Krooninen sairaus

tiivistelmä

Muuttoliike ja invaasion pahanlaatuisia soluja ovat edellytyksiä syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Bcl-2-perheen proteiinien koostuu noin 25 jäsentä ja on laajasti tutkittu yhteydessä apoptoosin. Huolimatta siitä, että pienet molekyylit, kohdistaminen Bcl-2-proteiinien on jo annettu kliinisissä kokeissa, hyvin vähän tutkimuksia tutkittu roolin antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien vieressä solukuoleman yhteydessä etäpesäke. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia leikellä mahdollista roolia antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L maahanmuutosta ja invaasio paksusuolisyövän soluja riippumattomia solukuoleman ohjaustoiminto. Käytimme muuttoliike ja invaasion määritykset sekä kolmiulotteinen soluviljelmissä analysoida peräsuolen syövän solulinjoissa (HT29 ja SW480) jälkeen siRNA välittämä knockdown tai yliekspressio Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L. Havaitsimme ole spontaani solukuolemaan induktio ole alentunut solujen lisääntymisen puuttuu Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L. Sen sijaan knockdovvn Mcl-1 lisäsi leviämisen. Silmiinpistävän osoitamme syvällinen heikentynyt niin, muuttoliikkeen ja invaasio, ja peräsuolen syöpäsolujen jälkeen Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L knockdown. Tämä fenotyyppi uudistettiin kokonaan soluissa yli-ilmentävät Mcl-1, Bcl-2 tai Bcl-x

L. Kaikkein voimakkaamman vaikutuksen joukossa tutkittujen proteiinien havaittiin Bcl-2. Esitetyt tiedot osoittavat keskeinen rooli Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L maahanmuuton ja hyökkäys paksusuolisyövän soluja riippumatta niiden tunnetut antiapoptoottisten vaikutuksia. Siten meidän tutkimus osoittaa uusia kasvaimia torjuvaa mekanismeja Bcl-2-proteiinin kohdistamista.

Citation: Koehler BC, Scherr A-L, Lorenz S, Urbanik T, Kautz N, Elssner C, et al. (2013) Beyond Cell Death – antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinit säädellä Migration ja invaasiota peräsuolen syövän solut

In vitro

. PLoS ONE 8 (10): e76446. doi: 10,1371 /journal.pone.0076446

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 14 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 03 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Koehler ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Postdoctoral-Fellowship myönnetty BCK alkaen lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Heidelberg, Saksa (https://www.medizinische-fakultaet-hd.uni-heidelberg.de), ja avustukset HSB Saksan Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1) ja Merck Serono GmbH (Darmstadt, Saksa). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Henning Schulze-Bergkamen sai tutkimusmäärärahojen sekä korvaus konferenssin matkakulut ja palkkiot Merckin Serono GmbH. Mikään kirjoittajat liittyy Merck Serono työsuhteen, neuvonta, patenttien ja tuotteiden kehittämiseen tai markkinoida tuotteita. Ei tuote Merck Serono on käytetty tai tutkittu käsikirjoituksen. Merck Serono GmbH ei ollut mukana kokeissa tai valmistuksessa käsikirjoituksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

kolorektaalisyöpää (CRC) on toiseksi yleisin maligniteetti naisilla ja kolmas miehet maailmanlaajuisesti yhä esiintyvyys. Lisäksi CRC on neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään. Vaikka edistysaskeleet lääkekehityksen ja kirurgia lisäsi kokonaiselossaolo, ennuste potilaiden kanssa metastasized CRC (vaihe UICC IV) on edelleen rajoitettu [1], [2]. Metastasation on merkittävä kuolinsyy syöpäpotilailla ja liittyy monivaiheinen prosessi, valtava monimutkaisuus. Huolimatta kasvava ymmärrys taustalla polkuja, monia näkökohtia etäpesäkkeiden edelleen ratkaisematta [3], [4].

B-solulymfooma-2 (Bcl-2) proteiinien perhe koostuu noin 25 jäsentä ja on tutkittu laajasti suhteen apoptoosin signalointia. Herkän tasapainon Bcl-2-proteiinien säätelee solun kohtalon at mitokondrioiden pinnalla. Proapoptoottiset Bcl-2-proteiinien (ts Bax ja Bak) sitovat niiden antiapoptoottisten sukulaiset (ts Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L). Jos kyseessä on muutos tämän tasapainon kohti kuoleman proapoptoottiset Bcl-2-proteiinien, joita vapautuu niiden antiapoptoottisten kollegansa. Kun proapoptoottiset Bcl-2 proteiineja vapautuu, mitokondrioita aktivoituvat ja solukuolema tapahtuu [5]. Lisäksi panos antiapoptoottisten proteiinien kuolion ja autophagy on osoitettu [6], [7]. Vuonna autophagy, antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien toimia sitomalla proautophagic proteiineja, kuten Beclin1 [8], [9].

antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien on laajalti yli-ilmentyy ihmisen syövissä, mukaan lukien CRC. Esimerkiksi lisääntynyt ilmentyminen Bcl-x

L ja Mcl-1 kohdalla on osoitettu CRC ja korreloi huonon erilaistumista, korkeammat kasvaimen vaiheen ja huonon ennusteen potilaista [10] – [12]. Sen sijaan toisessa tutkimuksessa esitellään tietoja korreloidaan korkean Bcl-2: n ilmentymisen kanssa hyvän kliinisen aikana potilailla, joilla on CRC [13]. Nämä ristiriitaiset raportit osoittavat ei-tarpeeton toiminnot antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien ja selventää tarvetta syvempään tutkimus sitoutumista ja merkitystä näiden proteiinien CRC.

On yhä enemmän todisteita varten roolista antiapoptoottisten proteiinien pidemmälle solukuoleman sääntelyä. Esimerkiksi, Mcl-1 ja sen silmukointivariantit on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa hengitysteiden ketjun ja oksidatiivisen metabolian [14]. Bcl-x

L ja Bcl-2 on liitetty signalointi mukana reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto [15], [16]. Vaikutukset Bcl-2-proteiinien proliferaatioon on vielä selvennettävä. On olemassa jonkin verran näyttöä antiproliferatiivisia vaikutuksia Bcl-2, Bcl-x

L ja Mcl-1 fysiologisessa ympäristössä [17]. Tässä tapauksessa eloonjäämishyötyä solujen vähemmän altis apoptoosin säilyy ainakin osittain kustannuksella leviämisen. On kuitenkin tärkeää kysymystä, jos säätelyvaikutukset Bcl-2-proteiinien solusyklin ja solukuoleman ovat riippumattomia ilmiöitä. Toistaiseksi vain harvat tiedetään mahdollinen sitoutuminen antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien maahanmuutosta ja invasiivisuus syöpäsolujen. Bcl-x

L on osoitettu olevan osallisena rintasyövän metastasation ja CRC muuttoliike, mutta rooli Bcl-2 ja Mcl-1 kasvaimen leviäminen ratkea [18], [19]. Tutkimuksessamme olemme pyrittiin selvittämään solukuoleman induktio, jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion CRC solujen poistamisen jälkeen Bcl-2, Bcl-x

L tai Mcl-1 ilme. Tärkeintä, knockdovvn antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien suoraan esti muuttoliike ja invaasion CRC solujen riippumattomia solukuoleman induktion tai vaikutuksia proliferaatioon. Yhteenvetona meidän tutkimus tarjoaa uusia oivalluksia antituumorivaikutukset Bcl-2-proteiinin inhibitio kolorektaalisyövässä pidemmälle solukuoleman signalointi ja solukierron säätelyssä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja Solulinjat

CRC solulinjoissa HT29, SW480, Caco2 ja Colo205 ostettiin ATCC. Soluja viljeltiin kostutetussa atmosfäärissä (37 ° C, 5% CO

2) RPMI + GlutaMAX ™ (Gibco, Karlsruhe, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS: ää (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Gibco). Kaikkia solulinjoja säännöllisesti seulottiin tartuntoja eikä ylitä kulkua 10. Kemoterapia reagenssien 5-fluorourasiilin, Oksaliplatiini ja irinotekaanin ostettiin Sigma-Aldrich (Hampuri, Saksa).

elinkelpoisuustesti

Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja 24 h ymppäyksen jälkeen transfektoidaan tai käsitellään kuten on osoitettu. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä kolorimetristä 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), kuten aiemmin on kuvattu [20]. Absorbanssi mitattiin 550 nm: ssä käyttäen mikrolevyn lukijaa (Infinite 200 pro; Tecan, Männedorf, Sveitsi).

RNAi, plasmidit ja transfektio

Sirna (siRNA) kohdistaminen Bcl-x

L, Bcl-2, Mcl-1-mRNA: n tai plasmidi-DNA annettiin päivänä 1 kylvämisen jälkeen solujen 12 tai 6-kuoppaisille levyille, joissa on yhtymäkohta 70-80% ajankohtana transfektion. Seuraavat siRNA sekvenssit on sovellettu (MWG Biotech, Ebersberg, Saksa): Bcl-x

L 5′-gcuuggauaaagaugcaaTT-3 ’(sense) ja 5′-uugcaucuuaucccaagcAG-3′ (antisense), Mcl-1 5’- aaguaucacagacguucucTT-3 ’(sense) ja 5′-gagaacgucugugauacuuTT-3′ (antisense), Bcl-2 5’-uaauaacgugccucaugaaTT-3 ’(sense) ja 5′-uucaugaggcacguuauuaTT-3′ (antisense). siRNA GFP käytettiin kontrollina: GFP 5’-ggcuscguccaggagcgcaccTT-3 ’(sense) ja 5′-ggugcgcuccuggacgguagccTT-3’ (antisense). Pienet kirjaimet edustavat ribonukleotideja ja pääkaupungeissa deoksiribonukleotidejä. Solut transfektoitiin OptiMEM® (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) ilman täydentää käyttäen RNAiMAX ™ (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan.

Plasmidi transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine® LTX (Invitrogen) in OptiMEM® varten SW480 soluja tai peqFECT DNA (Peqlab, Erlangen, Saksa) täydellisessä RPMI varten HT29 mukaan valmistajan protokollaa. Seuraavia plasmideja käytettiin: ihmisen Mcl-1 kloonattiin pEF4 vektoriin. Ihmisen Bcl-2 ja Bcl-x

L kloonattiin pcDNA3 vektori. pcDNA3-hBCL-2 oli ystävällinen lahja W. Roth (Institute of Pathology, Heidelberg). pcDNA3-hBCL-x

L oli ystävällisesti M. Li-Weber ja P.H. Krammer (saksalainen Cancer Research Center, Heidelberg, Saksa). Vastaava tyhjä vektoreita käytettiin verrokkeina. Samanaikaisesti, transfektiotehokkuuden validoitiin käyttäen GFP Transfektiomenetelmätapa virtaussytometrialla. Transfektion tehokkuus oli vähintään 70% kaikissa kokeissa (tietoja ei esitetty) ja edelleen arvioitiin Western-blottauksella 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen.

havaitseminen leviämisen ja Cell Death

käsittelyn jälkeen , supernatantti siirrettiin FACS-putkiin ja solut varovasti irti käyttämällä Accutasella ™ (PAA) ja yhdistettiin vastaavaan supernatanttiin. Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin, joka sisälsi 0,1% (w /v) natriumsitraattia, 0,1% (v /v) Triton X-100 ja 50 ug /ml propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich). 1 tunnin inkuboinnin 4 ° C: ssa DNA: n kokonaismäärä solujen mitattiin protokollan Nicoletti

et al.

[21] käyttäen CANTO II virtaussytometrillä (Becton Dickinson [BD], Franklin Lakes, NJ USA). Solusyklin analyysi tehtiin käyttämällä FACS Diva 6 (BD) ja FlowJo 7.6.5. (Puu Star Inc., Ashland, OR USA). Solut edustavat subG1 fraktiota kuvattu apoptoottisia.

tarkentaa solukuoleman induktio ja proliferaatio, solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin Solusykli ja leviämisen kitti virtaussytometrialla (BD) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, soluja pulssitettiin 1 tunnin ajan 20 uM bromideoksiuridiinia (BrdU) erottamaan leväten jakautuvat solut. Tämän jälkeen solut kerättiin, kiinteät, läpäiseviksi ja sitten uudelleen kiinnitettiin seurasi värjäys fluorokromilla kytketty vasta-aineita lohkaistaan ​​PARP (Asp214 kytkettynä PE) indikaattorina apoptoosin, BrdU (kytketty PerCP-Cy ™ 5.5) lisääntymistä ja phosphorylated- H2AX (pS139, joka on kytketty Alexa Fluor® 647) ja DNA-vaurioita, vastaavasti. Sitten solut analysoitiin virtaussytometrialla.

Cell Lysis, SDS-Page ja Western-blottaus

Solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille, niitä viljeltiin 24 tuntia ja käsiteltiin, kuten on ilmoitettu. Solulyysiksen, SDS-Page ja Western blotting suoritettiin. Seuraavia vasta-aineita käytettiin immunodetektioon: anti-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa), anti-Bcl-x

L (Cell Signaling, Boston, MA USA), anti-Bcl-2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-αTubulin (Sigma), anti-katkaistuun PARP (ASP214, Cell Signaling).

Cell Counting

Solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin erityisiä siRNA jälkeen 24 h. Solut kerättiin, suspensoitiin ja sitten laskettiin käyttäen Neubauer kammion 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua transfektion. Trypane sininen värjäys käytettiin jättää kuolleita ja hajanainen soluja aikana laskentatoimenpide.

Migration Analyysit

2 x 10

6 solua ympättiin 12-kuoppalevyille, kasvanut yhtymäkohta noin 70-80% ja transfektoitiin kuten. 24 h transfektion jälkeen solujen yksikerroksista oli naarmuuntunut käyttämällä steriiliä pipetin kärkeä. Solut pestiin sitten keski- ja Kuvat otettiin heti kiinni käyttämällä käännettyä mikroskooppia (CKX41, Olympus Inc., Hampuri, Saksa) varustettu digitaalisella väri kamera (XC30, Olympus Inc.). Tarkka sijainti kuvan sisällä yksikerroksisen oli merkitty tunnistaa saman aukon seuraavien 72 h. Kuilu sulkeminen mitattiin 24 tunnin välein seuraavasti käyttäen CellSense® kuvankäsittelyohjelma (Olympus Inc.): Gap etäisyydet tyhjästä välillä toisella puolella ja muut mitattiin tietyin väliajoin pitkin reunaa syntyvän tyhjästä (joka 200 pm). Keskimääräinen mitatusta etäisyydet laskettiin sitten ja verrataan keskimääräinen etäisyys rako alkaa ajankohtana kokeen [22].

invaasiomääritys

BioCoat ™ matrigeelin ™ Invasion Chambers (8 mikronin huokoskoon, BD) käytettiin tutkimaan hyökkäystä SW480-soluja. Matrigel ™ invaasio kammiot hydratoitiin FCS RPMI kostutetussa atmosfäärissä 2 tuntia. Seuraavassa invaasio kammiot siirrettiin kumppani kuoppiin (BD), jotka sisältävät 750 ui RPMI täydennetty 10% FCS. FCS toimii kemoattrak- invasiivisia soluja. Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja transfektoitiin kuvatulla tavalla. 24 h transfektion jälkeen solut kerättiin käyttäen Accutasella ™ (PAA), yhdistettiin ja laskettiin. 3 x 10

5-solut suspendoitiin sitten uudelleen 500 ul: aan FCS RPMI ja siirretään yläosaan hyökkäyksen kammion. 72 tunnin jälkeen, yläpinnan invaasio kammio esipuhdistetaan poistamaan ei-tunkeutuvat soluihin käyttäen pumpulipäinen vanupuikolla. Tunkeutuneet solujen alapinnan insertin fiksoitiin 80% EtOH: ssa 30 minuuttia, mitä seurasi värjäys ydinten käyttämällä Hoechst 33342 (Invitrogen) 15 minuutin ajan. Insertit pestiin sitten PBS: ssä. Viisi kuvia jokaisen insertin otettiin ja lukumäärä hyökkäsi solujen laskettiin paljaalla silmällä.

3D Cell Culture

Käytimme Alvetex® Scaffolds inertistä, erittäin huokoinen ja rajat polystyreeni rakennustelineet, se leikattiin 200 pm paksu kalvo suorittaa sopiva kolmiulotteinen soluviljelmäkokeita. Alvetex® tukirakenteet käytettiin 12-kuoppalevyformaatissa (Reinnervate AVP002, Sedgefield, UK) steriileissä olosuhteissa. Scaffolds inkuboitiin steriilisuodatetaan EtOH: ta (80%) 5 minuutin ajan esikäsittelynä, pestiin kahdesti, keskipitkän ja jäljellä väliaineessa. Solut transfektoitiin ja kerättiin käyttäen Accutasella ™ kuvatulla, laskettiin ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen RPMI. 1 x 10

6 Sitten solut ympättiin päälle insertin levyn yhteensä 200 ui väliainetta. 3 h ymppäyksen jälkeen, tukirunkoja tulvi kevyesti alhaalta, kunnes täydellinen kattavuus saavutettiin. Väliaine vaihdettiin joka 48. h.

Leikkaus ja immunohistokemia 3D-Scaffolds

72 tunnin kuluttua, tukirunkoja pestiin kahdesti PBS: ssä, leikkaa viipaleiksi ja välittömästi siirretään Cryomolds® sisältävä lokakuu kiinnitysväliaine (Science Services, Munich, Saksa) ja vähitellen jäädytettiin kaasufaasissa nestemäisen typen. 24 tunnin kuluttua -80 ° C: ssa, laseista cryosectioned (kryostaatti, Thermo) ja asennettu HistoBond® dioja. Osiot (9 um paksuus) fiksoitiin 4% PFA ja värjättiin hema- ja eosiinilla morfologista tutkimuksissa solujen kokonaismäärään ja mittaus invaasion syvyyteen. Lisäksi, immunhistochemistry suoritettiin käyttäen NovoLink Polymer havaitseminen System (Leica, Wetzlar, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden jälkeen PFA-kiinnitys ja lämmön epitooppisup- haku (HIER) sitraattipuskurissa (pH 6). Vasta-aineita Ki67 (Abcam), ja Bcl-x

L (Cell Signaling) käytettiin ja laseja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Kuvat otettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia. Kuvat analysoitiin CellSense® ja ImageJ ohjelmistoja.

Tilastollinen analyysi

Data saatu hyökkäyksen ja 3D-telineen kokeissa analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä (pariksi, kaksipuolinen), joka perustuu normaalia dataa jakelu. Siirtolaisuusjärjestö määritykset, suhde gapclosure vastauksena, ja aikaa ja hoitoa selittävinä muuttujia tutkittiin analysoimalla varianssi (ANOVA). Analyysi välisen vuorovaikutuksen aikaa ja hoito ei ollut tavoite Tämän tutkimuksen ja se ei sisälly varianssi mallissa. SPSS 20 tilastot (IBM, NY USA) ohjelmiston käytettiin kaikkiin tilaston analyysejä. Arvo P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x L Expression in Human peräsuolen syövän Cell Lines

tutkiakseen ekspression antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L ihmisen CRC solulinjoissa, mittasimme proteiinin tasot neljän peräsuolen syövän solulinjat. Caco2, Colo205, HT29 ja SW480-solut ovat laajalti käytetty ja hyvin tunnettu [23], [24]. Caco2 solujen tiedetään olevan huonosti kasvaimia synnyttäviä hiirissä. SW480 ja Colo205 solut ovat paikallisesti invasiivisia potilaalle tehdä kasvainmuodoista. HT29 metastasoituvat maksassa ja keuhkoissa, kun injektoidaan ihonalaisessa [24]. MCL-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L ilmentyminen oli havaittavissa CRC solulinjoissa (Fig. 1A). Caco2 solut osoittivat huomattavia määriä Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L, jolla on korkein ilmentymistaso Bcl-2. Colo205 soluilla oli vähentynyt määrä Bcl-x

L. SW480-soluissa oli suunnilleen sama määrä kaikista Bcl-2-proteiinien. HT29 osoitti hallitseva ilmaus Bcl-2 ja alhainen Bcl-x

L. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että ekspressiokuviota antiapoptoottisten proteiinien vaihteli CRC käytetyt solulinjat tutkimuksessamme. Ei ollut mitään korrelaatiota tuumorigeenisyyden solulinjan ja tietyn ekspressiokuvio (Fig. 1A). Päätimme keskittyä SW480-soluissa ja HT29 edelleen kokeiluja Bcl-2 knockdovvn, koska molemmissa solulinjoissa jakaa kyky hyökätä ja muoto etäpesäke hiirimalleissa.

(A) Western blot analyysit peräsuolen syöpä solulinjat Caco2, Colo205, SW480 ja HT29. Pohjapinta ekspressiotasot Bcl-x

L, Mcl-1 ja Bcl-2. Tubulin toimi latauskontrollina. Solut on järjestetty yhä tuumorigeenisyystesti vasemmalta oikealle. Tässä tuumorigeenisuus osoittaa kykyä solulinjan etäispesäkkeitä hiirillä. Pienin tuumorigeenisyystesti tarkoittaa paikallisen tuumorikasvun puuttuvat invasiivisuus; korkein tuumorigeenisyyteen osoittaa muodostumista kaukaisten elimen etäpesäke (maksa ja /tai keuhkoissa). (B) Western blot analyysit HT29 (vasemmalla) ja SW480 (oikealla) solut jälkeen siRNA välittämää knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua transfektion. Tubulin toimi latauskontrollina. Western-blotit esitteli edustavat kolmen erillisen kokeen.

knockdovvn antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinit ei indusoi Spontaani Apoptosis mutta herkistää CRC-solujen kemoterapia

ensimmäinen määritti erityisiä siRNA kohdistaminen Bcl-2, Bcl-x

L tai Mcl-1 jakson aikana 72 h HT29 ja SW480-soluissa. Tässä downregulation antiapoptoottisten proteiinien oli tehokas ainakin 72 tuntia, kuten havaittiin Western blot -analyysillä (kuvio. 1 B). Selvittääkseen vaikutuksen downregulation Bcl-2, Bcl-x

L tai Mcl-1 solun elinkelpoisuuden suoritimme MTT-määrityksissä 48 h transfektion jälkeen. Tulokset osoittavat ole vaikutuksia laski antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinin tasot solun elinkelpoisuutta HT29 ja SW480-soluissa (kuvio. 2 A).

(A) MTT-määritys SW480 ja HT29 jälkeen knockdovvn Mcl- 1, Bcl-2 ja Bcl-x

L. (B) Virtaussytometrinen analyysit ja vastaavat Western blot-pilkkomista varten PARP 48 tuntia sen jälkeen pudotus on Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L HT29 (vasemmalla) ja SW480-soluja (oikealla). (C) virtaussytometrinen analyysi HT29 (vasemmalla) ja SW480-soluja (oikealla) ja pH2AX 48 tuntia sen jälkeen pudotus on Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L. 24 h Staurosporiini käsittely (1 uM) toimi positiivisena kontrollina solukuoleman induktioon. (D) virtaussytometrianalyysin DNA-pirstoutuminen HT29 jälkeen knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L seurasi 48 h käsittelemällä 30 uM oksaliplatiinin ja 0,2% DMSO: ta ajoneuvoa. Virtaussytometria analyysi suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (Oksa = oksaliplatiinin).

Toiseksi, tutkimme spontaaneja solukuoleman induktio tapahtui transfektoiduissa HT29 ja SW480-soluissa. Näin ollen, olemme analysoineet solujen lohkaistaan ​​poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) 48 h transfektion jälkeen virtaussytometrialla sekä Western-blottauksella. Koska PARP on tavoite aktivoitujen kaspaasi 3 sen pilkkominen osoittaa tehokasta toteuttamista apoptoosin [25]. Emme havainneet kasvua pilkotun (cl.) PARP tasoilla jälkeen Mcl-1 taintumisen (Fig. 2 B). For Bcl-2 ja Bcl-x

L Knockdown, havaitsimme hyvin lievä kasvu cl. PARP tasot FACS, mutta ei tunnistanut kohtuullinen määrä katkaistun proteiinin Western blot (kuvio. 2 B). Lisäksi pyysimme DNA vahinkoa tunnusmerkki solukuoleman. Siksi me värjätyistä soluista 48 tuntia transfektion jälkeen fluorokromilla on kytketty vasta-aineen kohdistaminen fosforyloitua histoni H2AX [26]. Fosforylaatiota H2AX tapahtuu vastineena DNA kaksinkertainen säikeen katkoksia. Ei ollut huomattava määrä fosforyloidun H2AX havaittavissa transfektoiduissa soluissa ja hallintalaitteet (Fig. 2 C). Staurosporiini (STS) hoitoon HT29 ja SW480-solut toimivat positiivisena kontrollina solukuoleman induktioon (Fig. 2 B ja C).

Kolmanneksi, pyrimme tutkimaan mahdollisuuksia antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinin knockdown on herkistää HT29 kliinisesti relevantteja ja yleisesti käytettyjä kemoterapeuttisia. 5-FU: n ja irinotekaanin ei ollut merkittäviä stabiloivaa vaikutusta siRNA-välitteisen knockdovvn antiapoptoottisten proteiinien, kuten arvioitiin FACS-analyysillä DNA-fragmentaation (tuloksia ei ole esitetty). Silmiinpistävä vastakohta, havaitsimme syvällinen ja erittäin merkittävä herkistyminen oksaliplatiinille jälkeen Knockdown on antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bcl-x

L ja Mcl-1 (Fig. 2D).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että knockdovvn Bcl-2, Bcl-x

L tai Mcl-1 ei aiheuttanut spontaania solukuoleman ja ilmeisesti hyvin kompensoida CRC soluissa. Niistä kemoterapeuttisia sovellettu CRC hoitoon, vain vaikutus oksaliplatiinin oli merkittävästi täydennetty knockdovvn antiapoptoottisten proteiinien.

knockdovvn antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinit Kiinnostavuus ei Antiproliferative Vaikutukset CRC Cells

Kun syrjäytymisen spontaanin solukuoleman induktion jälkeen Bcl-2, Bcl-x

L tai Mcl-1 knockdown tutkimme seuraavaksi leviämisen CRC soluja. Suuri osa käsittelemättömien HT29 (38,6%) oli lisääntyvissä arvioimana BrdU (Fig. 3 A ja B). Suhde lisääntyvien solujen ei ollut merkitsevästi erilainen jälkeen Bcl-2 ja Bcl-x

L pudotus (siBcl-2:37,3%; siBcl-x

L: 37,4%). Sen sijaan, pudotus ja Mcl-1 johti merkittävään kasvuun BrdU verrattuna kontrolleihin (47,5 vs. 38,6%, p 0,05, Fig. 3 A ja B). Sillä SW480-soluissa, havaitsimme alemman perustason leviämisen (21,1% BrdU-positiivisia soluja). Tulokset, jotka on transfektoitu siRNA vastaan ​​Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L olivat samansuuntaisia ​​kuin saatujen HT29. Jälleen vain Mcl-1 knockdown johti merkittävään kasvuun BrdU positiivisuus, kun taas Bcl-2 ja Bcl-x

L Knockdown osoitti merkittäviä vaikutuksia (Mcl-1:25,6% vs. 21,1%, p 0,05, Fig. 3 C). Edelleen vahvistaa meidän tuloksia leviämisen jälkeen siRNA transfektion, seurasimme yhteensä solujen lukumäärät SW480-solujen ajan. Tulokset olivat linjassa BrdU kokeet: Vain poisto Mcl-1 lisännyt koko solumäärien, kun taas mitään merkittäviä muutoksia havaittiin Bcl-2 ja Bcl-x

L poisto (Fig. 3 D) . Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että ei ole merkittävää vaikutusta knockdown Bcl-2 ja Bcl-x

L jakautumiseen. Sitä vastoin ei ole Mcl-1 estäminen johtaa lisääntyneeseen proliferaatioon suunnattu tiettyjä toimintoja Mcl-1 tässä yhteydessä.

SW480 ja HT29 solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl- x

L. 24 h transfektion jälkeen solut pulssitettiin 20 uM BrdU ja valmistettiin virtaussytometrialla. (A) edustaja alkuperäinen virtaussytometrialla tietoja HT29 BrdU positiivisuus värjäyksen jälkeen anti-BrdU-vasta kytketty PerCP-Cy5.5 fluorofori. (B) Virtaussytometrinen analyysejä BrdU vuonna HT29 ja (C) SW480-soluissa. (D) Yhteensä solumäärän SW480-solujen jälkeen knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, talteen ja laskettiin 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Kokeet ajettiin kolmena rinnakkaisena (virtaussytometrialla) ja sextuplicates (solulaskennan). Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05.

knockdovvn antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinit Massiiviset heikentää Migration CRC Cells

Seuraavaksi tavoitteena oli tutkia vaikutukset Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L poisto siirtyvien CRC soluja. Jotta visualisoida solujen vaeltamiseen, suoritimme naarmu määritykset yksikerroksisissa transfektoitujen HT29 ja SW480-soluissa. Gap etäisyys mitattiin joka 24 tunnin kuluttua knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L seuraa laskeminen kaventaminen. Kaventamiseksi oli merkittävästi hidastunut sekä HT29 ja SW480-solujen jälkeen knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L (p-arvot HT29: siMcl-1: 0001; siBcl-2: siBcl-2: = 0,0005; siBcl-x

L: = 0,004.) (Fig. 4 B ja C, vasen). Vuonna HT29 ja SW480-soluissa, silmiinpistävin tehosta havaittiin knockdovvn Bcl-2. Tässä vaellusetäisyydet alennettiin 56% vuonna SW480 ja 36% HT29 72 tunnin jälkeen verrattuna kontrolleihin (Kuva. 4 A; Fig. 4 B ja C, vasen). Yhdessä osoitamme kielteisiä vaikutuksia Mcl-1, Bcl-x

L ja Bcl-2 pudotus CRC maahanmuuttoa riippumaton solukuoleman induktion ja antiproliferatiivisia vaikutuksia.

SW480 ja HT29 solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L ja kasvatettiin yhtenä kerroksena. Gap etäisyys mitattiin joka 200 pm reunaa pitkin raon ja kaventamiseksi laskettu 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua transfektion. (A) edustaja kuvat vangiksi jälkeen knockdovvn Bcl-2 in HT29 (asteikko bar ilmoitettava suurennos kaikille paneelit). (B) Gap sulkeminen kinetiikka HT29 jälkeen knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L (vasen) ja vastaava Western blotit (oikealla). (C) Gap sulkeminen kinetiikka SW480-solujen jälkeen knockdovvn Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L (vasen) ja vastaava Western blotit (oikealla). Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. (P-arvot HT29: siMcl-1: 0001; siBcl-2: 0001; siBcl-x

L: = 0002. P-arvot SW480: siMcl-1: = 0,0011; siBcl -2: = 0,0005; siBcl-x

L: = 0,004).

yli-ilmentyminen antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinit Nopeuttaa Migration CRC Cells

lisäksi testasimme lisääntynyt ilmentyminen Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L HT29 ja SW480-solujen vaikutteita maahanmuutto- ja mahdollisesti siirtyy fenotyypin knockdown kokeita. Jälleen, teimme tyhjästä määrityksiä ja käytettyjen transfektoidut solut vastaavat plasmidit Bcl-2-proteiinien. Silmiinpistävän, havaitsimme merkittävästi kiihtynyt muuttoliike SW480-solujen yli-ilmentävät Bcl-x

L ja Bcl-2 (p 0001, Fig. 5 B, vasen). Yli-ilmentäviä soluja Bcl-2 lähes kaksinkertaistui siirretyn etäisyyden kuluttua 72 h (999 nm vs. 526 nm kontrolleissa Fig. 5 A). Sillä Mcl-1 yliekspressoivia SW480-solujen havaitsimme pienempi, mutta merkittävä kasvu muuttoliike (p 0,01, Fig. 5 B, vasen). Nämä havainnot tehtiin myös HT29 yliekspressioon Mcl-1, Bcl-2: n tai Bcl-x

L (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi ei ollut lisääntyvän leviämisen havaita soluissa, jotka yliekspressoivat Mcl-1, Bcl-2: n tai Bcl-x

L (tuloksia ei ole esitetty). Yhteenvetona, me osoitamme, että antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien kykenevät laukaisemaan migraation CRC soluja.

SW480-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka ilmentävät ihmisen Mcl-1, Bcl-2: n tai Bcl-x

L ja kasvanut yksikerroksinen. Aukot luotu ja kaventamistavoitteen kuvatulla tavalla mitattuna. (A) edustaja kuvia SW480-solujen yli-ilmentävät Bcl-2 (asteikko bar osoittaa suurennus kaikille paneelit). (B) Gap sulkeminen kinetiikka SW480-solujen yli-ilmentävät Mcl-1, Bcl-2 ja Bcl-x

L (vasen) ja vastaava Western blotit (oikealla). Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. p-arvot: Mcl-1: = 0,0006; Bcl-2: = 0,0002; Bcl-x

L: 0,0001.

knockdovvn antiapoptoottisten Bcl-2 proteiinit Regulate invasiivisuus CRC Cells

tutkimiseksi edelleen sääntelyn vaikutuksia Mcl-1 Bcl-x

L ja Bcl-2 prosesseja kannalta CRC etäpesäkkeitä, myös arvioida invaasion CRC-solujen käsittelyn jälkeen Bcl-2-proteiinien. Solut, joissa poistetaan Bcl-x

L osoitti merkittävästi heikentynyt invasiivisia ominaisuuksia Boyden kammiossa invaasio määrityksissä verrattuna valetransfektoituihin soluja (70% verrattuna kontrolleihin, p 0,05; Fig. 6 A ja B). Useimmat silmiinpistävän, knockdown Bcl-2 kumosi melkein täysin kapasiteettia SW480-solujen hyökätä (38% verrattuna kontrolleihin, p 0,001). Lisäksi Mcl-1 knockdown aiheutti myös vähentää huomattavasti invaasion (37% verrattuna kontrolleihin, p 0001; Fig. 6 A ja B). Nämä havainnot korostavat roolia antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien maahanmuuton ja hyökkäys CRC solujen ja tunnistaa merkittävä rooli Bcl-2: n yhteydessä invasiivisuus.

SW480-solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin on kuvattu. 24 x 10

5-soluja ympättiin saliin on transwell. 48 h ymppäyksen jälkeen, ytimet alapinnan visualisoitiin Hoechst-värjäys. (A) edustaja kuvaa alemman insertin pinta jälkeen Hoechst värjäyksen (asteikko bar osoittaa suurennus kaikille paneelit). (B) Viisi näkökenttien kohti insertin laskettiin. n = 5 ryhmää kohden. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Määritykset ovat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. ** P 0,01.