Krooninen sairaus

tiivistelmä

CONTACTIN-1: n on osoitettu edistävän syövän etäpesäkkeiden. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien edelleen epäselviä. Me raportoimme tässä, että pudotus on CONTACTIN-1 A549 keuhkosyövän soluja vähentää A549 invaasion ja solun kyky kasvaa pehmeässä agarissa vaikuttamatta solujen lisääntymistä. Vähentäminen CONTACTIN-1 aiheutti ylösajon E-kadheriinin, sopusoinnussa E-kadheriinin ollessa inhibitive of syöpäsoluinvaasiota. Kun pyritään tutkimaan mekanismeja, joilla CONTACTIN-1 vähentää E-kadheriinin ilmentymisen, havaitsimme, että CONTACTIN-1 on tärkeä rooli AKT aktivointi, kuten knockdovvn CONTACTIN-1 heikennetty AKT aktivointi. Lisäksi esto AKT aktivointi tehostaa merkittävästi E-kadheriinin ilmentymisen, havainto, joka jäljittelee tilannetta havaittu CONTACTIN-1 knockdovvn, mikä viittaa siihen, että aktivointi AKT on rooli CONTACTIN-1-välitteisen downregulation E-kadheriinin. Lisäksi pystyimme osoittamaan, että knockdovvn CONTACTIN-1 ei entisestään vähentää A549: n invaasiota kykyä, kun AKT aktivaatio estyi AKT- estäjällä. Edelleen tukevat havainnot, me yli-ilmentynyt CNTN-1 kahden CNTN-1 null rintasyövän solulinjat ilmentävät E-kadheriinin. Kun yli-ilmentyminen, CNTN-1 vähensi E-kadheriinin tasot yhdessä solulinjassa ja lisääntynyt AKT aktivointi muissa. Lisäksi meidän tutkimus 63 ensisijaisen keuhkosyövässä, havaitsimme 65% ensisijaisen keuhkosyövässä ollessa CONTACTIN-1 positiivisia ja näissä karsinoomat, 61% oli E-kadheriinin negatiivinen. Yhdessä tarjoamme todisteita siitä, että CONTACTIN-1 näyttelee roolia downregulation E-kadheriinin keuhkosyövässä ja että AKT aktivaatio edistää tätä prosessia. Tutkimuksessa, mekanismeja vastuussa CONTACTIN-1 aktivoida AKT, osoitimme, että knockdovvn CNTN-1 A549-soluissa ei tehostanut PTEN ilmaus mutta voimistunut PHLPP2, fosfataasi, joka defosforyloi AKT. Nämä havainnot viittaavat siten siihen, että CONTACTIN-1 tehostaa AKT aktivaatio osittain estämällä PHLPP2 välittämän AKT dephosphrorylation.

Citation: Yan J, Wong N, Hung C, Chen WX-Y, Tang D (2013) Contactin- 1 Vähentää E-kadheriiniekspressiota Via aktivointi AKT Lung Cancer. PLoS ONE 8 (5): e65463. doi: 10,1371 /journal.pone.0065463

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 29 lokakuu 2012; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 28, 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Eturauhassyöpä Kanada D. Tang. Kirjoittajat myös antaa tunnustusta rahoitustuki St. Josephin HealthCare Hamilton, Ontario, Kanada Hamilton Centre for Munuaiset Research (HCKR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hermosoluadheesioantigeenin proteiini CONTACTIN-1 (CNTN-1) koostuu kuudesta Ig domeenien neljä fibronektiinin kaltaisia ​​motiiveja, ja glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) -moiety [1]. GPI-osa ankkuroituu CNTN-1 ulkoiseen kalvoon pintaan keskus- ja reuna-neuronien [2], [3]. CNTN-1 on tärkeä rooli Axon laajentaminen ja muodostumisen septate kaltaisten liitoskohdissa aksonien ja myelinating gliasoluissa [4] – [6], Lisäksi CNTN-1 toimii ligandina Notch-reseptorin aivoissa johtaa oligodendrocyte kypsytys [7]. Näiden tavoitteiden mukaisesti in vitro havaintojen, in vivo tutkimukset paljastavat kriittinen rooli CNTN-1 aksoniohjauksen ja synapsi muodostumista [8] – [10]. Knockdovvn CNTN-1 in

Xenopus

embroys johti misguidance ja defasciculation kolmoishermon aksonien [11]. Katsovat, hiirissä, joilta puuttuu CNTN-1 kuolevat muutaman viikon aiheuttamien vakavien ataksia [4], [8].

Vaikka menetys CNTN-1-toiminto, seurauksena geenin tyrmäys tai spontaani mutaatioita

CNTN-1

, vaikuttaa keskushermostoon ja ääreishermoston muttei lihasliitoksen (NMJs) hiirissä [8], [12], mutaatiot

CNTN-1

geeni on sekaantunut haittaamaan NMJs toiminto ihmisellä [13]. Mutaatio johtaa käyttöönoton ennenaikaisen lopetuskodonin sisällä kolmannen Ig-domeenin liittyi familiaalinen muoto tappava synnynnäinen myopatiaa ihmisellä [13]. Huolimatta kertyvät tutkimusta CNTN-1-toiminto, vähän tiedetään sen toiminta ulkopuolella hermostoon. Vaikka Northern blot analyysit haima-, keuhko-, munuais- ja luustolihasten havaittiin vain pieniä määriä CNTN-1-transkriptien [14], sen toiminta näissä kudoksissa ja ilmaisunvapautta muissa kudoksissa ei ole vielä määritelty. Vasta viime aikoina ovat siellä on raportoitu CNTN-1 ilmentymisen sairauksissa ulkopuolella hermoston, etenkin sen osallistumista syöpä. CNTN-1 havaittiin ensisijainen keuhkosyöpä ja pudotus on CNTN-1 keuhkosyöpää soluissa estettiin spesifisesti niiden etäpesäkkeitä, mutta ei muodostumista paikallisen ksenograftikasvaimissa immuunipuutteisilla hiirillä [15]. Tämä johtuu osittain keskeinen rooli CNTN-1 aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestelyn ja polttovälin tarttuvuus rakenteisiin [15]. Lisäksi, CNTN-1-välitteisen etäpesäke säätelee VEGF-C ja CNTN-1 lisää GTP: hen sitoutuneen RhoA, joka johtuu CNTN-1-edisti keuhkosyöpä ja metastaasit [15], [16]. Keuhkosyöpä potilaalla on korkeat CNTN-1 on huono ennuste [15]. Yhdenmukaisesti näiden raporttien tekijät parantaa keuhkosyövän etäpesäke myös ylössäätelee CNTN-1 [17]. Lisäksi CNTN-1: n on raportoitu melanooma [18] ja se liittyy etäpesäkkeitä mahasyövän, suun okasolusyöpä, ja ruokatorven syöpään [19] – [22].

Vaikka kertynyt todisteita rooli of CNTN-1 syövän etäpesäkkeitä, taustalla olevien mekanismien vastuussa tämän prosessin jää epäselväksi. Tutkimiseksi edelleen CNTN-1-välitteisen oncogenesis olemme tippuu alas CNTN-1 A549 keuhkosyövän soluja. Tämä johti ylössäätely E-kadheriinin. Vuonna ensisijainen keuhkokarsinooma, korkeita CNTN-1 rinnalla oli alhainen E-kadheriinin. Mekanistisesti CNTN-1 on tärkeä rooli AKT aktivoinnin, mikä puolestaan ​​estää E-kadheriinin ilmentymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, plasmidit ja inhibiittorit

Keuhkosyöpä solulinjoja (A549 ja H1299), rintasyövän solulinjat (MCF7, BT549, BT474, MDA-MB-453, T47D ja ZR751), munuaissyöpä solulinjoja (A498 ja 786-0), kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa) , joka on glioblastoomasolulinjan (U87) ja 293T-solut (ihmisen 293 munuaisen alkion epiteelisolut) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A549, BT549, H1299, T47D, BT474, ZR751, MDA-MB-453 ja 786-0-soluja viljeltiin RPMI 1640 media. MCF7, HeLa- ja 293T-soluja viljeltiin DMEM: ssä ja A498 ja U87-soluja viljeltiin MEM-media. Kaikki alustat täydennettiin 10% FBS (Sigma Aldrich, Oakville, ON) ja 1% penisilliini-streptomysiini (Life Technologies, Burlington, ON). Identiteetti A549 varmistettiin STR tekemän analyysin DDC Medical (Fairfield, OH). CNTN-1 shRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) ja CNTN-1 isoformi 3 cDNA hankittiin Open Biosystems (Huntsville, AL). Akt estäjä VIII hankittiin Calbiochem (EMD, Mississauga, ON). E-kadheriinipromoottorin ajettu lusiferaarikonstrukti luovutti ystävällisesti Dr. Antonio García de Herreros, Universitat Pompeu Fabra, Espanja [23].

knockdovvn CNTN-1

Hairpin shRNAs (ohjaus /Ctrl ja CNTN-1) oli ilmaistaan ​​retroviruspohjaisia ​​shRNA vektori (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Knockdovvn CNTN-1 suoritettiin saamiemme julkaistuista ehdoista [24] – [26]. Lyhyesti, gag-pol-ilmentävällä vektorilla, rev ilmentävällä vektorilla ja kirjekuoren ilmentävällä vektorilla (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON) oli lyhytaikaisesti kotransfektoitiin kanssa suunniteltu retroviruksen plasmidi 293T-soluihin. Viruksen sisältävä väliaine kerättiin 48 tuntia myöhemmin, suodatettiin 0,45 um: n suodattimen, ja sentrifugoitiin 20000 g: ssa 120 minuutin keskittyä retrovirus. Polybreenin (10 ug /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ON) lisättiin ennen infektiota ja solut valittiin stabiilin integraation puromysiinin (1 ug /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ON).

Retroviral yliekspressio CNTN-1

Human CNTN-1 isoformi 3 cDNA hankittiin (Open Biosystems, Huntsville, AL) ja muokataan edelleen tuottaa täyspitkä isoformin 1 CNTN-1. PCR-alukkeet syntetisoitiin reunustavat C-pää fragmentin läsnä isoformin 1, mutta puuttuu isoformin 3. RNA eristettiin A549-solujen TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ON) ja sitä käytettiin templaattina RT-PCR: llä. Saatu C-pää PCR-fragmentti ligoitiin pBluescript KS +: n ja tämän jälkeen leikata ulos restriktiokohdan MfeI; ainutlaatuinen sivusto läsnä isoformin 1 ja isoformin 3, muutama emäsparia ylävirtaan ennen kahden sekvenssin eroavat. C-pää-fragmentti ligoitiin sitten kaupallisesti ostettu isoformin 3. täyspitkä isoformi 1 cDNA CNTN-1 sen jälkeen kloonattiin retrovirusvektoriin, pBabe. Vahvistus positiiviset kloonit määritettiin DNA: n sekvensoinnilla. Yliekspressio CNTN-1 suoritettiin käyttäen gag-pol ilmentävällä vektorilla ja kirjekuoren ilmentävällä vektorilla (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON). Kaikki vaiheet suoritettiin samalla tavalla edellä on kuvattu knockdovvn CNTN-1. PBabe vektori ilman CNTN-1 käytettiin tyhjän vektorin kontrolli.

soluproleferaatiomäärityksessä

yhteensä 1000 solujen A549 shCTRL ja shCNTN-1-solut ympättiin 96-kuoppaisen levyn ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5 päivää. Proliferaatio mitattiin käyttämällä WST-1-solujen lisääntymisen määrityksessä Kit (Millipore, Mississauga, ON) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssilukemia mitattiin levylukijalla 420mn.

invaasiomääritys

Modified Boyden kammiot kaupalliselta koostuu inserttien jossa on 8 um huokosia kalvo päällystetty matrigeelin (BD Biosciences, Mississauga, ON ) laitettiin 24-kuoppalevylle. Invasion määritykset suoritettiin valmistajan menettelyn. Lyhyesti, matrigeeliä insertit annettiin 2 tunnin nesteyttää 37 ° C: ssa ennen käyttöä, kun läsnä on 0,5 ml kasvualustaa. Täydellistä kasvualustaa (0,5 ml), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) pantiin alempaan kammioon. Yhteensä 5 x 10

4-solut ympättiin yläkammioon insertin 0,5 ml: ssa seerumia 22 tunnin ajan. Solut, jotka läpi kalvot kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla (0,5%, Sigma Aldrich, Oakville, ON). Prosenttiosuus invasiivisen solujen laskettiin jakamalla solujen määrä kulkee 8 um huokoskoko matrigeeliä kalvoon liikkuvien solujen lukumäärä kontrollimembraanin läpi ja kertomalla 100

riippumattomaan kasvuun Assay

A549 shCTRL ja A549 shCNTN solut ympättiin yksittäisiin kuoppiin kuuden kuopan levyille tiheydellä 10

4 solua /kuoppa 2 ml: ssa 2X väliainetta, joka sisälsi 0,25% agaroosia. 3 viikon kuluttua, 5 random kentät kuoppaa kohti tutkittiin pesäkkeet ja laskettiin alle faasikontrastimikroskoopissa. Mean pesäke ala määritettiin käyttäen Image Pro 5.0-ohjelmisto. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.

Western blot-analyysi

Solulysaatit valmistettiin puskuriin, joka sisälsi 20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA: ta, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 25 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM NaF, 1 mM β-glyserofosfaatti, 0,1 mM natriumortovanadaatti, 1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptiiniä ja 10 ug /ml aprotiniinia (Sigma Aldrich, Oakville, ON). Kaikkiaan 50 ug solulysaatin, ellei toisin mainita erotettiin SDS-PAGE-geelillä ja siirrettiin Amersham Hybond ECL nitroselluloosa- membraaneihin (Amersham, Baie d’Urfe, QC). Membraanit blokattiin 5% kuorittua maitoa, ja sitten inkuboitiin vasta-aineiden kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Asianmukaista HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita inkuboitiin yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Signaalit havaittiin käyttämällä ECL Western blotting Kit (Amersham, Baie d’Urfé, QC). Ensisijaisen ja toissijaisen vasta-aineet ja käytetyt väkevyydet olivat: anti-CNTN-1 (1:200, R anti-AKT (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-AKT Ser473 fosforylaatio (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti-GSK3p Ser9 fosforylaatiota (1, 1000, Cell Signaling, Danvers , MA), anti-GSK3p (1:1000, Upstate Biotechnology, Billerica, MA), anti-E-kadheriinin (1:2500, BD Biosciences, Mississauga, ON), anti-Snail (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-PHLPP2 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), anti-GAPDH (1:5000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti-aktiini (1:1000, Santa Cruz), anti-vuohi (1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-hiiri (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON) ja anti-kani (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON)

immunofluoresenssi

Soluja käsiteltiin kuten on määritelty kuvassa legendoja. Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin kiinnittämällä soluja 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,05% saponiinia (Sigma Aldrich, Oakville, ON) 15 minuutin ajan. Anti-CNTN-1 (1:20, R 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

tulokset

CNTN-1 vähentää E-kadheriinin ilmentymisen

CNTN-1 on keskeisessä asemassa etäpesäke A549 keuhkosyövän soluihin [15]. Tutkimiseksi edelleen CNTN-1-välitteisen keuhkosyöpä etäpesäke, olemme tippuu alas CNTN-1 A549-soluissa. Vaikka knockdovvn CNTN-1 ei vaikuttanut solujen lisääntymistä (kuvio 1A), solujen kyky kasvaa pehmeässä agarissa ja hyökätä matrigeeliä väheni merkittävästi (kuvio 1 B, C). Nämä tulokset ovat linjassa raportissa että knockdovvn CNTN-1 ei vaikuttanut muodostumista ksenograftikasvaimissa mutta alensi solun etäpesäke kykyä [15].

(A) A549-soluja transfektoitiin stabiilisti ohjaus (CTRL) tai CNTN-1 shRNA. Knockdovvn CNTN-1 varmistettiin western blot (upotus). 1000-solut ympättiin 96 solulevyille. Solujen proliferaatio määritettiin päivittäin käyttäen WST-1-solujen lisääntymisen määrityksessä sarja viisi päivää. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Tyypilliset tulokset yhdestä toista näkyvät. (B) tutkimiseksi solun kyky kasvaa pehmeässä agarissa, 10

4-solut ympättiin agar sisältävässä elatusaineessa 3 viikkoa. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa. Tyypillisiä kuvaa yhdestä kokeesta esitetään (vasen paneeli). Koot pehmytagar pesäkkeet laskettiin ImagePro 5.0 ohjelmiston ja esitetään keskiarvoina ± SD. *:

p

0,05 verrattuna A549 shCNTN-1-soluja (2 tailed opiskelija t-testi). (C) A549 shCTRL ja shCNTN tutkittiin niiden kyky läpäistä ohjaus ja Matrigel kalvo. Kokeet suoritettiin kolme kertaa. Tyypillisiä kuvaa yhdestä kokeesta esitetään (vasen paneeli). Invasion kvantitoitiin (oikea paneeli).

hyökkäys kyky epiteelisolujen-alkuperä syövät johtuu menetys epiteelisolujen soluadheesion proteiini, E-kadheriinin [29], [30]. Sen tutkimiseksi, onko E-kadheriinin edistää CNTN-1-medaited soluinvaasiota, pystyimme osoittamaan, että knockdovvn CNTN-1 lisäsi merkittävästi E-kadheriinin ilmentymisen (kuvio 2A). Tämä kiihdytyssäätely oli osittain johtuu korkeus E-kadheriinin transkriptio, osoituksena nousu E-kadheriinin mRNA (kuvio 2B) ja E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus (kuvio 2C). Lisäksi sopusoinnussa CNTN-1 on ankkuroitu solun pinnalla [3] ja sivuston toiminto E-kadheriinin ollessa myös solun pinnalla, knockdovvn CNTN-1 ei ainoastaan ​​vähentää huomattavasti solun pinnan sisältö CNTN-1 ( Kuvio 2D), mutta myös lisääntynyt solun pinnan E-kadheriinin (kuvio 2E). Yhdessä edellä havainnot osoittavat, että CNTN-1 vähentää E-kadheriinin ilmentymisen ainakin in vitro.

(A) Solulysaatit valmistettiin ilmoitetun solulinjat, jota seuraa havaitseminen E-kadheriinin, CNTN -1 ja aktiini western blot (vasen paneeli). Kokeet toistettiin kolme kertaa. Tasot E-kadheriinin kvantitoitiin ja piirretään (keskiarvo ± SD). *:

p

0,05 kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. (B) Reaaliaikainen PCR-analyysi E-kadheriinin ilmentymisen ilmoitettu solulinjoissa. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. E-kadheriinin mRNA A549 shCNTN soluissa esitetty kertainen muutos, että A549 shCTRL soluja. *:

p

0,05 kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. (C) A549 shCTRL ja A549 shCNTN soluja transfektoitiin ohimenevästi E-kadheriinin, jota ohjaa lusiferaasi ja CMV ajetaan LacZ rakentaa 48 tuntia, minkä jälkeen arvioimalla lusiferaasin ja β-gal toimintaa. Kokeet toistettiin kolme kertaa. (D) immunofluoresenssi A549 shCTRL ja A549 shCNTN varten CNTN-1. (E) immunofluoresenssivärjäystä E-kadheriinin on ilmoitettu solulinjoissa. Tumat vastavärjättiin DAPI.

edelleen määritellä suhde CNTN-1 ja E-kadheriinin, olemme tutkineet 63 ensisijaisen keuhkosyövän (taulukko 2). Noin 65% (41/63) ja 35% (22/63) ensisijaisen keuhkosyövän ilmaistaan ​​helposti havaittavissa (CNTN-1

+) ja huomaamaton CNTN-1 (CNTN-1

-), vastaavasti IHC (kuvio 3A). Tämä on sopusoinnussa julkaistun esiintymistiheys CNTN-1

+ versus CNTN-1

– ensisijainen keuhkosyövän [15]. Lisäksi meidän analyysi 46 vaiheiden I /II ja 17 vaiheiden III /IV ensisijaisen keuhkosyövän (taulukko 2), noin 61% vaiheiden I /II ja 76% on vaiheiden III /IV karsinoomat ovat CNTN-1-positiivisia (kuvio 3B), mikä osoittaa roolin CNTN-1 keuhkosyöpä etenemiseen.

Kuusikymmentä kolme ensisijaista keuhkosyövän päässä kudossiruina oli IHC värjättiin CNTN-1 ja E-kadheriinin. (A) Tyypillinen kuvia keuhkosyövässä korkea ja alhainen CNTN-1. Prosenttiosuus keuhkosyövän, joilla on korkea tai alhainen CNTN-1 on osoitettu. (B) kudossiruina skannattiin ja analysoitiin ImageScope. CNTN-1 ilmentymisen seuraavat keuhkosyöpä etenemistä analysoitiin. (C) tyypillisiä kuvia keuhkosyövässä korkea ja alhainen E-kadheriinin. Prosenttiosuus keuhkosyövän, joilla on korkea tai alhainen E-kadheriinin on osoitettu. (D) perusteella IHC värjäys, osuus CNTN-1-positiivisia karsinoomia, jotka ilmensivät korkeita tai matalia tasoja E-kadheriinin laskettiin. (E) Ensisijainen keuhkosyöpä oli IHC värjättiin CNTN-1 ja E-kadheriinin. Alueet positiivinen CNTN-1 ja negatiivinen E-kadheriinin (sininen laatikko, sininen ympyrä), positiivinen CNTN-1 ja positiivinen E-kadheriinin (vihreän laatikon), negatiivinen CNTN-1 ja positiivinen E-kadheriinin (punainen laatikko ) ja molemmat CNTN-1 ja E-kadheriinin negatiivinen (musta laatikko) voidaan havaita.

analysoitiin myös E-kadheriinin ilmentymisen ensisijainen keuhkokarsinooma. E-kadheriinin

+ ja E-kadheriinin

– karsinoomien havaittiin (kuvio 3C) ja suurin osa tapauksista on E-kadheriinin-negatiivinen (63% tai 40/63). Tämä on sopusoinnussa useissa julkaisuissa, jotka osoittavat 60% -70% keuhkojen adenokarsinooma ilmentävien alentunut E-kadheriinin ilmentymisen [31], [32]. Toiset ovat myös raportoitu pienempi prosenttiosuudet, alle 50% keuhkosyövässä ilmentävät vähensi E-kadheriinin [33], [34]. Tärkeää on, noin 61% CNTN-1 positiivisia karsinoomia ovat myös E-kadheriinin-negatiivinen (Kuva 3D). Emme kuitenkaan noudata karsinoomat, jotka olivat negatiivisia sekä CNTN-1 ja E-kadheriinin (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että CNTN-1 ei ole ainoa tekijä estämällä E-kadheriinin ilmentymisen. Tukemalla tätä ehdotusta, kun taas CNTN-1 negatiivinen keuhkosyöpä alueet voivat olla E-kadheriinin positiivinen, samasta potilaan CNTN-1 positiivisia keuhkosyövän ilmentymisen määrän väheneminen E-kadheriinin (kuvio 3E). Yhdessä meidän tutkimus tukee sitä käsitystä, että CNTN-1 helpottaa keuhkosyöpä etenemisen /etäpesäkkeiden osan kautta downregulation E-kadheriinin.

CNTN-1 laskee E-kadheriinin ilmentymisen kautta parantaa AKT aktivaation

tutkimiseksi vastaavien mekanismien CNTN-1-välitteisen downregulation E-kadheriinin ilmentymisen, ensin määritetään, onko CNTN-1 vaikuttaa etanat ilmaisua. Snail on laajimmin tutkittu estäjä E-kadheriinin transkription [23]. A549-soluja, knockdovvn CNTN-1 ei muutu etanat ilmentymistä (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että etana voi olla merkittävä tekijä mukana CNTN-1-estoa E-kadheriinin ilmentymisen A549-soluja. Tutkittuaan muiden E-kadheriinin transkriptiotekijöitä, SIP1 ja Slug ilmaisun jälkeen vähentynyt CNTN-1 knockdovvn A549-soluissa (kuvio 4B, C). Kuitenkin, mitään muutosta ei nähty E47 ja Twist (tietoja ei esitetty).

(A) Solulysaatit varten osoitetun solulinjojen tutkittiin etanat ekspression Western blot. Kokeet suoritettiin kolme kertaa. Tyypillisiä kuvia (upotus) ja määrällistä Snail ilmaisun näkyvät. Reaaliaikainen PCR-analyysi (B) SIP1 ja (C) Slug lausekkeen osoitettu solulinjoissa. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. MRNA A549 shCNTN soluissa esitetty kertainen muutos, että A549 shCTRL soluja. *:

p

0,05 kaksisuuntaisella Studentin t-testiä.

Muut ja olemme hiljattain osoittaneet, että AKT-vaikutusta pienentää E-kadheriinin ilmentymisen [35] – [39 ] ja AKT-vaikutusta on keskeisessä asemassa kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden [40] – [42]. Olemme siis tutkittava, onko AKT myötävaikuttaa CNTN-1-välitteisen downregulation E-kadheriinin. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, me määritetty asema AKT aktivaation A549 ohjaus soluissa ja A549-soluja, joissa CNTN-1 oli tippuu alas. Verrattuna shCTRL soluja, knockdovvn CNTN-1 vähensi merkittävästi AKT aktivaation (kuvio 5A). Edelleen vahvistaa muutoksia AKT aktivointi, olemme osoittaneet, että verrattuna shCTRL solujen fosforylaatio seriinillä 9 GSK3p, vakiintunut AKT tavoite [41], väheni merkittävästi CNTN-1 pudotus soluissa (kuvio 5B). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että CNTN-1 on rooli AKT aktivointi.

(A) Solulysaatit A549- shCTRL ja A549 shCNTN tutkittiin p-AKT ja koko AKT Western blot (vasen paneeli) . AKT aktivointi kvantitoitiin (oikea paneeli). (B) fosforylaation Ser9 GSK3p (pGSK3β), GSK3p, ja GAPDH ilmaisun A549 shCTRL ja A549 shCNTN solut määritettiin myös.

määritetään sitten onko modulaatiota AKT-vaikutusta edesauttaa CNTN-1 indusoima väheneminen E-kadheriinin ilmentymisen. Esto AKT aktivaation AKT- estäjällä lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen A549-soluja (kuvio 6A), mikä osoittaa, että väheneminen AKT aktivoinnin yhteydessä knockdovvn CNTN-1 voi edistää havaittu inhibitio A549-invaasion (kuvio 1). Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, pystyimme osoittamaan, että vaikka knockdovvn CNTN-1 vähensi A549 soluinvaasiota upon DMSO hoito (rakkula-ohjattu), knockdovvn CNTN-1 ei vielä estää A549 soluinvaasiota kun AKT aktivaatio estyi (kuvio 6B) . Yhdessä nämä havainnot tukevat käsitystä, että CNTN-1 inhiboi E-kadheriinin ilmentymisen kautta parantaa AKT aktivaation. Kuten vähentäminen E-kadheriinin on tärkeä rooli syövän etäpesäkkeiden [29], [30], menetys E-kadheriinin näin osaltaan keuhkosyöpään etäpesäkkeiden.

(A) A549-soluja käsiteltiin AKT- estäjällä (AKT-estäjällä VIII) lisäämään pitoisuuksien ja sitten tutkittiin E-kadheriinin, AKT aktivointi (Pakt), AKT, ja Actin ilme. (B) A549 shCTRL ja A549 shCNTN-1-soluja valehoidettujen (DMSO, kaksi parasta paneelit) tai käsiteltiin AKT-estäjällä (alla kaksi paneelit), jonka jälkeen määrittämällä niiden invaasio kapasiteetti matrigeeliä inserttejä. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Sekä tyypillinen kuvia ja kvantifiointiin solujen invaasiota kykyä näkyvät. *:

p

0,05 kaksisuuntaisella Studentin t-testiä.

CNTN-1 lisää AKT aktivointi vähentämällä PHLPP2 ilmaisu

AKT aktiivisuutta säätelee sekä tuotantoketjun fosfataasit, PTEN ja PHLPP (PH domain leusiinirikkaita repeat proteiinifosfataasi). Siksi selvitettävä, onko jompikumpi tai molemmat fosfataasit ovat mukana CNTN-1 Knockdown aiheuttama väheneminen AKT aktivointia. Verrattuna shCTRL soluja, knockdovvn CNTN-1 ei merkittävästi vaikuta PTEN ilmentymistä (kuvio 7A). Kuitenkin vähentäminen CNTN-1 lisäsi merkittävästi PHLPP2 ilmentymistä A549-soluja (kuvio 7B). Lisäksi säätelyä PHLPP2 in CNTN-1 pudotus A549-solut oli osittain johtuu kasvusta PHLPP2 mRNA: ta (kuvio 7C), jotka voivat olla seurausta joko säätelyä PHLPP2 geenin transkription tai stabilointi PHLPP2 mRNA.

(A) A549 shCTRL ja A549 shCNTN-1 solulysaateista tutkittiin PTEN ilmentyminen western blot (ylhäällä). Kokeet suoritettiin kolme kertaa. Tyypillisiä kuvat yhdestä kokeen näytettiin (vasen paneeli). PTEN ilmentyminen kvantitoitiin myös (oikea paneeli). (B) PHLPP2 ilmentymistä A549 shCTRL ja A549 shCNTN solulinjoissa tutkittiin Western blot (ylhäällä). Kokeet toistettiin kolme kertaa. Tyypillisiä kuvat yhdestä kokeen näytettiin (vasen paneeli). PHLPP2 ilmentyminen kvantifioitiin (oikea paneeli). *:

p

0,05 kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. (C) Reaaliaikainen PCR-analyysi PHLPP2 ilmaisun osoitettuun solulinjoissa. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

CNTN-1 sääntely E-kadheriinin ja AKT aktivointi ei ole ainutlaatuinen A549

Voit selvittää, CNTN-1 säätelee E- kadheriinin ja AKT muissa syöpäsolulinjoissa, tutkimme useita rinnan, munuaisen, keuhkon ja kohdunkaulan syöpien CNTN-1 ja E-kadheriinin ilmentymisen. Huolimatta erilaisia ​​syöpiä tutkittiin, CNTN-1 ei ole yleisesti ilmaistuna proteiinin syöpä (kuvio S1). Lisäksi, koska kaksi rintasyövän solulinjoissa tutkittiin ilmaistaan ​​E-kadheriinin, meidän on tutkinut, jos CNTN-1 voi säänneltyjen E-kadheriinin ja AKT-vaikutusta näissä kahdessa solulinjassa. Kun kohdunulkoinen yli-ilmentymisen CNTN-1 in BT549, havaitsimme lasku E-kadheriinin ilmentymisen verrattuna tyhjän vektorin ohjaus ilman muutosta AKT aktivointi (kuva S2). Sen sijaan, yliekspressio CNTN-1 MCF7-soluissa johti kasvuun AKT aktivaatio verrattuna tyhjän vektorin ohjaus (kuvio 8A, B), kuitenkin, ei ole havaittu muutosta E-kadheriinin (kuvio 8C, D). Perusteella nämä todisteet, CNTN-1 säätelyyn E-kadheriinin ja AKT ei rajoitu keuhkosyöpä ja voi olla rooli muiden ilmentävien syöpien CNTN-1.

(A) CNTN-1 on yli-ilmentynyt MCF7-solut ja solujen lysaatit kerättiin ja ajettiin western blot varten CNTN-1, p-AKT, AKT ja Actin ilme. (B) immunofluoresenssi ja CNTN-1 ilmoitettu solulinjoissa. (C) Solulysaatit kerättiin ilmoitetusta solulinjat. Vain 10 ug solulysaattien ajettiin western blot E-kadheriinin ja aktiinin ilmentymistä. (D) immunofluoresenssivärjäystä E-kadheriinin on ilmoitettu solulinjoissa. Tumat vastavärjättiin DAPI.

Keskustelu

CNTN-1 on hermo Adhesion Protein kanssa tehtäviä aksoniohjauksen ja synapsi muodostumista [8] – [10].