Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkea makrofagien tunkeutuminen on korreloi parannettu selviytymistä kolorektaalisyövässä (CRC). Kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM) pelataan kompleksi roolit kasvainten synnyssä, koska niiden uskotaan on sekä kasvaimen estämiseksi (M1 makrofagit) ja kasvaimen edistäminen (M2 makrofagit) toimintaa. Tässä olemme käyttäneet immunohistokemiallinen lähestymistapa asteen määrittämiseksi soluttautua makrofagien kanssa M1 tai M2 fenotyyppi kliinisistä näytteistä CRC suhteessa ennusteeseen, niin CRC yleensä, mutta myös alaryhmissä CRC määritelty mikrosatelliittien epävakaus (MSI) seulonta tila ja CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP). Yhteensä 485 peräkkäisen CRC näytteet värjättiin typpioksidisyntaasin 2 (NOS2) (merkitään myös iNOS) merkkiaineena M1 makrofagien fenotyyppi ja scavenger-reseptorin CD163 merkkiaineena M2 makrofagien fenotyyppi. Keskimääräinen soluttautuminen NOS2 ja CD163 ilmentävät makrofagit pitkin invasiivisia kasvain edessä oli puolittain määrällisesti arvioitiin käyttäen neljän arvostellaan asteikolla. Kaksi alatyyppiä makrofagien, näytetään M1 (NOS2

+) tai M2 (CD163

+) fenotyypit, kirjattiin. Havaitsimme merkittävän korrelaatio määrän NOS2

+ ja CD163

+ solut (

P

0,0001). Vahva käänteinen korrelaatio kasvaimen vaiheessa todettiin molempien NOS2 (

P

0,0001) ja CD163 (

P

0,0001) tunkeutuminen. Lisäksi potilaille kätkeminen kasvaimet erittäin soluttautunut NOS2

+ soluja oli huomattavasti parempi ennuste kuin soluttautunut muutamat NOS2

+ soluja, ja tämä havaittiin olevan riippumaton MSI seulonnan tila ja CIMP tila. Mitään merkittävää eroa löydettiin syöpää tautivapaalle ryhmissä CRC erilaisilla NOS2 /CD163 suhteet. Lopuksi, lisääntynyt tunkeutumisen makrofagien kanssa M1 fenotyypin kasvaimen katkaistaan ​​liittyy samanaikainen kasvu makrofageissa kanssa M2 fenotyyppi, ja vaiheessa riippuvaisella tavalla korreloi paremmin ennusteeseen potilailla, joilla on CRC.

Citation: Edin S, Wikberg ML, Dahlin AM, Rutegård J, Öberg Å, Oldenborg PA, et al. (2012) Distribution makrofagien kanssa M1 tai M2 fenotyypin Suhde Ennuste ja Molecular ominaisuudet peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (10): e47045. doi: 10,1371 /journal.pone.0047045

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 15 lokakuu 2012

Copyright: © Edin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Ruotsin Cancer Society (myönnä. CAN 2011/839, Palmqvist, www.cancerfonden.se), Swedish Research Council (myönnä. B03488901, Palmqvist, www.vr.se), huippututkimuksen Grant alkaen maakäräjien Västerbottenin, Ruotsi (myönnä. VLL-132981, Palmqvist), Cancer Research Foundation Pohjois-Ruotsissa (myönnä. AMP 09-619, Edin, www.cancerforskningsfonden.se), ja Tore Nilsons Foundation (Edin, www.torenilsonsstiftelse.nu). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tulehdussolut ovat läsnä tuumorin mikroympäristössä useimpien syöpien ja on raportoitu vaikuttavan miljöön inflammatoristen välittäjäaineiden ja soluproliferaation signaaleja, angiogeneesiä ja kudoksen uudelleen tavalla, joka voisi edistää syövän etenemistä [1] – [3 ]. Kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) ja niiden roolit kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden on keskusteltu useissa viimeaikaisissa arviot [4] – [8]. Yleensä TAMeja tavataan ja ympäröivän useimmat kasvaimet ja voi, kun se aktivoidaan, vapauttaa lukuisia tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa käyttäytymiseen kasvainsolujen ja muiden solujen kasvain strooman. Kyky makrofagien sopeutua ympäristöönsä on johtanut tunnistamiseen kaksi polarisoitunut fenotyypit makrofagien [7], [9]. Lyhyesti, klassisesti aktivoitu M1 makrofagit on tunnusomaista ilmentymistä typpioksidisyntaasin 2 (NOS2) (merkitään myös iNOS), samoin kuin monet pro-inflammatoristen sytokiinien (esim IL1B, IL6, IL12, IL23 ja TNF) ja ne on raportoitu on korkea bakterisidinen ja kasvaimia tuhoavaa kapasiteettia. Tärkeimmät toiminnot vaihtoehtoisesti aktivoida M2 makrofagit sijaan kaivella roskia ja edistää kudosten korjaamiseen, mutta niillä on myös immunosäätelyvaikutuksia toimintoja. Monet tekijät tuottaman M2 makrofagit toimivat hyväksi syövän etenemisen, stimuloiva kasvaimen kasvua, (esim epidermaalisen kasvutekijän (EGF), fibroblastien kasvutekijä 1 (FGF1) ja transformoiva kasvutekijä beeta 1 (TGFp 1), angiogeneesiä (esim verisuonen endoteelin kasvutekijä A (VEGFA)) ja matriisi remodeling (esim FGF1, fibriini ja matriisi metallopeptidases (MMP)). lisäksi M2 makrofagit tuottavat myös immuuni sääntelyn tekijöitä (esim IL10 ja TGFp 1), jotka vaimentavat immuunivastetta.

TAM usein havaittu olevan M2 fenotyyppi, ja ne on liitetty vähentynyt selviytymisen potilailla, joilla on esim melanooma [10], [11], rintojen [12], [13], munuaisen [14] ja virtsarakon syövän [15] , [16]. tämä ei kuitenkaan ole totta syövistä. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että lisääntynyt tiheys makrofagien CRC korreloi paremmin ennusteeseen [17] – [20]. Lisäksi mahasyöpä potilailla on todettu on parempi ennuste, jossa on suuri määrä TAMeja [21], [22]. tulokset eturauhasen [23], [24], keuhko [25] – [29] ja kohdun limakalvon syöpä [30] – [32] ovat kuitenkin ristiriitaisia. On yhä selvempää, että makrofagit voi olla erilaisia ​​rooleja kasvainten synnyssä riippuvainen kudosten ja syöpätyypin. On mielenkiintoista spekuloida, että erilaisia ​​rooleja makrofagit erilaisissa syövissä voisi käsittää vaihtelut tasapaino M1 ja M2 fenotyypit (kasvaimen ehkäisy vs. kasvain edistäminen) vetämänä tekijät kasvaimen mikroympäris- yksittäisten syöpiä. Siellä voisi olla myös vaihtelu tietyissä syöpätyyppeihin.

kulutustarviketta on aliluokitusta niiden mikrosatelliitti (MSI) asema ja CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP). Noin 15% CRC määritellään mikrosatelliitti epävakaa (MSI), fenotyypin vikojen aiheuttamia DNA mismatch korjaus, joka on toisin kuin mikrosatelliitti vakaa (MSS) CRC [33]. Yksittäisissä CRC, MSI on erittäin liittynyt CIMP [34]. CIMP voidaan luokitella CIMP-korkea tai CIMP-alhainen mukaan hypermetylation aseman CpG saarten joukko geenejä, jotka ovat metyloitumattomia normaalissa peräsuolen kudokseen tai CIMP-syöpäkasvain [35] – [38].

Tässä tutkimuksessa, jakautuminen eri alatyyppejä makrofagien evalutated 485 kliinisissä näytteissä CRC käyttäen typpioksidisyntaasi 2 (NOS2) merkkiaineena M1 makrofagien fenotyyppi ja sieppaajareseptori CD163 merkkiaineena M2 makrofagi fenotyyppi. Tunkeutuminen NOS2

+ ja CD163

+ solujen liittyi ennusteeseen viittaavia ja molekyylien muuttujat sekä ennuste, niin täydellinen CRC kohortti ja alaryhmissä CRC määritelty MSI seulonta tila ja CIMP tila. Voisimme päätellä, että suodattumista M1 makrofagien CRC liitetään soluttautua M2 makrofagien ja korreloi parantuneet eloonjäämisen vaiheessa riippuvainen tavalla CRC, ja että tämä on riippumaton MSI seulonnan tila ja CIMP tila.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

käsittely kudosnäytteistä ja potilastiedot tässä tutkimuksessa hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Uumajan yliopistollisessa sairaalassa (Regional Ethical Review Board Uumajassa), mukaan lukien menettelyä, jossa potilaat suullisesti antoivat tietoisen suostumuksen. Tämä suostumus dokumentoitiin kussakin potilaskertomus, ja pidetään eettinen komitea riittäväksi. Kudosnäytteet rekisteröitiin numerolla ja vuosi tietokantaan analyyseissa käytetyn ilman nimiä tai henkilötunnus merkitty.

Tutkimuskanta

Kliininen näytteitä potilaista on kolorektaalisyövän Umeå Study (CRUMS) [39], kirurgisesti resektoitiin CRC kerättiin vuosina 1995 ja 2003 laitoksella Surgery, Uumajan yliopistollisessa sairaalassa, Uumaja, Ruotsi. Kaikista potilaista formaliinikiinnitetyt parafiiniin upotettu kudosta otettiin näyte ja patologinen muuttujat tunnusomaista yksi patologi tarkistamalla rutiininomaisesti värjätyt leikkeet. Kliiniset tiedot, mukaan lukien selviytyminen tiedot, saatiin yksi kirurgi tarkistamalla potilastietoja. Kaikkiaan 485 potilasta (300 paksusuolen syövät, 180 peräsuolen syöpiä, ja 5 ei ole määritelty alisivustoasi sisällä colorectum) sisällytettiin tutkimukseen. Jossa 28 potilasta puuttuvat tiedot joko NOS2 tai CD163 ilmentyminen, 474 yksilöille NOS2 ja 468 yksilöille CD163 oli saatavilla analyysiä varten. Adjuvanttihoitoa annettiin 68 (14,0%) potilaista. Preoperatiivinen sädehoitoa annettiin 108 (60,0%) peräsuolen syöpää potilasta, joista 83 sai 5 x 5 Gy, ja 25 sai 25 x 2 Gy. Hengissä analyysit, 37 potilasta jätettiin pois epätäydellisestä seurantatiedot tai johtuen kuolemaan perioperatiivisen komplikaatioita. Hengissä analysoi tulokset koskien NOS2 /CD163 suhde, kaikkiaan 422 potilasta oli käytettävissä.

immunohistokemia ja immunoflourescense

Näytteet kiinnitettiin 4% formaldehydiä ja upotettiin parafiiniin, mukaan rutiinimenetelmiä laitoksella Kliininen patologia, Uumajan yliopistollisessa sairaalassa, Uumaja Ruotsi. Yksi 4-pm-osio kutakin potilasta leikattiin, kuivattu, de-vahattu ja nesteytyksestä. Dioja alistettiin sitten lämpöä välittämä antigeenin haku käyttämällä Diva liuosta (biocare Medical, Concord, CA), joka Decloaker ™ painekeitin. Immunohistokemiallista menettelyjä, puoliautomaattinen värjäysautomaatilla (Ventana ES, Ventana Inc., Tucson, AZ) käytettiin. Anti-CD163 monoklonaalinen vasta-aine (Novacastra) käytettiin laimennoksena 1:100, ja anti-NOS2 polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam) käytettiin laimennoksena 1:50. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä.

arviointi, dioja käytiin läpi alla valomikroskoopilla. Immunohistokemiallinen värjäys arvioitiin edustavimmat alue leviämisrintamassa ja arvioitu eikä /heikko (pisteet 1), kohtalainen (pisteet 2), vahva /vankka (pisteet 3) ja massiivinen tunkeutuminen (pisteet 4) mukaan Forssell et al. [18]. Näytteet arvioitiin kaksi kertaa saman tarkkailijan, ja ristiriitainen tapausta tarkistettiin kolmannen kerran, jonka jälkeen ratkaiseva tuomiolla. Sillä immunoflourescense, anti-CD163 monoklonaalinen vasta-aine, anti-NOS2 kanin polyklonaalista vasta-ainetta ja anti-CD68 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (GeneTex Inc) käytettiin laimennoksena 1:50, ja anti-CD68-hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Dako) käytettiin yhdellä laimennus 1:400. Lohko, kudosleikkeet käsiteltiin PBS: llä, joka sisälsi 10% normaalia vuohen seerumia ja 0,4% Triton X-100: ssa 20 minuuttia, minkä jälkeen pesu pesupuskurilla (PBS, 0,2% Triton X-100, 0,2% naudan seerumin albumiinia). Seuraavaksi levyt inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (PBS: ssä, 0,1% Triton X-100) 1 tunti huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen ne pestiin pesupuskurilla. Levyjä inkuboitiin edelleen DAPI laimennoksena 1:1000 ja toisen anti-kani-IgG Alexa®488 ja anti-kani-IgG Alexa®555-vasta-aineita (Invitrogen) laimennettuna 1:400 (PBS: ssä, 0,1% Triton X-100) 1 tunnin ajan. Sen jälkeen ylimääräinen pesun jälkeen levyt kiinnitettiin Vectashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories) ja katsottu käyttäen Nikonin Eclipse C1 -konfokaalimikroskoopilla öljyllä upottamalla ja 40 × tavoite.

MSI seulonta tila ja CIMP tila

MSI seulonta tila määritettiin immunohistokemiallisesti aikaisemmin kuvatulla [39]. Positiivinen MSI seulonta asema (MSI) on valittu kudosnäytteiden kasvaimen soluja, joista puuttuu tumavärjäystä yhden tai useamman proteiinien MLH1, MSH2, MSH6 tai PMS2, tämä vastakohtana negatiiviseen seulontaan tila (MSS), jossa kasvain ytimet olivat läsnä ilmaisemalla kaikki neljä merkkiä. CIMP tila määritettiin mukaan hypermetylaatiota kahdeksan geenin paneeli (

CDKN2A

,

MLH1

,

CACNA1G

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

IGF2

,

ja CRABP1

) mukaan MethyLightT menetelmällä (kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR) aikaisemmin kuvatun pohja- ja koetin sekvenssit [39] , [40]. Seuraavat määrä hypermetyloitunut geenien määritelty CIMP-syöpäkasvain, 0 geenit; CIMP-alhainen kasvaimia, 1-5 geenit; ja CIMP korkea kasvaimet, 6-8 geenejä.

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen PASW Statistics 18 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Ristiintaulukointeja analysoitiin Fischerin eksakti testi ja lineaarinen suhteita tarkka lineaarinen-by-lineaarinen yhdistys testi. Kaplan-Meier selviytymisen analyysiä käytettiin arvioimaan syöpää erityisiä selviytymisen ja vertailut ryhmien välillä tehtiin log-rank-testi. Cancer-tautivapaalle määriteltiin kuolema tunnettuihin levitetään tai uusiutuva sairaus. Monimuuttuja selviytyminen analyysit tehtiin käyttämällä Coxin suhteellista vaaraa malleja.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentäminen M1 ja M2 makrofagimarkkereiden

NOS2 valittiin markkerina makrofaagien M1 fenotyypin ja CD163 merkkiaineena makrofagien kanssa M2 fenotyyppi. Kun haluat varmistaa, NOS2 ja CD163 olivat markkereita, voi erottaa välillä erillisiä populaatioita makrofagien, yksilöitä 10 CRC potilasta valittiin sattumanvaraisesti ja jakelua NOS2 ja CD163 analysoitiin kaksinkertainen immunoflourescent värjäyksessä, mitä seurasi konfokaalimikroskopialla. NOS2 ja CD163 havaittiin ensisijaisesti ilmaistaan ​​eri populaatioissa makrofagien (kuvio 1A). Pieni yli-kierros voidaan kuitenkin tunnistaa, mikä on sopusoinnussa muovi luonnetta makrofageissa. Makrofagit, että erittäin ilmaistuna yksi markkereita, kuitenkin johdonmukaisesti ei ilmaista toinen markkeri. Tämä varmistaa NOS2 ja CD163 merkkeinä, joita voidaan käyttää erottamaan eri alaryhmien makrofagien näyttämään lähinnä M1 tai M2 fenotyyppejä, vastaavasti. Lisäksi NOS2 ja CD163 ilmentyminen havaittiin soluissa, jotka ilmaisivat myös makrofagimarkkeri CD68 (kuva 1 B ja C).

konfokaali kuvia immunoflourescent värjäykset CRC (A) NOS2 (punainen) ja CD163 (vihreä) , (B) CD68 (punainen) ja CD163 (vihreä) ja (C) NOS2 (punainen) ja CD68 (vihreä). Ytimet paljasti DAPI värjäytymistä (sininen), ja overlay on flourescense kerätään kaikki kanavat.

Expression of NOS2 ja CD163 oli puolittain määrällisesti arvioida yksilöiden välillä 485 CRC käyttävillä potilailla immunohistokemia mukaan aiemmin dokumentoitu neljän porrastettu asteikko [18]. Edustavia värjäykset soluttautua NOS2

+ tai CD163

+ makrofagit esitetään eiköhän 2. Noin 70% kaikista kasvaimista näy vaatimaton massiivisiin soluttautuminen NOS2

+ ja CD163

+ soluja (pisteet 2 -4), loput osoittivat heikkoa tai mitään tunkeutumista ei (pisteet 1). Valtaosa NOS2 ja CD163 ilmentyminen havaittiin soluissa sijaitsee kasvain strooman tihein pitkin invasiivisia kasvain edestä.

edustaja valomikroskooppisella kuvia Immunohistokemiallisen värjäykset of NOS2 ja CD163 peräkkäisissä leikkeissä saman CRC kasvain näyte.

suhde NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien

taajuudet soluttautua NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien kasvaimen edessä on esitetty taulukossa 1. Infiltroiva makrofagit ilmentävät NOS2 tai CD163 olivat erittäin korreloivat positiivisesti (

P

0,0001). Määrät CD163

+ solujen kasvain edessä olivat kuitenkin usein korkeampi kuin NOS2

+ solut.

Association between soluttautua NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien ja ennusteeseen viittaavia ja molekyylitason parametrit

tulokset soluttautua NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien CRC näytteet korreloivat eri ennusteeseen viittaavia muuttujat (taulukko 2). Kun mukaan lukien kaikki kasvaimet, ei suhde NOS2

+ tai CD163

+ makrofagien infiltraatiota todettiin sukupuoli, ikä, luokka, kasvumalli, adjuvanttihoitoa tai ennen leikkausta sädehoitoa. Heikko lineaarinen trendi havaittiin lisääntynyt soluttautuminen NOS2

+ makrofagit päässä ceacum peräsuoleen (

P

= 0,043). Vaikka mitään merkittävää yhdistyksen NOS2 ilmentymisen havaittiin kasvaimen tyyppi, joka on merkittävää yhteyttä kasvaintyyppi todettiin CD163 ilmentyminen (

P

= 0,005), jossa CD163 soluttautuneet kasvaimia useammin, jolla on ei-mucinous histologia. Vahva käänteinen yhdessä kasvaimen vaiheesta esiintyi sekä NOS2

+ (

P

0,0001) ja CD163

+ (

P

0,0001) makrofagien tunkeutuminen.

Verrattaessa soluttautua NOS2

+ tai CD163

+ makrofagien molekyyli parametrit (taulukko 3), ei korrelaatiota NOS2

+ tai CD163

+ makrofagien infiltraatiota havaittiin joko MSI seulonta tila tai CIMP tila. Kun yhdistetään MSI seulonnan asema CIMP tila kuitenkin CD163

+ makrofagien infiltraatiota havaittiin olevan huomattavasti alhaisempi CIMP-korkea kasvaimet verrattuna CIMP-negatiivinen tai CIMP-alhainen kasvaimia joukossa ryhmässä MSS kasvaimia (

P

= 0,042).

Prognostic merkitys soluttautua NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien

arvioida ennustetekijöiden vaikutusta makrofagien infiltraatiota, vertasimme yleinen syöpä erityisiä selviytymisen potilailla, joilla eri tulokset soluttautua NOS2

+ tai CD163

+ makrofageja. Kuvio 3 esittää Kaplan-Meier tontit syöpää erityisiä selviytymisen CRUMS potilailla, joilla on eri soluttautua NOS2

+ ja CD163

+ makrofageja. Lisääntynyt soluttautuminen NOS2

+ makrofagien kasvaimen rintama erittäin merkitsevästi yhteydessä parannetun ennusteen (Log-rank

P

= 0,0003) (kuvio 3A). Samanlainen yhdistys nähtiin myös CD163

+ makrofageja (Log-rank

P

0,0001) (kuvio 3D). Mahdollisesti curatively resektoitiin CRC (so ilman potilailla, joilla on etäispesäkkeitä tai ei-radikaaleja) merkitystä yhdistyksen välillä NOS2

+ makrofagien infiltraatiota ja ennusteen oli kadonnut (Log-rank

P

= 0,132). Kuitenkin tässä ryhmässä merkitys NOS2

+ makrofagien infiltraatiota ja ennusteen palautettiin erottamiseen tapauksissa paksusuolen syövän peräsuolen syöpiä, Log-rank

P

= 0,008 paksusuolen verrattuna Log-rank

P

= 0,881 peräsuolessa (kuvio 3B ja C). Jotta vastaava analyysi CD163

+ makrofagien tunkeutuminen curatively resektoitiin CRC samanlainen tendenssi havaittiin (Log-rank

P

= 0,034 kaikissa CRC, log-rank

P

= 0,059 paksusuolen, log-rank

P

= 0,236 peräsuolessa) (kuvio 3E ja F).

CRC tapausta pisteytettiin NOS2 (A-C) ja CD163 (D-F) ilmaisu , pisteet 1-4. Näkyy ovat Kaplan-Meier tontit syöpää erityisiä eloonjäämisen (A ja D) kaikki CRC, (B ja E) mahdollisesti curatively resektoitiin paksusuolen syövät, ja (C ja F) mahdollisesti curatively resekoituun peräsuolen syöpiä. Log-rank testejä käytettiin laskettaessa

P

arvoja.

Koska voimakas korrelaatio kasvaimen vaiheen ja ilmaus NOS2 ja CD163 suoritimme Coxin monimuuttuja verrannollinen vaara mallien mukaan lukien muuttujat sukupuoli, ikä, lokalisointi, kasvain vaiheessa ja yksi makrofagimarkkeri vastaavasti. Hazard suhde (t) sekä NOS2 (HR 0,67, 95% CI +0,40-+1,12,

P

= 0,12) ja CD163 (HR 0,66, 95% CI 0,42-1,06,

P

= 0,087) osoitti suojaavaa vaikutusta, mutta ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä korostaen vaiheessa riippuvuus.

mahdollinen vaihteluita NOS2 /CD163 suhde potilaiden eloonjäämiseen analysoitiin myös. Mitään merkittävää eroa ei havaittu syöpää erityisiä selviytymisen CRC suhteessa NOS2 /CD163-suhde, ei kaikissa CRC tapauksissa (kuvio 4A) eikä valitun ryhmän mahdollisesti curatively resektoitiin koolonsyöpien (kuva 4B). Lisäksi NOS2 /CD163-suhde ei ollut merkitsevää yhteyttä hengissä monimuuttujamenetelmin (tuloksia ei esitetty).

Syöpä-erityisiä selviytymisen CRC tapauksia teki varten NOS2 /CD163-suhde. Näkyy ovat Kaplan-Meier tontit NOS2 /CD163-suhde (A) kaikki CRC, tai (B) mahdollisesti curatively resekoituun paksusuolen syöpiin. Log-rank testejä käytettiin laskettaessa

P

arvoja.

Prognostic merkitys soluttautua NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien mukaan MSI seulonnan tila ja CIMP tila

analysoimiseksi edelleen ennusteen arvioinnissa makrofagin tunkeutumisen, vertasimme yleinen syöpään erityinen selviytymisen sisällä eri alaryhmiä CRC määritelty MSI seulonta tila ja CIMP tila.

MSI tapauksia CRC on todettu on hieman parempi ennuste kuin MSS tapauksia [33]. Makrofagi-infiltraation havaittiin olevan prognostinen tekijä alaryhmissä sekä MSI (kuvio 5A ja D) ja MSS tapauksissa (kuvio 5B ja E). Prognostisia arvo NOS2

+ makrofagien tunkeutuminen ei pääse merkitystä MSI tapauksissa (Log-rank

P

= 0,256), mutta se teki niin MSS tapauksissa (Log-rank

P

= 0,002). CD163

+ makrofagien tunkeutuminen oli merkittävä ennustetta sekä MSI (Log-rank

P

= 0,009) ja MSS (Log-rank

P

= 0,003) tapauksissa. Kun yhdistetään MSI seulonnan tila on alhainen (pisteet 1-2) tai korkea (pisteet 3-4) tunkeutumiseen NOS2

+ tai CD163

+ makrofagien merkittäviä ennuste esiintyi sekä NOS2

+ ( log-rank

P

= 0,005) ja CD163

+ (log-rank

P

= 0,0004) makrofagien infiltraatiota (kuvio 5C ja F). Kaikkein edullisin ennuste löytyi MSI tapauksissa erittäin soluttautunut makrofageja, erityisesti NOS2

+ makrofageja. MSS tapauksissa alhainen makrofagien tunkeutuminen näkyy pahin ennuste (kuvio 5C ja F). Mitään merkittäviä eroja ennusteeseen havaittiin välillä MSI ja MSS tapaukset osaryhmään alhainen tai korkea soluttautumista NOS2

+ tai CD163

+ makrofagien.

alaryhmiä CRC järjestettiin mukaan MSI seulonnan tila ja lasketa NOS2 (A-C) ja CD163 (D-F) lauseke, pisteet 1-4. Näkyy ovat Kaplan-Meier tontit syöpää erityisiä eloonjäämisen (A ja D) MSI tapauksissa (B ja E) MSS tapauksissa ja (C ja F) yhdistettiin MSI seulonta tila ja NOS2 tai CD163, pisteet 1-2 tai 3- 4, vastaavasti. Log-rank testejä käytettiin laskettaessa

P

arvoja.

makrofaagianalyysi tunkeutumisen osoitettiin olevan prognoosi- merkitys kaikissa CIMP alaryhmissä (Kuva 6A-C ja E-G). NOS2

+ makrofagien tunkeutuminen osoitti merkittävää vaikutusta syöpää erityisiä selviytymisen CIMP-low tapauksissa (

P

= 0,011). Makrofagit ilmentävät CD163 osoitti merkittäviä vaikutuksia ennusteen CIMP-neg (Log-rank

P

= 0,006) ja CIMP-korkea (Log-rank

P

= 0.022) tapauksissa. Kun yhdistetään CIMP seulonnan tila on alhainen (pisteet 1-2) tai korkea (pisteet 3-4) tunkeutuminen makrofagien ilmentävien NOS2 tai CD163, merkittäviä ennuste esiintyi sekä NOS2 (Log-rank

P

= 0,015) ja CD163 (Log-rank

P

= 0,001) tunkeutuminen (kuvio 6D ja H). Kaikkein edullisin ennuste löytyi erittäin tunkeutunut CIMP alaryhmiin (kuvio 6D ja H). CIMP osaryhmään alhainen soluttautumista NOS2

+ tai CD163

+ solujen Vertailun huonompi ennuste. Mitään merkittäviä eroja ennusteeseen välillä havaittiin CIMP-negatiivinen, CIMP matalia tai CIMP korkea tapausten alaryhmää matalalla tai korkealla soluttautumista NOS2

+ tai CD163

+ makrofagien.

alaryhmiä CRC järjestettiin mukaan CIMP tilan ja pisteytettiin NOS2 (A-D) ja CD163 (E-H) lauseke, pisteet 1-4. Näkyy ovat Kaplan-Meier kuvaajia yksilöitä (A ja E) CIMP-negatiivinen tapauksissa (B ja F) CIMP-alhainen tapauksissa (C ja G) CIMP-korkea tapauksissa ja (D ja H) yhdistettynä CIMP tila ja NOS2 tai CD163, pisteet 1-2 tai 3-4, vastaavasti. Log-rank testejä käytettiin laskettaessa

P

arvoja.

Keskustelu

Isäntä mikroympäristölle käy läpi dramaattisia muutoksia etenemisen aikana syöpä, joka vaikuttaa stroomasolut, matriisi koostumus, angiogeneesi sekä immuunivasteen, joka puolestaan ​​voi olla merkittävä vaikutus kasvaimen kasvuun ja levitä [41]. Tulehduksellinen kasvaimen mikroympäris- on ehdotettu seitsemäs tunnusmerkki syövän etenemisessä [42]. Analyysi immuuni contexture – eli sijainti, tiheys ja toiminnallinen suuntautuminen immuunisolujen – ja miten se on integroitu kasvain molekyyli- ominaisuudet voivat antaa tärkeää tietoa potilaan ennusteeseen sekä ennusteen vaste eri hoidot [43], [ ,,,0],44]. Makrofagien on tärkeä rooli kasvaimen edessä, jotka erittävät tekijöitä, jotka monin tavoin voi vaikuttaa sekä kasvaimen ja ympäröivän stroomasolut, mukaan lukien muiden solujen immuunijärjestelmän.

Olemme aiemmin osoittaneet, suhteellisen laajassa kliinisessä kohortin että suuri tunkeutumisen ilmentävien solujen makrofagimarkkeri CD68 kasvaimen edessä CRC johtaa parannettuun ennusteeseen [18]. Täällä, jakelu makrofagien kanssa M1 tai M2 fenotyyppi arvioitiin

in situ

tässä kohortissa analysoida tärkeydestä eri alatyyppejä makrofagien CRC potilaan ennustetta. Tätä tutkimusta varten NOS2 ja CD163 valittiin markkereita erottamaan välillä makrofagien näytetään ensisijaisesti M1 tai M2 fenotyyppejä, vastaavasti. Sekä NOS2 ja CD163 on käytetty muiden kuin merkkiaineita määritellä M1 tai M2 makrofagin fenotyyppejä ihmisen syövissä [10], [45] – [57]. Me täällä vahvistettu kaksinkertaisella immunoflourescent värjäys ja konfokaali analyysi että nämä merkit on suurelta osin tehdä erillinen kahden eri solualapopulaatiota jotka on makrofagilinjan (kuvio 1). Kuitenkin näyttää olevan pieni määrä soluja, jotka eivät ilmentävät sekä NOS2 ja CD163, mutta useimmiten pienempiä määriä, mikä viittaa siihen, että seka fenotyyppi joskus esiintyä. Makrofagi alatyyppejä, että erittäin ilmaista joko NOS2 tai CD163, mutta hyvin harvoin ilmaista merkkiaine vastakkaisen alatyyppi. Erillinen määritelmä makrofagien sisään populaatioiden M1 ja M2 alatyyppejä on todennäköisesti hieman yksinkertaistus, koska makrofagit ovat erittäin muovia soluja ja voi näyttää kirjo fenotyyppien [58]. Kuitenkin markkereita M1 ja M2 makrofageja voidaan edelleen käyttää tunnistamaan tärkeimmät fenotyypin tai toiminnon eri makrofagien populaatioissa. Vaikka huomaamme, että NOS2 ja CD163 ilmentyvät eri populaatioiden makrofagien, on edelleen olemassa vaara, että kaikki M1 tai M2 makrofagit ilmentävät näitä markkereita ja että siksi voi menettää osaa makrofagien väestön tutkimuksessamme. Lisätutkimuksia tarvitaan tarkistaa M1 ja M2 ja fenotyyppien löytää tarkempia merkkiaineiden erottaa M1 ja M2 makrofagien populaatiot.

Kun korreloi ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia (taulukko 2), heikko lineaarinen suuntaus todettiin lisääntyneen suodattuminen M1 makrofagien peräisin ceacum peräsuoleen, joka on sopusoinnussa peräsuolen jatkumo teorian ehdottama Yamauchi et al [59], [60]. Heidän tutkimuksessaan CIMP-korkea, MSI-korkea ja

BRAF

mutaatioita havaittiin asteittain kasvavan peräsuolen nousevassa paksusuolessa. Ceacal syöpiä todettiin vastaavan ainutlaatuisen alatyyppi, joka ei noudattanut lineaarisuuden suuntausta. Kuitenkin makrofagien infiltraatiota ceacal syöpiä ei ole jätetty lineaarisuudesta. Expression of NOS2 ja CD163 korreloi käänteisesti kasvaimen vaiheesta, mikä osoittaa, että suurempi vaihe kasvaimet suuremmassa määrin ovat karanneet immuunijärjestelmää. Lisäksi NOS2 ja CD163 ilmentyminen korreloi hyvin ilmentymisen makrofagimarkkeri CD68 (

P

0,0001), joka tukee tätä NOS2 ja CD163 ilmaistaan ​​solujen makrofagilinjan.

monissa kliinisissä tutkimuksissa on havaittu, että suuri soluttautuminen TAMeja korreloi huonoon ennusteeseen ja TAM ovat siten ehdotettu olevan M2 fenotyypin, jotka edistävät syövän etenemiseen. Kuitenkin me ja muut ovat viime aikoina, että suuria määriä TAMeja CRC antavat paremman ennusteen ja eloonjäämisaste [17] – [20], [52]. Tämä on ensimmäinen tutkimus, meidän tietomme, jossa merkkiaineita alatyyppien M1 ja M2 makrofagit käytetään yhdessä tarkoitus verrata jakautuminen eri makrofagien fenotyyppejä ja niiden suhde ennusteen CRC. Voisimme tarkkailla merkittävä tilastollinen korrelaatio määrän NOS2

+ ja CD163

+ makrofageja (

P

0,0001), mikä osoittaa kahta samanaikaista makrofagien sekä M1 ja M2 fenotyypit on kasvain leviämisrintamassa (taulukko 1). Lisäksi lisääntynyt tunkeutumisen sekä NOS2

+ ja CD163

+ makrofagien kasvaimen edessä oli korreloi merkittävästi parantunut ennuste (kuva 3). Tämä korrelaatio havaittiin myös alaryhmässä curatively resektoitiin paksusuolen syöpiin, mutta ei alaryhmässä curatively resekoituun peräsuolen syöpiä. Eräs mahdollinen selitys tähän eroon voi olla se, että toisin kuin useimmat paksusuolen syövän potilaille, monet (60%) ja peräsuolen syöpä potilaat saivat ennen leikkausta sädehoitoa, jonka tiedetään aiheuttavan vähentää tulehdusreaktion [61]. Emme kuitenkaan löytäneet mitään eroa makrofaagien infiltraatiota välistä kasvaimia potilailla, jotka olivat saaneet leikkausta edeltävän sädehoitoa ja ne, jotka eivät olleet (taulukko 2).

suhde soluttautua makrofageissa M2 fenotyypin ja ennusteeseen CRC on aiemmin analysoitu muutamassa tutkimuksessa. Mukaan Nagorsen et al., Kuten tutkimuksessamme, strooman soluttautuminen CD163

+ M2 makrofagien CRC oli korreloi merkittävästi parantunut eloonjääminen [52]. Nämä kirjoittajat eivät kuitenkaan arvioida rinnakkaista läsnäoloa M1 makrofageja. Algars et ai. havaitsivat positiivisen korrelaation peritumoraalista CLEVER-1 /Stabilin-1

+ M2 makrofagien ja eloonjäämisen CRC [17]. He lisäksi havaittu, että alhainen M1 /​​M2 suhde johti enemmän uusiutuva sairaus. Kuitenkin tutkimuksessaan M1 makrofageja pidettiin ne makrofagit, jotka eivät esittäneet Clever-1 /Stabilin-1. M1 makrofagien on ehdotettu olevan kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta, ja odotetusti, potilaat kätkeminen kasvaimet, joilla on korkea soluttautumista NOS2

+ makrofageja havaittiin merkittävästi parempi ennuste kuin ne, joilla on vähän tai ei NOS2 infiltraatiota (kuvio 3A). Samanlaisia ​​Tutkimuksessamme Ohri et al.