutuksista Au-NP ilmenemistä näiden proteiinien tarvitaan.

Koska sytotoksisuutta ei voi olla ainoa vaikutus, joka nanohiukkaset voivat aiheuttaa, tässä tutkimuksessa keskityimme soluproliferaatioon, invaasio toimintaa, ja proteiinin ilmentyminen, jotka kaikki voivat vaikuttaa läsnäolo Au-NP: itä. Tärkeyden tutkimiseksi partikkelikoon nanolääketieteessä, päätimme neljä erilaista Au-NP: koot (eli 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm) perusteellisen analyysin tästä järjestelmästä.

Lopuksi päätimme tutkia näitä vaikutuksia kahden ihmisen keuhkosyövän solulinjoja (eli A549 ja 95D), koska keuhkosyöpä on suuri pahanlaatuinen kasvain Kiinassa ja on kasvava esiintyvyys useimmissa kaupungeissa. Vuonna 2010 oli noin 600.000 uudella keuhkosyöpää Kiinassa [20]. Määrien sairastuvuuden nousevat edelleen nopeasti, koska vakavien ilmansaasteiden [21]; kuitenkin, tietämystä biologisten vuorovaikutusten ja vasteita Au-NP ihmisen keuhkosyöpä solut on hyvin rajallinen. Lisäksi saada perusteellisen ymmärtämisen valmistusprosessit, koimme, että oli tärkeää aluksi keskittyä vaikutuksista nanohiukkasten yksittäisiin syöpäsoluihin, eikä koko elimiä, joissa muut tekijät voi vaikeuttaa tulosten tulkintaa. Siksi Tutkimuksen tavoitteena oli saada aikaan tärkeän perustan soveltamista Au-NP keuhkojen syövän hoidossa.

Methods

valmistelu ja karakterisointi sitraatti-Capped Au-NP:

Au-NP: itä (5 nm ja 10 nm) syntetisoitiin käyttäen parkkihappo /sitraattiliuosta, jossa parkkihappo roolissa pelkistimen ja sitraatti toimii stabilointiaineena [22]. Kunkin synteesi kahdesta ensimmäisestä liuosta tarvitaan: (a) 1 ml: ssa 1% (w /v) HAuCl

4 liuosta, joka lisättiin 79 ml: aan vettä; ja (b) seosta, joka koostuu 4 ml 1% (w /v) sitraattiliuosta, 0,7 ml tai 0,1 ml: ssa 1%: parkkihappo, ja vettä (saavuttamiseksi lopulliseen tilavuuteen 20 ml). Sekä (a) ja (b) liuoksia kuumennettiin 60 ° C: ssa vesihauteessa, ja sitten liuos (b) lisättiin (a) jatkuvasti sekoittaen. Saatu Au-NP jäähdytettiin huoneenlämpötilaan (RT) ja seuraavissa kokeissa.

synteesit 20 nm ja 40 nm Au-NP stabiloitu sitraatti-ioneja suoritettiin käyttäen klassisia sitraatti pelkistysmenetelmällä [23] . Kunkin synteesi, 100 ml: lla 0,01% HAuCl

4 liuosta kuumennettiin kiehuvaksi. Valitut määrät (4,5 ml tai 1,0 ml), 1% sitraattiliuosta lisättiin ja kiehumispiste jatkettiin, kunnes liuoksen väri muuttui rubiininpunainen. Sitraatti-capped Au-NP liuos jäähdytettiin luonnollisesti RT.

morfologia Au-NP havaittiin käyttämällä siirto (TEM, JEM-2100EX, JEOL, Tokio, Japani) nopeuttamaan jännite 200 kV. Ultravioletti-näkyvän (UV-Vis) spektrit saatiin Shimadzu UV-3600 spektrofotometrillä alueella 300-1100 nm.

Cell Culture

A549 ja 95D-solujen (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan Academy of Sciences) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (kaikki GIBCO, Invitrogen) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Soluja esi-viljeltiin väliaineessa yön yli ja sitten sitä käsiteltiin joko kanssa tai ilman 50 ug /ml Au-NP liuosta vielä 48 tuntia. Solut kerättiin trypsiini-ethylenediamintetraacetic (EDTA; GIBCO, Invitrogen) irtoaminen logaritmisen kasvuvaiheen ja sentrifugoitiin. Sitten solut suspendoitiin uudelleen DMEM 10% FBS: ää alakulttuurista tai muuta käyttöä.

otto ja TEM tutkimukset

ottoa Au-NP: itä tutkittiin myös käyttämällä TEM. Ennen altistumista Au-NP, A549-solut ja 95D-solut maljattiin pitoisuutena 1 x 10

6 solua per astia 100 mm viljelyastia (Corning, USA), joka sisältää elatusainetta, ja inkuboitiin 37 ° C ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Au-NP jälkeen lisättiin. Altistumisen jälkeen Au-NP: itä 48 tunnin ajan, solut kiinnitettiin 3,7% (v /v) paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 20 minuutin ajan RT: ssä. Sen jälkeen, solut valmistettiin TEM-analyysi seuraavasti: solut kiinnitettiin 1% (w /v) osmiumtetroksidin 2 tuntia, kuivattu luokiteltujen sarjojen 30%, 50%, 70%, 80%, ja 90% etanolia ja käsiteltiin kolme kertaa 100% etanolilla 15 minuutin ajan kutakin. Sitten näytteet upotettiin seokseen, jossa oli hartsia propyleenioksidia polymeroitiin 80 ° C: ssa. Ultraohuet leikkeet TEM valmistettiin käyttäen timantti veitsellä ja näytteet analysoitiin käyttämällä transmissioelektronimikroskooppia.

solunelinkykyisyysmääritys

A549 ja 95D-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille alhaisella yhtymäkohta (2000 solua /kuoppa), niiden annettiin kiinnittyä yön yli, ja käsiteltiin Au-NP (kontrolli, 5 nm, 10 nm, 20 nm, ja 40 nm). 24 tunnin kuluttua, 48 h ja 72 h, solun elinkelpoisuus reagenssilla (Cell laskenta kit-8, Kaiji, Nanjing) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1, 2, 3, ja 4 h, vastaavasti. Absorbanssiarvot 450 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä mikroviljelylevyille levynlukijaa (BioRad) ja solujen elävyys ilmaistuna prosentteina käsittelemättömään kontrolliin (100% solujen elinkelpoisuuden). Vaikutus Au-NP: erikokoisia elinkelpoisuudesta solujen mitattiin kolmena kappaleena, ja kokeet toistettiin vähintään kolmasti.

Apoptosis Detection anneksiini V /propidiumjodidia (PI) värjäys

solut log-vaiheen ympättiin 6-kuoppaiselle viljelylevylle tiheys 1 x 10

5 solua per kuoppa, inkuboitiin 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa, ja annettiin kiinnittyä yön. Käsittelyn jälkeen Au-NP (ohjaus, 5 nm, 10 nm, 20 nm, ja 40 nm) 48 tuntia, apoptoosin ja nekroosin analysoitiin anneksiini V-PI (BD Biosciences) apoptoosin havaitseminen pakki seuraten valmistajan ohjeita. Näytteet analysoitiin käyttäen BD FACS CantoII väline (BD Biosciences).

virtaussytometria analyysi Cell Cycle

Solut kerättiin käyttämällä 0,25% trypsiiniä, 1 mM EDTA-liuoksella ja vahvistetaan 12 h 70% etanolilla 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut sentrifugoitiin 3000 rpm: llä 15 minuutin ajan etanolin poistamiseksi perusteellisesti. Sitten solut pestiin kahdesti 3 ml: lla PBS: ää, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PI värjäysliuoksena ja inkuboitiin 15 minuutin ajan RT: ssä. Värjäysliuos koostui 20 ug /ml PI: n ja 0,2 mg /ml RNaasi A: ta PBS: ssä. Näytteet analysoitiin sen jälkeen käyttämällä BD FACS CantoII väline (BD Biosciences). Kaksikymmentä tuhatta tapahtumaa kerättiin kustakin näytteestä. Prosenttiosuudet solujen G0 /G1, S ja G2 /M vaiheiden solusyklin määritettiin käyttämällä ModFit ohjelmistoa (BD Biosciences).

invaasiomääritys

invaasiomääritys roikkuu soluviljelmässä insertit (8,0 um huokoskoko) esi-päällystettiin 50 ug /ml matrigeeliin (BD Biosciences) yläpinnalle. Soluja esi-viljeltiin väliaineessa yön yli ja sitten sitä käsiteltiin joko kanssa tai ilman 50 ug /ml Au-NP ratkaisu vielä 48 tuntia, sitten solut kerättiin ja 2,5 × 10

5 solua maljattiin 200 ui DMEM 0,2% naudan seerumialbumiinia (BSA) on kammion yläosaan. Alaosassa kuoppaan lisättiin 750 ui DMEM, joka sisälsi 5% FBS: ää. Invaasio määritys suoritettiin 48 h soluviljelmässä yrityshautomo.

Soluja kiinnitettiin korvaamalla viljelyalusta pohjalle ja päälle kammion 4% formaldehydiä PBS-liuos. Kiinnityksen jälkeen 15 minuuttia RT: ssa, kammiot huuhdeltiin PBS: ssä ja värjättiin 0,2% kristallivioletilla 10 minuutin ajan. Pesun jälkeen kammiot viidesti kastamalla ne suuri dekantterilasiin täynnä dH

2O solut (nyt sininen) yläosassa Matrigel kalvon poistettiin käyttämällä useita Q-vihjeitä. Solut poistettiin, kunnes ei enää sinistä väriainetta voidaan poistaa Q-vihjeitä. Sitten solut, jotka jäivät olivat ne, jotka olivat tunkeutuneet ja olivat saavuttaneet pohjan kalvon.

kvantitoitiin myös hyökkäyksen soluihin käyttäen QCM ™ 24-kuoppaisen Cell Invasion fluorometrinen määritys (Millipore), jossa ECMatrix-päällystetyn insertit, mukaan valmistajan ohjeiden. Tämä määritys tarjoaa tehokkaan järjestelmän kvantitatiivinen arviointi hyökkäyksen kasvainsolujen kautta tyvikalvon malli. A549 ja 95D-soluja kasvatettiin 2 d täydellisessä elatusaineessa, joko ilman (kontrolli) tai, kun läsnä on Au-NP: itä (5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm). Lopussa hoidon, solut suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa ja ympättiin (2,5 x 10

5 solua /250 ui) kuhunkin insertti monikerroksinen levy kammion. Seerumia (10%) lisättiin seerumia alemman kammion kemoattraktantti. Sen jälkeen, kun 48-tunnin inkuboinnin aikana 37 ° C: ssa, ei-tunkeutuvat solut poistettiin yläosasta lisää. Seuraavaksi insertit laitettiin puhtaaseen hyvin sisältää esilämmitettyä solujen irtoaminen liuosta ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Insertit poistettiin kuopista, ja lyysipuskuria /väriaine lisättiin sisältävä väliaine irrotettuja soluja 15 minuutin ajan RT: ssä. Sitten seokset luetaan fluoresenssilevylukijaa (Bio-Tek, Synergy HT) käyttämällä 480/520 nm suodatin asetettu. Fluoresenssi mitattiin ilmoitettu suhteellinen fluoresenssin yksikkö (RFU) arvoja.

Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) määritykset

Kokonais-RNA eristettiin käsittelemättömistä ja Au-NP-käsiteltyjen A549 ja 95D-soluissa käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen Life Technology). Käänteistranskriptio (RT) reaktio suoritettiin käyttäen 1 ug kokonais-RNA: ta, joka käänteiskopioitiin cDNA käyttäen oligo-dT-aluketta ja sitten qRT- PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green Mix (Applied Bio-järjestelmät). Aluke sekvenssejä käytettiin PCR olivat seuraavat: ICAM-1, eteenpäin ACACTAGGCCACGCATCTGAT, käänteinen AGCATACCCAATAGGCAGCAA; MMP-9, eteenpäin GGCTACGTGACCTATGACATCCT, käänteinen TCCTCCCTTTCCTCCAGAACA; glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), eteenpäin GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC, käänteinen GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT. PCR suoritettiin 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 1 min 70 ° C: ssa 35 sykliä. Vertailevaa Ct menetelmää käytettiin laskemaan suhteellinen runsaus mRNA ja tulokset kohdegeenin ilmentymistä verrattiin GAPDH ilmaisua. Tulokset saatiin kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Protein määrälliset määritykset

MMP-9-proteiinin ekspressiota supernatantti ja solulysaatti mitattiin käyttämällä MMP paneelin 2 magneettihelmi kit, joka perustuu Luminex tekniikkaa. Lyhyesti, MMP9 capture-aineita (Millipore) konjugoitiin Luminex helmiä (helmet alue 33). MMP-9 havaitseminen vasta-aineita (Millipore) konjugoitiin biotiiniin toimintatapoihin palvelu Millipore. Solut hajotettiin MILLIPLEX MAP lyysipuskuria (Millipore) ja laimennettiin yhtä suurella tilavuudella MILLIPLEX MAP solun määrityspuskurissa (Millipore). MMP-9 capture-vasta-aine helmet laimennettiin 25 ul: aan MILLIPLEX MAP solumäärityksessä puskuria ja lisättiin magneettisen levyn (Millipore). Sitten 25 ui laimennettua solulysaattia tai soluviljelmän supernatantti siirrettiin kuhunkin kuoppaan kiinteä levy ja inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ravistellen. Inkuboinnin jälkeen helmet pestiin kahdesti pesupuskurilla, ja 25 ui havaitsemisen vasta-aineita lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ravistellen. Sen jälkeen, 25 ui MILLIPLEX MAP streptavidiini-fykoerytriini (Millipore) ja inkuboitiin 30 min RT: ssa ravistellen. Lopuksi suojanestettä lisättiin pesun jälkeen, ja signaali luettiin käyttämällä Luminex FLEXMAP 3D ™.

Western Blot analyysi

western blot analyysiä, A549 ja 95D-solut maljattiin dosviljelypulloihin ja käsiteltiin Au-NP (ohjaus, 5 nm, 10 nm, 20 nm, ja 40 nm). 48 tunnin kuluttua, 5-10 x 10

6 solut kerättiin ja lyysattiin jääkylmällä lyysipuskurilla. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin elektroforeettisesti päälle polyvinylideenifluoridi kalvoja. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, 2 h ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kaniinin anti-MMP-9-vasta-ainetta (1:1000, Abcam), kanin anti-ICAM-1-vasta-aine (1:500, Cell Signaling), tai hiiren anti-GAPDH-vasta-ainetta (1:10000, Abmart). GAPDH: ta käytettiin housekeeping-geenin valvontaa ja ekspressiotasot MMP-9 ja ICAM-1 normalisoitiin suhteessa GAPDH. Proteiinit havaittiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-tai anti-hiiri-vasta-aineilla ja visualisoitiin kemiluminesenssin reagenssit varustettu ECL (BioRad, USA). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin ja kvantitoitiin käyttäen ChemiDoc XRS molekyyli- lämpökamera (BioRad).

Tilastollinen analyysi

GraphPad Prism 5 tilastollisia analyysejä ohjelmistoa käytettiin kaikissa tilastollisten analyysien tehty tässä tutkimuksessa ( GraphPad Prism versio 5.00 Windowsille, GraphPad Software, San Diego Kalifornia, USA). Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastolliset vertailut suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin

t

-testiä varten verrattuna kontrolliryhmään. Eroja pidettiin merkittävinä P 0,05.

Tulokset

synteesi ja karakterisointi Au-NP

Au-NP syntetisoitiin sitraatti vähennys menetelmä ilman lisämodifiointia käytettiin kaikki tutkimukset ja ovat tässä kutsutaan muunneltua nanohiukkasia. Määrittää suhde koon ja biologisen toiminnan nanohiukkasten, käytimme Au-NP neljä eri kokoa (5, 10, 20 tai 40 nm), ja tunnettu siitä, ne TEM ja UV-Vis-spektrit (kuvio 1). Hiukkaset osoitettiin olevan kaikilla aloilla, joilla on kapea kokojakauman. Korkea elektronitiheydet Au-NP: itä sekä tasalaatuisuuden muodon ja koon tehnyt niistä erittäin ilmeistä alla lähetyksen elektronimikroskoopilla.

Transmission (TEM) kuvia Au-NP: itä, joiden halkaisija on (A ) 5 nm, (B) 10 nm, (C) 20 nm, tai (D) 40 nm. Sisäkkeet näyttää korkean resoluution kuvia. Mittaviivat 20 nm ja 100 nm (merkitty). E: UV-vis-spektrit Au-NP: 5 nm, 10 nm, 20 nm, ja 40-nm halkaisijat.

sisäistäminen Au-NP

sen tutkimiseksi, Au-NP erikokoisia ristissä solukalvon ja missä ne sijaitsevat, A549 ja 95D-soluja inkuboitiin 48 h, kun läsnä on Au-NP: itä (5, 10, 20, ja 40 nm) täydellisessä soluviljelyalustassa . Kuvio 2 esittää sisäistämisen eri kokoisia Au-NP. Suurin osa hiukkasista löytyivät kalvoon sitoutunut vesikkeleitä tai perinuclear alueen solujen sisällä.

TEM kuvia 200 nm suurennos osoittaa sisäistämisen 25 ug /ml Au-NP: itä eri kokoja (5 nm , 10 nm, 20 nm, ja 40 nm) otetaan (A) A549 ja (B) 95D-solujen 48 tunnin jälkeen hoidon.

mittaaminen sytotoksisuus Au-NP: itä

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään vaikutuksen näiden Au-NP proliferaatioon kahden eri keuhkosyövän solulinjat, A549 ja 95D-soluissa. Sytotoksinen vaikutus neljän Au-NP eri halkaisijat testattiin samana pitoisuutena. Meidän havainnot osoittivat, että 5-nm Au-NP on keskeinen rooli estossa leviämisen Sekä A549 ja 95D-solut 48 tuntia ja 72 tuntia (kuviot 3A ja B). Au-NP, joiden läpimitta on 20 nm ja 40 nm: n näytteillä huomattava tehosta 24 h lähtien edistämisessä leviämisen A549-solujen, kun taas mitään edistäminen havaittu 95D-soluissa (kuviot 3A ja B). Au-NP, joiden halkaisija on 10 nm ei ollut vaikutusta proliferaatioon sekä A549 ja 95D-soluissa. Estävät solujen lisääntymistä, lisäämällä solujen apoptoosin, ja pidätti solut G0 /G1 sykli ilmenee sytotoksisuutta 5 nm Au-NP. Ei ollut mitään merkittävää eroa (P 0,05) apoptoosin ja solusyklin jakelua 10 nm, 20 nm, ja 40 nm AuNP-käsiteltyjen ryhmien (kuviot 3C-H). Nämä tulokset osoittivat, että pienet Au-NP voi olla sytotoksisia ja että halkaisija ei ole ainoa tekijä, joka vaikuttaa solujen lisääntymistä ja vuorovaikutusta Au-NP, joka on hyvin monimutkainen prosessi, joka oikeuttaa lisätutkimukset.

Solu linjat A549 (A) ja 95D (B) logaritmisessa kasvuvaiheessa altistettiin Au-NP: itä 24 tunnin ajan, 48 h, ja 72 h. Solujen elinkelpoisuus laskettiin prosentteina elävien solujen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Kukin tulos edustaa keskiarvoa elinkelpoisuuden ± keskihajonta (SD) on kolmen erillisen kokeen. Apoptosis (C-D) ja solukierron (E-H) analyysit A549 ja 95D-solujen käsiteltiin eri kokoisia Au-NP. Virhe palkit osoittavat SD arvot neljästä itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

invaasiomääritys

tyvikalvon mallia käytettiin arvioitaessa hyökkäyksen aktiivisuutta solujen. Tulokset on esitetty kuviossa 4. Tuloksemme osoittivat, että solujen invaasio nostettiin huomattavasti hoidon jälkeen A549-5-nm Au-NP: itä ja 95D-solujen kanssa 10-nm Au-NP (P 0,05). Sitä vastoin solut sisäistetty 20 nm tai 40 nm Au-NP eivät vaikuta merkittävästi invaasio aktiivisuus (kuva 4). Nämä tulokset osoittavat selvästi ehdotti, että hyökkäys vaikutukset olivat hiukkasten koko- ja riippuvaista solutyypistä.

Kuvat edustavat A549-soluja (A) ja 95D-solut (B), jotka ovat ylittäneet huokoset matrigeelin hyökkäyksen kammio ja vastaavat fluoresenssin intensiteetin tuloksia. * P 0,05. Virhe palkit ilmaisevat SD arvot kolmen erillisen kokeen.

Effects of Au-NP on Expression of MMP-9 ja ICAM-1 in Lung Cancer Cells

Saadaksemme syvempää ymmärrystä tämän ilmiön qRT-PCR suoritettiin mitata mRNA tasot MMP-9 ja ICAM-1-hoidon jälkeen Au-NP. Tulokset osoittivat, että 5 nm ja 10 nm Au-NP erityisesti helpottaa mRNA ICAM-1 molemmissa solulinjoissa (kuviot 5B ja D, P 0,05). MRNA: n ilmentyminen MMP-9 lisääntyi 5 nm Au-NP-käsiteltyjen A549-soluja ja 10 nm Au-NP-käsiteltyjen 95D-soluissa, mutta erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (kuvio 5A ja C). Suoritimme sitten Luminex-pohjaista koetta, kun läsnä on MMP-9 magneettisia helmiä määrittää proteiinin ilmentyminen MMP-9 sekä solulysaatista ja viljelmän supernatantti. Tuloksemme osoitti, että hoito 5 nm Au-NP lisääntyi merkittävästi tasot MMP-9 lysaatissa A549-soluja, kun taas MMP-9 on erityisesti voimistunut lysaatissa 95D-solujen käsittelemällä 10 nm Au-NP: itä (kuvat 6 A B). Vertailut tasoon MMP-9 supernatantissa paljasti, että ei ollut merkittävää eroa (P 0,05) välillä Au-NP-käsitellyn ja Au-NP-käsittelemätöntä A549 ja 95D (kuviot 6 C-D).

tulokset qRT-PCR (A-B) A549 ja (C-D) 95D-solujen kuluttua 48 tunnin inkubointi 5 nm, 10 nm, 20 nm, tai 40 nm Au-NP. * P 0,05, *** P 0,001 vs. kontrolli. Virhejanat osoittavat SD-arvot kolmesta itsenäisestä kokeesta.

kvantifiointi ilmentymisen MMP-9 solulysaatissa (A-B) ja supernatantti (C-D) A549 ja 95D-soluissa, vastaavasti , suoritettiin käyttämällä Luminex tekniikkaa. * P 0,05. Virhe palkit ilmaisevat SD arvot kolmen erillisen kokeen.

Lisäksi olemme tutkineet proteiinin ilmentymisen käyttäen western blotting. Tulokset osoittivat, että MMP-9 ja ICAM-1 ilmentyivät lysaatit A549 ja 95D-soluissa käsittelemällä 5 nm ja 10 nm Au-NP, vastaavasti (kuvio 7); toisin, MMP-9 ja ICAM-1 oli vaimentua käsittelemällä 40 nm Au-NP, mikä viittaa siihen, että Au-NP: itä hiukkaskoko on tärkeä rooli sääntelyn näiden proteiinien. Nämä tulokset kunhan todisteita siitä, että MMP-9 ja ICAM-1, keskeiset modulaattorit soluinvaasiota voitaisiin säädellä Au-NP: itä.

edustavat tulokset osoittavat vaikutuksen Au-NP käsittely ilmaus MMP-9 ja ICAM- 1 A549 (A) ja 95D (B) soluista. Suhteellinen band tiheys MMP-9 ja ICAM-1 keskiarvo kontrolliryhmässä (C-H). Arvot ilmaistaan ​​suhteellinen intensiteetti normalisoidaan GAPDH intensiteetti ja annetaan keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 vs. kontrolli.

Keskustelu

alhaiset tuotantokustannukset ja suhteellisen helposti syntetisoida Au-NP tehdä ne toteuttamiskelpoisia tuleville biolääketieteen sovelluksiin. Kuitenkin siirtyminen Au-NP: alkaen työtason klinikalle, paljon enemmän tietoa tarvitaan tietoa perusvuorovaikutusta välillä nanomittakaavan materiaaleja ja biologisten järjestelmien. Bioturvallisuustason ja biologisesta yhteensopivuudesta Au-NP: itä ovat tärkeitä huolenaiheita, jotka olisi osoitettava ennen tällaisia ​​materiaaleja levitetään biologisten järjestelmien. Samanlainen kuin monissa muissa raporteissa [24], [25], tässä tutkimuksessa, Au-NP oli helppo tarttunut A549 ja 95D-solujen kautta epäspesifinen endosytoosin ja sijaittava soluliman rakkulat. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että pienet Au-NP: itä, joiden halkaisija on 5 nm osoittavat suurta tehoa proliferaation estossa, apoptoosin edistämiseksi, ja pidättämällä solukierrossa G0 /G1 vaiheeseen kaksi keuhkosyövän solulinjat. Sen sijaan ei ole selvää sytotoksisuutta havaittiin 10 nm, 20 nm, ja 40 nm Au-NP-käsiteltyjä soluja, mikä on yhtäpitävä tulosten kanssa muiden tutkimusryhmien. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että pinnan koko, eikä pinta-maksu, on suuri rooli terapeuttisen vaikutuksen Au-NP: [26]. Yleensä Au-NP varten lääkeaineen ja photothermal hoito sovellukset ovat mitoiltaan suurempia kuin 10 nm, joka on riittävä alentamaan pinnan reaktiivisuus ja näin tehdä kultaa ytimiä hyvänlaatuinen. Koon suurempi kuin 6-8 nm on myös optimaalinen esteenä munuaisten kautta ja näin pienentäen verenkierron puoliintumisaika [27]. Yllättäen tuloksemme osoittivat, että leviämisen A549 edistettiin kuluttua 24 h hoidon Au-NP 20 nm tai 40 nm halkaisijaltaan. Tätä ilmiötä ei havaittu 95D-soluissa. Lisäksi 5-nm Au-NP: itä ja 10 nm merkittävästi edistänyt hyökkäyksen A549 ja 95D-soluissa, vastaavasti, kun taas invasiivisia mahdollisuutta ei ollut vaikuttanut läsnäollessa hiukkasista, joiden koko on yli 20 nm. Nämä tulokset tukevat näkemystä, että Au-NP: tä ei yleisesti kohdistaa kaikkiin solutyypit [28]. Coulter et al. havaitsivat, että eloonjääntifraktio Au-NP-käsitellyt solut osoittivat voimakasta riippuvuutta solutyypistä verrattuna käsittelemättömien solujen suhteen säteilylle herkäksi mahdollisia [24].

Tutkimuksessamme parannettu hyökkäys kyky oli mukana merkittävä ICAM-1: n ja MMP-9 ilmentymistä. Invasion läpi ECM on tärkeä askel tuumorimetastaasissa. Syöpäsolut aloittaa hyökkäyksen kiinni ja levittää pitkin verisuonen seinämään. Metalloproteinaasien ovat endopeptidaasit, jotka pystyvät hajottamaan ECM osia, mikä mahdollistaa syöpäsolujen käyttää verisuoniston ja imunestejärjestelmään [29] – [31]. MMP-9 on herättänyt paljon huomiota sen kyvyn hajottaa tyypin IV kollageenia, perusosasta tyvikalvon [32]. Lisääntynyt MMP-9 potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, on raportoitu [33], [34]; Siksi aineet tukahduttamalla ilmaus MMP voi estää syöpäsolujen muuttoliike ja invaasiota [35]. ICAM-1 on edustava adheesiomolekyyli mukana vuorovaikutusta kasvainsoluja, endoteeli, ja ECM. Korkea ICAM-1 ihmisen keuhkosyöpä näytteet korreloi suuremman riskin pitkälle edenneitä syöpiä (vaiheet III ja IV). A549 /ICAM-1-soluja osoitettiin indusoivan in vitro solujen invaasiota, ja in vivo tuumorin etäpesäkkeiden [36]. Denissenko et ai. havaittu, että ICAM-1 downregulation mRNA ja proteiini tasoilla johti vahva tukahduttaminen ihmisen rinta- soluinvaasiota kautta Matrigel matriisi [37]. Huomasimme, että 5 nm ja 10 nm Au-NP tehokkaasti edistää ICAM-1 ja MMP-9 A549 ja 95D-soluissa, vastaavasti, mikä osittain selittää tehostetun toiminnan hiukkasten syöpäsoluinvaasiota.

koska ylössäätely vaikutuksia Au-NP on MMP-9 ja ICAM-1 ilmentymisen A549 ja 95D solun ehdotti, että pienet hiukkaset saattavat hallussaan kyky helpottaa hyökkäyksen keuhkosyövän soluja, edelleen in vivo tutkimuksissa on vahvistettava mekanismeja. Yhteenvetona hoito 5 nm Au-NP esti tehokkaasti solujen lisääntymistä ja edistää apoptoosin, mutta se myös voimistunut ICAM-1 ja MMP-9, sekä lisääntynyt hyökkäyksen A549-soluja. Sen sijaan, Mukherjee et ai. raportoitu, että Au-NP: tä (5 nm halkaisijaltaan) osoitti antiangiogeenisiä ominaisuuksia (toisin sanoen inhiboi kasvaimia kasvua uusien verisuonten) sekä in vitro että in vivo [38].