Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hiirellä Double Minute 2 (MDM2) proteiini on keskeinen säätelijä solujen lisääntymisen ja apoptoosin, joka toimii ensisijaisesti estämällä p53 kasvaimia estävä. Samoin PI3-Kinase (PI3K) /AKT reitin on kriittinen kasvutekijä välittämiä solun eloonjäämisen. Lisäksi on raportoitu, että AKT voi suoraan fosforyloida ja aktivoida MDM2. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että IGF-1 up-regulation MDM2-proteiinin tasot PI3K /AKT-riippuvaisella tavalla. MTOR rapamysiinillä tai ilmaus vallitsevan negatiivisen eukaryoottinen initiaatiofaktoria 4E sitova proteiini 1 (4EBP1) mutantti proteiini, samoin kuin ablaatio eukaryoottisten initiaatiofaktoria 4E (EIF4E), tehokkaasti poistetaan IGF-1-välitteinen säätely ylöspäin MDM2. Lisäksi osoitamme, että rapamysiini estää tehokkaasti MDM2 ilmaisun ja herkistää syöpäsolut kemoterapiaa. Yhdessä tämä tutkimus paljastaa uuden mekanismin, jolla IGF-1 aktivoi MDM2 kautta mTOR polku, ja että farmakologisen mTOR yhdistettynä kemoterapia voi olla tehokkaampi hoidettaessa osajoukko syöpiä kätkeminen kasvoi MDM2 aktivointia.

Citation: Du W, Yi Y, Zhang H, Bergholz J, Wu J, Ying H, et al. (2013) Rapamysiini inhiboi IGF-1-välitteisen Up-asetuksen MDM2 ja herkistää syöpäsolut Kemoterapia. PLoS ONE 8 (4): e63179. doi: 10,1371 /journal.pone.0063179

Editor: Zhi-Min Yuan, University of Texas Health Science Center at San Antonio /Greehey CCRI, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16. marraskuuta 2012; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2013; Julkaistu: 30 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) avustukset (CA79804) ja National Key Basic Research Program (973 Program) Kiina (2012CB910700) ja ZX, ja Yhdysvaltain puolustusministeriö congressionally Suunnatun Medical Research Programs apurahan (W81XWH-10 -1-0161) JB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epänormaali aktivointi Hiiren Double Minute 2 (MDM2) on perustettu tärkeäksi aiheuttavana tekijänä ihmisen syövän kehittymisessä. MDM2 toimii ubikitiinipromoottori E3 ligaasilla helpottaa hajoamista p53, avainsäätelijä varten solujen lisääntymisen, apoptoosin ja vanhenemista vastauksena cellular korostaa kuten DNA-vaurioita ja kasvaimia synnyttävän stressi [1]. Monistaminen

MDM2

-geeni on havaittu erilaisissa ihmisen kasvaimia ja syöpiä, mukaan lukien pehmeän kudoksen kasvaimia, osteosarkooma, ja ruokatorven karsinooma [2]. Erityisesti, MDM2 on osoitettu olevan p53-riippumattoman onkogeenisen toiminnot [3], [4]. Työ meiltä ja muut ovat osoittaneet, että MDM2 voi kohdistaa ja estää retinoblastoomaproteiinia (Rb) kautta proteasomin välittämää hajoaminen [5], [6], [7], [8], [9]. MDM2 on myös osoitettu monimutkainen ja säädellä proteiinin stabiiliuden ja /tai aktiivisuutta osajoukko proteiineja, jotka liittyvät soluproliferaatioon ja solukuoleman, mukaan lukien p73 [10], [11], E2F1 [12], sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori p21 [13], beeta-arrestin, ja G-proteiiniin kytketty reseptori-kinaasi 2 (GRK2) [14], [15].

on osoitettu, että MDM2-proteiinin solunsisäisen sijainnin ja proteiinin toimintoja moduloidaan PI3 -Kinase (PI3K) /AKT-reitin. AKT voi suoraan fosforyloida MDM2 at Ser166 ja Ser188, mikä helpottaa tumaansiirtymiseen [16] ja p53 hajoamista sekä p300 vuorovaikutusta [17], [18]. Lisäksi, yliekspressio AKT on osoitettu vakauttamaan MDM2-proteiinin [19]. Viime aikoina AKT on tullut kriittinen säätelijänä nisäkkäiden rapamysiinin kohde monimutkaisten 1 (mTORC1). AKT estää TSC2 /TSC1 monimutkainen, mikä johtaa aktivoitumiseen mTORC1 [20]. Tärkeää on, kehittyvien näyttöä siitä, että mTORC1 toiminta on kriittinen AKT onkogeenisten toimintoa. Todellakin, nopeutettu kasvaimen kasvua, kun konstitutiivisen aktivaation AKT korjaantuu mTOR [21]. Samoin hiiret ilmentävät ihmisen AKT1 eturauhasen kehittää kasvainilmiasua, joka on täysin kumottu mTOR [22]. Lisäksi inaktivointi AKT johtaa soluproliferaation inhibointi, joka on riippuvainen mTORC1 [23]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että AKT-mTOR-reitti on ratkaisevan tärkeää kasvaimen solujen kasvua.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 (IGF-1) up-regulation MDM2 ilmaisun kautta AKT-mTOR polku. MTOR mukaan rapamysiini, ilmaus määräävän negatiivisen eukaryoottinen initiaatiofaktoria 4E sitova proteiini 1 (4EBP1) mutantti tai vaiennettu eukaryoottisten initiaatiofaktoria 4E (EIF4E) tehokkaasti kumota IGF-1-välitteinen säätely ylöspäin MDM2. Lisäksi osoitamme, että rapamysiini estää tehokkaasti MDM2 ilmaisun ja herkistää syöpäsolut kemoterapeuttisen lääkkeen aiheuttamista apoptoosin.

Tulokset

IGF-1 indusoi MDM2 Expression on PI3K-riippuvaisella tavalla ja ei Alter MDM2 proteiini vakaus- tai Vakaan tilan mRNA-tasojen

Olemme aiemmin osoittaneet, että IGF-1 moduloi sykliiniriippuvaisen estäjä p21 vaikuttavan solujen selviytymistä upon genotoksinen stressi [24]. Koska IGF-1: n tiedetään aktivoida PI3K /AKT-reitin, olimme kiinnostuneita roolin selvittämisessä PI3K /AKT IGF-1-välitteisen solujen eloonjäämistä. Kuten kuviossa 1A, IGF-1 hoidossa seerumin puutteessa ihmisen osteosarkooma U2-OS-solut (p53 villityyppi) selvästi johtanut AKT aktivointia, mikä näkyy lisääntyminen AKT fosforylaation. Erityisesti, IGF-1 indusoi MDM2-proteiinin ilmentymistä, kuten on esitetty lisääntyminen sekä MDM2-proteiinin bändejä havaitun MDM2-spesifistä vasta-ainetta, SMP14, aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä [6], [9], [25]. Tämä vaikutus IGF-1: n MDM2 esti tehokkaasti käsittelemällä LY294002, selektiivinen PI3K-inhibiittori [26], mutta ei PD98059, inhibiittori MAP-kinaasin kinaasi (MEK), tai SB203580, spesifinen inhibiittori p38 stressiin aktivoitu proteiinikinaasi [27]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että IGF-1 up-regulation MDM2-proteiinin ilmentymistä kautta PI3K-AKT signalointikaskadissa.

(A) U2-OS-soluja pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja sitten esikäsitelty joko PI3- kinaasi (PI3K) estäjä LY294002 (20 uM), MAP-kinaasin kinaasi (MEK) estäjä PD98059 (25 pM), tai p38 stressi-aktivoitu proteiinikinaasi-inhibiittori SB202190 (10 uM) neljän tunnin ajan, minkä jälkeen seuraa käsittely IGF-1 (50 ng /ml) kuuden tunnin ajan. Solut hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi. (B) H1299-soluja pidettiin seerumin puutteessa inkuboimalla ilman FBS: ää 24 tunnin ajan ja käsiteltiin IGF-1 kuuden tunnin ajan kuten on osoitettu. Solulysaatit altistettiin western blot-analyysi. S: lyhyt altistus; L: pitkän altistuksen.

Koska olemme aiemmin osoittaneet, että IGF-1 voi aktivoida p53, ja MDM2 on suora alavirtaan p53 tavoite [24], kysyimme, onko vaikutus IGF-1 on ilmaus MDM2 on riippuvainen p53. Käsittelimme p53-null ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä H1299-solujen IGF-1. IGF-1 kykeni silti indusoimaan MDM2-proteiinin ilmentymistä H1299-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 B), mikä osoittaa, että IGF-1-välitteinen säätely ylöspäin MDM2 on riippumaton p53.

Seuraavaksi me tutkimme, IGF-1 up-regulation MDM2-proteiinin tasot lisäämällä proteiinia vakautta. Kuten odotettua, IGF-1 kasvoi MDM2-proteiinin ilmentymistä (kuvio 2A). Kuitenkin, IGF-1 käsittely ei merkittävästi muuttanut MDM2-proteiinin puoliintumisaika, määritettynä käsittelemällä proteiini biosynteesin estäjän sykloheksimidin (kuvio 2A ja 2B) ja pulssi-chase kokeissa (kuvio 2C ja 2D). Sitten tutki IGF-1 indusoi MDM2 lisäämällä mRNA-tasoja. Kuitenkin kvantitatiivinen PCR (Q-PCR) analyysi osoitti, että MDM2 mRNA eivät vaikuta merkittävästi IGF-1 käsittely (kuvio 2E), mikä osoittaa, että IGF-1 ei vaikuta vakaan tilan mRNA-tasot.

( A) U2-OS-soluja pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ennen käsittelemällä IGF-1 (50 ng /ml) kuuden tunnin ajan. Sitten soluja käsiteltiin 50 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) läsnä ollessa tai poissa ollessa IGF-1 ja kerätty merkitty kertaa. Solulysaatit altistettiin western blot-analyysi MDM2 ja aktiini. (B) kvantitatiivinen analyysit MDM2-proteiinin tasoja soluissa, joita käsiteltiin CHX tehtiin densitometrisesti skannausta kunkin yksittäisen MDM2-proteiinin bändi ja vastaavat aktiini-proteiinin bändi. Suhde MDM2 yli aktiini nollan ajankohtana mielivaltaisesti asetettu 100 prosenttia. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta suoritettiin samanlaisia ​​tuloksia. (C) U2-OS-soluja käsiteltiin IGF-1 (50 ng /ml) kuuden tunnin ajan ja leimattiin metabolisesti

35S-metioniinilla neljäkymmentä minuuttia, ja sitten ajoivat kylmällä metioniinia. Solulysaatteja yhtä määrät radioaktiivisuutta immunosaostettiin SMP14 vastaisella vasta-aineella MDM2. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja visualisoitiin autoradiografialla. (D) Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin densitometrialla skannaus käyttämällä ImageQuant ohjelmistoa. (E) seerumia U2-OS-soluja käsiteltiin IGF-1 (50 ng /ml) kuuden tunnin ajan. MDM2-geenin ilmentymisen tasot määritettiin kvantitatiivisella-PCR (Q-PCR) ja normalisoitiin GAPDH ilmentymisen. Tiedot esitetään keinot ja SE kahden itsenäisen kokeen suoritettiin kaksinkertaisina.

mTOR mukaan Rapamysiini Blocks IGF-1- ja hereguliinin välittämän Up-regulation MDM2

AKT on on osoitettu olevan tärkeä säätelijä mTORC1 toimintaa. Siten tutkimme, onko mTOR polku on rooli IGF-1-välitteinen säätely ylöspäin MDM2. Tätä varten me seerumia ja sitten esikäsiteltiin U2-OS-solut rapamysiini, selektiivinen estäjä ja mTOR [28], ennen IGF-1 hoidossa. Kuten odotettua, rapamysiini esti fosforylaation ribosomaalisen proteiinin S6 (kuvio 3A). Erityisesti rapamysiini esti myös IGF-1 aiheuttama MDM2 ylössäätöä (kuvio 3A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin H1299 soluissa, jossa rapamysiini kumottiin IGF-1 aiheuttama MDM2 ylössäätöä ja fosforylaatiota 4EBP1 (kuvio 3B). Lisäksi ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen AKT (myristiinihappo-AKT) lisännyt MDM2-proteiinin tasoa, joka on täysin tukossa läsnä rapamysiiniä (kuvio 3C). Yhdessä nämä tiedot tukevat vahvasti käsitystä, että rapamysiini-herkkä reitti on kriittinen ylössäätöä MDM2 kautta IGF-1 /PI3K /AKT signalointi.

U2-OS (A) tai H1299 (B) soluja pidettiin seerumin puutteessa ja esikäsitellään rapamysiinin (50 nM) neljän tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten IGF-1 (50 ng /ml) kuuden tunnin ajan. Solut hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi. Kvantitatiivisia analyyseja MDM2-proteiinin tasot tehtiin densitometrisesti skannausta kunkin yksittäisen MDM2-proteiinin bändi ja vastaavat aktiini-proteiinin bändi. Suhde MDM2 yli aktiinin kontrollinäytteessä mielivaltaisesti asetettu 1,0. (C) U2-OS-soluja infektoitiin yhdistelmä-adenovirus, joka koodaa GFP tai myristiinihappo-AKT 24 tuntia ennen hoidon rapamysiiniä (100 nM) neljän tunnin ajan. Solulysaatit altistettiin western blot-analyysi.

Koska here- guliini voi aktivoida AKT, kysyimme, onko tämä ligandi voi säätää ylös MDM2 käytettäessä mTOR-riippuvaisella tavalla. MCF-7-soluja tai H1299-soluja pidettiin seerumin puutteessa ennen käsittelyä rapamysiiniä, ja sitten käsiteltiin hereguliini-beeta (HRG). Kuten on esitetty kuviossa 4A, aktivointi AKT signalointi HRG indusoitunut tehokkaasti MDM2-proteiinin ilmentymistä, joka esti kokonaan rapamysiini sekä MCF-7 ja H1299-soluissa (kuvio 4A ja 4B). Lisäksi PI3K estäjä LY294002 esti vaikutus HRG on ylössäätöä MDM2 (kuva 4B), mikä osoittaa, että hereguliinin välittämä lisäävä säätely MDM2 riippuu PI3K. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että rapamysiini-herkkä reitti vaaditaan säätely ylöspäin MDM2 IGF-1 tai here- guliini signalointireittejä.

(A) MCF-7-solut seerumin puutteessa ja esikäsitelty rapamysiinillä (50 nM) neljän tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten hereguliinin beeta (HRG; 25 ng /ml) 24 tunnin ajan. Solut hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi. (B) ilman seerumia H1299-soluja esikäsiteltiin rapamysiinin (50 nM) tai LY294002 (20 uM) neljän tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten hereguliinin beta (25 ng /ml) 24 tunnin ajan. Solulysaatit altistettiin western blot-analyysi.

ilmentäminen Mutant 4EBP1 Viallinen in mTOR fosforylaatio vaimentaa IGF-1-välitteinen säätely ylöspäin MDM2

Seuraava ratkaistava, onko EIF4E, merkittävä alavirran kohde mTOR, on mukana IGF-1-välitteinen säätely ylöspäin MDM2. Koska mTOR fosforyloi 4EBP1, jolloin sen irtaantuu EIF4E ja johtavat muodostumista translaation aloitus- kompleksi [29], käytettiin mutantti 4EBP1-5A, josta puuttuu viisi Ser /Thr-fosforylaatiokohdat kohteena mTOR ja toimii siten määräävän negatiivinen estäjä sitomalla elF4E estääkseen translaation aloittamista [30]. Tätä varten, H1299-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko villityypin 4EBP1 tai 4EBP1-5A, jonka jälkeen seerumistarvaatio ja IGF-1 hoidossa. Kuten kuviossa 5A, IGF-1 hoito johti jyrkkään nousuun fosforylaatioon AKT, S6 ja 4EBP1, korreloi selvästi lisääntynyt MDM2 ilme. Erityisesti ilmentyminen villin tyypin 4EBP1 ei merkittävästi muuttanut vaikutusta IGF-1 MDM2 ilmaisua, mikä johtuu todennäköisesti tehokas fosforylaation 4EBP1 in H1299 soluissa. Kuitenkin IGF-1-välitteisen MDM2 ylössäätöä merkittävästi inhiboi ektooppinen ilmaus 4EBP1-5A. Seuraavaksi jotta roolin tutkimiseksi EIF4E suoraan, me ablatoitu endogeeninen EIF4E käyttäen Sirna (siRNA) U2-OS soluissa. Vaikka hiljentäminen EIF4E ei merkittävästi vaikuttanut pohjapinta MDM2 ilmaisu (kuvio 5B), knockdovvn EIF4E kumosi kokonaan vaikutus IGF-1 lisäämiseen MDM2 tasolla, vaikka selvää 4EBP1 fosforylaatiota (kuvio 5C).

(A) H1299 -solut transfektoitiin ohimenevästi villityypin 4EBP1, 4EBP1-5A tai vektoriplasmidiin. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut jaettiin ja pidettiin vielä 24 tuntia ennen seerumin nälkään 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin kanssa tai ilman IGF-1 (50 ng /ml) kuuden tunnin ajan. Solut hajotettiin ja niille suoritettiin Western blot. Kvantitatiivisia analyyseja MDM2-proteiinin tasot tehtiin densitometrisesti skannausta kunkin yksittäisen MDM2-proteiinin bändi ja vastaavat aktiini-proteiinin bändi. Suhde MDM2 yli aktiinin kontrollinäytteessä (kaista 1) on mielivaltaisesti asetettu 1,0. (B) U2-OS-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti siRNA spesifisiä EIF4E (si4E) tai sekoitettua kontrollipeptidiä (siScr). Solulysaatit altistettiin western blotting, kuten on esitetty. (C) U2-OS-solut transfektoitiin si4E tai siScr pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ennen käsittelyä tai ilman 5 ng /ml IGF-1 kuuden tunnin ajan. Solulysaatit altistettiin western blotting, kuten on esitetty. (D) U2-OS-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti siRNA spesifisiä S6K (siS6K) tai salattu siRNA (siScr). Solulysaatit altistettiin western blotting, kuten on esitetty. (E) U2-OS-solut transfektoitiin siS6K tai siScr pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ennen käsittelyä tai ilman 5 ng /ml IGF-1 kuuden tunnin ajan. Solulysaatit altistettiin western blotting, kuten on esitetty.

Lisäksi fosforyloivaan ja estämällä 4EBP1, mTOR fosforyloi ja aktivoi ribosomaalisen proteiinin S6 Kinase (S6K), joka puolestaan ​​fosforyloi ja aktivoi ribosomaalisen proteiinin S6 lisäämiseksi proteiiniin käännös. Niinpä ablatoitu S6K siRNA U2-OS soluissa. Kuten kuviossa 5D ja 5E, havaitsimme samanlaisia ​​vaikutuksia kuin EIF4E Knockdown, mikä osoittaa IGF-1-välitteisen MDM2 ylössäätöä vaatii mTOR signalointia, joka liittyy sekä EIF4E ja S6K polkuja.

Rapamysiini hoito vähentää MDM2 Expression ja herkistää syöpäsolut doksorubisiinille indusoiman apoptoosin

Koska MDM2 on keskeinen negatiivinen säätelijä p53, joka on välttämätön DNA-vaurion indusoiman apoptoosin, tutkimme vaikutus rapamysiinin doksorubisiinin aiheuttaman apoptoosin p53-positiivisten syöpäsoluja. Valitsimme MCF-7-rintasyöpäsolut, koska ne satama somaattisen mutaation PIK3CA geenin, joka antaa konstitutiivisesti aktiivinen AKT-mTOR-reitin [31]. MCF-7-solut esikäsiteltiin rapamysiini, mitä seuraa käsittely matalan annoksen doksorubisiinia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla määrityksessä ja western blot-analyysi lohkaisemalla poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP), biokemiallinen markkeri apoptoosin. Näissä olosuhteissa, ei rapamysiini tai doksorubisiini yksin merkittävästi indusoi apoptoosia. Kuitenkin, kun läsnä on rapamysiini, doksorubisiinin tehokkaasti indusoi solukuolemaa (kuvio 6A). Erityisesti rapamysiini esti täysin ylössäätöä MDM2, mutta ei p53 (kuvio 6B). Samanlaisia ​​ilmiöitä havaittiin ihmisen osteosarkooma SJSA-1-soluissa, jotka tarjoavat sataman MDM2 vahvistus [25] (kuvio 6C ja 6D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että rapamysiini estää MDM2-proteiinin ilmentymistä, mikä johtaa herkistymistä syöpäsolujen doksorubisiinille solukuolema.

(A-B) MCF-7-soluja pidettiin normaalin kasvun media, esikäsitelty rapamysiini (100 nM) 48 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten doksorubisiinia (0,6 ug /ml) 24 tunnin ajan. Sekä kelluva ja kiinnittyneet solut kerättiin, ja altistettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä (A) ja Western blot-analyysillä (B). Solujen elinkelpoisuus on esitetty prosentteina elävien solujen yli koko solut laskettiin. Data esitetään keinot ja SE kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. (C) SJSA-1-soluja pidettiin normaalin kasvun media, esikäsitelty rapamysiiniä (100 nM) 48 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten doksorubisiini (1 ug /ml) 36 tuntia. Sekä kelluva ja kiinnittyneet solut kerättiin ja alistettiin western blot-analyysi. (D) morfologia SJSA-1-soluissa kirjattiin faasikontrastimikroskopiassa (100 x).

tutkimme seuraavaksi alas-säätely MDM2 näyttelee kausaalinen rooli herkistyminen solujen doksorubisiinin rapamysiinillä hoitoon. Käsittelimme U2-OS-soluja ja alfa-doksorubisiinin joko läsnä tai poissa ollessa ektooppinen ilmentyminen MDM2. Kuten kuviossa 7A, MDM2 ilmaisu dramaattisesti palautui lohkaista PARP tasoja, verrattuna soluihin, jotka ilmentävät vektoria ohjaus. Erityisesti MDM2 ilme vähennetään p53-proteiinin tasot sekä Ser15 fosforylaatio p53. Lisäksi MDM2 ilmaisu tehokkaasti pelastettiin indusoimaa solukuolemaa rapamysiini plus doksorubisiini hoitoa (kuvio 7B ja 7C). Nämä tiedot osoittavat, että inhibitio MDM2 ylössäätöä rapamysiinillä on suurelta osin vastuussa herkistävät solujen kemoterapeuttisen hoidon.

(A-B) U2-OS-solut transfektoitiin väliaikaisesti MDM2 tai vektorisäätö. Kaksikymmentäneljä tuntia post transfektioissa solut esikäsiteltiin rapamysiiniä (100 nM) 48 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten doksorubisiini (1 ug /ml) 36 tuntia. Sekä kelluva ja kiinnittyneet solut kerättiin ja alistettiin western blotting (A) tai virtaussytometria analyysi (B). (C) morfologia U2-OS solujen kirjattiin faasikontrastimikroskopiassa (100 x).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että IGF-1 up-regulation MDM2 proteiini tasoilla kautta mTOR-reitin, mikä lisää toinen kerros hienoa sääntelyn määrää MDM2-p53-reitin IGF-1 /AKT signalointiryöpyn. AKT on aikaisemmin osoitettu fyysisesti vuorovaikutuksessa ja fosforyloivat MDM2, mikä helpottaa MDM2 tumaansiirtymiseen [16]. Fosforylaatiota MDM2 parantaa MDM2 vuorovaikutusta p300, mikä lisää ubikitiini E3 ligaasin aktiivisuutta p53 ja helpottaa p53 ubikitinaatio ja hajoaminen [17]. Lisäksi, fosforylaatio MDM2 on Ser166 ja Ser188, jonka AKT on osoitettu vakauttaa MDM2-proteiinin estämällä sen itse ubikitinaation [19]. Kuitenkin on myös raportoitu, että AKT-välitteinen fosforylaation MDM2 ei näytä merkittävästi vaikuttavan MDM2 solunosasijaintia [18]. Siten vaikka on selvää, että AKT säätelee positiivisesti MDM2, tarkka molekyylitason mekanismit näyttävät olevan solujen tyypille ja kontekstisidonnaisia.

Aikaisemmat tutkimukset viittaavat siihen, että MDM2 voidaan säännellä translaation tasolla. Tehostettu käännös MDM2 on havaittu ihmisen choriocarcinoma solulinjoissa [32]. MDM2 mRNA sisältää erilliset 5 tulkitsemattoman alue (UTR), joka on rooli translaation tehokkuutta [33]. Lisäksi lisääntynyt MDM2 ilmentyminen indusoi BCR /ABL ilmentyminen liittyy parannettu MDM2 käännöksen takia sääntelyä 5’UTR MDM2 mRNA [34]. Lisäksi IGF-1 signalointia, joko knockout IGF-1-reseptorin (IGF-1 R) tai IGF-1 R-kinaasin estäjä, on osoitettu vähentävän MDM2 käännös välittyy sen 5 ’UTR [35]. Erityisesti on raportoitu, että hepatosyyttikasvutekijän (HGF) helpottaa MDM2 käännös kautta mTOR alkion hepatosyyteissä [36].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että molemmat IGF-1 ja hereguliinin signalointi aktivoi MDM2 kautta AKT -mTOR kautta. Tämä tutkimus osoittaa kaksi tärkeätä seikkaa. Ensinnäkin soluvasteita erilaisiin jännityksiä lähentämiseksi p53-MDM2-reitin, joka toimii Keski anturi stressiä. Toiseksi, on olemassa kaksi suurta sääntelymekanismeja moduloimaan MDM2-proteiinin tasot: p53-riippuvaisen transkription säätelyyn ja mTOR-riippuvaisen translaation ohjaus. Stressi signaaleja, mukaan lukien DNA-vaurioita, hypoksia, ravinteiden puutteesta ja oksidatiivisen stressin, aktivoida p53, joka puolestaan ​​kopiointia up-regulation MDM2 ilme. Kasvutekijä signalointi, toisaalta, aktivoi AKT-mTOR väylän parantaa MDM2-proteiinin käännös. Tämä herkkä sääntely MDM2 takaa p53 on tiukassa valvonnassa. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että EIF4E tai S6K ablaatiota eivät vaikuta merkittävästi MDM2 pohjapinta tasoilla. Kuitenkin hiljentäminen joko EIF4E tai S6K poistettu kokonaan IGF-1 aiheuttama MDM2 säätelyä ylöspäin. Nämä tulokset osoittavat, että mTOR koulutusjakson vaaditaan kasvutekijän välittämää MDM2 ylössäätöä.

mTOR käyttämällä erityisiä farmakologisia inhibiittoreita tuloksia G1 /S solusyklin pysähtymiseen, vaimennus solujen kasvua, ja apoptoosin [37 ]. Pre-kliiniset tutkimukset osoittavat, että rapamysiinin ja sen johdannaiset estävät syöpäsolujen kasvua ja proliferaatiota, mikä on osoitettu sekä

in vitro

ja erilaisissa ihmisen syövissä eläinmalleja käyttämällä [38]. Lisäksi todettiin, että mTOR edistää apoptoosin kautta translaation valvonta Mcl-1, BCL-2 kuten perheenjäsen [39]. Kuitenkin, useimmissa tapauksissa, mTOR ei yksin tehokkaasti apoptoosia; pikemminkin se herkistää solut apoptoottisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi rapamysiinin lisää kykyä sisplatiinin indusoimaan apoptoosia ihmisen promyelosyyttisen leukemian solulinjoja ja munasarjasyövän solulinjoissa [40]. RAD001, rapamysiini johdannainen, on osoitettu herkistää useita p53-positiivisten syöpäsolujen sisplatiinin indusoiman apoptoosin inhiboimalla p21-proteiinin ilmentymisen kautta tukahduttaminen yleisen käännös [41]. Lisäksi rapamysiini herkistyneet useita myeloomasolulinjoja deksametasonin: n indusoiman apoptoosin, joka liittyy vähentynyttä ilmentymistä sykliini D2 ja surviviini [42]. On myös raportoitu, että ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen mutantin 4E-BP1 jäljittelee vaikutus rapamysiinin apoptoosin tehostamiseksi useita myeloomasolujen, mikä viittaa siihen, että mTOR inhibiittorit herkistää soluja estämällä cap-riippuvaisten käännös [43]. Tämän mukaisesti käsite, pienet molekyylit, jotka kohdistuvat cap-riippuvaisten translaation aloituksen estämällä eIF4A voi palauttaa huumeiden herkkyys hiiren lymfooma malli [44].

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että rapamysiinin ja doksorubisiini yhdistelmähoito johti vähentää MDM2 ilmaisua, mikä johti lisääntyneeseen apoptoosin, epäilynalaisiksi että p53 voi olla mukana tässä prosessissa. Tuloksemme osoittivat, että doksorubisiini sääteli p53, odotetusti. Kuitenkin, kun taas rapamysiini /doksorubisiini hoito ei vaikuta merkittävästi p53-proteiinin tasoa, fosforylaatio seriinillä 15 p53 lisättiin, mikä viittaa siihen, että p53: n aktiivisuus indusoituu. Tärkeää on, ektooppinen ilmentyminen MDM2 päinvastainen apoptoosin, samanaikainen alentunut p53-proteiinin tasot ja seriinin 15 fosforylaatiota. Kuitenkin, MDM2 voi myös olla p53-riippumattoman toiminnot estää apoptoosia, kun läsnä oli doksorubisiinia /rapamysiinin yhdistelmähoitoon.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että rapamysiini herkistää syöpäsolut kemoterapeuttinen lääkkeen indusoiman apoptoosin ja ehdottaa, että mTOR -targeted syövänvastainen-terapia yhdistettynä kemoterapia voi olla tehokkaampi hoidettaessa p53-positiivisia syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture, lääkehoitojen ja Plasmidit

Ihmisen rinta MCF-7-soluissa, osteosarkooma U2-OS-soluja ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä H1299-solut ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 4,5 g /l glukoosia, johon on lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; sertifioitu, GIBCO) , 100 yksikköä /ml penisilliiniä (GIBCO), 100 ug /ml streptomysiiniä (GIBCO), ja 2 mM L-glutamiinia (GIBCO). Kaikki solulinjat siirrostettiin käyttäen 0,05% trypsiini-EDTA-liuosta (GIBCO). Soluja pidettiin kosteutetussa 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2 ilmakehässä. -Solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC). MCF-7, U2-OS tai H1299-soluja 60-70% konfluenssiin oli seerumia 24 tunnin ajan seerumittomassa DMEM ennen IGF-1 hoidossa. IGF-1 (Sigma) valmistettiin 100 ug /ml kantaliuoksesta vedessä. Kemialliset inhibiittorit LY294002, PD98059, SB202190 (Calbiochem), ja Rapamysiini (Sigma) valmistettiin, kuten on 1000 x kantaliuoksina. Doksorubisiini (Sigma) valmistettiin 2 mg /ml kantaliuosta. Hereguliini-beeta (Upstate) valmistettiin 20 ug /ml liuoksena PBS: ssä. UV hoito, media poistettiin ja solut säteilytetään kannet poistetaan on Spectrolinker XL-1000 UV Crosslinker (Spectronics Corporation). Säteilytyksen jälkeen media lisättiin ruokia ja soluja kasvatettiin kuten kutakin koetta varten ennen keräämistä sekä kelluvat ja tarttuneet solut.

adenovirusinfektio, ohimenevä transfektio ja RNA häiriöt

Solut at 60% konfluenssiin infektoitiin adenovirus, joka koodaa AKT tai vektorin ohjaus, ja inkuboitiin kaksi tuntia 37 ° C: ssa varovasti sekoittaen kahdeskymmenes minuutin välein, minkä jälkeen lisättiin viljelyalustaa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 24 tuntia. H1299-solujen 80%: n konfluenssiin tai U2-OS-soluja 50%: n konfluenssiin transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Media korvattiin kahdeksan (H1299) tai kuusi (U2-OS) tuntia transfektion jälkeen. Sirna vastaan ​​EIF4E (AAGCAAACCUGCGGCUGAUCU), S6K (GGACATGGCAGGAGTGTTT) ja salattu siRNA ohjaa spesifisiä kullekin siRNA oligonukleotidin ostettiin Shanghai GenePharma Co., Ltd. ja transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Western Blot analyysi

Solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen EBC

250 lyysipuskuria (250 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM NaF, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia , 2 ug /ml aprotiniinia, ja 2 ug /ml leupeptiiniä). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad). Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin, erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore), ja hybridisoitiin sopivan primaarisen vasta-aineen ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen myöhempää havaitsemista tehostetun kemiluminesenssin. Monoklonaalinen vasta-aine SMP14 spesifinen MDM2 (Santa Cruz) käytettiin 1:200 laimennuksen. Monoklonaalinen vasta-aine DO-1 spesifisiä p53 (Santa Cruz) käytettiin laimennoksena 1:250. Polyklonaalinen vasta-aine C-11 spesifinen aktiini (Santa Cruz) käytettiin laimennoksena 1:1000. Vasta-aineet ovat spesifisiä PARP (# 9542), fosfori-AKT (Ser473; # 9271), yhteensä AKT (# 9272), Phospho-S6 ribosomaalinen proteiini (seriini 235/236; # 2211), S6 ribosomaalinen proteiini (# 2217), S6 kinaasin (# 9202), EIF4E, Phospho-4EBP1 (Ser65; # 9456) tai 4EBP1 (# 9452) ostettiin Cell Signaling Technology ja käytetään 1:1000 laimennoksina.

virtaussytometria-analyysi

Solut trypsinoitiin, pestiin kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Solut värjättiin propidiumjodidilla (PI), jota oli täydennetty 80 ug /ml RNaasi A: ta 37 ° C: ssa tunnin ajan pimeässä. Sitten solut altistettiin virtaussytometria analyysi FACScan -virtaussytometrillä (Becton Dickson), ja tiedot analysoitiin käyttäen Cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickson).

Kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA uutettiin -soluihin käyttäen Tryzol mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Gibco). RNA käänteistranskriboitiin käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad). Reaktio suoritettiin myös ilman käänteistranskriptaasia toimimaan negatiivisena kontrollina. Q-PCR suoritettiin 25 ul reaktiotilavuuksissa (8 ng cDNA, 12,5 ui Taqman Universal PCR Master Mix, 1,25 ui Demand Gene Expression Reagent; Applied Biosystems) sekä MDM2 ja GAPDH. Q-PCR-reaktio suoritettiin ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Q-PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 10 minuuttia 95 ° C: ssa, jota seuraa 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja hehkutus /ulottuvat 60 ° C: ssa yhden minuutin ajan. Suhteellinen kvantitointi-arvot laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää.

solunelinkykyisyysmääritys

Sekä kelluvat ja tarttuvat solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Yhtä suuret tilavuudet trypaanisinisen väriliuos (0,4%, Gibco) ja solususpensiota sekoitettiin ja värjättiin viiden minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lukumäärät värjätään ja unstained solut laskettiin hemasytometriä. Vähintään 500 solua näytettä kohti laskettiin. Prosenttiosuus elinkelpoisuuden edustaa suhdetta värjäämättömiä soluja solua yhteensä. Opiskelijan

t-

testiä käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä ryhmien välisten erojen.

Kiitokset

Kiitämme tohtori J Lawrence (University of Virginia, Charlottesville, Virginia) varten pCMV4-4EBP1 ja pCMV4-4EBP1-5A plasmidit.