Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Jopa 80% potilaista kuolee eturauhassyöpä ovat kehittyneet luustometastaaseja jotka ovat parantumaton. Kastraatio yleisesti käytetään eturauhassyövän. Vaikka tauti aluksi vastaa androgen saarto strategioita, se tulee usein kastraation kestävä (CRPC kastraatio Resistant Eturauhassyöpä). Useimmat hiirimalleissa sekoitettu vaurioiden peräisin eturauhassyövän solut ovat androgen herkkiä. Niinpä loimme uuden mallin CRPC (androgeenireseptorin (AR) negatiivinen), joka aiheuttaa sekoitettu vaurioita luun.

Methods

PC3 ja siitä valmistettujen uusien solujen klooni PC3C solut ruiskutetaan suoraan sääriluiden SCID-uroshiirissä. Kasvaimen kasvu analysoitiin radiografian ja histologia. Suoria vaikutuksia kunnostettua alustaa Molempien solulinjojen testattiin osteoklastien osteoblasteihin ja osteosyyttejä.

Tulokset

Huomasimme, että PC3C indusoiman sekoitettu leesiot 10 viikkoa kuluttua sääriluunsisäinen injektion.

vitro

, PC3C väliaine pystyi stimuloimaan tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRAP) -positiivinen osteoklastien. Osteoprotegeriinin (OPG) ja endoteliini-1 (ET1) olivat erittäin ilmaisseet PC3C taas dikkopf-1 (DKK1) ilmentyminen väheni. Lopuksi PC3C erittäin ilmaistaan ​​luun liittyviä markkereita osteopontiinissa (OPN), Runx2, alkalinen fosfataasi (ALP), luun sialoproteiinia (BSP) ja tuotti mineralized matriisi

vitro

osteogeenisissa olosuhteissa.

Johtopäätökset

Olemme perustaneet uuden CRPC solulinja hyödyllisenä järjestelmän mallintamiseen ihmisen metastaattisen eturauhassyövän joka esittelee sekoitettu fenotyyppi luustometastaaseja joka havaitaan yleisesti eturauhassyövän potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti. Tämä malli auttaa ymmärtämään androgeenista riippumattoman mekanismeja etenemistä eturauhassyövän luuhun ja tarjoaa prekliinisissä mallin testaamiseen vaikutuksia uusien hoitojen luustometastaaseja.

Citation: Fradet A, Sorel H, Depalle B, Serre CM, Farlay D, Turtoi A, et al. (2013) Uusi hiirimallissa osteoblastic /Osteolyyttiset Vauriot Human androgeenisesti hylkivät Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (9): e75092. doi: 10,1371 /journal.pone.0075092

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 08 elokuu 2013; Julkaistu: 19 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Fradet et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CNRS (Edith Bonnelye), Inserm, University of Lyon, ”Ligue Régionale contre le Cancer” (Isère) (EB) https://www.ligue-cancer.net/ja ”Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la eturauhasen (ARTP) ”(Edith Bonnelye) https://www.artp.org/. Anais Fradet tukee Ligue Nationale contre le Cancer, https://www.ligue-cancer.net/Baptiste Depalle mukaan avustusta Rhône Alpes ”Cible” ohjelma ja Akeila Bellahcene on Senior Research Associate kansallisen rahaston for Scientific Research, Belgia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Edith Bonnelye on luettelossa Plos One Academic toimittajat. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Bone on yleisin sivusto eturauhassyövän etäpesäkkeiden luuetäpesäkkeistä jopa 80% kehittyneen taudin [1]. Kirurginen ja hormonihoitojen ovat osoittaneet myönteisiä vaikutuksia vain alkuvaiheen hormoni-reagoiva sairaus. Todellakin, jos tauti useimmiten aluksi reagoi, se etenee usein ja tulla androgen riippumaton. Siinä vaiheessa, joilla on pitkälle edennyt sairaus usein näyttää osteoblastic tai seka vaurioita luun [2,3]. Mekanismeja, joilla eturauhasen syöpien indusoidaan etäpesäkkeitä luuhun luottaa monimutkainen vuorovaikutus syöpäsolujen ja luun mikroympäristössä [4]. Kasvu eturauhassyöpäsolujen muuttaa luun (muodostuminen ja resorptio) erittämällä tekijöitä, jotka vaikuttavat suoraan osteoblastit (luuta muodostavat solut) ja osteoklastien (luun resorptioaktiviteettia solut). RANKL (Receptor aktivaattori NF-kB ligandi) stimuloi osteoklastien erilaistumista ja toimintaa pitäen osteoprotegeriinin (OPG) toimii valereseptori RANK (RANKL-reseptori). Siksi tasapaino RANKL ja OPG, joka voidaan molempien valmistaja eturauhassyövän solut, on kriittinen kontrolloinnissa osteoklastiaktiivisuutta ja osteolyysiä luun etäpesäke [4-6]. Toisaalta, pro-osteoblastisia molekyylejä voidaan tuottaa myös eturauhasen syöpäsoluja. Itse asiassa ensimmäinen kliinisiä tutkimuksia nimenomaan kohdistaa osteoblastien metastasoituneen eturauhassyövän perustui endoteliini-1 (ET1), mitogeenisellä tekijä osteoblastien, joka voi edistää kasvua osteoblastien at metastaasien [7,8]. Lisäksi transformoiva kasvutekijä β (TGFli), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) on runsaasti ilmaistaan ​​eturauhassyövän solut ja niillä on suora vaikutus osteoblastitoiminnan [9,10]. Siivettömän (WNT) polku, joka on sekaantunut osteoblastogenesis on myös osallisena kehittämisessä osteoblastic etäpesäkkeiden eturauhassyövässä [11]. Up-sääntely WNT-perheen ligandin WNT1 eturauhasen syöpäsolujen ja laskusta seerumissa WNT antagonisti dikkopf-1 (DKK1) ilmentyminen on raportoitu potilailla, joilla on edennyt metastaattinen eturauhassyöpä ja liittyy osteoblastisia leesioita [12] . Lopuksi eturauhassyövän solut, jotka indusoivat luun etäpesäke myös ilmaista suuri määrä luun liittyvät tekijät, kuten osteo- (OPN), osteokalsiini (OCN) tai luun sialoproteiinia (BSP) erittyy luuta ja jotka edistävät edistää niiden osteomimicry ominaisuudet [13].

suurin osa sekoitettu luuetäpesäkkeistä peräisin eturauhassyövän hiiri malleja androgen herkkiä ja että asia ei todellakaan jäljitellä kliinisessä tilanteessa. Me kuvattu luonnehdinta uuden solulinjan (eli PC3C), jotka aiheuttavat sekoittaa luuston vaurioita eläimillä, joka on peräisin ihmisen androgeeniriippumattomaksi AR-negatiivinen solulinja PC3, tiedetään indusoivan puhdasta osteolyyttiset etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

käytetyt hiiret tutkimuksessamme käsiteltiin mukaan sääntöjen décret nro 87-848 du 19/10/1987, Pariisi. Kokeellinen protokolla on tarkistettu ja hyväksytty Rhone-Alpes alueellinen komitea Ethic Eläinkokeiden (Lyon, Ranska) (Register Number: 0121). Eläinkokeet rutiininomaisesti tarkastanut hoitavan eläinlääkärin että laitteet ovat edelleen ehdotettujen protokollia. SCID hiirillä 6 viikon ikäisen sijoitettiin häkkeihin este olosuhteissa laminaaristi eristetty huput. Eläimillä tuumoriksenografteja seurattiin huolellisesti varten perustettu merkkejä hätä ja epämukavuutta ja oli inhimillisesti lopetettiin.

Soluviljely

PC3 solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , USA). PC3C solut, alakulttuuria solulinja PC3 eristettiin laboratoriossamme

in vitro

kerta solupopulaation kulttuuriin. Näin spontaaniin johtaminen solujen vihdoin saatu alakulttuuri solulinja nimeltään PC3C joka valittiin perustuu sen epiteelin fenotyyppiin (kuva S1) [14,15]. Hormoni riippuvainen ihmisen eturauhassyövän VCAP soluja antelias lahja Pr M Cecchinin (Department of Clinical Research, University of Bern, Bern, Sveitsi) ja saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). VCAP viljeltiin RPMI. PC3 ja PC3C soluja viljeltiin rutiininomaisesti F12K ravinneseosta ja DMEM-elatusainetta (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), vastaavasti täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS; Perbio /Thermo tieteellisen, Rockford, IL, USA ) ja 1% (v /v) penisilliiniä /streptomysiiniä (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa. PC3 ja PC3C olivat myös viljeltiin yhteydessä osteogeeninen olosuhteissa kolmen viikon ajan osteoblastien väliaineessa, jota oli täydennetty 50 ug /ml askorbiinihappoa (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi). Kymmenen mM natrium-β-glyserofosfaatti (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi), lisättiin aikana 1 viikko lopussa viljelmän. PC3 ja PC3C olivat jatkuvasti (päivien 1 21) altistuu osteogeeninen olosuhteissa. Visualisointiin mineralisaation, kaivot kiinnitettiin ja värjättiin von Kossa ja ALP [16].

Eläinkokeet

sisäinen luinen -tuumoriksenografti kokeita (Charles River Laboratories, Wilmington, MA , USA), pieni reikä oli porattu on 26 gaugen steriili neula läpi oikean säären kanssa polvi flexed nukutetuilla 6- 8 viikon ikäisille SCID hiirillä. Käyttäen uutta steriiliä neulaa asennettu 50: aan steriiliä Hamilton ruisku (Hamilton Co .; Bonaduz, GR, Sveitsi), yhden solususpensio (6×10

5 15-il PBS) PC3 tai PC3C soluissa oli huolellisesti injektoidaan luuytimen ontelon. Viikosta 2 kasvainsoluinokulaation jälkeen, röntgenkuvia Nukutettujen hiiriä viikoittain otettu käyttöön MIN-R2000 elokuvat (Kodak, Rochester, NY, USA) MX-20 kaappi röntgen järjestelmä (Faxitron-yksikköön röntgen Corp, Tucson , AZ, USA). Eläimet lopetettiin sen jälkeen, kun 6 ja 10 viikon ajan hiirille injektoidaan PC3 ja PC3C soluissa. Mikrotietokonetomografia tomografia-analyysit suoritettiin käyttäen mikro-tomografiin Skyscan 1174 (Skyscan; Kontich, Belgia). X-ray tube oli asetettu jännite on 50 kV ja virran 800 uA. 0,5 mm alumiini suodatinta käytettiin vähentämään säteen kovettumista esineitä. Näytteitä skannattiin 70% etanolia, joiden voxel koko 20 pm. Kunkin näytteen, 265 kohta kuvat oli rekonstruoitu NRecon (versio 1.6.1.8, Skyscan). Kolmiulotteiseen mallintamiseen ja analysointiin BV (Bone Volume) /TV (kokonaistilavuus) suhde (prosentteina luukudoksen) saatiin kanssa CTAN (versio 1.9, Skyscan) ja CTVol (versio 2.0, Skyscan) ohjelmistoja. Dissekoiduissa luut sitten käsitelty histologista ja histomorfometriseen analyysiin.

Ihonalaiset PC3C solujen (10

6 100 ui PBS) tehtiin myös 6- 8 viikon ikäisille SCID hiirillä. Eläimet lopetettiin 12 viikon jälkeen ja kasvaimia kiinnitettiin ja upotettiin parafiiniin.

Bone histomorfometrisysteemiä ja histologia

Sääriluu eläimistä kiinnitettiin, kalkittomat 15% EDTA /0,4% PFA ja sulautettujen parafiiniin. Viisi um leikkeet värjättiin Goldner Trichromilla ja eteni histomorfometriseen analysoi laskea TB (kasvaintaakkaa) /STV (Soft Tissue Volume) suhde (prosentteina kasvainkudoksen).

in situ

havaitsemiseen osteoklastien toteutettiin metastaattinen luu- kudosnäytteiden käyttäen tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRAP) aktiivisuus kit määritys (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi).

osteoklastigeneesin määritys

Ensisijainen luuytimen solut saatiin sen jälkeen, kun sääri- ja reisiluun luuytimen huuhtelemalla 6-viikon ikäisiä OF1 uroshiiriä. Soluja viljeltiin sitten 7 päivää, erilaistumisen väliaine: a-MEM-elatusainetta, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 20 ng /ml M-CSF: ää (R 0,05.

Tulokset

Expression of pro-osteoblastic tekijöistä PC3C solut

Vuodesta ihmisen androgeenireseptorin kestävä eturauhassyöpäsolulinja PC3, saimme kerta solupopulaatio kulttuuri

in vitro

uuteen alakulttuuri solulinja nimeltään PC3C soluja, jotka valittiin perustuu sen epiteelin fenotyyppiin (kuva S1). Odotusten ja samalla tavalla vanhempien PC3-solut, AR ei voitu havaita reaaliaikaisella PCR PC3C kun se ilmaistiin hormoni riippuvaa solulinjaa VCAP käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio 1A). Toisaalta, eturauhasen markkereita P504S (alfa methylacyl-coA rasemaasi (AMACR)) ja eturauhasen hapan fosfataasi (PAP) on ilmaistu molemmissa solulinjoissa vahvistettiin eturauhasen Solujen alkuperää (kuvio 1 B). [21]

Detection reaaliaikaisella PCR AR mRNA ilmaisun PC3, PC3C ja VCAP syöpäsolujen linjat (A), AMACR, PAP (B) ja DKK1, ET-1, FGF9, ryyppy, OPN, OPG, Runx2 ja TGF mRNA ilmaisun (C ja D) PC3 ja PC3C syöpäsolujen linjat. Geenit ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen PCR kolmelle näytteelle ja normalisoidaan että ribosomaalisen proteiinin geenin L32 * p 0,05; ** P 0,001, *** p 0,0001.

Characterization reaaliaikaisella PCR: PC3C soluista osoitti, että ET1 ja OPG, kaksi tekijää, jotka ovat sekaantuneet patogeneesin osteoskleroottisena luun etäpesäkkeitä eturauhassyövän yli-ilmennetään verrattuna emosolulinjassa PC3 (kuvio 1 C-D) ja muiden tekijöiden, kuten fibroblastikasvutekijä 9 (FGF9) ja TGFp ovat samoin ilmaistu molemmissa solulinjoissa [8,22,23]. Toisaalta, ilmaus DKK1 ja noggin kaksi osteoblastien estäjät (vastaavasti Wnts ja luun morfogeneettinen proteiini (BMP) estäjiä), on vähentynyt PC3C verrattuna PC3 (kuvio 1 C-D) [24,25]. Lisäksi PC3C samalla PC3-solut ekspressoivat tekijöiden tiedetään olevan osallisena eturauhassyövän osteomimicry kuten OPN ja Runx2. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PC3C solut voivat mahdollisesti aiheuttaa osteoblastic vaurioita verrattuna PC3-solut, joiden tiedetään pääasiallisesti näytteille osteolyyttisiä vaurioita luun.

PC3C solut indusoivat sekoitettu osteoblastic /osteolyyttiset vaurioita

testaamiseksi omaisuutta PC3C aiheuttavan luuleesioita sisäistä sääriluun injektiot tehtiin osaksi miehen SCID hiiriin. Kymmenen viikkoa tuumorisolujen inokulaation jälkeen, röntgenkuvaus analyysi osoitti, että eläimet, joissa PC3C kasvaimia oli luun leesiot, jotka sisältyvät osteolyyttinen ja osteoblastien osat (kuvio 2 I), kun taas puhdasta osteolyyttisiä leesioita havaittiin eläinten laakerin PC3 kasvaimia jälkeen 6 viikkoa (kuvio 2E). Kapasiteetti PC3 ja PC3C aiheuttavan puhdasta osteolyyttisiä ja sekoitetaan vaurioita, vastaavasti, varmistettiin käyttämällä 3D mikro-CT jälleenrakennus (Kuva 2F-G ja JK) (luun tilavuus, BV /TV, taulukko 1), histologia (kuva 2 H ja L ) ja histomorfometriset analyysit sääriluut (luuston tuumorikuorma, TB /STV, taulukko 1). Kuten odotettua luurangon leesioita ei havaittu sen jälkeen, kun PBS: ää injektiona (Sham eläimet) (kuvio 2A-D, taulukko 1). Immunohistokemiallisesti, olemme vahvistaneet,

in vivo

, että ET-1 ja OPG olivat erittäin ilmaistaan ​​PC3C kasvaimia (kuvio S1, B, D) verrattuna PC3 (kuvio S2, A, C).

(A) PC3 ja PC3C inokuloitiin SCID-uroshiirissä; 10 viikkoa rokottamisen jälkeen, radiografia paljasti puhtaan osteolyyttisiä vaurioita hiiriä, joihin injektoitiin PC3-solujen (n = 6) (E) ja sekoitetaan vaurioita hiiriä, joihin injektoitiin PC3C soluja (n = 8) (I) verrattuna hiiriin injektoitiin PBS: ää (n = 10) (A) (katso * (lysis) ja valkoiset nuolet (muodostuminen)). (B, C F, G-J, K) Kolmiulotteinen mikro-CT rekonstruktioveistosta sääriluut ja (D, H, L) histologiaa Goldner trikromi värjäys vahvisti radiografian tuloksia. T: Kasvain; HUOM: New Bone.

BV /TV (%) B TB /STV (%) B Sham (n = 10) 22,4 +/- 2,90PC3 (n = 6) 3,6 +/- 4,1 *** 72,6 +/- 6,6 *** PC3C (n = 8) 39,5 +/- 3,0 *

$ 36,6 + /- 4,5 ***

$ Taulukko 1. Histomorfometrinen analyysi sääriluu etäpesäkkeiden aiheuttama injektion PC3 ja PC3C soluja.

BV /TV: luun tilavuus /kokonaistilavuus. TB /STV: kasvaintaakkaa /pehmytkudoksen äänenvoimakkuuden. Sham tehtiin kontrollina.

n

on haarojen lukumäärä luuetäpesäkkeistä. * P 0,05; *** P 0001 verrattuna Sham;

$ P 0001 verrattuna PC3. CSV Lataa CSV

luun stimulaatiota PC3C solut

Näiden tietojen me seuraavaksi kysytään PC3C voisi muuttaa luun resorptiopinnoille solujen, osteoklastien (OC) ja luuta muodostavia soluja, osteoblastit (OBt) . Primaarisen hiiren luuytimen soluja RANKL, makrofagikasvutekijä (M-CSF), ja elatusaine on PC3C stimuloi enemmän muodostumista tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRAP) -positiivinen monitumaisten OC verrattuna havaittu elatusaine PC3-soluja ja käsittelemättömät solut (Ct) (kuvio 3A). Toisaalta, hoitoon ensisijainen hiiren pääkallon viljeltyjen solujen osteogeeninen olosuhteissa vakioitu väliaine on PC3C oli vähemmän inhiboiva vaikutus OB erilaistumista kuin väliaine PC3-solujen käsittelemättömiin soluihin verrattuna (Ct) (kuvio 3B). Itse asiassa suuri määrä OB visualisoitiin käyttäen OPN immunovärjäystä

in vivo

(kuvio 4A a-b). Mielenkiintoista, PC3 väliaine stimuloi OPG ja RANKL ilmaisun ensisijainen OBt kun PC3C väliaine vähentynyt OPG tuotanto johtaa vahvempi kasvu RANKL /OPG suhdetta OBt käsitelty PC3C väliaine verrattiin PC3-solujen (kuvio 3C). Yhdenmukainen näiden

in vitro

tuloksia, TRAP värjäys sääriluun osien metastasoituneen jalkojen eläimistä otetaan PC3C osoitti suuren määrän TRAP-positiivisten monitumaisten OC verrattuna havaittiin PC3 ja Sham eläimiin (kuva S3). Lopuksi puolikvantitatiivinen PCR suoritettiin osteosyyttien solulinjassa, MLO-Y4, pystyimme osoittamaan, että sclerostin (SOST) ja Dentin matriisi hapan fosfoproteiini 1 (DMP1) ilmentyminen stimuloi jälkeen 24 hoidon PC3 ja PC3C väliaine vastaavasti taas OPG ja RANKL-ekspressio ei vaikuttanut (kuvio 3D).

(A) hiiren luuytimen soluja viljeltiin, kun läsnä on RANKL ja M-CSF: n ja käsitellyn tai (Ct), jossa kasvualusta on saatu PC3 ja PC3C soluja. Enemmän OC (valkoinen nuoli) muodostettiin käsitellyissä viljelmissä PC3C elatusaine verrattuna käsitellyt viljelmät PC3 väliaine ja Ct (ANOVA, p 0,0001). (B) Hiiren pääkallonluissa soluviljelmät käsiteltiin päivästä 1-21 kanssa kasvualusta saatu PC3 ja PC3C solu. Mineralisoituneet luu kyhmyt olivat läsnä ja visualisoitiin von Kossa värjäys 21. päivänä (ks mineraali mustana, valkoisena nuolet). Mineralisoituneen luun kyhmyn muodostuminen vähenee, kun ensisijainen soluja käsiteltiin kunnostettua alustaa mistä tahansa PC3 /PC3C soluja (verrattuna ei-käsitellyn (Ct) solut); lasku oli vähemmän kun PC3C solujen väliainetta käytettiin (verrattuna PC3) (ANOVA, p 0,001 vs. Ct ja vs. PC3). (C) PC3 väliaine stimuloi ilmaus OPG ja RANKL perusterveydenhuollossa OBt verrattuna ei-käsiteltyjen (Ct), kun taas PC3C väliaine vain estää ilmaus OPG verrattuna Ct joka johtaa korkeamman RANKL /OPG suhde PC3C olosuhteissa. (D) Detection reaaliaikaisella PCR SOST, DMP1, OPG ja RANKL mRNA ilmaisun MLO-Y4 soluja käsiteltiin PC3 ja PC3C väliaine. Tulokset piirretään keskimääräinen lukumäärä OC ± SD ja OB kyhmyt ± SD kolmesta kaivojen valvonnasta ja jokaisen kunnossa ja edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta. Geenit ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen PCR kolmelle näytteelle ja normalisoidaan että ribosomaalisen proteiinin geenin L32 * p 0,05; ** P 0,001, *** p 0,0001.

(A) immunodetektio OPN OB luuetäpesäkkeissä aiheuttama PC3C soluja (katso OBt a ja b suurennoksia on; katso mustat nuolet) (A) ja kasvaimet soluissa (B a). Samoin OPN, BSP ilmentymistä havaitaan kasvainten solujen

vivo

(B, b). (C) tapaan hiiren ensisijaista pääkallonluissa soluja, PC3 ja PC3C viljeltiin osteogeenisen edellytykset 21 päivää. ALP (a, c) ja von Kossa-värjäys (b, d) esittävät korkean ilmentymisen ALP (c) ja mineralisaatio (valkoinen nuoli) (d) PC3C soluissa, kun taas ei ALP ilmentymistä (a) ja mineralisaatio havaittiin PC3-soluissa ( b). (D) Detection reaaliaikaisella PCR OPN, ALP ja OCN mRNA ilmaisun PC3C ja PC3 soluja viljeltiin osteogeenisen olosuhteissa 21 päivän ajan. Geenien ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen PCR kolmelle näytteelle ja normalisoidaan että ribosomaalisen proteiinin geenin L32 ** p 0001. Bar = 200 pm T: Kasvain; OB: osteoblastien; HUOM: New Bone.

PC3C solut indusoivat vankka osteoblastic reaktioiden yhteydessä osteogeeninen olosuhteet

Koska PC3C soluissa indusoi uuden luun muodostumista

in vivo

, me seuraavaksi testataan ovatko ne voisi tuottaa OBt markkereita. Sen jälkeen immunovärjäys luun metastaattisen kudosleikkeiden, OPN ja BSP havaittiin ilmaistu PC3C soluissa

in situ

(kuva 4B a ja b). Lisäksi 3 viikon kuluttua viljelyn,

in vitro

, kun osteogeeninen olosuhteet mukaan lukien askorbiinihapon ja β-glyserofosfaatti (kuvio 4C b ja d), PC3C solut osoittautuivat alkalisen fosfataasin (ALP) -positiivinen (kuvio 4CC ) ja pystyivät muodostamaan calcified matriisin positiivinen von Kossa värjäytymistä (kuvio 4C d), kun taas PC3 oli ALP-negatiivisia ja ei indusoinut matriisi mineralisaatiota (kuvio 4C a ja b). Expression of ALP jälkeen askorbiinihapon suotuisa vaikutus varmistui PC3C soluissa reaaliaikainen PCR (kuvio 4D). Samoin OPN oli hyvin ilmaistu PC3C verrattuna PC3 soluihin samalla OCN ilmaistiin sekä solujen linjat näissä koeolosuhteissa (kuvio 4D), mikä viittaa korkea osteomimicry omaisuutta PC3C verrattuna PC3 soluihin. Lopuksi Fourier-muunnos infrapuna Microspectroscopy (FTIRM) tutkimus kasvaimia saatu ihonalaisen PC3C solujen paljasti amideja I (pääasiassa C = O-venytys) ja II (lähinnä NH taivutus) ja III (lähinnä CN venyttely ja NH taivutus) ryhmiä proteiinien (kuva S4, katso I ja II punainen viiva), jotka yleensä vastaavat orgaanisen matriisin (90% tyypin I kollageenin) luun (kuva S4, katso sininen ja musta viiva). Ei fosfaatti tai karbonaattia molekyylitason värähtelyt havaittiin, mikä osoittaa puuttuminen mineraali sisällä PC3C kasvain

in vivo

(kuva S4). Toisaalta, uutta luuta saatu hiiristä sääriluu injektoitiin PC3C solujen osoitti, että läsnä on mineraali- (kuva S4). Samanaikaisesti näiden seurauksena suuri määrä tyypin I kollageeni havaittiin ilmaistaan ​​PC3C verrattuna PC3-solujen reaaliaikaisella PCR

in vitro

(kuvio 5A). Lisäksi PC3C solut osoitettiin ympäröivät tyypilliset tyypin I kollageeni kuituja

in situ

arvioituna elektronimikroskoopilla (kuvio 5B katso nuolia ja suurennettuna). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, korkeammat osteomimicry ominaisuuksia PC3C verrattuna PC3-solujen, mikä selittää ainakin osittain niiden kyvystä indusoida sekoitettu osteoblastic /osteolyyttiset vaurioita.

(A) Detection reaaliaikaisella PCR tyypin I kollageenin mRNA: n ekspression PC3C ja PC3 soluja viljeltiin normaaliolosuhteissa. Geenien ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen PCR kolmelle näytteelle ja normalisoidaan että ribosomaalisen proteiinin geenin L32 * p 0,05. (B) visualisointi tyypin I kollageenin in PC3C soluissa viljelty lasipeitinlevyn elektronimikroskoopilla (katso mustat nuolet).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme perustaneet ja karakterisoineet uusi androgeenista riippumaton eturauhassyöpä-solulinjaa (PC3C), joka nopeasti antaa seka luuleesioita SCID-uroshiirissä, 10 viikkoa sen jälkeen, kun sisäinen sääriluun kasvainsolujen injektion jälkeen. Tämä malli voi olla hyödyllistä tutkia solu- ja molekyylitason mekanismeja, jotka eroavat androgeeniriippuvaisten ja androgeeni-riippumaton eturauhasen karsinoomien, kun ne etäpesäkkeitä luuhun. Eturauhassyövässä, androgeenireseptorin saarto strategioita yleensä hoidetaan osteoblastisissa luustometastaaseja. Sen sijaan vastauksia näihin hoitomuotoihin ovat usein lyhyitä johtuvat jälkeisiä traductional muutoksia tai mutaatioita AR jotka vähentävät ligandia sitova ja väistämättä CRPC [26,27]. Rooli AR väylän osteoblastisolulinjaa etenemisen eturauhasen syöpä tunnetaan huonosti, koska käytettävissä malleja sekoitetaan ja puhdasta osteoblastic vaurioita (C4-2B, PCa2b, VCAP) ovat pääasiassa androgeeniresponsiivinen kuten [28,29]. Näin ollen aktiivinen AR reitin uskotaan osallisena osteoblastien etenemisen eturauhasen syöpä. Kuitenkin koskien PC3C malli, tämä olettamus ei tapahdu koska molemmat solut linjat PC3 ja PC3C solulinjat eivät ilmennä AR. Toisaalta, AR negatiivinen malleja käytetään yleisesti PC3 ja DU145 soluja, jotka ovat peräisin CRPC potilaiden aiheuttama puhdas osteolyyttisiä vaurioita ja eivät lisäänny, mikä ihmisellä havaittu [30,31]. Sitten, jotta voidaan vastata tarpeeseen kliinisesti merkittäviä malleja eturauhasen syöpään liittyvien luuleesioita, uudempi hormoni-riippumaton on kehitetty kuten MDA PCa 118 ja Ace-1, joka samalla tavalla kuin PC3C mallia eivät ilmaise AR ja aiheuttaa mixed vauriot [22,32]. Kuitenkin osteogenesis joka indusoitiin FGF-9 MDA PCa 118 mallia ei osallinen osteoblastivastetta aiheuttama PC3C kuin FGF-9 ilmentyminen ei ollut tilastollisesti merkitsevästi moduloitu välillä PC3 ja PC3C soluja.

Mielenkiintoista, verrattuna PC3, PC3C solut ilmentyy suuresti ET-1, joka on mitogeeninen tekijä OB [33,34].