Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen endogeeninen retrovirus K (HERV-K) on kaikkein ehjä retrovirus ihmisen genomissa. On olemassa useita täyspitkä tai lähes täyspitkä HERV-K proviruksia siinä. Analysoida joka HERV-K provirusten johtaa viruksen transkriptien syöpäsolulinjoissa ja testata, onko ionisoivalle säteilylle voi muuttaa tasoja HERV-K-transkriptien RT-PCR-tutkimukset tehtiin käyttäen useita ihmisen syöpäsolulinjoja. Primers useista tehtävissä virusgenomin käytettiin ja mukana paria suunniteltu ylittämään pujontaliitosten viruksen RNA: iden. Koska ionisoivan säteilyn, transkriptit havaittiin useista HERV-K proviruksia solulinjoissa ihmisen eturauhasen, kohdunkaulan, pään ja kaulan, tai rintasyöpiä, ja proviruksia josta transkriptit alkunsa vaihteli kesken eri linjat. Vain yksi 13 testatuista solulinjoista (kohdunkaulansyöpä linja C33A) pystynyt osoittamaan HERV-K selostukset. Saumattu RNA: t havaittiin mukana virus-RNA: t saumattu odotetusti tavanomaisella virus- liitoskohdat, sekä useita vaihtoehtoisesti liitettyjä RNA: t. Vaihtoehtoisesti silmukoituneet transkriptien nousi erityisiä provirusten, ja havaittiin useimmissa käytetyt solulinjat. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin arvioimaan ionisoivan säteilyn vaikutuksilta. Nämä analyysit osoittivat, että HERV-K transkriptien olivat koholla neljässä kahdestatoista riviä testattu, nimenomaan kaikkia kolmea eturauhassyövän riviä käytetään ja yksi rintasyöpä rivi. Korotukset olivat ohimeneviä, korkeimmillaan 24 tuntia kerta-annoksen jälkeen gammasäteilyn vaihteli 2,5-20 Gy, ja palaavat normaalille tasolle 72 tuntia. Yhteenvetona, nämä tutkimukset osoittivat, että ionisoiva säteily voi vaikuttaa tasot HERV-K-transkriptien soluissa, ja nämä vaikutukset vaihtelevat eri soluissa. Muutokset HERV-K transkriptipitoisuuksissa saattaa vaikuttaa useita biologisia prosesseja soluissa, ja tulevaisuuden tutkimuksen ionisoivan säteilyn HERV-K on tavoittelemisen arvoinen.

Citation: Agoni L, Lenz J, Guha C ( 2013) Variant jatkaminen ja ionisoivan säteilyn vaikutuksen ihmis- endogeeninen retrovirus K (HERV-K) transkriptejä Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (10): e76472. doi: 10,1371 /journal.pone.0076472

Editor: Robert Belshavv Plymouth University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 27 elokuu 2013; Julkaistu: 18 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Agoni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat NIBIB 1 R01 EB009040 (CG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ionisoivan säteilyn (IR) endogeenisten retrovirusten (ERVs) ovat suurelta osin tuntemattomia. DNA genomit ERVs on integroitu genomiin vastaanottavan lajien seurauksena tartuntojen ituradan solujen yli evoluution ajan. Tähän mennessä ionisoivan säteilyn ERVs on tutkittu vasta hiirillä [1], jossa se on ollut tiedossa jo vuosikymmeniä, että ionisoiva säteily voi aktivoida hiiren -endogeenisten (MERVs) [2] – [4]. Ionisoivan säteilyn vaikuttaa myös immuunivasteiden syöpäsoluja, ja yhdessä tutkimuksessa havaittu CD8 + T-solut ovat reaktiivisia kohti Merv antigeenin hiiren säteilytettyä paksusuolikarsinooma malli [5]. Siten on todennäköistä, että ionisoivan säteilyn endogeeninen retrovirus ilme saattaisi vaikuttaa immuunivasteen kasvainsoluja kohtaan.

Ionisoiva säteily on raportoitu lisäävän transkriptionaalista aktiivisuutta monia viruksia, kuten CMV [6], [7 ], HPV [8] ja HIV [9], [10] infektoiduissa soluissa. Molekyylitason mekanismit ovat vielä suurelta osin tuntemattomia, vaikka HIV, IR on raportoitu lisäävän transkription kautta LTR promoottoriaktivoinnilla [9], [10]. Kliinisellä tasolla, tutkimukset ovat osoittaneet odottamattoman suuren uudelleenaktivointi määrä piilevän HBV-infektion maksasolukarsinoomassa sädehoidon jälkeen [11]. HPV tartunnan saaneiden solujen, lisääntynyt tuotanto E6 /E7-transkriptien ja proteiinien on osoitettu, y-säteilytys [8]. Tällä kliinisellä tasolla, lisääntynyt sytotoksiset lymfosyytit (CTL) HPV-E6 /E7-antigeenit on havaittu kohdunkaulan syöpäpotilailla sädehoidon jälkeen [12]. Lisäksi vaikutukset tasoja viruksen ilmaisun, ionisoivan säteilyn tiedetään moduloivan immuunivasteita syöpää vastaan ​​[13] – [15].

Endogeeniset retrovirukset ovat genomissa läsnä jokaisen solun yksittäisen ja voi olla tavoitteet immuunivasteiden kaltaisia ​​vastaan ​​MERVs [16]. Sekä T- ja B-lymfosyyttien vasteita on havaittu myös ihmisen endogeenisen retrovirukset (HERVs) [17] – [21]. Selkeimmin immuunivaste on havaittu vastaan ​​viimeksi hankittu joukko retrovirusten ihmisen genomin, HERV-K [18], [19], [22], [23]. HERVs olemassa ihmisen genomin muodossa integroitujen retrovirus-DNA-genomit kutsutaan proviruksia. Yhdessä ne ovat arvioidaan muodostavan noin 8% ihmisen genomin [24]. Koska valinta paineita isäntä pitää nämä proviruksia ehjä muodossa, mutaatiot väistämättä kertyy heidät evoluution ajan ja lopettanut virusgenomin osia ja inaktivoimalla virusinfektiivi-. HML2 alatyyppi HERV-K on ainoa retrovirus tulleen genomiin ihmisen linjaa, koska eroavuus ihmisen ja simpanssin suvusta esiintyi noin 6 miljoonaa vuotta sitten [25] – [31]. Koska se on viimeksi asetettu, HERV-K HML2 on kaikkein ehjä sarja retrovirusten ihmisen genomin [25], [32] – [39]. Siitä huolimatta mikään yksittäinen HERV-K proviraalinen lokuksen tiedetään, että on täysin toimiva ja pystyy tuottamaan infektiovirionien, vaikka rekombinaatio joukossa loci nykyisten tänään ihmisen genomin voisi palauttaa virusinfektiivi- [37]. Monet HERV-K provirusten ovat riittävän ehjänä koodaavat proteiineja, jotka voivat säilyttää joitakin toimintoja [25], [35], [36], [38], [39], ja näiden proteiinien ilmentymisen on ehdotettu korreloivan sairauksien kuten syövän [40] – [44].

HERV-K transkriptoidaan vaihtelevassa määrin useissa ihmisen sairauksia kuten syöpää [20], [45] – [48], HIV-infektio [18], [49 ] – [51] ja autoimmuunisairauksiin [52], [53]. Yksittäiset HERV-K lokusten ihmisen perimässä eroavat eheyden erityisten avoimen lukukehyksen, toimivuus koodatut proteiinit, eheys cis-vaikuttavan elementtejä, ja mahdollisesti kapasiteetin DNA-sekvenssit reunustavat virus-DNA vaikuttaa transkriptioon. Ne vaihtelevat noin 97 yli 99% identtinen pairwise vertailu toisiinsa, ja monet eri joukossa ovat yhden emäsparin muutoksia. Siksi tunnistamaan erityiset HERV-K lokusten ilmaistuna ihmisen näytteen ja ymmärtää perusteellisesti biologisen roolin HERV-K ihmisen sairauksiin, jos lainkaan, on tarpeen sisällyttää analyysiin viruksen transkriptien on yhden nukleotidin taso missään tutkimuksessa ne [54]. Olemme aikaisemmin havainneet HERV-K transkriptien eturauhassyövän solulinjoissa ja havaittiin, että jotkut transkriptit saumattu epätavallinen asemissa viruksen genomissa [55]. Havaitseminen variantti silmukoinnin HERV-K transkriptien eturauhassyövässä linjat oli odottamaton. Tässä raportissa nukleotidi- perustuva analyysi erityisten HERV-K lokuksen että transkriboidaan ja mahdollisuus epätavallinen silmukointivariantit laajennettiin myös muunlaisiin syöpäsolun linjat. Testasimme myös oletusta, että ionisoiva säteily voi muuttaa tasoja ihmisen endogeeninen retrovirus K selostukset. HERV-K-proteiinien tiedetään olevan tavoitteet sekä T- ja B-lymfosyyttivasteiden [17] – [21], [46]. Ensimmäisenä askeleena kohti onko HERV-K antigeenejä saattavat joutua säteilytys aiheuttama modulaatio ja kenties muodostavat Ehdokaskohteiden kasvaimia, T-solujen immunoterapian syövän annon ionisoivaa säteilyä, me tutkimme, ionisoiva säteily vaikuttaa tasot of HERV-K transkriptien erilaisissa syöpäsolulinjoissa.

tulokset

HERV-K Transcription syöpäsolulinjoissa

HERV-K transkriptio on raportoitu esiintyvän ihmisen syövän . Kuitenkin vaste HERV-K ionisoivalle säteilylle ei ole koskaan testattu syöpä- tai normaaleissa soluissa. Voit tarkistaa HERV-K transkription ja luoda vertailuperusviivan kokeissa IR, ensin suoritetaan käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) RNA eristettiin 13 syöpäsolulinjasta syöpään sivustoja tavallisesti käsitelty sädehoidon: eturauhanen, kohdunkaulan, pää niska, ja rinta. RT-PCR: t suoritettiin käyttäen alukepareja useista osista virusgenomin kuviossa 1. Alukkeet viruksen proteaasin (

pro

), polymeraasia (

pol

) olivat kykenee havaitsemaan silmukoimattoman virus-RNA, ja kirjekuori (

env

) geeni alukkeet pystyivät havaitsemaan sekä silmukoimattoman ja yksittäin saumattu env mRNA: t. Odotettu koko tuotteet havaittiin 12 solulinjoissa ulos 13 testattu

pro

ja

pol

amplikonien ja 11 solulinjoissa varten

env

amplikoni (kuvio . 2A). Parallel RT-PCR: t suoritettiin alukkeilla varten

GAPDH

geeni todentaa tarkasti vertailukelpoisia lastaus RNA kaikista näytteistä ja lastaus geelejä. Kontrollit ilman käänteiskopioijaentsyymiä varmistanut, että tuotteet tuotetaan RNA malleja eikä mahdollisesti pilaavaa genomista DNA (Fig. 2).

geneettinen kartta on HERV-K provirussekvenssejä (harmaa) työnnetään reunustavat isännän genomiin sekvenssit on näytetään 5 tai 6 emäsparin kohde monistetaan sekvenssi (TTS) merkitty mustat laatikot. Silmukoitu ensisijainen viruksen transkriptio, yksittäin-saumattu

env

mRNA ja kaksinkertaisesti-saumattu

rec

ja

NP9

mRNA: t on esitetty alla virusgenomin yhdessä yksittäin saumattu RNA [56], että ei tiedetä koodata mitä tahansa proteiinia. 3 ’poly (A) hännät on merkitty (AAAA). 292 nukleotidin poisto tyypin 1 HERV-K proviruksia kattavat pol-env risteyksestä näytetään (Δ292). Tyyppi 2 HERV-K proviruksia ja niiden selostukset sisältävät näitä nukleotidin. Kannat PCR parit näkyvät alareunassa kuten mustat nuolet kanssa nimet, joilla ne tunnistetaan koko paperi. Harmaa nuolet tunnistaa alukkeita käytetään sisäkkäistä PCR. Katkoviiva, kulma rivillä leikatusta intronisekvensseihin että 1X-env ja 2X-rec alukeparia suunniteltiin ylittämään. Käytetyn alukeparin kvantitatiivista RT-PCR: llä on myös esitetty (q-env).

RT-PCR suoritettiin havaita viruksen transkriptien viidessä eri asemissa HERV-K-genomin, joista kaksi poikki liittämiseen risteykset havaita RNA: t saumattu at tavanomaisella env mRNA liitoskohtaan (1x-env) ja rec mRNA pujontaliitosten. GAPDH RT-PCR suoritettiin samanaikaisesti ja toimi positiivisena kontrollina RNA eheyden ja lastaus vertailua. Tuotteet erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Genomi-kannat käytettyjen alukkeiden on esitetty kuviossa. 1. Parallel tarkastukset tehtiin ilman käänteistranskriptaasia (-RT) kontrolleina jättää DNA saastuminen. DNA kokomarkkerit näkyvät vasemmalla.

Nämä tiedot vahvistivat, että HERV-K transkriptit olivat läsnä useimmissa ihmisen syöpäsolun linjat testattu. Siellä oli muutamia tapauksia, joissa HERV-K RT-PCR-tuotteet ei havaittu (kuvio. 2). Yksi kohdunkaulan syövän solulinja, C33A, eivät tuottaneet RT-PCR-tuotteiden kanssa tahansa kolmesta alukeparia, vaikka se ei anna odotettua tuotetta varten

GAPDH

ohjaus vahvistusta (Fig. 2A). Yksi rintasyövän solulinjaa, MDA-MB-468, johdonmukaisesti jättänyt saadaan

env

amplikonin, vaikka

pro

ja

pol

tuotteet olivat läsnä (Fig. 2A ). Herkkyyden lisäämiseksi, sisäkkäisiä RT-PCR suoritettiin

env

amplikonin käyttäen alukkeita sijoitettu, kuten on esitetty kuviossa 1.

env

tuote havaittiin MDA-MB-468 rinta- syöpä linja, koska se oli 11 muiden linjojen (Fig. 3A). Kuitenkin vielä ollut mitattavia määriä C33A kohdunkaulan syöpäsoluja, mikä osoittaa, että silmukoimattoman ja yksittäin saumattu HERV-K RNA: t eivät olleet läsnä havaittavia määriä tässä solulinjassa. Parallel monistusreaktiot suoritettiin ilman käänteistranskriptaasia ja olivat kauttaaltaan negatiivisia, mikä osoittaa, että monistuksen oli peräisin RNA-templaattien eikä mitään potentiaalisesti saastuttavan genomista DNA: ta (Fig. 3).

Perättäiset PCR suoritettiin RT-PCR-tuotteiden kuviossa. 2 havaita viruksen transkriptien kolmella eri tehtävissä HERV-K genomin. Kaksi RT-PCR: ien rajat silmukoinnin risteyksissä havaitsemaan RNA: t saumattu at tavanomaisella env mRNA liitoskohtaan (1x-env) ja rec ja NP9 mRNA (2X-rec, 2X-NP9) pujontaliitosten. Tuotteet erotettiin elektroforeesilla. Genomi-kannat käytettyjen alukkeiden on esitetty kuviossa. 1. Parallel tarkastukset tehtiin ilman käänteistranskriptaasia (-RT) kontrolleina jättää DNA saastuminen. DNA kokomarkkerit näkyvät vasemmalla.

läsnäolo HERV-K saumattu Transkriptejä syöpäsolulinjoissa

Kun arvioidaan HERV-K transkriptien on riittävä eheys, että RNA: t ja jatkettavien, suoritimme RT-PCR poikki kahden viruksen tavanomaisen liitoksen liittymissä. Useita saumattu HERV-K-mRNA: t on karakterisoitu [40], [56] – [58], mukaan lukien yksittäin saumattu koodaavan mRNA: n Env-proteiini, ja kolme kaksinkertaisesti saumattu-RNA: t, joista yksi koodaa Rec, ja toinen, joka koodaa NP9 (kuvio . 1). HERV-K HML2 provirusten olemassa kahta eri tyyppiä kutsutaan tyypin 1 ja tyypin 2, riippuen siitä, 292 emäsparin jakso nukleotideja, on läsnä (tyyppi 2) tai poistetaan (tyyppi 1). Tyypin 1 proviruksia, poisto poistaa aminoterminaalisen-koodausta osa

env

ja

rec

ja aiheuttaa kehyksessä fuusio

pol

ja

env

avointa lukukehystä (Fig. 1). Sitä vastoin tyypin 2 proviruksia, karboksiterminaalipäästä-koodausta osa

pol

ja että aminopäät

env

ja

rec

ovat täysin läsnä. 3 ’silmukoitumiskohta (3’SS) varten

env

mRNA ja ensimmäisen intronin

rec

mRNA sijaitsee ylävirtaan 292 emäsparin venyttää, mutta 5’SS toisen intronin on

rec

mRNA sijaitsee sisällä 292 emäsparin (Fig. 1). Siten tyypin 1 proviruksia eivät synnytä

rec

muodossa kaksinkertaisesti saumattu RNA (Fig. 1) tai koodata Rec proteiinia.

Käyttämällä alukkeita suunniteltu havaitsemaan yksittäin-saumattu

env

mRNA (1X-env, Fig. 1) ja kaksi pujontaliitosten in kaksoislaimennettu saumattu

rec

tai

NP9

mRNA: t (kutsutaan 2X-rec, Fig. 1), 11 ulos 13 solulinjojen havaittiin olevan positiivinen kanssa 1X-

env

alukkeita, ja 10 ulos 13 tuotti tuotteiden 2X-rec alukkeita (Fig. 2B). Havaitseminen saumattu tuotteiden myös lisänäyttöä siitä, että RT-PCR tuotteet on johdettu itse asiassa peräisin viruksen koodaama RNA: ita eikä mitään potentiaalisesti saastuttavan solun genomista DNA. Havaitseminen Erikokoisia tuotteiden kanssa 1 X-env alukkeiden oli odottamaton.

Jos haluat varmistaa, että odottamaton koko bändit olivat peräisin HERV-K RNA: ita ja saavutetaan parempi tarkkuus PCR-tuotteiden bändit agaroosigeelielektroforeesilla teimme sisäkkäisiä PCR (kuvio 1). Useita vyöhykkeitä havaitaan taas, ja tuotteita ei havaittu ilman käänteistranskriptaasia, mikä vahvistaa, että ne olivat peräisin saumattu virus-RNA: iden (Fig. 3). PCR-tuotteet tunnistettiin 1X-env amplikoni 12 ulos 13 solulinjojen ja nauhat kolmea eri kokoa havaittiin, jossa suhde intensiteetti kolme kaistaa vaihtelee kesken eri linjat. Useita koko tuotteet havaittiin myös 2X-rec amplikoni, kuten heikko bändi noin 500 emäsparia ja näkyvä kaista noin 250 emäsparia. Molemmat PCR-tuotteet olivat läsnä MDA-MB-468-rintasyöpäsolujen, mikä osoittaa, että jatkettuja virus-RNA oli läsnä tässä solulinjassa. Sillä C33A kohdunkaulan syöpäsoluja, kumpikaan sisäkkäisiä tuotteiden saumattu RNA havaittiin, mikä vahvistaa puuttuminen havaittavissa HERV-K transkriptien tässä solulinjassa. Tämä analyysi myös havaittu läsnäolo NP9 selostukset viidessä linjojen (Fig. 3).

tunnistaminen Yksittäiset HERV-K Active Loci

Syynä havaitsemiseksi useiden koko bändejä RT-PCR: istä kuvioiden 2B ja 3, etenkin 1X-env RT-PCR: t, oli epävarma. Yksi mahdollisuus oli, että he voisivat heijastaa ainutlaatuista poistot tai lisäykset, jotka olivat kertyneet tietyillä HERV-K lokusten yli evoluution ajan johtaen muuttuneeseen koko selostukset, ja nämä erityisesti lokuksille niitä transkriboidaan käytetyt solulinjat. Toinen oli, että liitoskohdat käytetään vaihtelevia keskuudessa yksittäisten HERV-K lokusten ihmisen perimässä, mikä johtaa eri kokoa tuotteita. Erottamaan nämä hypoteeseja ja tunnistaa erityiset loci josta selostukset alkunsa, PCR-tuotteet kuvassa 2 sekvensoitiin. Tämä edellytti analyysi transkriptien nukleotiditasolla, koska provirusten ovat niin lähellä toisiaan. Vaikka yksittäiset proviruksia kerääntyä ainutlaatuinen mutaatioita ajan evoluution ajan, jotkut HERV-K proviruksia ihmisen perimässä on niin uutta, että ne ovat yli 99% identtisiä, ja identtisyyden taso voi vaihdella eri puolilla virusgenomin. Proviruksia jotka muodostivat aiemmin ajoissa ovat muuttuneet vähitellen toisistaan. Sekvensointi riittävän pitkä PCR-tuotteita voidaan päätellä tietyn virus- loci jotka parhaiten vastaavat selostukset, vaikka erot ovat alle nukleotidi 100 kahden erityisesti proviruksia ja RNA-transkriptien niistä. Taulukossa 1 luetellaan 23 eniten ehjä HERV-K HML2 provirusten ihmisen genomissa, johon sekvenssejä verrattiin [39].

Aluksi

pro

,

pol

ja

env

PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan. Eräs esimerkki

pro

sekvenssit neljästä solulinjojen linjassa monien suhteellisen ehjä HERV-K provirusten ihmisen genomissa on esitetty kuviossa 4. Vertailu sekvenssien osoitti, että HERV-K-transkriptien havaitsimme täsmäsi näiden yhteinen ihmisspesifiset proviruksia, jotka osoittavat niiden johdettu ainakin pääasiallisesti peräisin osajoukko HERV-K HML2 proviruksia jotka muodostivat jälkeen ihmisen ja simpanssin suvusta erosivat. Muihin asemiin, oli useita toissijaisia ​​huiput sekvensointi kromatografit, mikä osoittaa, että PCR-tuotteet olivat peräisin seoksista selostukset useista loci. Taulukossa 1 on yhteenveto kaikkein hallitseva nukleotidin ( ”useita”, taulukko 1) kussakin niissä paikoissa, joissa useita nukleotideja yksiselitteisesti havaittu sisällä

pro

amplikoneja. Vaikka tämä parhaiten sovitettu proviruksen HERV-K102 (Taulukko 1), ei ollut mahdollista havaita tämän analyysin avulla, onko tämä provirus on itse asiassa puhtaaksi, koska se oli myös todennäköistä, että useat sekvenssi seos puhtaaksi provirusten vain sattumalta Hyväksytty tämä provirus. Sekvenssi seokset vaihtelivat jonkin verran kesken eri solulinjoissa (taulukko 1), ja havaittiin samalla muiden osien virusgenomin (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka oivalluksia, jotka voidaan saatu suora sekvensointi RT-PCR tuotteet olivat siten rajalliset, seokset se osoitti, että useita proviruksia litteroitiin kesken eri syöpäsolulinjoja.

alemman paneelin HERV -K täyspitkä proviruksia Vertailuun käytettiin tunnistamaan loci on peräisin mRNA-transkriptien näkyvät. Vasemmalla, suuret oksat säilynyt hominoids esitetään yhdessä arvioidut ajat niiden haarautumisen perintölinja johtavan modernin ihmisille miljoonia vuosia sitten (Ma). Proviruksia että lisätään täsmälleen ortologiset asemissa ihmisten ja muiden hominoids, ja ovat siten identtisiä syntyperän, on merkitty.

tutkia tarkemmin mikä HERV-K loci litteroitiin, seokset RT-PCR erotettiin yksittäisiksi sekvenssit kloonaamalla plasmidivektoreissa. Tämä myös sallittua tutkimus mikä osuus useiden koon tuotteet (kuviot. 2 ja 3). 1X-

env

RT-PCR-tuotteiden (Fig. 2A) on haulikon kloonattiin plasmidivektoreihin. Sillä 1X-env tuotteet, kaksikymmentäneljä yksittäistä kloonia kustakin solulinjasta määritettiin PCR-seulonnalla koon määrittämiseksi kloonatun amplikonin. Eri näytteiden, 4-13 kloonit valittiin sekvensointiin, ja tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Kloonit valittiin käsittämään joukko erikokoisia tuotteita jokaisen rivin, ja näin ollen, kuinka monta kertaa tahansa sekvenssi saatiin ei heijastaa sen suhteellinen runsaus joukossa HERV-K transkriptien kussakin solulinjassa. Lisäksi laajuus sekvensointi rajoittui katsomalla yleisimpiä tuotteita, ja on todennäköistä, että vähemmän runsaasti puhtaaksi proviruksia ei havaitse tätä analyysia.

Nämä analyysit tunnistettu yhteensä kuusi erilaista yksittäisten HERV-K lokusten joukossa 12 solulinjoja (taulukko 2). Kaksi näistä oli HERV-K102 ja HERV-K108 (jatkossa proviruksia tunnistetaan yksinkertaisesti K102, K108, jne.). Yhdessä kolmasosa provirus, K (I), näitä havaittiin useita solulinjoja (taulukko 2). RT-PCR-tuotteet havaittiin myös kolme ylimääräistä provirusten, K107, K111 ja K117 yhden tai muutaman solun riviä. Transkriptien useista provirusten havaittiin useimmissa linjat. On todennäköistä, että laajempi sekvensointi kloonien määrän lisäämiseksi HERV-K loci havaittu. Viisi loci josta virus transkriptit havaittiin olivat ihmisspesifiset HERV-K proviruksia, joka vahvistaa, että havaitut transkriptit pääosin johdettu osajoukko HERV-K HML2 proviruksia jotka muodostivat jälkeen ihmisen ja simpanssin suvusta erosivat. Näin useimmin havaittu HERV-K saumattu

env

transkriptien ihmisen syövän solulinjat on johdettu viimeksi hankittu alijoukon retrovirusten ihmisen genomin.

Alternative jatkaminen Individual HERV- K Active Loci

sekvensointi 1X-env RT-PCR-tuotteiden osoitti liitos odotettuun tehtävissä HERV-K genomin, mutta yllättäen, myös osoitti selostukset saumattu lisämaksua sivustoja (kuva 5). Tavanomainen sivustoja havaittiin tyypin 2 proviruksia, K108, K109, ja K (I), ja tyypin 1 proviruksia, K102 ja K117 (Fig. 5). K108 on yksi ehjä proviruksia ihmisen perimässä ottaa täyspitkä avointa lukukehystä kaikille virusproteiineja [25], [35], ja tavanomaisesti saumattu selostukset se havaittiin seitsemässä eri linjojen (Fig. 5). Kuitenkin neljän loci, K102, K (I), K117 ja K111, osoitti epätavallinen 1X-env silmukointivarianttien muodostettu vaihtoehtoisten 5 ’ja 3’ liitoskohdat. Vaihtoehtona silmukointikohtia, joita käytettiin vaihteli kesken eri proviruksia (Fig. 5). Ne, jotka havaittiin (Fig. 5) joissakin tapauksissa vastasivat konsensus signaalit suuria tai pieniä spliceosomes, kun taas muissa tapauksissa ne eivät (Fig. 5). Useimmat vaihtoehtoisesti liitettyjä transkriptien olivat tyypin 1 proviruksia, mutta yksi heistä, K (I), oli peräisin tyypin 2 provirus. Siten vaihtoehtoinen silmukoitumiskohta käyttö ei pelkästään seurausta puuttuessa 292 emäsparin. K111 on vanhempi provirusta joka muodostuu ennen divergenssi gorilla sukua ihmisen-simpanssin linjaa noin 8 miljoonaa vuotta sitten [25], [59], mutta muut proviruksia josta saumattu transkriptit havaittiin tässä ovat ihmisen erityisiä.

5 ’ja 3’ erissä HERV-K provirussekvenssejä näkyvät yläosassa erottaa /ja /. 5’SS ja 3’SS osoittavat tavanomaisen silmukointipaikoista of HERV-K, ja niiden sijainnit on merkitty mustalla piireissä. Kannat ulomman PCR-alukkeiden, joita käytetään sisäkkäisiä PCR on esitetty nuolilla. Rakenteet env saumattu RT-PCR-tuotteiden solulinjojen ja provirusten ilmoitettuja kaaviona alla virusgenomin. Katko- taittuvat linjat osoittavat irrotettiin intronit. Punaiset ympyrät osoittavat kantojen sekvenssit jossa epäsovinnainen liitos tapahtui. Kunkin saumattu tuotteen yläosassa sekvenssi on esitetty päätelty primaarinen transkriptin sekvenssi määritettiin, että on sukulais genomisen lokuksen, ja pohja-sekvenssi on esitetty sekvenssin RT-PCR-tuote. Red nukleotidit yhdistettiin vuonna saumattu tuotteen. Harmaa nukleotidit osoittavat päät leikatun intronisekvenssit. Asema 292 nukleotidin deleetio lopullisen tyypin 1 provirusten on esitetty.

solulinjoja, jotka toissijaisesti 1X-env liitoskohdat havaittiin on esitetty taulukossa 2 ja kuviossa 5. K102, sama vaihtoehtoinen silmukointikohdista havaittiin kuudessa eri solulinjoissa, ja K117, samoissa kohteissa havaittiin kaksi (Fig. 5). Tämä viittaa siihen, että sekvenssit spesifisten kopioiden (ja provirusten, josta ne on johdettu) määritettiin vaihtoehtoisen silmukointikohdan käytön. Vaihtoehtoisesti silmukoituneet transkriptit havaittiin useimmissa solulinjojen, ja joissakin tapauksissa, sekä tavanomaisten että vaihtoehtoisten silmukointikohtien havaittu erityistä provirusten (K102, K (I), ja K117). On epäselvää, tämän analyysin onko solujen luonteesta osaltaan liittämiseen kuvioita havaittu. Yhteenvetona, toissijaisesti liitoskohdat havaittu osuus eri kokoa bändejä havaittu RT-PCR-reaktioissa poikki 1X-env liitoskohtaan (kuviot. 2 ja 3). Kuitenkin usein havaitseminen niiden ja vaihtelua eri HERV-K proviruksia olivat odottamattomia, ja mahdolliset molekyylibiologisia ne perustuvat oli tuntematon.

sekvensointi erikokoisten tuotteiden myös toteutettu PCR: t suoritettiin alukkeet havaita kaksinkertaisesti saumattu RNA: t (tuloksia ei ole esitetty). Mitä vähemmän näkyvästi, noin 800 emäsparin tuote (Fig. 2B) vastasi tavanomaisesti saumattu

rec

mRNA. Sisäkkäiset PCR vahvisti läsnäolo rec mRNA 9 13 solulinjojen (Fig. 3). Lisäksi sekvensointi osoitti, että merkittävä pienempi kaistalla kuviossa 2B vastasi RNA-liitetään päässä 5’SS ylävirtaan

gag

on 3’SS alavirtaan toisen intronin

rec

mRNA . Tätä RNA: ta, on kuvattu aiemmin [57], mutta ei tiedetä koodata mitä tahansa proteiinia.

Ionisoiva säteily (IR) Lisää HERV-K Transkriptio Eturauhassyöpäsolulinjat

Todettuaan, että HERV -K oli transkriboidaan erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa, kysyimme ionisoivaa säteilyä voisi muuttaa tasoja viruksen transkriptien. Kvantitatiivinen, RT-PCR (qRT-PCR) suoritettiin RNA eristettiin 12 solulinjat, jotka osoittivat HERV-K transkription. Solut 50% konfluenssiin säteilytettiin yhdellä altistumisesta

137Cs lähde. Annokset γ-säteilytyksen vaihdeltiin 0, 2,5, 5, 10 tai 20 Gy, ja soluja kullakin annoksella kerättiin 1, 3, 8, 24, ja 72 tuntia säteilytyksen jälkeen. Käytetyn alukeparin suunniteltiin

env

, alavirtaan 292 nukleotidin deleetio, niin että se havaitsee sekä silmukoimattoman RNA ja yksittäin-saumattu env mRNA: ta (Fig. 1). Kukin koe suoritettiin kolmesti ja kolme RT-PCR rinnakkaista tehtiin kullekin biologisten toistojen.

Useimmat solulinjat mukaan lukien kolme kohdunkaulan syövän riviä testattu, kolmen pään ja kaulan kasvaimia, ja kolme rintasyövän linjat ole havaittavissa merkittäviä eroja tason HERV-K-kopioita tahansa annoksen ionisoivan säteilyn ja milloin tahansa vaiheessa (Fig. 6). Kuitenkin kaikki kolme eturauhasen syöpäsolulinjoissa osoitti merkittävästi kohonneeseen HERV-K-transkriptien (Fig. 6). Korotukset kolmen eturauhassyövän solulinjoissa oli ilmeisintä 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. Tasot viruksen

env

RNA 24 tuntia lisättiin kaksin- kahdeksankertaiseksi verrattuna säteilyttämätöntä soluihin. Non-parametrinen, Wilcoxonin allekirjoitettu rank suoritettiin vertaamaan mittausten kullakin annoksella gammasäteilyn kanssa 0 Gy, ja P-arvot on esitetty taulukossa 3. Kaikki lisäykset eturauhassyövän solulinjoissa 24 tunnin oli merkitsevä P-arvojen 0,01. Siten ne olivat kauttaaltaan merkittävästi näitä rivejä ja havaittiin kaikkina säteilyannoksia käytetty. Jotkut lisäykset näitä rivejä näkyivät joidenkin näytteiden 8 tunnin kuluttua säteilytyksen, mutta ei 3 tuntia. Kaikki kasvu oli ohimenevää, sillä 72 tuntia säteilytyksen jälkeisiin tasot HERV-K oli palannut perustasolle kaikkien annoksilla γ-säteilytys. Yleensä korkein induktio havaittiin 20 Gy, suurimman annoksen käytetty, joskin merkittävä kasvu havaittiin kaikilla annoksilla ja ei ollut selvää korrelaatiota erityinen annos ja kertainen lisäys keskuudessa eturauhassyövän solulinjoissa.

genominen kantoja käytettyjen alukkeiden on esitetty kuviossa. 1. Viisi eri ionisoivan säteilyn annoksia käytettiin (0, 2,5, 5, 10, ja 20 Gy), kukin levitetään yhtenä annoksena, näkyvät erivärisinä viidessä eri aikoina jälkeen γ-säteilytys (1, 3, 8 , 24, ja 72 tuntia). Kertainen muutos suhteessa 0 Gy kunakin ajankohtana saatiin normalisoinnin 3 taloudenhoito geenejä. Pylväät edustavat kolmen riippumattoman RT-PCR toistot suoritetaan jokaiselle kolmesta kokeesta. Virhe palkit osoittavat standardipoikkeamat.

Yksi neljästä rintasyöpä- solulinjojen (MCF-7) myös osoitti kasvua HERV-K RNA-tasot seuraavissa γ-säteilytys (Fig. 6) . Kinetiikka lisäys oli samanlainen kuin mitä havaittiin kolmessa eturauhassyövän riviä, kasvoi kuusinkertaiseksi havaittu 24 tunnin säteilytyksen jälkeen 10 Gy käsiteltyjen solujen. Sekä 5 ja 10 Gy annosta tuotti tilastollisesti merkitsevää (taulukko 3), ja kasvaa yli kaksinkertaiseksi havaittiin 8 ja 24 tunnin kuluttua useita erilaisia ​​annoksia γ-säteilytys, joka osoittaa, että oli vaatimaton vaikutus γ-säteilytyksen tätä linjaa.

Yhteenvetona tasot HERV-K-RNA: t huomattavasti ionisoivan säteilyn murto syöpä testatuista solulinjoista. Korotukset olivat ohimeneviä ja saavutti noin 24 tunnin kuluttua säteilytyksen. Tämä vaikutus havaittiin kaikissa kolmessa eturauhassyövän solulinjoissa testattu, mikä viittaa siihen, että HERV-K näissä soluissa voi olla erityisen herkkiä ionisoivalle säteilytys.

Keskustelu

pääasiallinen Tämän tutkimuksen tulokset olivat, että ionisoivan säteilyn nostivat HERV-K-transkriptien joissakin syöpäsoluissa, ja että sen vaikutukset vaihteli linjat testattiin. Erityisesti kaikki kolme eturauhassyövän linjat, jotka testattiin osoittivat merkitsevästi kohonneeseen HERV-K RNA: iden, joka oli suurimmillaan noin 24 tunnin kuluttua altistumisesta yhden annoksen γ-säteilytys ja sitten laantunut. Samanlainen nousu ja myöhemmin väheneminen havaittiin myös yksi kolmesta rintasyövän riviä.