Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

munasarjasyöpä on viidenneksi suurin syy syöpäkuolemista naisten keskuudessa. Alkuvaiheen tauti jää usein havaitsematta, puuttuva oireiden ja luotettavien biomarkkereiden. Tunnistaminen varhaisessa geneettisten muutosten voisi tarjota oivalluksia uusia signalointi polkuja, jotka voidaan hyödyntää varhaista havaitsemista ja hoitoa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Hiiri munasarjojen pinnan epiteelisolujen (Mose) soluja käytettiin tunnistaa vaiheessa riippuvia muutoksia geenien ekspressiotasot ja signaalitransduktioreaktioteiden hiirellä koko genomin microarray analyyseja ja geeni ontologian. Nämä solut ovat läpikäyneet spontaani muutos soluviljelmässä ja siirtynyt ei-tuumorigeeniset tai keskitason ja aggressiivinen, pahanlaatuinen fenotyyppejä. Merkittävästi muuttuneen geenejä yliedustettuna useita polkuja, etenkin solun tukirangan toiminnallinen luokka. Samanaikainen kanssa geenien ilmentymisen muutoksia, tukirankaproteiinin arkkitehtuuri muuttui vähitellen sekavaa, jolloin poikkeava ilmaisu tai subsellulaarisista jakelu keskeisten solun tukirangan säätelevien proteiinien (polttoväli tarttuvuus kinaasi, α-aktiini, ja vinkuliinin). Tukirankaproteiinin epäjärjestys oli mukana muuttuneessa malleja seriinin ja tyrosiinifosforylaation sekä muuttuneen ilmaisun ja solunosasijaintia kiinteä signalointi välituotteiden APC ja PKCβII.

Johtopäätökset /merkitys

tutkimuksissa on todettu geenien ovat poikkeavasti ilmaistiin Mose solujen neoplastisia etenemistä. Osoitamme, että alkuvaiheessa häiriöstä aktiini mikrofila- seuraa progressiivinen epäjärjestystä mikrotubulushaarojen ja väli säikeitä myöhemmissä vaiheissa. Nämä vaihe-erityisiä, portaittain muutokset antaa lisää oivalluksia aikaa ja paikkatietojen tapahtumasarjaa, joka johtaa täysin jalostettuina koska nämä muutokset havaitaan myös aggressiivinen ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa riippumattomia histologinen tyyppi. Lisäksi tutkimuksemme tukevat välisen yhteyden poikkeavasta solun tukirangan järjestäminen ja sääntely tärkeitä loppupään signalointi tapahtumat, jotka voivat olla osallisina syövän etenemiseen. Siten meidän Mose peräisin oleva solu malli on ainutlaatuinen malli perusteellisesti mekaaniset tutkimukset munasarjasyövän etenemisen.

Citation: Creekmore AL, Silkworth WT, Cimini D, Jensen RV, Roberts PC, Schmelz EM (2011) muutokset Gene Expression and Cellular Architecture in munasarjasyöpäsolu Progression Model. PLoS ONE 6 (3): e17676. doi: 10,1371 /journal.pone.0017676

Editor: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 marraskuu 2010; Hyväksytty: 08 helmikuu 2011; Julkaistu: 03 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Creekmore et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimukset tukivat NIH R01 CA118846 (EMS, PCR) ja AICR myöntää 04B071 (EMS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä osuus on vain 3% on diagnosoitu syövistä, mutta on viides johtava syy syöpäkuolemista keskuudessa nainen, jolla on viiden vuoden eloonjäämisluvut vain 45% [1]. Keski-ikä diagnoosin on 63 vuotta, ja useimmat potilaat (62%) läsnä etäpesäkkeitä klo diagnoosi [1]. Munasarjasyöpä on heterogeeninen sairaus eri kudospatolo- tai kliinis alatyyppejä, jotka kehittävät ja läsnä eri tavalla. Tavanomainen näkemys on, että noin 90% munasarjojen syöpiä ovat peräisin yhden solun kerroksen pinnan epiteeli, joka ympäröi munasarjoissa [2]. Koska munasarjojen epiteelin muuttuu pahanlaatuinen fenotyyppi, se erottaa useisiin alatyyppeihin, jotka on luokiteltu vakavien, mucinous, endomet- ja kirkas cell carcinoma, joka perustuu niiden morfologiaa sijaan niiden genotyyppi [3]. Kuitenkin alkuperä yksittäisten alatyyppiä voi vaihdella ja korkeampi panos munanjohtimet ja kohdun limakalvo on aggressiivisempia syöpiä on parhaillaan keskustelua [4]. Alkuperä Sekä munasarja- ja munanjohtimen epiteelin on sama, eli coelomic epiteelin [2], jotka voivat edistää kiistaa.

epiteelikasvaimet munasarjasyöpiä osoittaa korkean geneettisen heterogeenisyyden seurauksena mutaatioita, vaientaminen, ja poistot. Koska muutoksia geenien ilmentyminen, joko mutaatio, epigeneettiset sääntelyn tai ero silmukointitapahtumilla, vaikuttaa kasvainten kehittymiseen, eteneminen, huumeiden reagointikykyä ja lopulta selviytymisen potilaan tunnistaminen kasvaimen alatyypin ja sen geneettinen sormenjälki on välttämätöntä. Äskettäin uusi luokittelu epiteelin munasarjojen kasvaimia osaksi tyypin I ja tyypin II syöpien on ehdotettu: tyyppi 1 ovat hyvänlaatuisia ja rajatapauksia kasvainten suhteellisen vakaa genotyypit taas tyypin II sisältää aggressiivisia ja korkean asteen kasvaimet, jotka ovat geneettisesti epävakaita ja niillä huomattavia geneettisiä muutoksia [ ,,,0],5]. Useimmat epiteelisyövissä seurata etenemistä järjestelmä, joka käynnisti solujen edetä adenoomien ja adenokarsinoomia ja etäpesäkkeiden, varaamiseen geneettiset muutokset vaiheittain aikana etenemistä [6]. Tämä sekvenssi on kuvattu myös huonolaatuisia munasarjakarsinoomissa; se on kuitenkin keskusteltu jos kaikki munasarjasyöpiä seurata tätä syövän kehitystä vuodesta esiasteleesioita kaikkein aggressiivinen munasarjojen kasvaimia (tyyppi II) ei ole lopullisesti tunnistettu [5]. Äskettäin Lee et ai. ovat ehdottaneet, että fimbria munanjohdin voi olla alkuperän ”tyypin II” serous karsinoomien soluissa [7]. He ehdottavat, että tyypin II kasvaimet syntyvät ”p53 allekirjoitus” esiasteleesioita peräisin vahvistus erittyvien epiteelisolujen. Myöhemmät mutaatiot sitten helpottaa etenemistä serous munanjohtimien intraepiteliaalisten syöpä ja lopulta vakavasta syöpä.

Tällä hetkellä geeniekspressiomalleja on käytetty ainoastaan ​​onnistuneesti erottamaan mucinous ja selkeitä solun serous karsinoomat [8] välillä tai huonolaatuisen , alhainen pahanlaatuinen potentiaali ja korkea-asteen, etäpesäkkeitä [9], [10], [11]. Luotettava molekyyli- tai kliinisten merkkiaineiden muutosten tunnistamiseksi alkuvaiheessa etenemistä ei ole vahvistettu vielä, ja koska alkuvaiheessa tauti ovat suhteellisen oireettomia diagnoosi usein vain tapahtuu myöhään vaiheissa. Siksi luonnehdinta geeniekspressioprofiilien alkuvaiheen esiasteleesioita munasarjasyövän voisi tarjota uusia oivalluksia ja tunnistaa uusia tavoitteita ennaltaehkäiseviä ja hoitoon ponnisteluja.

Olemme aiemmin kehittäneet ja tunnusomaista solun mallin epiteelin munasarjasyöpä etenemistä tutkia tapahtumasarjaa, joka johtaa munasarjan epiteelin syövän [12]. Geneettisesti hiiren munasarjojen pinnan epiteelisolujen (Mose) soluja, jotka ovat peräisin C57BL6-hiiriä, joille on tehty spontaani muutos soluviljelmässä. Heterogeeninen Mose solut käyvät läpi erillisiä fenotyyppiset muutokset, koska ne ovat jatkuvasti siirrostettiin kulttuuri, varhain käytäviä edustavat premaligni, ei-tuumorigeenisiä fenotyyppi, väli- kohdat edustavat siirtymäkauden fenotyyppi, ja myöhemmin kohtia etenee erittäin aggressiivinen pahanlaatuisen fenotyypin, kun sitä annetaan immunokompetenteista hiirille . Siirtymäkauden valtioiden etenemistä oli havaittavissa muutoksia kasvu, solukoko, kontakti-inhibition menetys kasvun, ja kyky kasvaa pallosia alle tarttumattoman olosuhteissa. Tärkeää on, sekä Mose-I (väli passage) ja Mose-L (myöhäinen passage) soluja on myös hankkinut kyky muodostaa kasvaimia kun ruiskutetaan vatsaonteloon syngeenisten immunokompetenttien hiirten, joskin entinen oli vähemmän invasiivisia [12].

Tässä tutkimuksessa tunnistimme merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen malleja ei-transformoidut Mose peräisin olevien solujen siirtymistä aggressiivisempia ja fenotyyppien käytetyt geeni ontologian työkaluja määrittää niiden toiminnallisia luokkia. Siirtymäkauden toteaa tämän mallin antoi meille mahdollisuuden tunnistaa vaiheessa riippuvaisen geenejä, geenituotteiden ja signaalitransduktioreaktioteiden mukana munasarjojen syövän etenemiseen. Täällä korostetaan progressiivinen muutoksia, jotka johtavat erittäin säädeltyyn solun tukiranka. Monet näistä muutoksista vahvistettiin arkistoituja ihmisen munasarjasyövän microarray aineistoja. Mikä tärkeintä, me osoittavat, että solun tukirangan epäjärjestyksestä voi olla syvällisiä vaikutuksia solunosasijaintia tärkeä signalointi välituotteita, mikä lopulta voi johtaa moduloitu signalointireittien edistää munasarjasyöpä kehitystä. Nämä geenit, niiden geenituotteita ja siihen liittyvä signalointi polkuja voi edustaa uusia kohteita varhaisen puuttumisen neoplastisten etenemisen.

Tulokset

Differentially geenien hiiren munasarjasyövän etenemisen

tunnistamaan geeni-ilmentymisen muutosten etenemisen aikana munasarjojen epiteelin syövän ja määrittää mahdolliset vaihe-erityisiä malleja, käytimme koko genomin mikrosiruanalyysi verrata geeniekspressiotasot soluissa, jotka edustavat hyvänlaatuinen (Mose-E), välituotetta (Mose-I), ja pahanlaatuinen ( Mose-L) vaiheissa hiiren munasarjasyöpä. Kolme biologinen rinnakkaista käytettiin vaihtelun huomioimiseksi sisällä heterogeeninen kulttuureissa. Niistä 45102 koetin sarjat mikrosirulla (joka edustaa 18136 selityksin geenejä), 960 koetinsarjojen todettiin merkittävästi säädelty (701 selityksin geenit) ja 1006 merkittävästi alassäädetty (711 selityksin geenejä) suurempi kuin 2-kertaiseksi (p≤ 0.05) välillä Mose-E ja Mose-L-solut. Näistä 1966 muuttuvat koetinsarjojen, 58,9% ei esiintynyt merkittävää muutosta ekspressiotasot etenemisen aikana välillä Mose-E ja Mose-I, joka osoittaa että suurin osa muutoksia geenien ilmentyminen liittyy myöhemmin tapahtumia pahanlaatuinen etenemisen mallissamme, jossa 608 lisääminen ja 549 pienenee solujen siirtymistä Mose-I Mose-L. Sen sijaan 33,3% vaikutti geenien osoitti progressiivista lisäystä (272 koetin sarjat) tai vähennys (382 koetin sarjat) ilmentymisessä soluiksi siirtyminen Mose-E Mose-I Mose-L-solut (kuvio 1). Pieni määrä vaikuttaa antureista sarjaa, 3,9%, osoitti Mose-I /Mose-E-luvut, jotka olivat sisällä 0,4 kertainen Mose-L /Mose-E-luvut, mikä osoittaa, että nämä geeniekspressiota muutokset voivat liittyä hyvin varhaisessa tapahtumia pahanlaatuinen etenemistä meidän solut. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että suurin osa muutoksista geeniekspressiotasot joko esiintyy jatkuvasti, on portaittain koko etenemisen mallimme tai tapahtuvat myöhemmissä vaiheissa, kun taas vain rajalliset muutoksen aikana alkuvaiheessa. Täydelliset tietosarjat löytyy GEO tietokantaan (GSE24789).

45102 koetinsarjojen analysoitu, 970 oli merkittävästi (p≤0.05) sääteli (A) ja 1006 olivat alassäädetty (B ) yli kaksinkertaiseksi. Nuolet osoittavat ilmentymiskuvio muuttuu useita koetinsarjojen osoitti vieressä nuoli. Koetinsarjojen merkitty toinen ei noudata kuvattuja malleja.

yliedustettuna geeni ontologian luokat munasarjasyövän etenemisessä

havaitsemiseksi polkuja, jotka voivat osaltaan edistää ja etenemistä munasarjojen syöpä, Gene Trail ohjelmaa käytettiin tunnistamaan toimintakategorioihin geenien, jotka osoittavat tilastollisesti merkittäviä muutoksia niiden ekspressiotasot välillä Mose-E ja Mose-L-solut. Gene Trail on kehittynyt geeniperimä rikastamiseen analyysin työkalu, joka määrittää yliedustettuna geeni ontologian luokat tietokokonaisuuksien [13]. Yli-edusti solukomponenttiin, biologisen prosessin, ja molekyylitason toiminta geeni ontologian tuoteryhmät in Mose-L versus Mose-E ekspressoidaan eri geenin sarjat on lueteltu taulukossa 1 (p 0,01). Yliedustus geenien solusyklin ja soluproliferaatiota luokat odotettiin vuoksi aiemmin raportoitu lisääntynyt kasvunopeus Mose-L-solut [12] ja osallistumista kontrolloimattoman soluproliferaation syöpää [14]. Mielenkiintoista, solun tukirangan ja Metal Ion /KATIONINVAIHTOKOLONNI sitova edustamaan ryhmään huomattava määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien, joilla on huomattava päällekkäisyys geenien luokiteltu näissä molemmissa ontologian luokista. Kuitenkin toisin kuin monenlaisia ​​tehtäviä geenien Metal Ion /KATIONINVAIHTOKOLONNI sitova luokka, geenit koottu tukirankansa geeni ontologian luokka olivat toiminnallisesti hyvin erityinen. Koska uskotaan, että muutokset ekspressiotasot solun tukirangan proteiinit ja niiden sääntelyviranomaiset etenemiseen liittyvä ja etäpesäkkeitä [15], [16], [17], muutokset geenien rakenteen ja sääntelyn solun tukirangan aikana etenemisen meidän Mose malli käytiin lisätutkimuksia.

Epäjärjestyksestä matkapuhelinverkon solun tukirangan aikana pahanlaatuinen etenemisen

aktiinisytoskeletonin.

Niistä 141 geenit luokiteltu sisällä solun tukirangan geeni ontologian luokka, 90 on geeni tuotteita, jotka ovat alayksiköt aktiinisäikeiden (taulukko 2) tai ovat mukana järjestämiseen ja sääntelyn aktiinisytoskeletonin (taulukko 3; täydellinen luettelo täydentävien taulukossa S1). Useimmat näistä geeneistä, ekspressiotasot muuttui vähitellen vaiheittain soluiksi siirtynyt peräisin Mose-E mose-I mose-L, mikä osoittaa, että nämä muutokset jatkuvasti tapahtuvat koko etenemisen. Vain kolme geeniä, γ-aktiini 1, formin 1, ja drebrin 1, osoitti Mose-I /Mose-E-luvut, jotka olivat alle 0,4 kertainen Mose-L /Mose-E-luvut, mikä viittaa siihen, nämä ovat aikaista muutoksia pahanlaatuinen etenemisen (taulukko 2 ja 3). Seitsemän geenejä, mukaan lukien integriinin av, -β1, ja -β2, osoitti ekspressiotasot, että muutetaan suurin suuruus Mose-I-soluja, joista kaksi varmistettiin qRT-PCR: llä (taulukko 2 ja taulukko 3). Monet näistä geeneistä on väärin säädellystä syövän tai mukana etäpesäke mukaan lukien kaikki 15 geenejä, jotka varmistettiin qRT-PCR: llä (taulukko 2 ja 3).

geenituotteet osajoukko geenien vahvistettiin qRT-PCR: llä analysoitiin myös western blot sekä immunofluoresenssimikroskoopilla määrittää mahdolliset erot niiden solunosasijainti. Microarray tulokset osoittivat asteittaista laskua α-aktiini ja γ-aktiini-mRNA: n, joka vahvistettiin qRT-PCR: llä (taulukko 2), ei kuitenkaan muutoksia β-aktiini havaittiin. Tämä vastasi laskua yhteensä aktiini proteiinin tasot aikana etenemisen (kuvio 2A). Lisäksi tutkiminen F-aktiini arkkitehtuuri immunofluoresenssimikroskopialla paljasti selvästi eroja aktiini subsellulaaristen organisaatio. Mose-E solut osoittivat pitkä, hyvin määritelty kaapeli, kuten stressi kuitujen värjäyksen jälkeen Alexa Fluor

488 konjugoitu -falloidiinia taas pahanlaatuinen Mose-L soluilla vähemmän erillisiä F-aktiini rakenteita ja organisaatiota. (Kuvio 3A, 1

st sarake). In Mose-L-solut, aktiini rakenteet vaihtelivat pieni ohut stressi kuitujen näkyvä ”pörrössä” alueilla, joilla on hyvin lyhyt aktiinisäikeiden, muistuttaa podosomes (kuvio 3A ja 3B, konfokaali kuva 2 upotus). Huomattavaa on, että Mose-I näytteillä F-aktiini epäjärjestyksestä samanlainen kuin Mose-L-solut (kuvio 3A). Nimenomaan vertailla solu F-aktiini sisällön välillä Mose solulinjojen, menettely perustuu fluoresoivasti konjugoidun phalloidin käytettiin. Kuten kuviossa 4 on esitetty, solun kokonais-F-aktiini väheni 78% (p 0,01) Mose-L-solut verrattuna Mose-E soluja, vahvistaa qRT-PCR: n ja Western tuloksia.

Koko solu-uutteiden kohteesta Mose-E (E, valkoiset pylväät), Mose-I (I, harmaat pylväät) ja Mose-L (L, mustat pylväät) solut altistettiin Western blot-analyysi vasta-aineiden kanssa (A) aktiini säädellään proteiineja ja ( B) mikrotubuluksen proteiineja. Expression tasot ilmaistaan ​​prosentteina Mose-E tasoa normalisoinnin ribosomaalinen proteiini L19 (RPL19) tai γ-tubuliinin kolme biologista rinnakkaisnäytteiden kahtena kappaleena ± keskihajonta. Edustaja blot kolmesta biologisesta toistojen näkyy. * P≤ 0.01.

(A) Immunofluoresoivat värjäys Mose-E, Mose-I ja Mose-L-solut visualisoida aktiinisäikeiden (-falloidiinia vihreä), α- tubuliinin (2

nd sarake), β- tubuliinin (3

rd pylväät), tai sytokeratiini (4

nnen sarakkeen) yhdessä tuman (sininen, DAPI). (B ja C), Triple värjäys Mose-E ja Mose-L-solut DAPI (sininen), phalloidin (f-aktiini, vihreä), ja vasta-aineet α-aktiini (punainen, B) tai vinkuliinin (punainen, C). Konfokaalinen kuvissa ovat 0,6 um erillään solun sisällä, jossa kuva 1 alkaen juuressa kennon ja kuva 2 yläosaa kohti solun. Co-lokalisointi näkyy keltainen sulautunut ja konfokaali kuvia. (D) Triple värjäys Mose-E ja Mose-L-solut DAPI (sininen), vasta-ainetta vastaan ​​FAK (vihreä), ja vasta-aine FAK fosforyloidun tyrosiinin 861 (punainen, FAK

Y861). Keltainen yhdistetyn kuvan osoittaa kolokalisaation. (Original suurennos X600)

Yhtä suuret määrät Mose-E tai Mose-L-solut, joissa päällystetty. 48 tunnin jälkeen solut kiinnitettiin paraformaldehydillä ja värjättiin falloidiinia konjugoitu Alexa Fluor

488. Phalloidin liuotettiin MeOH: lla ja fluoresenssi määritettiin. Data normalisoitiin solujen lukumäärä ja esitetään keskimääräinen suhteellinen fluoresoiva (RFU) per solu ± keskihajonta. * P≤ 0,01.

Konfokaalimikroskopia paljasti suurta eroa paksuus solut; Mose-E solut oli keskimääräinen paksuus 2 pm, mikä osoittaa, nämä solut ovat melko tasainen, kun kasvatetaan muovia, kun taas Mose-L-solut osoittivat keskimääräinen paksuus 4,4 um koko sytoplasmisen alueen. Konfokaalinen kuvat kuvassa 3B (konfokaali image 1 ja 2) ovat peräkkäisiä z-pinot 0,6 mikrometriä erilleen aloittaen tyvestä solussa, johon aktiini kuituja löytyy runsaasti osoitteessa kiinnitys sivustoja. Koska keskimääräinen Mose-L-solu on 4,4 um, toinen kuva kaappaa suunnilleen keskimmäisen kolmanneksen solun, ei kalvo, mikä viittaa ei-kuitumaisia ​​rakenteita Mose-L-solut eivät ole seurausta kalvon ruffling. Ne ovat kuitenkin solussa sytoplasmassa ja muistuttavat rakenteita, tunnettu siitä, invasiivisen rintasyövän solujen podosomes [18]. Sen sijaan, Mose-E (kuvio 3B) solut osoittivat stressin kuitujen koko solut, joilla ei ole lyhyt aktiinisäikeiden.

Mikrotubulukset.

Gene tuotteita, jotka muodostavat tai säätää mikrotubulusverkoston käsitti toiseksi suurin joukko geenejä (44 141) vaikuttaa aikana neoplastisen transformaation Mose soluja (taulukko 4; täydellinen luettelo täydentävien taulukossa S2). Kaikki mutta kuusi geeniä vain ylös- tai alaspäin säädeltyjä Mose-L-solut. Viisi geenit (Tubb2b, Cenpe, Mtap6, nDn, ja Vav2) oli ekspressiotasot, jotka vähitellen muuttuu Mose-E Mose-I Mose-L, mikä osoittaa, että nämä muutokset jatkuvasti tapahtuvat koko etenemistä. Ainoastaan ​​yksi geeni, Ninl, osoitti Mose-I /Mose-E-luvut, että jos alle 0,4 kertainen Mose-L /Mose-E-suhteet, mikä viittaa siihen, että tämä on varhainen tapahtuma maligni kehittyminen (taulukko 4). Mielenkiintoista on, että 44 differentiaalisesti ilmaisi mikrotubulusten ja mikrotubuluksiin liittyvien geenien, 12-geenit koodaavat proteiineja, jotka liittyvät kromosomissa congression (Kif18a, Kif22, Kif4), erottelun (ASPM Cenpe, Ckap2, Incenp, Jub, Kif20a, Kif23, Lats2, Prc1) ja /tai sytokineesi (Incenp, Kif20a, Kif23, Prc1) (taulukko 4) [19]. Kaikki 12 geenit osoittivat vähentynyttä ilmentymistä viisi 12 koodaavien geenien kinesiinien, jotka ovat molekyyli- moottoreita, jotka käyttävät energiaa ATP hydrolyysin siirtää pintaa pitkin mikrotubulusten säikeitä tai horjuttaa ne [19], [20].

pienenee merkittävästi tasojen α-tubuliinin isoformia 4a ja useita isoformeja β-tubuliinin havaittiin myös mikrosirulla data. Varmistus qRT-PCR yksittäisten isomuotojen osoittautui vaikeaksi korkea homologian, mutta lasku tubuliinin β3 mRNA Mose-L-solut vahvistettiin. Ei kuitenkaan ole merkittäviä muutoksia β-tubuliinia proteiinin tasojen Mose-E ja Mose-L-soluja havaittiin (kuvio 2B). Sen sijaan, α-tubuliinin proteiinin tasot alenivat 34% Mose-L-solut ja 67% in Mose-I-soluja verrattuna Mose-E tasoilla. Ei merkittäviä muutoksia γ-tubuliinia mRNA: ta (määritystuloksia ei ole esitetty) tai proteiinin tasot (kuvio 2B) todettiin ja immunovärjäys paljastaneet mitään helposti havaittavissa eroja proteiinin lokalisaatio välillä Mose-E ja Mose-L-solut (tuloksia ei ole esitetty).

Tärkeää oli huomattavia eroja Mose-E ja Mose-L-solut, kun solunsisäisen järjestämistä mikrotubuluksen proteiinien, α- ja β-tubuliinia, tutkittiin immunofluoresenssilla (kuvio 3A). In Mose-E soluissa, sekä α- ja β-tubuliinin näkyvät niin kauan määritelty filamentit säteili, mikä on todennäköisesti perinuclear lokalisoitu keskusjyvänen (kuvio 3A, 2

nd ja 3

rd pylväät yläpaneeli), raportoitu normaalina järjestäminen tubuliinin epiteelisoluissa. Sitä vastoin Mose-L-solut tubuliinin filamentit olivat vähemmän määritelty, jolla satunnainen sekavaa haaran ja alkuperä tubuliinin polymerisaatiota ei ilmeisiä monissa soluissa (kuvio 3A, 2

toisen ja 3

rd sarakkeita, pohjapaneelin ). Mose-I solut näyttävät olevan väli- fenotyyppi kanssa keskusjyvänen ilmenee noin 50% soluista yhdessä lyhyempiä, tarkemmin määrittelemättömistä säikeet kuin Mose-E soluissa (kuvio 3A, 2

nd ja 3

rd sarake , keskimmäinen paneeli).

Intermediate Filaments.

Viimeinen osajoukko vaikuttaa solun tukirangan liittyvien geenien (7/141) on geenituotteita, jotka muodostavat ja säätelevät väli hehkulampun (IF) verkkoon. MRNA-tasot määrä sytokeratiineja väheni Mose-L solujen sytokeratiineja 7,8, ja 19 varmistettiin qRT-PCR (taulukko 5). Immunovärjäämällä yleiseurooppalainen sytokeratiini-vasta paljasti, että Mose-E solut ovat hyvin järjestetty väli hehkulampun verkko ulottuu koko solut, kun taas välissä hehkulanka verkon Mose-L-solut koostuu lyhyitä rihmamaisia ​​rakenteita, jotka eivät säteile koko solu organisoidusti (kuvio 3A, viimeinen sarake). Hyvin määritelty sytokeratiinisäikeitä havaittiin vain noin 25% Mose-I-soluissa, ja loput soluista näyttää hajanainen sytokeratiinia värjäyksen rajallinen organisaatio muistuttaa Mose-L-solut.

Vertailu arkistoitu ihmisen munasarjasyöpä microarray aineistoja

sen määrittämiseksi merkitystä havaitut muutokset solun tukirangan geeniekspressiotasot meidän Mose solun etenemisen malli ihmisten munasarjasyöpä, arvioimme arkistoidut DNA-siru aineistoja jossa verrattiin geeniekspression tasoilla erilaisissa vahvistettu ihmisen munasarjan solulinjat normaali munasarjojen pinnan epiteelisolujen viitteenä (katso materiaalit ja menetelmät on kuvattu solulinjojen arvioitu). Vaikka ero ilmentyminen solun tukirangan geenien eivät olleet keskipiste näissä ihmisen tutkimuksissa noin 50%: n aktiini ja fokaalisen adheesion liittyviä geenejä taulukossa 2 kuten merkittävästi alassäädetty aikana Mose solujen etenemisen myös merkittävästi alassäädetty ihmisen munasarjan solulinjat. Kuten taulukosta 6, oli selkeä rikastamiseen merkittäviä muutoksia aktiini ja fokaalisen adheesion liittyviä geenejä. Käyttämällä kumulatiivinen bionomial jakelu, arvioitu todennäköisyys tarkkailla tämän monta ilmentyvät eri aktiini ja fokaalisen adheesion geenien ihmisen tutkimuksissa sattumalta olivat 2,23 x 10

-6 ja 1,87 x 10

-7 vastaavasti vertailua käsittävissä Nagarajan et al. [21] ja Iorio et ai. [22]. Lisäksi vertaileva analyysi paljasti, että useita muita aktiini sitovia geenejä taulukossa 3 luetellut merkittävästi vaimentua ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. Huomattavaa on, että Marcks ja Tpm2 olivat vaimentua mukaan 10- ja 23-kertaiseksi aggressiiviseen munasarjojen kasvainsoluissa verrattuna normaaliin OSE. Päällekkäisyys ilmentyvät eri geenien mikrotubulusverkoston toiminnallisen luokan ei saavuttanut merkitystä [21]. Tämä voi olla seurausta suhteellisen pieniä muutoksia geeni-ilmentymisen tasoa tähän luokkaan. Kuitenkin nDn geeni, joka oli 27 taitettava-säädellään Mose soluissa, oli peräti 125 taitettava-säädellään ihmisen syövän solulinjoissa [21]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että muutokset solun tukirangan ovat yhteisiä monille munasarjasyövän solulinjoissa riippumattomia histologinen tyyppi.

Muutoksia aktiinisytoskeletonin sääntelyn ja arkkitehtuurin aikana neoplastisia etenemisen

määrittämään mekanismit sytoskeletaalisten vapauttamisen aikana Mose pahanlaatuinen etenemisen, tutkimme ekspressiotasot ja solunosasijaintia useiden säätelevien proteiinien, kuten α-aktiini, vinkuliini ja polttoväli adheesiokinaasi (FAK). Nämä proteiinit valittiin siksi, että niiden osallistuminen tukirankansa asetuksessa, solun liikkuvuus, ja syövän etenemistä /etäpesäkkeitä. α-aktiniinin osallistuu aktiinin silloittamalla aktiinisäikeiden ja on osa fokaalisen adheesion monimutkainen, joka yhdistää aktiinisytoskeletonin integriineihin [23], [24]. Microarray Tulokset osoittivat, pienenee progressiivisesti α-aktiinin ilmentymistä tasoilla, jotka vahvistettiin qRT-PCR: llä (taulukko 2). α-aktiini-proteiinin tasot olivat merkittävästi vähentyneet sekä Mose-I ja Mose-L-solut verrattuna Mose-E-solut (kuvio 2A). Selvä kolokalisaation α-aktiniinin (punainen) kanssa aktiinisäikeiden (vihreä) kulkee rinnakkain etureuna oli aina selvä in Mose-E soluja (kuvio 3B). In Mose-L-solut, α-aktiniinin esiintyi pitkälti diffuusia värjäytymistä sytoplasmassa huomattavasti vähemmän ilmeinen yhteistyössä localiziation kanssa aktiinisäikeiden (kuvio 3B, punainen). Tämä havaittiin myös Mose-I-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Konfokaalimikroskopia osoitti α-aktiniinin ei kolokalisoituvat on hyvin lyhyt aktiinisäikeiden ja sekavaa aktiini löytyy Mose-L-solut (kuvio 3B, konfokaali kuvia ja upotus).

Lisäksi aktiinifilamentin niputtaminen, α -actinin toimii alustana välittäjänä proteiini-proteiini vuorovaikutusten osallistuvat henkilöt mukaan lukien muotoilu ja ylläpitää paikallisia tarttumista [23], [24]. Mose solut oli eriasteista geenituotteiden tiedetään yhdistää tai moduloida paikallisia tarttumista (taulukko 2, Focal Kiinnikkeistä). Lisäksi, useita geenituotteita suoraan liittää α-aktiniinin moduloida paikallisiin tarttumisiin (zyxin, vinkuliinin, integriini b1 ja b2) tai säädellä aktiinin (palladinin ja syndekaani). Muutoksia mRNA-tasojen useiden näiden geenien vahvistettiin qRT-PCR: llä (taulukko 2). Tärkeää on, liittyvien geenien syövän etenemiseen (eli Itgb2, Itgb5, paksilliini, fyn) näytetä voimistunutta ilmentymistä, kun taas ajatellaan tukahduttaa etenemiseen (eli vinkuliini, Gravin) osoitti vähentynyt ekspressiotasoja verrattuna Mose-E soluja.

vinkuliini, joka sitoo aktiini ja on osa fokaalisen adheesion monimutkainen yhdistää aktiini integriineihin, näytteillä vähentyneistä mRNA (taulukko 2) ja proteiini tasoilla (kuvio 2A) aikana pahanlaatuinen etenemisen. Visualisoida mahdollisia muutoksia Sijainti solussa Mose solut immunovärjättiin sekä F-aktiini ja vinkuliini (kuvio 3C). In Mose-E soluja, vinkuliinin co-lokalisoitu päihin aktiini nippuja, jotka muodostavat hyvin määritelty fokaalisen adheesion rakenteet ovat samanlaisia ​​kuin ei-transformoitujen epiteelisolujen. Sen sijaan vinkuliini värjäytyminen oli suurelta osin hajanainen ja vain vähän yhteistyössä paikallistaa aktiini kuitujen Mose-L-solut. Luontaisesti, polttoväli tartunta kaltaisia ​​rakenteita Mose-L-solut olivat vähemmän määritelty ja lisää punktuaalista. Konfokaalimikroskopia paljasti, että vinkuliinin jaettiin koko sytoplasmassa Mose-L-solut ja ei ilmeisesti liittää suoraan sekavaa aktiinin, (kuvio 2C, konfokaalisella kuvia). Vastaavia vinkuliinin värjäyskuviot havaittiin 90% Mose-I (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että poikkeava vinkuliinin solunosasijaintia on varhainen tapahtuma, kuten solujen siirtymistä Mose-E mose-I.

Ensisijainen komponentti paikallisessa tarttumisessa, FAK, eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia mRNA-tasojen aikana Mose etenemisen (taulukko 2). Kuitenkin, FAK-proteiinin tasot olivat merkittävästi koholla sekä Mose-I ja L-soluja verrattuna Mose-E (kuvio 2A). Sen määrittämiseksi, on myös muutos FAK toimintaa ja lokalisointi, Mose solut immunofluorescently värjättiin yhteensä FAK (punainen) ja FAK fosforyloitiin tyrosine861 (FAK-P

Y861, vihreä) (kuva 3D). Huomattavaa on, että fosforylaatiota FAK tyrosiini- Y

861 Src, yksi kahden tähteen fosforyloituu Src, edistää solujen vaeltamiseen [25], [26]. Kuten on esitetty kuviossa 3D, FAK oli vain marginaalisesti liittyy limakalvojen Mose-L-solut verrattuna kirkkaan pistemäistä värjäytymistä solussa reuna Mose-E, mutta on melko diffuusion jaetaan koko sytosoliin. Kaiken kaikkiaan oli hyvin vähän pistemäistä värjäytymistä FAK kehällä Mose-L-solut. Mielenkiintoista, perifeerinen koko FAK yhteistyössä paikallistaa aktiivisen FAK-Y

861, mikä viittaa siihen, että reuna-FAK toimii sekä Mose-E ja L-solujen (kuvio 3C, yhdistää). Koska FAK värjäys vaatii MeOH kiinnittymisestä konfokaalimikroskopia ei toimittanut ratkaisevia tuloksia siitä kolokalisaation hajakuormituksen koko FAK ja pFAK-Y

861 havaitaan Mose-L-solut. Näin ollen on epäselvää, hajanainen taskuihin sekavaa aktiini ja yhteensä FAK osaltaan pienentää muodostumiseen paikallisessa tarttumisessa havaittiin Mose-L-solut.

Neoplastiset tukirankansa muuttuu vaikutus signaalintransduktioreitteihin

tukirangan on tärkeä rooli tuumorisolun etenemistä ja tapahtumia, kuten muuttoliike ja invaasio, jolloin solut mukautua ja selviytyä eri mikroympäristöihin; yhdisteitä, jotka säätelevät solun tukirangan organisaatio on käytetty syöpähoitojen [27]. Toisaalta, organisaatio solun tukirangan vaikuttaa solujen organisaatio, kiinnitysalueisiin ja polaarisuus, ja vesicular kuljetukset. Kuten edellä on mainittu, solunosasijaintia liittyvien proteiinien paikallisessa tarttumisessa näytetään poikkeavuuksien kanssa samanaikaisesti sekavaa tilaan solun tukirangan. Tämä voi mahdollistaa kasvainsolujen ohittaa solun homeostaattisina valvontajärjestelmät ohjaamalla signalointia proteiinien eri paikkoihin, mikä muuttaa saatavuus sitovien kumppanien tai substraatteja, jotka voivat muuttaa signaalitransduktioreittejä. Koska poikkeava signalointi on merkki maligniteetti [28] immunovärjäyty- maailmanlaajuisen tyrosiini- ja seriini fosforyloidut proteiineja käytettiin yleisenä mittarina signaalinvälitysreitin organisaatio ja toiminta.

Tyrosiinifosforylaatio, indikaattori reseptorin ja ei- reseptori tyrosiinikinaasin aktiivisuuden, on keskeisessä asemassa syöpäsoluissa, säätelevät lisääntymistä, erilaistumista ja aineenvaihduntaa;