Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotkut voimakas kemoterapiaa huumeiden, kuten tubuliinia sitovia aineita oli kehitetty luonnosta kasveista, kuten podofyllotoksiinia ja paklitakseli. Kuitenkin huono sytotoksinen valikoivuus, vakavia sivuvaikutuksia, ja rajallinen tehokkuus ovat edelleen merkittäviä huolenaiheita niiden terapeuttista käyttöä. Kehitimme täyssynteettinen podophyllotoxin johdannainen nimettiin Ching001 ja tutkitaan sen anti-kasvaimen kasvua vaikutukset ja mekanismit keuhkosyövän prekliinisissä. Ching001 osoitti selektiivinen sytotoksisuus eri keuhkosyövän solulinjat, mutta ei normaalin keuhkojen soluihin. Ching001 esti polymeroinnissa mikrotubulusten tuloksena mitoosi pidätys ilmeistä kertyminen mitoosin liittyviä proteiineja surviviiniperäiset ja aurora B, mikä johtaa DNA-vaurioita ja apoptoosin. Ching001 myös aktivoitu proapoptoottisten ER stressiä signalointireitin. Injektoimalla vatsaonteloon 2 mg /kg Ching001 inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua A549 ksenografti, kun taas injektio 0,2 mg /kg Ching001 laski keuhkojen kolonisaatiokyky A549-solujen kokeellisen metastaasin määrityksessä. Nämä anti-kasvaimen kasvun ja keuhkojen kolonisaation inhibition vaikutukset olivat voimakkaampia kuin paklitakselihoidolla samalla annoksella. Ksenograftikudoksista kasvainkudoksen tahroja vahvistivat lisäksi, että Ching001 aiheuttama mitoosia pidätyksen ja kasvaimen apoptoosin. Lisäksi hematologian ja biokemian testit verinäytteiden sekä kudoksen tutkimukset osoittivat, että Ching001 hoito ei näytä ilmeistä toksisuudet sisään testattujen eläinten. Annoimme prekliinisissä näyttöä siitä, että uusi synteettinen mikrotubulus estäjä Ching001, joka voi laukaista DNA-vaurioita ja apoptoosin aiheuttamalla mitoosi pidätyksestä ja ER stressi, on mahdollinen syövänvastainen yhdiste edelleen lääkekehityksen.

Citation: Chen JY, Tang YA, Li WS, Chiou YC, Shieh JM, Wang YC (2013) synteettinen Podofyllotoksiini Johdannaiset Kiinnostavuus Anti-Cancer Effects indusoimalla Mitoottista pidätys ja proapoptoottisiin ER Stressi Keuhkosyöpä prekliinisissä. PLoS ONE 8 (4): e62082. doi: 10,1371 /journal.pone.0062082

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 joulukuu 2012; Hyväksytty 17. maaliskuuta 2013 Julkaistu: 30 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksilla CMNCKU10107 päässä Chi Mei Medical Center, Taiwan (JMS) ja NSC 101-2325-B-006-008 National Science neuvosto, Taiwan (YCW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jotkut voimakas kemoterapialääkkeillä oli luonnosta peräisin kasveista. Esimerkiksi podophyllotoxin, aktiivisen komponentin puhdistettu

Podophyllum peltatum

[1] – [3], käytetään vakiohoito sukupuolitauti syyliä [4]. Podofyllotoksiini inhiboi mikrotubulusten polymeroitumisen johtaa mitoosin vajaatoimintaan ja solusyklin pysähtymisen [5] – [7]. Puolisynteettiset podofyllotoksiinin johdannaiset, esimerkiksi etoposidi ja teniposidi, käytetään tällä hetkellä syöpälääkkeet leukemia, lymfooma, glioblastooma, keuhkosyöpä, ja kivessyövät [8]. Monet muut syöpälääkkeet, jotka ovat peräisin luonnon yrttejä myös olla kyky estää mikrotubulusdynamiikan [2], [9]. Esimerkiksi taksolin (tai paklitakselia) ja alkaloidi yhdisteet ovat luonnontuotteita puhdistettu

Taxus brevifolia

tai

C. roseus

, vastaavasti. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että paklitakseli ja alkaloidi yhdisteet voivat keskeyttää mikrotubulusdynamiikan [9] – [13].

Vaikka monet tubuliinia sitovat aineet oli kehitetty, voimakas sytotoksisuus kohti normaaleja soluja, masennus luuytimen ja lisääntynyt riski toissijainen akuutti myelooinen leukemia rajoittaa niiden kliinistä tehoa [1], [14] – [16]. Näin ollen kehittää uusia aineita, joilla on parempi sytotoksinen selektiivisyys ja rajoitetusti sivuvaikutuksia on tärkeää syövän hoidossa. Olemme kehittäneet uuden täyssynteettinen podophyllotoxin johdannainen korkea puhtaus ja hyvä tuotto nimeltään Ching001, ja totesi, että Ching001 osoitti vahvaa sytotoksisuutta erityisesti keuhkosyövän solulinjoissa, mutta ei normaalissa keuhkojen soluissa. Ching001 esti mikrotubulusten polymeroitumisen ja pidätti solukierrossa mitoosin. Ching001 aiheuttaman apoptoosin induktion kautta DNA-vaurion ja aktivointi ER stressin signalointi. Ching001 osoitti kasvaimen kasvun inhibition ja estää kasvaimen kolonisaatiota ilman näkyvää sivuvaikutuksia ksenograftimalleissa viittaa siihen, että sitä voitaisiin edelleen testata uutena kasvaimen vastainen reagenssi.

Tulokset

Ching001 Näyttää Selective Cytotoxicity kohti Cancer mutta ei Normaali Lung Solut

Ching001 on täysin synteettinen yhdiste, ja sen rakenne on esitetty kuviossa. 1A. Sytotoksisuus Ching001 eri keuhkosyövän solulinjat ja MRC5 normaali keuhkojen solulinjassa tutkittiin. IC50 lasketaan regressioanalyysin eri solulinjoja: CL1-0, 1,99 uM; CL1-5, 1,90 uM; A549, 1,21 uM; H1299, 2,58 uM; ja MRC5, 8,27 uM Ching001 käsittely 48 h (Fig. 1 B). Ching001 osoitti selektiivinen sytotoksisuus keuhkosyövän soluja, mutta ei normaaleihin ihmisen MRC5 keuhkojen solut.

(A) rakenne Ching001 yhdistettä. (B) Sytotoksisuusmääritvs normaalin keuhkojen MRC5 ja eri keuhko- syöpäsoluja seurattiin trypaanisinisellä värjäystä. Soluja käsiteltiin eri pitoisuus Ching001 48 tuntia. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja normaalin MRC5 solut ja syöpäsolut. ***

P

0,001. (C) Virtaussytometria-analyysi solusyklin jakautumisen keuhkosyövän solulinjoja käsiteltiin vaihtelevilla annoksilla Ching001 ja eri kestot. (D) Immunofluoresenssi ja α-tubuliinin (vihreä) ja DAPI tumavärjäystä (sininen), kun 1 uM Ching001 hoito 2-8 tuntia S-vaiheessa synkronoidaan keuhkosyövän solulinjat. DMSO: ta käytettiin liuottimena ohjaus. Mittaviivat: 10 pm.

Ching001 Estää Microtubule polymeroituminen ja viiveet M-vaiheen eteneminen

Koska podophyllotoxin tiedetään kohdistaa mikrotubulusten, sen rakenteellinen analogi Ching001 kohdistaa myös mikrotubulusten. Mikrotubulusproteiinit kokoonpano testi osoitti, että 1 gM Ching001 hoito vähensi liukenemattoman polymeroidussa muodossa mikrotubulusten sisällä 6 h (Fig. S1A). Immunofluoresenssitutkimukset of α-tubuliinin osoitti merkittäviä häiriöitä mikroputkiorganisaatiota verrattuna liuotinkontrolliviljelmissä DMSO sekä A549- ja CL1-5 keuhkosyövän soluja (Kuva. S1B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mikrotubulusten on mahdollinen kohde Ching001.

Seuraavaksi tutkittiin vaikutusta Ching001 solusyklin etenemisen. Virtaussytometria analyysit osoittivat, että G2 /M-vaiheen väestön käsiteltyjen keuhkosyövän soluja, mukaan lukien H1299, A549, CL1-0, ja CL1-5, lisääntynyt annosriippuvaisesti kanssa 0,5-1 uM Ching001 hoitoa 6 tuntia. G2 /M solusyklin väestöstä edelleen lisääntynyt dramaattisesti, mukana ulkonäkö sub-G1 jae pitkäaikainen Ching001 hoito 12 h (Fig. 1 C). Virtaussytometrianalyysi ja runsaudenmäärityksessä S-vaiheessa synkronoitu keuhkosyövän soluja vahvisti myös, että Ching001 hoito pidätetty solusykliä G2 /M-vaiheen siis esti lisääntymistä (kuvio. S2).

edelleen leikellä vaikutus Ching001 aikana G2 /M pidätys, immunofluoresenssimenetelmällä mikrotubulusten suoritettiin S-vaiheessa synkronoidaan keuhkosyöpä solut käsiteltiin Ching001 (Fig. 1 D). DMSO-käsiteltyjen solujen alkoi tulla pro-metafaasiin kuluttua 2 h ja eteni Anaphase 4 tunnin kuluttua vapautumisen S-vaiheessa. Solut eteni telophase 6 h ja saavutti myöhään sytokineesiin loppuun mitoosin 8 h. Kuitenkin Ching001 käsiteltyjä soluja tuli M-vaihe 2 h ja pysyi metafaasissa jopa 8 h (Fig. 1 D).

Tuottaa molekyylitason todisteet M-vaiheen pysähtymisen, suoritimme western blot-analyysit keskeisten proteiineja säädellään solun mitoosia, mukaan lukien aurora B, surviviini ja fosforyloitu mitoosi-proteiinin monoklonaalisella 2 epitooppeja (p-MPM2) [17] – [19]. Tulokset osoittivat, että Aurora B, surviviini ja p-MPM2 säilyi korkeana sen jälkeen Ching001 hoidon verrattuna DMSO-kontrollin, joka osoittaa M-vaiheen pysähtymisen (Fig. 2A). Lisäksi, immunosytokemia värjäys osoitti, että noin 15%: ssa DMSO: ta käsiteltyjen solujen olivat M-vaiheen niiden ilmentymistä sekä aurora B ja surviviini, kun taas Ching001 hoito lisäsi merkittävästi M-vaiheen solupopulaation, joka oli mukana ilmaistaan ​​aurora B ja surviviini (Fig. 2B). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että Ching001 pidättää solusyklin etenemisen M-vaiheessa.

(A) Western blot -analyysit mitoosin liittyvien proteiinien jälkeen 1 uM Ching001 hoito osoitetun kertaa keuhkosyövän solulinjat. (B) häiriöstä M-vaiheen solukierron aiheuttamien Ching001. Keuhkosyövän solulinjat analysoitiin surviviinipeptidillä (vihreä), aurora B (punainen), ja DAPI (sininen), kun 1 uM Ching001 hoitoa 24 tuntia. DMSO: ta käytettiin liuottimena ohjaus. Mittaviivat: 30 pm.

Ching001 aiheuttama Mitoottista pidätys Johtaa DNA-vaurio ja apoptoosin Lung Cancer Cells

Se oli raportoitu, että virheet mitoosia tuottaa vahinkoa ja pirstoutumista DNA [20]. Meidän Western blot-analyysit osoittivat kasvua DNA-vaurion merkki γ-H2AX syöpäsoluissa jälkeen Ching001 hoidon (Fig. 3A), joka vahvistettiin immunofluoresenssilla ja γ-H2AX (Fig. S3). Edelleen tutkittava DNA aiheuttaman vaurion Ching001 hoito johtaa lopulta apoptoosin, PS translokaation havaittiin immunofluoresenssilla jälkeen Ching001 hoidon (Fig. 3B). Lisäksi, apoptoosin aiheuttaman DNA tikkaat määritys suoritettiin (Fig. 3C). Vahva PS: 24 tunnin ja induktio apoptoottisten DNA tikkaiden 48 h Ching001 saaneilla H1299, A549, CL1-0 ja CL1-5 solut viittaavat siihen, että DNA aiheuttaman vaurion mitoosin virheet aikana Ching001 hoidon lopulta johtaa apoptoosin.

(A) Western blot analyysit DNA-vaurioita markkeri γ-H2AX jälkeen 1 uM Ching001 hoito ilmoitetuilla aikoina. (B) Immunofluoresenssi varhaisen apoptoosin markkeri PS translokaation jälkeen Ching001 hoidon 24 tuntia. Mittaviivat: 30 pm. (C) apoptoottiset-spesifinen DNA: n fragmentoituminen havaittiin DNA-tikkaat analyysit jälkeen Ching001 hoidon 48 tuntia.

Ching001 indusoi Pro-apoptoottiset ER Stress signalointireitin

On huomattava, että toiminta ER stressiä kaspaasi-4 suureni ajasta riippuva tavalla H1299 ja A549 keuhkosyövän solulinjat jälkeen Ching001 hoidon (Fig. 4A). Tutkia mekanismeja Ching001 kohtelu proapoptoottisten ER stressin induktio, western blot apoptoosin säätelemiseksi proteiineja kuten ER stressin signalointireittejä tehtiin. Aktivointi ER stressin näkyi lisääntynyt ilmentyminen p-PREK, p-eIF2α, p-JNK, GADD153 ja kaspaasi-4 jälkeen Ching001 hoidon (Fig. 4B). Lisäksi, Ching001 käsittely laski ekspressiota anti-apoptoottisen tekijän Bcl-2 ja lisääntynyt ilmentyminen pro-apoptoottisen tekijän Bax, mikä johtaa apoptoosin kautta pilkkominen apoptoosin executioner kaspaasi-3 (Fig. 4A). Nämä tulokset osoittivat, että Ching001 indusoiman apoptoosin, ainakin osittain, kautta ER stressiä signalointireitin.

(A) Kaspaasi-4 lisääntyi aikariippuvaisesti jälkeen 1 uM Ching001 hoitoon sekä A549 ja H1299 keuhkosyöpäsolua linjat merkityillä aikoina. **:

P

0,01, ***:

P

0,001. (B) Western blot analyysit ER stressiin liittyvät signalointi proteiineja (blotit yläpuolella pisteen viiva) ja apoptoosiin liittyvien viestintäproteiinit (blotit alapuolella katkoviivaosa) jälkeen Ching001 hoidon ilmoitettuina aikoina.

Ching001 Exhibits

vivo

Vieraslajisiirteen kasvun esto Mitosis pysähtymiseen ja apoptoosiin ilman apoptoosin ympäröivä kudos on Vieraslajisiirteen

-tuumoriksenografti määritys suoritettiin testaamaan tuumorin kasvun estäminen kykyä Ching001

vivo

. Intraperitoneaalisesti 0,4 mg /kg Ching001 viisi kertaa alkuperäisen hoidon osoitti kasvaimen kasvun inhibitiota vaikutuksen, joka oli samanlainen kuin 4 mg /kg hoito paklitakselin, tunnettu mikrotubulusten estäjä (Fig. 5A, vasen paneeli). Kasvaimen kasvu oli edelleen inhiboitui käsittelemällä 2 mg /kg Ching001. Mitään merkittäviä kehon painon hoidetuissa eläimissä verrattuna kontrolliryhmään havaittiin (Fig. 5A, oikea paneeli).

(A) ICR-kantavissa nude vakiintuneita A549 kasvaimet (-50 mm

3) käsiteltiin Ching001 (0,4 mg /kg tai 2 mg /kg) intraperitoneaalisella injektiolla day1, Day3, day5, päivä7, ja Day9 (kuten on esitetty nuolella päätä). Tunnettu mikrotubuluksen inhibiittoria, paklitakseli (4 mg /kg), käytettiin vertailussa. Kasvaimen tilavuutta (vasemmalla) ja kehon paino (oikealla) mitattiin joka toinen päivä asti day35. Points, keskiarvo; baareja, ± SEM. *:

P

0,05, **:

P

0,01, ***:

P

0,001. (B) Aktivoitu kaspaasi-3 IHC värjäys tuumorikudoksessa ICR-nude-hiiriin otettu liuotin kontrolliryhmässä ja Ching001 hoito (2 mg /kg) ryhmä. Alkuperäinen suurennus × 200. (C) Kudos immunofluoresenssi surviviinin (vihreä), aurora B (punainen), ja DAPI (sininen) on -tuumoriksenografti liuottimien verrokkihiiriin ja Ching001 käsiteltyihin hiiriin (2 mg /kg). Nuolet osoitti mitoosi solujen liuotinkontrolli kasvain. Laajentunut luku on poikkeava kromosomien jälkeen Ching001 hoidon. Mittaviivat: 30 pm.

Sen tutkimiseksi, Ching001 indusoi kasvaimen apoptoosin

vivo

, immunohistokemia (IHC) värjäys aktivoitua kaspaasi-3 suoritettiin. Löysimme lisääntynyt ilmentyminen aktivoitua kaspaasi-3 in tuumoriksenografteja alkaen Ching001 hoidetussa ryhmässä verrattuna liuottimella käsitellyssä ryhmässä (kuvio. 5B). Lisäksi Ching001 kasvaimen solut näyttivät olevan kutistui tumassa ja johdettiin ulkonäkö, joka edustaa apoptoottista solukuolemaa vierassiirrekokeissa kyhmyn (kuva. S4A), kun taas ei histologista tai apoptoottisen fenotyypin havaittu ympäröivän terveessä kudoksessa ksenograftin (Fig. S4b ). Sen tutkimiseksi, Ching001 aiheuttama mitoosin pidätys

vivo

, kudoksen immunofluoresenssi surviviinispesifisten ja aurora B suoritettiin. Tulokset osoittivat lisäystä solupopulaation että koekspressoi surviviiniperäisten ja aurora B Ching001 käsitelty kasvainkudoksessa verrattuna liuottimella käsitellyn kudoksen (Fig. 5C). Tärkeää on, poikkeava kromosomi kokoonpano havaittiin Ching001 käsitelty ksenograftin (suurennettu osakuva kuvassa. 5C). Nämä

vivo

tulokset tukevat kanssa

vitro

tietojen Ching001 indusoi mitoosia pidätys, kromosomivaurio, ja apoptoosin.

Ching001 Estää Cancer kolonisaatiokyky

vivo

vaikuttamatta Normaali Vital Function

Voit tarkistaa

vivo

kolonisaatio esto potentiaalia Ching001, kokeellinen etäpesäke eläinkokeissa tehtiin. A549 keuhkosyövän soluja injektoitiin suonensisäisesti hännän laskimoon hiirillä. Hiiret saivat 0,2 mg /kg Ching001, kymmenesosa annoksen käytetään anti-kasvaimen kasvun eläinkokeissa, intraperitoneaalisesti joka toinen päivä päivästä 1 päivään 35. DMSO toimi liuottimena ohjaus ja 0,2 mg /kg paklitakselia, sisällytettiin mukaan positiivisena kontrollina. Lisäksi A549-soluja esikäsitellään 1 uM Ching001 ennen hännän laskimoon injektiona suoritettiin myös. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05. (B) toinen hematologian ja biokemian testit verta testattu hiirillä. Vuonna hematologian testit, valkosolujen, punasolujen ja verihiutaleiden testattiin. Vuonna biokemian testit, GOT, GPT, albumiini, ja koko-bilirubiini käytetään indikaattoreina maksan toiminta; BUN ja kreatiniinia indikaattoreina munuaistoiminnan. Tulokset osoittivat, että Ching001 hoito ei aiheuttanut havaittavaa muutosta maksan ja munuaisten toimintoja verrattuna DMSO-käsiteltyihin eläimiin.

Keskustelu

Kehitetään syöpälääkkeiden kanssa tehokkaammaksi ja rajoitettu puoli -effects, suunnittelimme täysin synteettinen yhdiste Ching001 ja tarkastellut kasvainten vastaisen toiminnan

vitro

ja

vivo

keuhkosyövän malli . Ching001 osoitti erityistä sytotoksisuutta eri ihmisen keuhkosyövän solulinjoja annoksina Saharan mikromoolitasoa ilman ilmeistä sytotoksisuutta vastaan ​​normaalin ihmisen keuhkojen solulinjassa. Eläinkokeet osoittivat, että Ching001 esti kasvaimen kasvua ja kolonisaatio

vivo

ilman merkittäviä sivuvaikutuksia testattu hiirillä. Molekyyli rooli Ching001 kasvaimen kasvun estäminen välittyy ainakin osittain mikrotubulusten de-polymerointi johtaa mitoosin pidätykseen ja DNA-vaurioita. Nämä tapahtumat yhdessä ER stressin induktio, johti lopulta apoptoosin keuhkojen syöpäsoluja

vitro

ja

vivo

(Fig. 7 ).

Rapid solusyklin etenemistä on yksi ominaisuuksista proliferoituneita syöpäsolun. Inhibitio mikrotubulusten polymeroinnin Ching001 pidättää M-vaiheen solusyklin etenemisen ja johtaa DNA-vaurioita. Lisäksi, Ching001 hoitoon laukaisi aktivointi ER stressiä signalointireitin aktivoitumisen kautta PERK ja kaspaasi-4 signalointi cascade. Pitkittynyt M-vaiheen pysähtymisen ja aktivoitu ER stressiä signaloinnin myöhemmin indusoida apoptoosia syöpäsolujen käsiteltiin Ching001.

western blot-analyysit havaitaan jatkuva ilmentyminen p-MPM2 edustavat sisäänkäynti M-vaiheen solusyklin [18], [19], mikä osoittaa, että Ching001 käsitellyt solut irtautuneet G2 ja edeltää M vaiheeseen. Lisäksi aurora B ja surviviinista hallita järjestely ja erottaminen kromosomin mitoosin aikana. Hajoamista aurora B ja surviviiniperäistä M-vaihe helpottaa pään mitoosin [17]. Havaitsimme lisääntynyt koekspressio aurora B ja surviviinille sekä solu- ja eläinten näytteet, mikä viittaa siihen, että Ching001 estää poistumisen M-vaihe. Meidän α-tubuliinin immunofluoresenssimenetelmällä S-vaiheessa synkronoitu soluista osoitti solusyklin pysähtymisen metafaasissa. Kaikki yhdessä, meidän tulokset tukevat hypoteesia, että Ching001 pidättää solusyklin M-vaihe, joka voi johtua inhibition mikrotubulusten polymeroitumisen ja häiriöitä karan mikroputkiorganisaatiota. Pidentää M-vaiheen pysähtymisen soluissa johtaa epäonnistumiseen kromosomi eriytymistä ja myöhemmin kuolemaan mitoosin [21]. Nykyinen solu- ja eläinten tulokset antavat näyttöä siitä, että Ching001 hoito indusoi M-vaiheen pysähtymisen seurasi DNA-vaurioita ja apoptoottisen solukuoleman.

pettäminen ydin- maahanmuutto ja jako voisi häiritä homeostaasiin ER [22]. ER transmembraaninen anturit tunnetaan PERK ja IRE1α jälkeen aktivoituu fosforylaation, joka myöhemmin aktivoi kaspaasi-4 [23]. Ching001 käsittely lisäsi ilmentymistä ER stressin markkereita ja apoptoosin markkereita klo 6-12 tuntia. Nämä tulokset viittaavat siihen, Ching001 aiheuttama syöpäsolujen apoptoosin voi johtua samanaikaisesti kautta induktion mitoosin vikoja ja ER stressiä aktivointi varhaisessa ajankohtina. Lisäksi, ei ole selvää aktivointi luontainen apoptoosin signalointia proteiini kaspaasi-9 ja ulkoisten apoptoosin signalointia proteiini kaspaasin 8 havaittiin sen jälkeen, kun Ching001 hoidon (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että Ching001 indusoi syöpäsolujen apoptoosia on kautta ER stressiä. Vaimennus ER-välitteisen apoptoosin indusoiman Ching001 ER anturit pudotti solujen ansaitsee lisätutkimuksia.

Podofyllotoksiini on luonnontuote analogi Ching001 [5] – [7]. Podophyllotoxin johdannainen yhdisteitä käytettiin kliinisissä syövän hoidossa on usein johtuvan vastuksen poikkeavasta ilmaisun ja mutaatio spesifisten β-tubuliinin isotyyppien aikana hoidon [24]. Lisäksi paklitakseli vastus on myös raportoitu korreloivan lisääntyneen ekspression p-glykoproteiinien [25], [26]. On syytä mainita, että Ching001 käsittely osoitti samanlaista sytotoksista vaikutusta eri keuhkosyövän soluista, jotka ilmentävät eri p-glykoproteiinien (Fig. 1 B ja kuviossa. S6). Lisäksi, Ching001 käsittely osoitti vahvaa sytotoksista aktiivisuutta kohti etoposidi-resistentti ihmisen orvaskeden syöpäsolulinjan (Fig. S7). Onko Ching001 on voimakas yhdiste hoitoon taxanes- tai etoposidi-resistenttien solujen optio lisätutkimuksia.

Lopuksi Ching001 on anti-kasvaimen kasvun ja kolonisaation inhibition tehoa ilman haittavaikutuksia myös prekliinisissä kokeissa. Nämä tulokset korostavat terapeuttista potentiaalia Ching001 syövän hoidossa. Synteettinen Ching001 yhdiste erittäin puhdasta ja tuottavat syöpää soluspesifisestä sytotoksisuus on potentiaalinen ehdokas testattava lyijy farmaseuttisen yhdisteen syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläimet saatiin National Laboratory Animal Center (Kiina, Taiwan) luvalla Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), National Cheng Kung yliopisto (IACUC hyväksynnän nro 98099) ja pidettiin taudinaiheuttajan tilassa. Tutkimuksessa hyväksynnän kistusneuvostolta laitos eettinen komitea vahvisti National Cheng Kung yliopisto.

Cell Line, Cell Culture, ja synkronointi

Normaalit ihmisen keuhkojen epiteelisolujen MRC5 ja ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinjaan linjat CL1-0, ja CL1-5 saatiin tri PC Yang (Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hospital, Taiwan) [27]. Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat H1299 ja A549 saatiin American Type Cell Culture. Ihmisen orvaskeden syöpäsolulinjassa KB ja KB-7D solut saatiin tohtori Jang-Yang Chang National Health Research Institute, Tainan, Taiwan. KB solulinja alkuperäinen hankittiin American Type Cell Culture ja KB-7D on etoposidi kestävä solulinja on johdettu KB solulinjasta [28]. Kaikki solut kasvatettiin DMEM (Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), jossa oli 10% FBS: ää (Gibco) ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco), ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. Synkronoida solut S-vaiheessa, soluja käsiteltiin 2 mg /ml afidikoliinilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 24 tuntia ja päästää solusykliä ennen Ching001 hoitoa.

yhdisteet Käytetyt

podophyllotoxin johdannainen, Ching001, valmistettiin mukana kirjoittamassa W.-S. Li. Pyyntö yhdiste on lähetettävä [email protected].

Sytotoksisuusmääritys

Solut (3 x 10

4) ympättiin 6-kuoppaisille viljelylevyille ja eri pitoisuus Ching001 (0,5, 1, 3, 5 uM) lisättiin kuhunkin kuoppaan 48 tuntia. Solujen lukumäärä ja elinkelpoisuus määritettiin trypaanisininen värjäystä ja solujen laskenta.

Microtubule Assembly Pitoisuus

Microtubule kokoonpano määritys suoritettiin edellisessä tutkimuksessa [29]. Solut (1 x 10

6) ympättiin 100 mm viljelymaljoihin ja käsiteltiin 1 uM Ching001 tai DMSO ohjaus 6-48 tuntia. Supernatantti osa kokosoluliuotteista kerättiin liukoisen αβ-tubuliinidimeereistä ja kvantifioidaan Bradford-määrityksellä. Pelletti kerättiin liukenematon proteiini, joka sisältää polymeroitua mikrotubulusten, joka oli keitetty proteiini näytepuskurissa liuottaa proteiineja. Noin 50 ug liukoista lysaatit käytettiin latauskontrollina, ja yhtä suuri tilavuus liukenematonta proteiinia lysaatit käytettiin α-tubuliinin immunoblottauksella. Kaikki vasta-aineet ja niiden reaktio-olosuhteita käytetään, on lueteltu taulukossa S1.

virtaussytometria

CL1-0, CL1-5, A549, ja H1299-soluja (1 x 10

6) olivat kerätään jälkeen 6-12 h hoito 0,5 uM tai 1 uM Ching001, pestiin kahdesti Hankin tasapainotetulla suolaliuoksella (Sigma-Aldrich) ja -20

oC etanolia kiinnitys yön yli. Soluja inkuboitiin DNA-interkalaattori propidiumjodidia (Sigma-Aldrich), 37

oC 1 h 1 ug /ml RNaasi A: ta ja 0,1% Triton-X100. Noin 3 x 10

4 solut havaittiin käyttämällä FACScalibur väline (BD Biosciences, San Jose, CA) analysoida solusyklin jakautumisen.

Immunosytokemia Värjäys

Solut (1 x 10

4) ympättiin kammiossa dioja ja käsiteltiin Ching001 tai DMSO ohjaus 48 tuntia. Käsitellyt solut hybridisoitiin α-tubuliinin vasta-ainetta ja DAPI jälkeen kiinnitys. Vasta-aineet surviviinispesifisten ja aurora B käytettiin mitoosi solujen värjäystä. Anti-PS-vasta-ainetta käytettiin havaitsemiseen varhaisessa vaiheessa apoptoosin. Sitten solut valokuvattiin Olympus FV1000 konfokaalimikroskoopilla. Yksityiskohtaiset menettelyt ja vasta-aineet on kuvattu taulukossa S1.

Western blot -analyysi

Näytteet, jotka sisälsivät yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin Immobilon-P kalvoja (Millipore). Western blot suoritettiin mittaamiseksi ekspressiotaso. Yksityiskohtaiset menettelyt ja vasta-aineet on kuvattu taulukossa S1.

DNA Ladder Pitoisuus

Solut (1 x 10

6) käsiteltiin DMSO-kontrollin tai 3-5 uM Ching001 varten 24-48 h, DNA uutettiin käyttämällä DNA-uuttopuskuria (0,2 uM fosfaatti-sitraattipuskuria, pH 7,8; ​​37

oC, 1 h reaktio), jota seurasi RNaasi A ja proteinaasi K hoitoon. Agaroosigeelielektroforeesi käytettiin DNA-molekyylipainomarkkeri analyysejä.

Kaspaasi-4-aktiivisuusanalyysi

Kaspaasi-4-aktiivisuuden määritys suoritettiin kaspaasi-4-aktiivisuuden määritys kit (GeneTex, Irvine, CA). Lyhyesti, noin 200 ug kokosoluliuotteista yhdessä DMSO-kontrollin tai Ching001 hoitoa 6-48 h käytettiin määrityksessä. Aktiivisuuden kaspaasi-4 määritettiin pilkkomalla LEVD-AFC alustalle ja havaita ELISA-lukijaa (Ex /Em: 400/505).

Quantitative käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)

mRNA ilmentyminen p-glykoproteiinin perheen geenien

ABCB1

ja

ABCG2

havaittiin qRT-PCR sekä normaali ja syövän keuhkojen solulinjoissa. Kokonais-RNA uutettiin ihmisen eri keuhko- solulinjoissa käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Noin 4 ug RNA: ta käänteiskopioitu cDNA käyttäen SuperScript-käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin havaitsemaan mRNA: n ilmentymisen taso kohdegeenien käyttäen StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), jossa

GAPDH

sisäisenä kontrollina. Alukkeet

ABCB1

ovat: sense 5′-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3 ’, antisense 5′-CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3’; ja

ABCG2

: sense 5′-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3 ’, antisense 5′-GGCCCGTGGAACATAAGTCTT-3’; for

GAPDH

: sense 5’GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ’, antisense 5’TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’. CDNA-näytteet monistettiin käyttäen SYBR Green (Applied Biosystems) ja lämpökäsittelyyn ehto, joka koostuu 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 45 sykliä 95 ° C: ssa 3 s ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Cycle kynnys (Ct), murto-syklin, jossa määrä monistetun tavoitteen saavuttaminen kiinteä kynnys määritettiin. Normalisoidut suhteet kohdegeenien laskettiin ACt [ACt = Ct

-kohde geeni – Ct

-GAPDH]. Tulokset esitettiin kertaisesti erot suhteessa IMR90 normaaliin keuhkojen solugeenejä ilme perustuu laskelmiin 2

-ΔΔCt (ΔΔCt = ACt

-lung solulinja – ACt

-IMR90).

MTT Sytotoksisuus Analysis

Eri pitoisuuksia Ching001 lisättiin kuhunkin levyyn, ja niitä inkuboitiin 48 tuntia. Elinvoimaisten solujen eri pitoisuuksia yhdistettä hoidon määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma, St. Louis, MO) määritys. Kun käsittelemätön kontrolli, 0,1% DMSO: ta sisältävää väliainetta käytettiin.

in vivo

-tuumoriksenografti muodostumisen määritys

ICR-Foxn1 nude-hiiriin (5 viikkoa vanhoja), olivat hankittu National Laboratory Animal Center hyväksymisestä Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), National Cheng Kung yliopisto (IACUC hyväksynnän nro 98099), ja nosti tietyssä taudinaiheuttajista vapaassa ympäristössä. A549-soluja (5 x 10

6) injektoidaan subkutaani- ksenograftikasvaimina hiiriin ja annettiin kasvaa 50 mm

3 kasvain kyhmy kuluessa 2-viikon. Sitten hiiret injektoitiin intraperitoneaalisesti 0,4 mg /kg, tai 2 mg /kg Ching001, tai 4 mg /kg paklitakselia kuin positiivisena kontrollina, tai liuotinta ohjaus (etanoli: kremofori: DDH

2O = 02:01:07) päivänä 1, 3, 5, 7, 9 tilavuus ksenografti ja paino hiirillä mitattiin ja kvantitoitiin aikana 35 päivää lääkehoidon. Ksenograftikudoksista tilavuus laskettiin (pituus x leveys neliö) /2 mm

3. Tärkeimmät elimet mukaan lukien sydän, keuhkot, maksa, munuaiset, ja ksenografti kyhmy leikeltiin ja värjättiin H & E edelleen vahvistusta.

In vivo

Kokeellinen metastaasin Pitoisuus

BALB /c-hiiriä hankittiin ja nosti saatuaan asianmukaisen Institutional Review board lupaa edellä kuvatulla tavalla. A549 (1 x 10

6) solua injektoitiin suonensisäisesti hännän laskimoon BALB /c-hiiristä, jotka sitten annettiin intraperitoneaalisesti DMSO-kontrollin, 0,2 mg /kg Ching001 tai 0,2 mg /kg paklitakselia joka toinen päivä viiden viikon ajan .