Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime tutkimusten mukaan AMPK aktivaattoreita voidaan soveltaa terapeuttisina lääkkeinä tukahduttamaan syöpäsolujen kasvua. Kuitenkin molekyyli mekanismi niiden ehkäisevästä toiminta syöpäsoluissa on vielä epäselvä. Tässä osoitamme, että AMPK aktivaattorit heikentää kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua vähentämällä DVL3 positiivinen säädin Wnt /β-kateniinin signalointi ja onkogeenisessä toimija kohdunkaulan syövän kasvainten synnyssä. Western blot ja immunohistokemiallinen analyysit, osoitimme, että DVL3 oli usein voimistunut ja merkittävästi kohonnut β-kateniinin (

P

= 0,009) ja CyclinD1 (

P

= 0,009) ilmaisuja kohdunkaulan syövän . Pakotettu ilmentymä DVL3 kohonnut β-kateniinin ja täydennetty kohdunkaulan syövän solujen kasvua, tarkastaa, että DVL3-välitteisen Wnt /β-kateniinin aktivointi on mukana kohdunkaulan syövän kasvaimen synnyssä. Toisaalta näkökohta, olemme huomanneet, että kohdunkaulan syövän solujen kasvua merkittävästi tukahdutti AMPK aktivaattorit ja tällaisten solujen kasvun estäminen oli samanaikainen vähentäminen DVL3 proteiinin tason ja ajasta riippuva käytöstapoja. Lisäksi heikentynyt mTOR signalointi aktiivisuutta myös vähensi DVL3 ilme. Sen sijaan yhteistyössä hoito Yhdiste C (AMPK estäjä) voisi merkittävästi kumota metformiinin aiheuttama DVL3 vähentäminen. Lisäksi yhteistyössä hoito AM114 tai MG132 (proteosomal estäjät) voivat osittain palauttaa DVL3 lauseke alla hoidossa metformiinia. Edelleen

in vivo

ubikinaa- määritys paljasti, että metformiini voi vähentää DVL3 by ubikitiini /proteasomaalisten hajoamista. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti osoittaa todennäköisen molekyylimekanismeihin että AMPK aktivaattorit tukahduttaa kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua heikentämällä DVL3 proteiinisynteesiä kautta AMPK /mTOR signalointia ja /tai osittain edistämällä proteasomaalisten hajoamista DVL3.

Citation: Kwan HT, Chan DW, Cai PCH, Mak CSL, Yung MMH, Leung THY, et al. (2013) AMPK Aktivaattorit Suppress Kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua estämällä DVL3 välitteisen Wnt /β-kateniinin Signaling Activity. PLoS ONE 8 (1): e53597. doi: 10,1371 /journal.pone.0053597

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 22 elokuu 2012; Hyväksytty: 30 marraskuu 2012; Julkaistu: 02 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Kwan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Wong Tarkista Hän hyväntekeväisyysyhdistykseksi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on yksi yleisimmistä gynekologiset syövät maailmanlaajuisesti. Tähän mennessä parhaiten tunnettu aiheuttaa kohdunkaulan syöpä on ihmisen papilloomaviruksen (HPV) infektio. Pysyvät HPV-infektio kehitystä edistävä syövän esiasteita kohdunkaulan syövän [1]. Kuitenkin, HPV-infektio ei yksin riitä muuttamaan epiteelisolujen isäntäsolut syöpäsoluja. Näin ollen myös muut tekijät, kuten ylös-säätely onkogeenien ja poikkeava aktivaatio liittyvien signalointipolkujen, voi olla mukana kohdunkaulan syövän synnyn [2]. Viimeaikaiset todisteet ovat osoittaneet, että poikkeava aktivaatio Wnt /β-kateniinin signalointi ratkaisevasti osallisina syövän kehitykseen [3], [4], [5]. Kertyminen β-kateniinin on tunnusomaista aiheuttamisessa poikkeavaan aktivoituminen Wnt /β-kateniinin signalointia, joka liittyy läheisesti syövän synnyn ja kohdunkaulan [6], [7], [8], [9], ja erityisesti invasiivisia kohdunkaulan karsinoomien [10]. Näin ollen, tämä reitti voi olla lupaava lähestymistapa molekyyli- terapiassa tämän taudin.

AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) on mestari säätelijä solujen energiajärjestelmän [11]. Aktivoidut AMPK toiminta heikentää mekanistinen rapamysiinin kohde (mTOR) signalointia ja sen vastaava p70S6 kinaasi ja 4E-BP1 toimintaa [12], mikä rajoitti proteiinisynteesiä [13], [14] ja solujen kasvua. Siksi ei ole yllättävää, että alhainen AMPK aktiivisuus suosii karsinogeneesin [15], [16]. Tätä varten, lukuisia farmaseuttisia AMPK aktivaattorit, kuten A23187, A769662, 5-aminoimidatsoli-4-carboxamideribonucleoside (AICAR) ja metformiinin on äskettäin osoitettu saavan aikaan kasvaimen vastaisen vaikutuksia useissa ihmisen syövissä, [17], [18], [19 ], [20], [21], [22], [23]. Erityisesti metformiinin on käytetty useita käynnissä olevia kliinisissä tutkimuksissa [24], [25], [26], [27]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit antituumorivaikutuksia näiden AMPK aktivaattoreita ei ole vielä selvästi selvitetty.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että DVL3 oli merkittävästi voimistunut ja korreloi Wnt /β-kateniinin aktiivisuus kohdunkaulansyöpä. Mikä tärkeintä, olemme ensimmäinen osoittamaan, että AMPK aktivaattorit estävät kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua haittaavaa DVL3 välittämää Wnt /β-kateniinin signalointi kohdunkaulan syöpäsoluja. Osoitimme, että esto AMPK /mTOR-välitteisen proteiinisynteesiä ja parantamiseksi proteasomaalisten hajoamisen olivat molekyylitason mekanismeja vähentämisessä DVL3 näytteillä AMPK aktivaattoreita. Meidän Pääteltiin tärkeyttä DVL3 kohdunkaulan syövän kasvaimien ja korosta terapeuttinen arvo kohdistaminen DVL3 mukaan AMPK aktivaattoreita kohdunkaulan syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Viisi kohdunkaulan syövän solulinjoista (HeLa, SiHa-, C33A, CaSki- ja C41) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) (solulinjat todennus tehtiin talon STR DNA profilointi) ja kahden kuolemattomaksi kohdunkaulan epiteelin solulinjoja ( NC104 ja NC105) [6] (lahja prof George. Tsao, anatomian laitos The University of Hong Kong) käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikkia solulinjoja kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO2 vähintään essential medium tai Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa (Gibco-BRL, Gaithersburg), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Gibco) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Gibco).

Plasmidit ja solujen transfektio

GFP-merkityn-DVL3 ilmentävät rakennetta käytettiin GFP /DVL3 proteiinin ilmentyminen [28], kun taas pEGFP-C1-plasmidia käytettiin negatiivisena kontrollina. PCMV2-Flag /DVL3 käytettiin TOP /FOP lusiferaasireportterigeenin määritys, kun sekä pSuper8XTOPFlash ja pSuper8XFOPFlash konstruktit toimitti ystävällisesti Dr. R. Moon (University of Washington, Washington, USA). LipofectAMINEa

TM 200 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) käytettiin solujen transfektioon mukaan valmistajan protokollia. Perustamaan GFP-DVL3 stabiilisti ilmentävien solujen, transfektoidut solut valittiin G418 for 2 viikkoa ja varmistettiin Western blot -analyysillä.

RNA ja määrälliset käänteistranskriptaasi-PCR

Kokonais-RNA oli uutetaan TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Komplementaarinen DNA syntetisoitiin käyttämällä käänteisen transkription reagenssipakkauksen (Applied Biosystems, Foster City). Ilmaus

DVL3

arvioitiin kvantitatiivisella käänteistranskriptaasi-PCR: llä (q-PCR) ABI PRISM ™ 7500-järjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen Taqman® Geenien ilmentyminen määritykset; ihmisen

DVL3

(määritys ID: Hs00610263_m1). Ihmisen

18S rRNA

(määritys ID: Hs99999901_m1) käytettiin sisäisenä kontrollina.

Protein Extraction, Western blotting ja immunohistokemiallinen (IHC) analysoi

Proteiini lysaatti uutettiin hajottamalla solut pelletoimiseksi 1x lyysipuskuria (10X lyysipuskuria (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 1:100 PMSF, proteaasi-inhibiittori ja tislattua vettä). Western blot -analyysiä varten, näytteet, jotka sisältävät kiinteän määrän proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin on Hybond-P -kalvoille (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, USA). Sitten kalvot blotattiin 5% rasvatonta maitoa 30 minuuttia ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla; anti-pp70S6kinase, anti-p70S6 kinaasi, anti-pAMPKα, anti-AMPKα, anti-CyclinD1 (Cell Signaling Technology), anti-DVL1, anti-DVL2, anti-DVL3, anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA) ja anti-β-kateniinin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) yön yli 4 ° C: ssa. Anti-hiiri- tai anti-kaniini-vasta-aine oli konjugoitu piparjuuren peroksidia (Amersham Pharmacia Biotech, OH) käytettiin ja visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham). Immunohistokemiallista analyysia varten, kohdunkaulan syöpä kudoksen array (CXC1021) (5 tapauksessa normaali kohdunkaulan /kohdunkaulan ja 97 tapauksissa kohdunkaulan syöpiä) (Pantomics Inc, CA, USA) käytettiin immunohistokemiallista värjäystä varten DVL3, β-kateniinin ja CyclinD1. Leikkeet immunovärjättiin primääristen anti-DVL3 (1:200 laimennos) (NB110-59941, Novus Biologicals, Littleton, CA USA), anti-β-kateniinin (BD Biosciences) (1:200 laimennus) ja anti-CyclinD1 (1 :100 laimennus) (H-295, Santa Cruz Biotehcnology). Inkubointi Tris-puskuroitua suolaliuosta, käytettiin negatiivisina kontrolleina. Heidän ekspressiotasoja pisteytettiin manuaalisesti kertomalla prosenttiosuus osuus immunopositiivista värjäyksen alue (0-100%) ja värjäyksen voimakkuuden (+1, heikko, +2, kohtalainen, +3, voimakas, ja +4, erittäin voimakas ). Kannen muutos kunkin geenin laskettiin jakamalla sen ilmentymistaso kussakin syövän näytteen keskiarvo sen ilmentymistaso normaalin kohdunkaulan /kohdunkaulan. Cutoff kohta (lukumäärä taittuu) kunkin geenin määritettiin sitten sen ekspressiotasot ja tilastollinen merkitsevyys. Kaikki kudoksen osassa tutkittiin ja tekee itsenäisesti kaksi tutkijaa.

Luciferase Reporter Assay

HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi 0, 50, 100, ja 200 ng pCMV2-Flag /DVL3 sekä joko pSuper8XTOPFlash tai pSuper8XFOPFlash lusiferaasireportterilla konstrukti. Kaikki transfektiot normalisoitunut pcDNA3.1 (+) vektori. Lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Transfektiotehot olivat normalisoitu

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja 3 itsenäisestä kokeesta.

In vivo

ubikitinaation Pitoisuus

menettelyä kuvattiin aiemmin [29]. Lyhyesti, C33A tai Hela-solut ympättiin 100 mm viljelymaljoille. PcDNA-HA (Ub)

8 oli ohimenevää transfektoitiin edellä solutyyppeihin käyttäen vastaavasti Lipofeactamin 2000 transfek- (Invitrogen). Solulysaatti kerättiin käyttämällä NET lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl ja 5 mM EDTA), 1% NP40, pH 8,0, 0,1 mM PMSF: ää, ja 1 mM Complete TM proteaasiestäjäseostabletit (Roche)) solupelletillä. Yksi mg solulysaattia inkuboitiin 1 ug hiiren anti-IgG ja anti-DVL3 (Santa Cruz) 4 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen, 40 ui Protein A /G Plus-agaroosi-helmiä (Santa Cruz) lisättiin kuhunkin näytteeseen ja sekoitettiin pyörittämällä yli yön 4 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen helmet pestiin neljä kertaa NET-lyysipuskurilla, mitä seurasi näytteen, joka sisälsi DTT: tä ja keitetään 10 minuuttia ennen elektroforeesia. Proteasomi-inhibiittorit, MG132 ja AM114, saatiin yhtiöstä Calbiochem (La Jolla, CA).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen lisääntyminen kit (XTT) (Roche) käytettiin mittaamaan solujen elinkelpoisuus 5 päivää mukaan valmistajan protokollaa. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena rinnakkaisena.

klonogeeninen määritys

Solujen annettiin kasvaa 2 viikkoa. 2 viikon kuluttua, väliaine poistettiin seurasi inkubointi metanolilla 30 minuuttia ja värjättiin sitten kristallivioletilla 1 tunnin ajan. Värjäyksen jälkeen solut pestiin PBS: llä. Triplication kunkin näytteen ja kolme riippumatonta kokeet suoritettiin, ja solujen lukumäärä laskettiin Gel-Doc-järjestelmä.

Data-analyysi

Studentin t-koe (parametritietoja) ja Mann- Whitneyn testin mukaan (ei-parametrinen tiedot) käytettiin analyysiin. Kliinis analyysi välinen ilmentymä DVL3, β-kateniinin, CyclinD1 ja kliinisten parametrien analysoitiin crosstabs ja Pearson Chi-Square test SPSS 13.0 ohjelmistolla (SPSS, Chicago, IL). Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD.

P

-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

DVL3 usein yliaktiivista kohdunkaulan syöpäsolut

Kehittyvät todisteita ovat osoittaneet että DVLs pystyvät säätää ylös β-kateniinin ja edistää solujen kasvua kolorektaalisyövän [30], pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma [31] ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [32] jne. Meillä on siis tutkittava ekspressiokuviota DVLs ( DVL1, DVL2 ja DVL3) kohdunkaulan syövän solulinjojen western blot -analyysillä. Tuloksemme osoittivat, että DVL3 mutta kumpikaan DVL1 eikä DVL2 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin paneelia kohdunkaulan syövän solulinjoista (Hela, SiHa-, CaSki-, C33A ja C41) verrattuna kuolemattomaksi kohdunkaula solulinjojen (NC104 ja NC 105) (kuvio 1A ), mikä viittaa siihen, että DVL3 on vallitsevasti yliaktiivista kohdunkaulan syöpäsoluja. Tutkimme seuraavaksi mRNA tasolla

DVL3

näissä solulinjoissa reaaliaikaisella kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (Q-PCR). Samoin

DVL3

mRNA-tasot olivat merkittävästi korkeampia kohdunkaulan syövän solulinjoissa verrattuna normaaliin kuolemattomaksi kohdunkaulan solulinjoissa (kuvio 1 B). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että DVL3 on merkittävä isoformin DVLs usein säädellään ylöspäin kohdunkaulan syövistä soluissa.

(A) Western blot-analyysi osoitti, että vain taso DVL3 mutta ei DVL1 ja DVL2 oli merkittävästi alku- säännelty kohdunkaulan syövän solulinjoissa verrattuna normaaliin kohdunkaula solulinjat. (B) Reaaliaikainen q-PCR paljasti mRNA

DVL3

oli ilmeisesti yleisempää kohdunkaulan syövän solulinjat verrattuna normaaliin kohdunkaula solulinjat. Arvo NC105 normalisointiin käytettiin muita solulinjoja. (C) immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että sekä DVL3 ja β-kateniinin oli säädelty kohdunkaulan syövän kudoksissa verrattuna normaaliin kohdunkaula näytteitä. DVL3 jakelusta sytoplasminen alue taas β-kateniinin sijaitsi sekä sytoplasman ja ydin- alueilla. (Suurennus: 20x) (D) lusiferaasireporttiterilla määritys paljasti, että ohimenevää transfektiolla DVL3 ilmentävien plasmidin voisi lisätä β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta HEK293-soluissa.

yli-ilmentyminen DVL3 ja β-kateniinin kohdunkaulan syövän

tutkia merkitystä DVL3 ja β-kateniinin kohdunkaulan syövän, tutkimme ilmauksia DVL3 ja β-kateniinin on kohdunkaulan syövän kudoksen array (CX1021) käyttäen immunohistokemiallista (IHC) analyysi. Immunoreaktiivisuus DVL3 havaittiin ainoastaan ​​sytoplasmassa kun taas β-kateniinin lokalisoitu sekä ytimet ja sytoplasman alueilla sekä normaalin kohdunkaulan syövän soluja (kuvio 1C). IHC-analyysi osoitti, että huomattavaa lisääntymistä ilmauksia DVL3 ja β-kateniinin havaittiin kohdunkaulan kasvainta kohdissa verrattuna normaalin kohdunkaulan osaa (taulukot 1 ja 2). Tilastollinen analyysi osoitti, että korkea ilmentyminen DVL3 (listalla 5 taittuu) korreloi merkitsevästi korkea β-kateniinin (rank 7 poimuja; P = 0,009) (taulukko 1). Kuitenkin, ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä DVL3 ilmaisun ja muiden kliinisten parametrien, kuten kasvain vaiheessa (

P

= 0,369), luokittelu (

P

= 0,658), etäpesäkkeitä (

P

= 0,243), β-kateniinin (

P

= 0,009) ja CyclinD1 (

P

= 0,009). Toisaalta, ylös-säätely β-kateniinin (rank 7 taittuu) oli merkitsevästi yhteydessä korkealuokkaisesta kasvaimet (

P

= 0,049) ja yli-ilmentyminen CyclinD1 (

P

= 0,009), mutta ei ollut merkittävää korrelaatiota kasvain vaiheessa (

P

= 0,189) ja etäpesäkkeiden (

P

= 0,345) (taulukko 2). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että lisääntynyt ilmentyminen DVL3 korreloi β-kateniinin, joka on mukana kohdunkaulan syövän kehittymisessä.

DVL3 parantaa proliferaatiota kohdunkaulan syövän solujen

DVLs ovat tärkeitä signaalitransduktion välittävien molekyylien Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta kontrolloida solujen kasvua. Puuttumaan onko DVL3 voisi edistää Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta, dual lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin. Transfektio DVL3 ilmentävän plasmidin HEK293-soluihin lisäsi β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että DVL3 on positiivinen säätelijä Wnt /β-kateniinin signalointikaskadissa. Seuraavaksi tutkia DVL3 edistää solujen lisääntymistä aktivoimalla Wnt /β-kateniinin väylän kohdunkaulan syöpää, kaksi kohdunkaulan syövän solulinjoista (C33A ja SiHa-) kanssa vakaasti ilmaus DVL3 perustettiin käyttäen ihmisen GFP-merkinnällä DVL3 ilmentävien plasmidi. Western blot-analyysi osoitti, että β-kateniinin oli merkittävästi kohonnut GFP-DVL3 stabiileja klooneja C33A (C-G25 ja C-G28) ja SiHa (S-G18 ja S-G20) (kuvio 2A). Toiminnallisesti XTT soluproleferaatiomäärityksessä paljasti, että ektooppinen ilmentyminen DVL3 tehostaa merkittävästi soluproliferaation GFP-DVL3 vakaa klooneista SiHa (

P

0,05) ja C33A (

P

0,001) soluja (kuvio 2B). Lisäksi, klonogeenisten määritys paljasti, että oli olemassa 2-3-kertainen määrä kasvaa pesäkkeiden SiHa- soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti GFP-DVL3 (S-G18 ja S-G20) (

P

0,05) ja C33A soluja (C-G25 ja C-G28) (

P

0,05) vastaavasti verrattuna niiden vektori valvonta (kuvio 2C). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että DVL3 parantaa Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta ja edistää proliferaatiota kohdunkaulan syövän soluja.

(A) Western blot osoitti, että stabiilisti yli-ilmentävät GFP-DVL3 kohonnut ilmentyminen β-kateniinin in C33A (C-G25 ja C-G28) ja SiHa (S-G18 ja S-G20). (B) XTT-määritys paljasti merkittävän kasvun soluproliferaation kohdunkaulan syövän solujen vakaa ilmentyminen GFP-DVL3 (C-G24 ja C-G28;

P

0,05) (S-G18 ja S- G20;

P

0,05). (C) klonogeeninen määritys osoitti, että kaksi ja kolme kertaa pesäkkeiden lukumäärä havaittiin GFP-DVL3 ektooppisesti ilmentävien C33A-solut (C-G25 ja C-G28) (

P

0,05) ja SiHa-soluja (S -G18 ja S-G20) (

P

0,05) verrattuna niiden vektorin valvontaa.

AMPK aktivaattoreita vähentää DVL3 kohdunkaulan syöpäsolut

Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että AMPK aktivaattorit voivat estävät solujen kasvua syöpien, erityisesti kohdunkaulan syövän

in vitro

[21], [33], [34]. Siksi tutkimme vaikutus AMPK aktivaattoreita ilmentymistä koskevat DVL3 ja siihen liittyvien Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta kohdunkaulan syöpäsoluja. AICAR hoito johti merkittävään vähentämiseen DVL3 tasojen kolmella kohdunkaulan syövän solulinjoissa (kuvio 3A). Toinen AMPK aktivaattori, A23187, aktivoi AMPK kautta ylävirtaan kinaasi (CaMKK) lisäämällä sytosolin kalsiumin taso [20], myös vähensi DVL3 ilmaisun C33A ja SiHa solujen annosriippuvaisesti (kuva 3C). Jotta edelleen vaikutusten arvioimiseksi A23187 on DVL3 ilmaisun, C33A ja CaSki käsiteltiin 1,25 uM A23187 ja talteen eri aikapisteissä. Askelvähennys DVL3 jälkeen havaittiin 10 ja 12 tuntia C33A ja CaSki vastaavasti eikä DVL3 jälkeen havaittiin 12 ja 24 tuntia molemmissa solulinjoissa (kuvio 3D). Jotta lisäksi arvioitava vähentäminen DVL3 välittämä AMPK aktivaattorit on universaali prosessi, kahden tunnetun AMPK aktivaattoreita, A769662 ja metformiinia, käytettiin. A769662 on thienopyridone joka aktivoi AMPK läpi vuorovaikutuksessa α- ja β-alayksikön AMPK. Kun A769662 hoito, DVL3 ilmentyminen lakkautettiin annoksesta riippuvaisella tavalla SiHa- ja C33A (kuvio 3B). Lisäksi metformiinin on hyvin yleinen AMPK aktivaattori sekä mahdollisen syöpälääkettä [22]. Käsittelemällä metformiinin, useat kohdunkaulan syövän solulinjoista näkyvissä ero vastauksia metformiinin ja osoitti köyhtyminen DVL3 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3E), sekä mitään muutosta mRNA tasolla

DVL3

vuonna C33A ja HeLa (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että vähentäminen DVL3 säätelevät AMPK aktivaattorien liittyy transkription jälkeisiä. Yhdessä nämä tiedot merkitsevät sitä, että AMPK aktivaattorit voivat vähentää DVL3 ja tällainen vaikutus on universaali prosessi.

(A) yhteydessä hoitoon AICAR, noin 80% vähennys DVL3 tason havaittiin keskuudessa C33A, C41 ja CaSki. (B) Kun hoito A769662 eri annoksia (0, 50 ja 100 uM), joka on 20-30% ja 80% -100%: n vähennys DVL3 SiHa- ja C33A voitiin havaita vastaavasti. (C) Kun käsittely A23187: llä eri annoksilla (0, 1,25 ja 2,5 uM) kaksikymmentä tuntia, C33A ja SiHa-solut osoittivat 80-90%: n vähennys DVL3 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. (D) Kun hoito 1,25 uM A23187 määrä pieneni DVL3 voitiin havaitaan 10 ja 12 tuntia C33A ja CaSki vastaavasti, kun taas vielä 100% vähennys DVL3 havaittiin 12 ja 24 tuntia molemmissa solulinjoissa. (E) yhteydessä hoitoon metformiinin, 60-80% vähennys DVL3 havaittiin Hela, SiHa-, CaSki-, C41 ja C33A annoksesta riippuvaisella tavalla.

(A) Reaaliaikainen q- PCR-analyysi osoitti, että metformiini ei ollut vaikutusta ilmentymistä

DVL3

mRNA: n ilmentymisen in C33A ja HeLa-soluissa. (B) Western blot-analyysi osoitti, että yhdiste C voisi vesiasiat askelvähennys DVL3 välittämän metformiinia. (C) XTT soluproleferaatiomäärityksessä osoittivat merkittävää vähenemistä soluproliferaation C33A (

P

0,001), SiHa (

P

0,001) ja HeLa-solut (

P

0,001) hoidettiin metformiinilla annoksesta riippuvaisella tavalla. (D) klonogeeninen määritys osoitti merkittävää vähentämistä muodostuneiden pesäkkeiden määrästä HeLa ja C33A hoidettiin metformiinilla annoksesta riippuvaisella tavalla.

AMPK aktivointi on ratkaiseva vähentäminen DVL3 välittämän AMPK aktivaattorit

Vaikka merkittävä rooli AMPK aktivaattoreita on aktivoida AMPK toimintaa, lukuisia raportteja ovat todistaneet, että jotkut AMPK aktivaattorit voivat käyttää off-tavoite vaikutuksia [35], [36]. Siksi on kiinnostavaa tutkia AMPK aktivaattoreita välittämää vähentäminen DVL3 on riippuvaisia ​​ainoastaan ​​AMPK signalointi aktiivisuutta. Käytimme voimakas AMPK estäjä, yhdiste C, vaikutusten lieventämiseksi metformiinin on AMPK aktivointia. Tasaisen vähentäminen DVL3 havaittiin käsittelyn jälkeen metformiinin C33A ja SiHa (kuvio 4B), silti askelvähennys DVL3 kumottiin lisäämällä yhdistettä C. (kuva 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että vähentäminen DVL3 välittämä metformiini on lähinnä AMPK signalointiaktiivisuuteen.

AMPK aktivaattoreita heikentää kohdunkaulan syövän solujen lisääntymistä vähentämällä DVL3 ja Wnt /β-signalointi aktiivisuutta

Olemme osoittivat, että ektooppinen ilmentyminen DVL3 voitaisiin edistää soluproliferaatiota kohdunkaulan syöpäsoluja. Siksi saada tarkempi käsitys funktio köyhdytetyn DVL3 minimoinnissa Wnt /β-kateniinin signalointi ja solujen lisääntymistä välittyy AMPK aktivaattoreita, C33A, SiHa ja HeLa soluja käsiteltiin metformiini ja niiden leviäminen hinnat tutkittiin XTT-määritys. Tuloksemme osoittivat, että metformiinin merkittävästi tukahdutettu soluproliferaatiota C33A (

P

0,001), SiHa (

P

0,001) ja HeLa-solut (

P

0,001) (kuvio 4C). Lisäksi klonogeenisten määritys paljasti myös, että pesäkkeiden määrä väheni 20 ja 50% C33A ja HeLa-soluissa (kuvio 4D). Nämä havainnot ilmeistä, että inhibitio kohdunkaulan syövän solujen kasvua AMPK aktivaattoreita johtuu vähentämiseen DVL3.

AMPK /mTOR on olennaisen tärkeää ehtyminen DVL3

AMPK aktivaattoreita pystyvät aktivoida AMPK ja moduloivat sen loppupään cascade, kuten translaation ohjaus proteiinisynteesiä estämällä mTOR-reitin [12], [13], [14]. Siksi me perusteltu tukkiminen AMPK /mTOR aktiivisuus voi jäljitellä vaikutuksia AMPK aktivaattoreita on askelvähennys DVL3. MTOR-estäjä (rapamysiini) käytettiin estämään mTOR aktiivisuutta. Rapamysiinin estää kinaasiaktiivisuudet mTOR inaktivoimiseksi p70S6K tapaukseen, ja poistetaan tiettyjä proteiini käännös [37]. Käsittelemällä Rapamysiinin, DVL3 väheni kohdunkaulan syövän solulinjoissa (C33A, C41, CaSki, HeLa ja SiHa) annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi inaktivointi p70S6K samanaikaisen alentamisen kanssa DVL3 havaittiin HeLa ja SiHa-soluja käsiteltiin 1 nM Rapamysiini (kuvio 5A). Yhdessä vähentäminen proteiinisynteesiä saattaa vähentää DVL3 ilmentymistä kohdunkaulan syövän solulinjoissa ja että askelvähennys DVL3 välittämä AMPK aktivaattoreita on lähinnä AMPK /mTOR signalointiryöpyn.

(A) Rapamysiinin inaktivoitua p70S6 kinaasi aktiivisuutta ja abortoitujen proteiinisynteesiä DVL3 kaikissa kohdunkaulan syövän solulinjoissa (C33A, C41, CaSki-, HeLa ja SiHa) annoksesta riippuvalla tavalla. (B) proteasomaalisten estäjä, AM114, palautti alennettu DVL3 välittämä metformiini C33A. (C) proteasomaalisten estäjä, AM114, ei voinut palauttaa alennettua DVL3 välittämä metformiinin SiHa- ja HeLa. (D)

In vivo

ubikinaa- määritys osoitti, että DVL3 oli hajonnut poly-ubikitinoitu DVL3 proteiini ((Ub) n-DVL3) in C33A solumallin. C33A-solut transfektoitiin pcDNA-HA (Ub)

8 plasmidi. Molemmat MG132 tai AM114 ja metformiinin käytettiin parantamaan määrä polyubiquitinated DVL3 proteiinituotteiden ((Ub) n-DVL3). Solulysaatit inkuboitiin anti-DVL3, ja immunosaostumat koetettiin anti-HA. Sama kalvo uudelleen tutkittiin anti-DVL3 havaita ilmentymisen DVL3.

AMPK aktivaattoreita myös edistää proteasomaalisten hajoamista DVL3

Useat todistelinjat osoittavat, että DVLs ovat tiukasti säännelty proteasomaalisten kulumismekanismi jossa menetykseen liittyvistä tekijöistä ubikinaa- väyliä johtaa DVLs kertymiseen [28], [38]. Niinpä perusteltu että proteasomaalisten hajoaminen voisi toimia vaihtoehtoisen mekanismin syyksi AMPK aktivaattoreita välittämä DVL3 vähentäminen. Käytimme AM114, joka on proteasomaalisten estäjä, tukahduttaa ubikitiini /proteasomaalisten hajoamista. Yhteiskäytössä hoidon AM114 ja metformiinin, kunnostettu DVL3 ilmentyminen havaittiin C33A mutta ei SiHa- ja HeLa-soluissa (kuvio 5B ja 5C).

in vivo

ubikinaa- määritys osoitti lisäksi, että DVL3 vuonna C33A soluissa voitaisiin hajonnut kautta ubikitiini /proteasomireitillä reitin koska muodostumista DVL3-ubikitinoitu tuotteet havaittiin käsiteltäessä metformiinin ja tällaisten DVL3-ubikitinoitu tuotteita entisestään, kun co-hoito joko AM114 tai MG132 (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittavat, että proteasomaalisten hajoaminen on myös tärkeä rooli vähentämisessä DVL3 välittämän AMPK aktivaattoreita.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että DVL3 oli poikkeavasti yliekspressoidaan ja merkittävästi korreloi lisääntynyt β-kateniinin kohdunkaulan syöpä. Tuloksemme osoittivat myös, että DVL3 voisi edistää kohdunkaulan syövän kasvua aktivoimalla Wnt /β-kateniinin signalointireitin. Vielä tärkeämpää on, käsittelimme mahdollista käyttöä AMPK aktivaattorien vähentämisessä DVL3 ja siten estämällä kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua. Lisäksi tämä on ensimmäinen raportti osoittaa mahdollisen molekyylitason mekanismeja miten AMPK aktivaattoreita heikentää kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua läpi ylikuulumisen AMPK ja Wnt /β-kateniinin signalointi.

Aberrant aktivoituminen Wnt /β-kateniinin signalointi polku on dokumentoitu eri ihmisen syöpiä, kuten kohdunkaulan syöpää [39]. Todellakin, asennus todisteita ovat osoittaneet, että DVLs, jotka ovat positiivisia säätelijöitä Wnt /β-kateniinin signalointireitin usein säädellään ylöspäin erilaisissa ihmisen syövistä [32], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Yli-ilmennetty DVLs läheisesti liittyy lisääntynyt Wnt /β-kateniinin aktiivisuutta ihmisen syövissä [31], [32], [47]. Kuitenkin hyvin vähän tiedetään toiminnalliset roolit DVLs kohdunkaulan syöpä. Tässä havaitsimme, että DVL3, mutta kumpikaan DVL1 eikä DVL2, oli merkitsevästi säädelty ja liittyvät lisätyn Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta ja kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua.

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että ylävirran kinaasien on AMPK, kuten LKB1, usein mutatoitunut ja poistetaan keuhko-, rinta- ja erityisesti kohdunkaulan syövistä [21], [48], [49], mikä alentaa AMPK toimintaa syöpäsolujen kasvua. Todellakin, matala AMPK aktiivisuus on yhteinen tapahtuma suosimalla syöpäsolujen kasvua [15], [16]. Siten AMPK on ratkaiseva tavoite syövän hoidossa. Me ja muut ryhmät ovat aikaisemmin osoittaneet, että useat AMPK aktivaattorit voivat tukahduttaa syöpäsolujen kasvua [21], [22], [50]. Kuitenkin molekyylimekanismeihin tukahduttaminen ovat edelleen paljolti hyödyntämättä. Aiemmin Kohno ryhmä osoitti, että metformiini vähensi proteiinin taso β-kateniinin kautta säätämällä sen fosforylaatio riippuvaa hajoamista [51]. Tämä antoi meille vihjeen, että metformiini voi säädellä ylävirtaan sääntelevät Wnt /β-kateniinin signalointiryöpyn. Tässä osoitimme, että merkittävä väheneminen DVL3 voitiin indusoida useat AMPK aktivaattoreita, mikä viittaa siihen, että AMPK aktivaattorit yleisesti vähentää DVL3. Aiempien raportit antituumorivaikutus metformiinin kautta alas-sääntelemiseksi CyclinD1 tasolla eturauhassyövän ja rintasyövän [52], [53], vähentäminen DVL3 ilme on myös yhteiskäytössä kanssa alentuneesta β- kateniinin ja sen alavirrassa oleva kohde, CyclinD1, joka on vastuussa solusyklin kontrolli. Yllättäen metformiini vaikuttaa vain proteiinin taso DVL3 muttei sen mRNA, mikä osoittaa, että sääntely DVL3 välittämän AMPK aktivaattoreita perustuu transkription jälkeinen muutos.

Koska useita AMPK aktivaattorit voivat vähentää DVL3, me arveltu, että AMPK toiminta on välttämätöntä tällaista sääntelyä. Sen testaamiseksi, onko AMPK aktivaattoreita niiden vaikutukset on DVL3 aktivoitumisen kautta AMPK, joka on AMPK estäjä, yhdiste C, oli mukana käsitelty metformiinin kohdunkaulan syöpäsolujen vaikutusten lieventämiseksi AMPK aktivointia. Kuten odotettua, yhdiste C laantui toiminta metformiinin lieventävien DVL3 ilme. Nämä havainnot ilmeistä, että AMPK aktivaattorit voivat vähentää DVL3 moduloimalla AMPK aktiivisuutta, ja tällainen vaikutus ei johdu AMPK aktivaattoreita ”off-kohdistettuja toimintoja. Todellakin,

in vitro

soluproliferaatiomäärityksissä paljasti myös, että käyttö AMPK aktivaattorien (esimerkiksi metformiini) voisi vähentää solujen lisääntymistä. Tarjoamme kiinteä näyttöä siitä AMPK aktivaattorit, erityisesti metformiini, kohdistamaan alaspäin säätäminen vaikutus DVL3 ja siten vähentävät ekspressiotasoja β-kateniinin ja CyclinD1, ja lopulta vaimentavat solujen lisääntymistä. Mikä tärkeintä, olemme ensimmäinen osoittaa, että AMPK aktivaattoreita kohdistavat antiproliferatiivinen vaikutus vähentämällä DVL3 ja Wnt /β-kateniinin signalointi aktiivisuutta. AMPK aktivointi näyttelee tarvittava asema tukahduttaa kasvainten kehittymistä kohdunkaulan syövän.