Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) voivat hyökätä ja etäispesäkkeitä epiteelivoltti-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) . Mutta miten ne paeta immuunipuolustus epäselvä. B7H1 on ratkaiseva negatiivinen kostimuloivana molekyylin mutta vähän tietoa siitä, onko se toimii CSCS. Niinpä määritettiin ilmaus B7H1 ja EMT-liittyvä markkereita kolorektaalisyövässä kantasolujen kaltaisia ​​soluja tutkia mahdollisen immunoevasion tapa CSCS. Me rikastettu CD133

+ peräsuolen syövän solut, jotka ilmestyi CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia kuten korkeampi muiden kantasolujen merkkiaineita Oct-4 ja Sox-2, kasvain pallo muodostavat kyky ja tuumorigeenisemmiksi NOD /SCID-hiiriin. Nämä CD133

+ soluilla EMT geeniekspressioprofiili myös korkeampaa Snail, Twist, vimentiinistä, fibronektiiniä ja alemman E-kadheriinin. Lisäksi CD133

+ solujen sekä solulinjassa ja peräsuolen syövän kudoksissa ilmaistuna korkea negatiivinen yhteistyössä stimuloivat molekyylin B7H1. Lisäksi jotkut B7H1

+ syöpäsolujen osoitti myös ominaisuus EMT, mikä osoittaa EMT solut voitaisiin välttyä immuunihyökkäyksen aikana etäpesäke. B7H1 ilmaisun ja EMT fenotyypit on CSCS viittaa mahdolliseen immunoevasion tavalla.

Citation: Zhi Y, Mou Z, Chen J, hän Y, Dong H, Fu X, et al. (2015) B7H1 Expression ja epiteelikasvaimet-To-mesenkymaalitransitioon Fenotyypit siitä peräsuolen syövän Varsi kaltaisia ​​soluja. PLoS ONE 10 (8): e0135528. doi: 10,1371 /journal.pone.0135528

Editor: Giuseppe Pirozzi, Istituto Nazionale Tumori, ITALIA

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2015; Julkaistu: 18 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Zhi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (ja ZM, nro 30872466), National Program Key Basic Research Project (973 Program) Kiinan (ja ZM, No. 2010CB529404). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja toinen naisilla [1], mutta edistys syövän hoidossa on tehty rajoitetusti viimeisten 50 vuoden aikana. Epäonnistuminen syövän hoito johtuu alapopulaatio syöpäsoluja kutsutaan syövän kantasolut (CSCS), jotka ovat oletetun syövän aloittamista solujen ominaisuuksien kanssa normaalia kantasoluja, kuten itseuudistumiseen, multipotenttisuus ja rajaton leviämisen mahdollisia [ ,,,0],2]. Lisäksi CSCS ajatellaan olevan ratkaiseva lääkeresistenssideterminantit [3]. Näin ollen uskotaan, että CSCS ovat ”siemeniä” syövän muodostumista ja vaikeasti poistettava. Peräsuolen CSCS on myös eristetty ja karakterisoitu perustuvat CSCS markkereita, kuten CD133 [4-9].

CSCS on keskeinen rooli syövän eteneminen ja metastaasit. Ymmärtää, miten syöpäsolujen etäispesäkkeitä, rooli epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tutkittu laajasti viime vuosikymmenen aikana. EMT antaa invasiivisia ja metastaattinen ominaisuudet, kestävyys hoitoja, ja CSCS fenotyyppien syöpäsoluihin kokeellisissa malleissa [10-15]. Syöpäsolut käynnissä EMT downregulate proteiinit liittyvät soluadheesiota, kuten E-kadheriinin ja upregulate proteiinit ilmentyvät mesenkymaalisten solujen, kuten vimentiinistä, N-kadheriinin ja fibronektiini [13], ja transkriptiotekijöiden kuten

Snail

Twist

, ja

Slug

samoin [16]. EMT helpottaa myös syövän solujen eloonjäänti sen jälkeen, kun hoidon syöpälääkkeitä, jotka kohdistuvat reseptoreiden epiteelisolujen [12, 17]. Lisäksi induktio EMT syöpäsoluissa lääkkeillä tai yliekspressio EMT transkriptiotekijöiden tuloksia hankintaan mesenkymaalisten ominaisuuksia ja ilmentymisessä kantasoluja merkkiaineita [18-20]. Toisaalta, syöpäsolujen käsittelyn jälkeen syöpälääkkeitä, joiden on osoitettu rikastuttaa CSCS, ilmentää ja fenotyyppien geenin ilmentymistä, kuten EMT [21]. Nämä havainnot osoittavat tiiviin CSCS ja hankinta EMT. Kuitenkin suurin osa patologeja vielä tehonnut EMT teoriaan, koska lopullinen todiste EMT tapahtuu ihmisen kasvaimissa puuttuu toistaiseksi.

CSCS hallussaan sisäisten biologisten ominaisuuksien muodostaa kasvain ja voi hyökätä kudosten kautta EMT. Mutta on epäselvää, että miten ne kiertää immuunivalvonnan lopullista selviytymisen immunokompetenteilla hosts. Immunoevasion voi auttaa CSCS hengissä ja sitten muodostaa kasvain [3]. Aiemmat raportit ovat ehdottaneet luontainen yhteyksiä immunosuppressioon ja EMT, kuten Snail aiheuttama EMT aiheuttama säätelevien T-solujen ja heikentynyt dendriittisolut [22]. Yhdessä oletamme immunoevasion on tärkeää CSCS että tehdään EMT kautta paraneoplastic tulehduksen alueella ilman immuunijärjestelmän tila ja toteuttaa ja metastaasit. Tietoja on kuitenkin edelleen niukasti n immunoevasion mekanismien CSCS [3].

B7H1, ligandi ohjelmoidun solukuoleman 1 (PD-1), on ollut tunnettu ratkaiseva kostimuloivana molekyylin ja on tärkeä rooli induktioon ja ylläpitoon perifeerisen toleranssin [23]. B7H1 on säädelty huomattavan erilaisia ​​syöpäsoluja, joka tarjoaa negatiivisia signaaleja ja johtaa immunosuppression kautta PD-1-B7H1 vuorovaikutusta syövän ja T-soluja [24, 25], jolloin kasvaimeen infiltroivien T-solujen toimintahäiriön ja Treg rekrytointi [26] . Nämä piirteet tekevät B7H1 tullut lupaava kohde hallita syöpää. Kuitenkin B7H1 ilme CSCS ei tunneta hyvin peräsuolen syöpä. Niinpä havaitaan B7H1 ilmaisun kolorektaalisyövässä tässä tutkimuksessa ja osoitti B7H1 ilmaisun ja EMT fenotyyppien siitä peräsuolen syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka voivat olla mekanismit CSCS paeta immuunivalvonnan ja hyökätä kaukainen kudoksiin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

paksu- ja peräsuolisyövän kudokset saatiin Southwest Hospital alle eettisiä protokollien hyväksymän eettisen komitean kolmannen Military Medical University, Chongqing, Kiina. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Eläinkokeet hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean kolmannen Military Medical University. Kaikki menettelyt olivat noudattaen National Institute of Health Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals.

Syöpä kudosten ja solujen Line

paksu- ja kasvaimet histopatologisesti arvioitu ja luokiteltu kasvain- Solmu-Metastasis (TNM) pysähdyspaikan järjestelmä (taulukko 1). Paksusuolen solulinja HT29 (Kataloginumero: TCHu 103, ostettu 29. toukokuuta, 2010 Cell Bank of Kiinan Academy of Sciences, Shanghai, Kiina) viljeltiin McCoyn 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Magneettinen solun lajittelu

HT29-solut kerättiin eksponentiaalisen kasvuvaiheen 0,25% trypsiiniä ( sisälsivät EDTA) jälkeen järjestetty CD133 Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksa) ohjeiden mukaisesti valmistajan. Kuolleet solut poistettiin Dead Cell poistosarja (Miltenyi Biotec) ennen lajittelua. CD133

+ ja CD133

– fraktiot kerätään erikseen ja värjättiin PE-konjugoidulla ihmisen CD133 /2 (293C3) vasta-aine (Miltenyi Biotec). PE-konjugoitu hiiren IgG2b (Miltenyi Biotec) käytettiin isotyypin kontrollivasta-ainetta. Solu puhtaus arvioitiin virtaussytometrialla (BD FACSCanto Ⅱ, San Jose, CA, USA).

Kasvaimia synnyttävä määrityksissä hiirillä

NOD /LTSZ-scid /SCID (NOD /SCID) hiiriä (Ostettu Beijing Laboratory Animal Research Center, Kiina) oli kasvatettu ja ylläpidetty Yksittäiset Ventilated Altaaseenpanotoimet System hyväksymissä olosuhteissa Institutional Animal Care ja käyttö komitean kolmannen Military Medical University. CD133

+ ja CD133

– solut lajitellaan ja laskettiin ennen rokotus. Syöpäsolut suspendoitiin 1: 1 seoksella median ja matrigeelin (BD Biosciences, Bedford, UK) ja ihon alle kylkiin 4 hiirten (8-10 viikon iässä). Kukin kylki ruiskutettiin 1 x 10

4 solut. Kasvainten kasvua seurattiin viikoittain ja mitataan äänenvoimakkuutta pituus x leveys x leveys /2. Kaikki hiiret tapettiin 7 viikkoa elinsiirron. Ksenografteja poistettiin, kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE).

Sphere muodostumisen määritys

lajiteltu CD133

+ ja CD133

– -soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa (NS Peruselatusaine, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Kanada) plus 10% NS-A Proliferation lisäravinteet (Human) (StemCell Technologies), epidermaalinen kasvutekijä (EGF) (20 ng /ml) (StemCell Technologies), emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) (10 ng /ml) (StemCell Technologies) ja hepariinia (2 ug /ml) (Invitrogen). Viljelyväliaine vaihdettiin 3 päivän välein. Kuvat pallojen otettiin kiinni 20 päivän jälkeen mikroskoopilla ja laskettiin numerot alle 100-kertainen suurennus satunnaisessa näkökentän. Joissakin aloilla värjättiin PE-konjugoidulla CD133 /2 (293C3) vasta-aine (Milteny Biotect). Jotkut kasvaimeen palloja hajotettiin kollagenaasilla tyypin Ⅳ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), ja sitten viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa, kuten mainitaan edellä onko aloilla voisi muodostaa uudelleen.

RNA: n uutto, cDNA synteesi, ja Q-PCR

CD133

+ ja CD133

– HT29 kerättiin vastaavasti ja lisätään Tripure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) purkaa RNA. 500 ng RNA: ta jokaisesta näytteestä oli käänteisesti transkriboidaan 20 ui reaktioseosta (TOYOBO Bio-Technology, Shanghai, Kiina). Expression taso kunkin geenin määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (Q-PCR). Taso tuote määritettiin SYBR Green (TAKARA Biotechnology, Dalian, Kiina). Q-PCR suoritettiin Mx3000P qPCR-järjestelmän (Agilent Technologies) ja seuraava ohjelma: alkudenaturaatio 2 minuutin ajan 95 ° C: ssa seurasi 45 PCR-sykliä (95 ° C 10 sekunnin ajan, 60 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 30 sekuntia). Tämän jälkeen yksi sykli suunnitteli Mx3000P ohjelmisto (95 ° C 60 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 95 ° C 30 sekuntia) lisättiin sulamiskäyräanalyysi. Primer sekvenssit on lueteltu taulukossa 2. Glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), käytettiin housekeeping-geenin valvontaa.

immunofluoresenssi

jääleikkeiden syöpäkudosten värjättiin mukainen verkossa protokolla (https://www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl.htm). Vasta-aineita ihmisen CD133, B7H1, E-kadheriinin ja vimentiinin käytettiin ekspression määrittämiseksi EMT merkkiaineiden CD133 positiivisia tai B7H1 positiivisia soluja. Samoin vasta-aineita ihmisen CD 133, B7H1 ja EpCAM käytettiin havaitsemaan CD133 ja B7H1 ilme syövästä kudoksiin. Yksityiskohdat vasta valinnan lueteltiin taulukossa 3. Toissijainen vasta-aineet hankittiin Beyotime instituutti Biotechnology, Shanghai, Kiina. Diamidino-fenyyli-indolia (DAPI) (Beyotime Biotechnology) käytettiin värjäämään tumaan. Kontrollit sisälsivät: 1) Blank: käytetään vasta-aineen laimennus puskurilla (5% naudan seerumin albumiinia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7,2) vain; 2) Negatiivinen kontrolli: käytetty vasta-laimennospuskuri plus toissijainen vasta-aineet; 3) Isotyyppi vasta-ohjaus: käytetään IgG-vasta-lajeista laimenee vasta-laimennospuskuri plus toissijainen vasta-aineita. Kontrolleja käytetään välttää epäspesifisen fluoresenssin.

HT29 värjäysmenettelyä oli samanlainen syöpäsoluissa, mutta ennen, että solut ympättiin poly-L-lysiinillä (Sigma-Aldrich) esipäällystetty-peitinlaseilla, viljeltiin McCoyn ”5A väliaine 24 tuntia ja kiinnitettiin sitten Fixation ja läpäiseväksi Solution (BD Biosciences).

värjäyksen jälkeen kaikki diat pidettiin kostutetussa kammioissa valolta 4 ° C: ssa kunnes kuvien ottamista.

kuvat talteenotto ja ilmaisun analyysi

Kaikki konfokaali kuvat otettiin vangiksi laserkeilauksella konfokaali- fluoresenssimikroskooppia (Leica TCS-SP5, Saksa). Kontrollit käytettiin säätämään asianmukaisen kaapata kunnossa välttämiseksi epäspesifisen fluoresenssin häiriöitä. Sama merkki eri dioja havaittiin samoissa olosuhteissa. Expression mitattiin laskemalla vastaavien solujen määrässä ottaa kuvia. Kukin dia mitattiin yli 5 kenttiä ja laskettiin vähintään 1000 solua.

Tilastollinen

Erot ksenografti määriä, pallo numeroita ja mRNA: n ilmentymisen tasoa välillä CD133

+ ja CD133

– solut analysoitiin Studentin

t

-testi.

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävä ero. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS (versio 13.0).

Tulokset

CD133

+ soluilla tuumorigeenisemmiksi potentiaali ja kasvaimen pallo muodostavat kyky

Koska keskustelut of CSCS merkkiaineiden edelleen olemassa [27, 28], tarkistimme syöpä varsi kaltaiset ominaisuudet lajitellun CD133

+ soluja ensin. CD133

+ ja CD133

– HT29 kerättiin määrittämiseksi solun kasvainten muodostumiseen. Prosenttiosuus CD133

+ soluja oli noin 90% (kuvio 1A). Kymmenen tuhansia CD133

+ ja CD133

– injektoidaan subkutaani- osaksi eri kylkiin NOD /SCID-hiirissä. Alkaen 5 viikkoa injektion jälkeen, kasvaimet, jotka ovat peräisin CD133

+ solujen alkoi olla huomattavasti suurempi kuin ne, jotka on johdettu CD133

– soluissa (kuvio 1B ja 1C). CD133

+ cell ksenografteissa osoitti pahanlaatuinen histologia kuten paksusuolen syöpä (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että CD133

+ solut ovat tuumorigeenisemmiksi. Lisäksi alalla muodostuminen on yksi piirteitä CSCS [4], päätimme pallo muodostumista CD133

+ soluja ja totesi, että CD133

+ solut muodostivat merkitsevästi enemmän kasvain aloilla kuin CD133

– soluja serum- viljelyalusta

in vitro

(kuvio 1 E). Lisäksi lähes kaikkien solujen CD133

+ solujen johdettu kasvaimen aloilla ilmaisivat korkeaa CD133 (kuvio 1 F). Lisäksi, sen jälkeen, kun solujen dissosiaatio kollagenaasin kanssa, solut voivat muodostaa kasvaimen pallojen uudelleen seerumia (kuvio 1G), joka osoittaa kyky uusiutua ja CD133

+ solut. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että CD133

+ solut hallussaan CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia.

HT29-soluja puhdistettiin CD133 magneettisia helmiä. Puhtaus CD133

+ solut määritettiin virtaussytometrialla (A). 1 x 10

4 CD133

+ ja CD133

– soluja ihon alle ruiskutetaan eri kylkiin NOD /SCID-hiirissä. Kasvukäyrä ksenograftikasvaimina NOD /SCID-hiirissä osoittaa eri kyky tuumorigeneesiä kaksi alapopulaatioiden (B). Kinetiikka kasvaimen kokoa seurattiin kerran viikossa (n = 4, keskiarvo ± SD, **

p

0,01) .A tyypillinen hiirillä näkyy 7 viikkoa inokulaation jälkeen (C). Pääluokat ksenograftien (D) CD133

+ soluja (vasen, 200-kertainen suurennus) ja CD133

– soluja (oikealla, 200-kertainen suurennus) analysoitiin hematoksyliinillä ja eosiiniväriä (bar = 100 um). CD133

+ solut näyttävät paljon voimakkaampi pallo muodostumisen kuin CD133

– ne (E). Histogrammi näyttää numerot pallojen peräisin eri alapopulaatioiden (**,

p

0,01). Kasvain aloilla ilmaista CD133 (F, top: neutraali valo, pohja: fluoresenssi, punainen; bar = 100 um). Sen jälkeen dissosiaatio, solut muodostivat pallojen uudelleen (G, alhaalla) seerumittomassa viljelyalustassa kuin heidän vanhempi sukupolvi (G, ylhäällä) (bar = 100 um).

CD133

+ HT29 ekspressoivat sekä kantasolujen liittyvä ja EMT liittyvät molekyylit

CSCS ovat oletetun syövän aloittamista solujen ominaisuuksien kanssa normaalin kantasolujen ilmentävät pluripotenttisuus markkereita, kuten Sox-2 ja Oct-4 [29-31] . Sen määrittämiseksi, ovatko CD133

+ HT29 myös ilmaista nämä kantasolujen liittyvä tekijät, transkription taso Oct-4 ja Sox-2 ilmentyminen mitattiin. Kuten odotettua, kaksi kantasolujen markkereita Oct-4 ja Sox-2 ilmennettiin merkitsevästi suurempi CD133

+ alaryhmässä (

p

0,05) kuin CD133

– soluja (kuvio 2A), joka on sopusoinnussa Oct-4 ja Sox-2 yliekspressio huonosti eriytetty kasvaimissa [32].

Suhteellinen mRNA ekspressiotasot kantasolujen merkkiaineiden Oct-4 ja Sox-2 (A), EMT liittyvä transkriptiotekijöitä Twist ja snail (B), ja EMT markers E-kadheriinin, fibronektiiniä, ja vimentiinistä (C) määritettiin reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR ja normalisoitiin GAPDH ilme. *,

p

0,05; **,

p

0,01.

Edellinen tutkimus osoitti, että EMT on mukana muuntaminen alkuvaiheessa kasvainten osaksi invasiivisia syöpäsairauksia [33]. Mielenkiintoista, varaamiseen todisteet osoittavat, että induktio EMT fenotyyppien erilaiset tekijät myös indusoi CSC kaltaisia ​​soluja [15]. Ei kuitenkaan ole selvää, onko CSCS näyttö EMT fenotyyppejä. Käsitellä tätä kysymystä, ilmaus EMT liittyvien molekyylien HT29 havaittiin, kuten transkriptiotekijöiden Snail ja Twist, epiteelin proteiini E-kadheriinin, mesenkymaalisten markkereita vimentiinistä ja fibronektiiniä. CD133

+ solut ilmensivät merkitsevästi korkeampi Snail, Twist, vimentiinistä ja fibronektiiniä kuin CD133

– soluja (

p

0,05) (kuvio 2B ja 2C). Toisaalta, E-kadheriinin ilmentymisen CD133

+ soluja oli merkitsevästi pienempi (

p

0,05) (kuvio 2C), mikä osoittaa CD133

+ soluja ilmenee EMT-liittyviä ominaisuuksia.

CD133

+ soluja potilaan kudoksissa näyttämään EMT fenotyypit

Vaikka EMT laajalti tutkittu

in vitro

, keskeinen kysymys EMT oli, että suoria todisteita tästä ilmiöstä tapahtuu ihmisen syöpä kudoksiin puuttui. Tämän kysymyksen, ilmaus CD133 ja EMT-fenotyypin molekyylit analysoitiin ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin. CD133 ilmaistiin hajautetusti vieressä adenokarsinooma pesä (Kuva 3), mutta ei paraneoplastic kudoksessa (S1 Kuva). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että CD133

+ solujen ilmaista vimentiinista (kuvio 3B), mutta ei E-kadheriinin in 13/20 havaittu paksu- ja peräsuolisyövän kudoksiin (kuvio 3A). Värjäämällä nämä kolme molekyylien samassa jaksossa, varmistimme osa CD133

+ solujen eri näytteissä (20% -40% yhteensä CD133

+ solut) osoitti tämän fenotyypin (kuvio 3C). Se osoitti, että suoraa näyttöä, että jotkin CD133

+ syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja oli EMT fenotyyppejä ihmisen syövän kudoksissa.

ilmentyminen CD133 (punainen), E-kadheriinin (vihreä) (A) tai CD133 (punainen) ja vimentiinin (vihreä) (B) tai CD133 (punainen), E-kadheriinin (vihreä) ja vimentiinin (sininen) (C) määritettiin immunofluoresenssin. Nucleuses värjättiin DAPI (A, B: sininen, C: harmaa). Se näkyy edustaja paksusuolen kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma, T3N0M0. (Bar = 20 pm)

Co-ilmentymä B7H1 ja CD133 in HT29 solulinjassa ja peräsuolen syövän kudoksissa

tutkimiseksi mekanismi miten CSCS paeta immuunivalvontaa, B7H1 ilmentyminen määritettiin in HT29 solulinjassa ja peräsuolen syövän kudoksissa. Olemme havainneet, että koekspressio B7H1 ja CD133 oli läsnä kaikkialla HT29-soluissa (kuvio 4A). Täsmentämiseksi B7H1 ilmentymisen potilaan kudoksissa, peräsuolen syöpä kudokset kerättiin. EpCAM, joka on luminal epiteelin markkeri, käytettiin erottamaan syövän pesiä ja strooman alue [34]. Olemme havainneet, että B7H1 olivat lähinnä syöpäsoluissa yli puoli (11/20) paksusuolisyövän kudoksista (taulukko 4). Lisää kiinnostavaa, noin 50% CD133 ilmentävien syöpäsolujen ilmaistaan ​​B7H1 (kuvio 4B ja 4C, taulukko 4). Lisäksi B7H1 ja CD133 olivat aina koekspressoidaan EpCAM

+ soluissa (kuvio 4B ja 4C). Se osoittaa CD133

+ CSCS voisi paeta immuunivalvontaa ilmaisemalla estävää molekyyliä B7H1.

ilmentyminen CD133 (punainen) ja B7H1 (vihreä) in HT29 (A) (bar = 20 pm), ja ilmaus EpCAM (sininen), CD133 (punainen) ja B7H1 (vihreä) kolorektaalisyövässä kudoksissa (B) (bar = 50 nm) määritettiin immunofluoresenssivärjäyksen. Nucleuses värjättiin DAPI (harmaa). Suorakulmion alue kuvaa suurennetaan (C) ja näyttää tyypillisen koekspressio CD133 ja B7H1 (nuolilla). Se näkyy edustaja peräsuolen kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma, T3N0M0.

B7H1 ilmentävien solujen näyttää EMT fenotyyppejä peräsuolen kudoksiin

Huomasimme, että B7H1 ilmentyi CD133

+ soluja ja saattaa olla merkitystä immunoevasion syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Olisi mielenkiintoista tietää, onko B7H1 ilmentyminen liittyy EMT. Ongelman suoraan, B7H1 ilmentyminen EMT fenotyypin soluissa määritettiin 11 paksu- ja peräsuolisyövän näytteitä joista CD133 koekpsressoitiin kanssa B7H1. Samanlainen kuin aiemmat tutkimukset [35], B7H1 ilmentyi syöpäsolujen erityisesti reunalla syövän (kuvio 5). Näissä tapauksissa, erityisesti jos se näytti kasvain orastava, huomasimme, että 20% -40% of B7H1expressing syöpäsolujen alassäädetty E-kadheriinin (kuvio 5A). Lisäksi 10% -25% ja B7H1

+ syöpäsoluja ilmaisivat vimentiinista, joka on mesenkymaaliset markkeri (kuvio 5B), mikä osoittaa, EMT fenotyyppi Tietyissä B7H1

+ soluja. Yhdessä se viittasi siihen, että yli-ilmentyminen B7H1 saattaa olla yksi immunoevasive mekanismeja ei ainoastaan ​​CD133

+ CSCS, mutta myös ohimenevää EMT fenotyyppisen syöpäsoluja.

ilmentymisen B7H1 (vihreä) ja E- kadheriini (punainen) (A) tai B7H1 (vihreä) ja vimentiinin (punainen) (B) määritettiin immunofluoresenssin. Yksi B7H1 ilmentävien solujen on osoitettu nuolella. Nucleuses värjättiin DAPI (sininen). Se näkyy edustaja paksusuolen kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma, T3N0M0. (Bar = 20 pm)

Keskustelu

CSCS katsotaan olevan ”siemenet” syövistä ja lisäksi voi esiintyä solun lajittelu perustuu tiettyjä pintamerkkiaineita. Vaikka markkereita CSCS on edelleen kiistanalainen, syöpäsolut ilmentävät tiettyjä molekyylejä näyttää CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia [9]. CD133 on yksi merkkiaineiden hematopoieettisten kantasolujen ja pidetään CSCS markkeri kolorektaalisyövässä [5-7, 27, 28, 36]. Tässä tutkimuksessa CD133

+ soluilla oli CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia osoittamalla valmiutta pallo muotoilu ja tuumorigeenisyyteen, ilmentävät korkeampaa kantasolujen merkkiaineiden Oct-4 ja Sox-2, joka oli yli-ilmentynyt huonosti eriytetty kasvaimissa [29, 31] . Lisäksi nämä solut ilmenee EMT geeniekspressioprofiili, joka oli pidetty tärkeänä erityispiirre yhdistää CSCS [15].

tulokset CSCS kaltainen piirteet CD133

+ solut olivat yhdenmukaisia aikaisemmat tutkimukset [5-7]. Vuonna Päinvastoin, on olemassa joitakin muita Tulokset osoittivat, että CD133 negatiiviset solut hallussaan CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia sijaan [27, 28]. Esimerkiksi CD133 negatiivinen solulinja (NANK) perustettiin alkaen ksenografteista josta peräisin tuoreesta kirurgisen näytteistä ihmisen paksusuolen ensisijainen ja sen munasarjojen metastaattinen kudosten siirtämistä osaksi NOD /SCID [28]. NANK solut hallussaan CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten pallo muodostumista ja tuumorigeenisyystesti NOD /SCID-hiiriin. Verrattuna Tutkimuksemme, voidaan havaita, että alkuperä syövän solut olivat varsin erilaisia, mikä saattaa häiritä tulosten johdonmukaisuus. Lisäksi NANK solut erosivat alkuperäisestä syövän sekä, kuten CD 133 ja CD44 ilmaistiin alkuperäisen syövän vaan heikosti NANK. Siksi näyttää siltä, ​​että tämä kontrasti merkitsee kompleksi syövän sijasta virheitä tutkimusmenetelmiä. Vaikka se ei ole riittävän tiukasti käyttää CD133 yksin tunnistamiseen CSCS, se on vahvistanut, että CSCS rikastuneet CD133

+ alaryhmässä ja tehnyt näyttää CSCS kaltaisia ​​piirteitä. On mielenkiintoista ja arvokasta tutkia piirteitä tämän alaryhmän.

CD133

+ peräsuolen syövän solut sekä solulinjassa ja syöpä kudoksiin ilmenee ominaisuuksista teki heistä erityisen ja helpompi hyökätä ja etäispesäkkeitä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CD133

+ HT29 osoitti EMT fenotyyppien ja koekspressoi B7H1, mikä osoittaa CSCS voi ilmaista B7H1 kiertää immuunivalvonnan kun he hyökkäävät kautta EMT. Samanlaisia ​​HT29, CD133 ekspressiotaso kolorektaalisyövässä kudoksissa oli vaihteleva eri soluissa. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CD133 ilmentyi syöpäsoluihin mutta ei verisolujen sisäpuolella [4, 5] ja useimmat karsinooman solut ekspressoivat membraaniin glykoproteiini EpCAM [34], jota pidetään yhtenä CSC merkkiaineiden useita karsinooma erilaisia ​​[37] Meillä havaittu, että CD133 ilmentyi EpCAM

+ soluissa (kuvio 4), mikä osoittaa ne CD133 ilmentävät solut ovat peräsuolen syövän soluja. Vaikka EMT on merkitty ominaisuus CSCS, onko luontainen yhteys niiden välillä jää epäselväksi. Aiemmissa tutkimuksissa, CSCS kaltaisia ​​soluja voitaisiin tuottaa indusoituvien EMT aktivointi solulinjoja tai hiirimallissa [19, 38]. Niinpä ajattelimme, että samanlainen ilmiö saattaisi olla kolorektaalisyövässä. Nykyisessä kokeessa, -konfokaalimikroskoopilla havaitsemiseen käytettiin eri merkkiaineiden ilmentymistä syöpien, jotka voivat tarkkailla useita proteiineja ilmentymistä kussakin solussa samanaikaisesti. Kuten odotettua, huomasimme, että CD133

+ solujen paksu- ja peräsuolisyövän kudoksiin oli EMT fenotyyppejä, vähen- tämisessä E-kadheriinin ja upregulating vimentiinista. Tämä ilmiö tapahtui osaan CD133 positiivisia soluja, jotka saattavat olla huolissaan siitä syystä, että EMT oli dynaaminen kurssi ja vaikea saada kiinni kytkimen. Yhdessä tuloksemme osoittavat suoran yhteyden CSCS ja EMT kolorektaalisyövässä kudoksissa.

CSCS on luontainen biologiset ominaisuudet muodostavat kasvain ja voi etäispesäkkeitä kautta EMT. Olisi mielenkiintoista selvittää, miten ne kiertää immuunivalvonnan lopullista selviytymisen etenkin immunokompetenteilla hosts. B7H1 on ratkaiseva negatiivinen kostimuloivana molekyylin johtaa immunoevasion syövissä. B7H1 ilme CD133

+ syöpäsoluja osoittaa, että B7H1 voi olla rooli CSCS. Äskettäin kliinisiä osoitti, että esto PD-1-B7H1 reitti johtaa suhteellisen hyvän ennusteen syövän hoitoon ja B7H1 ilmentymistä syöpäkudoksissa liittyy tulosten käsittelyä [39]. Sen perusteella, mitä olemme täällä, tämän merkittävän tuloksen saattavat liittyä ohjata CSCS kohdistamalla PD-1-B7H1 reitin. B7H1 pidetään parempi kohde kuin toinen negatiivinen yhteistyön stimuloivaa molekyyliä, CTLA-4, koska jakelu B7H1 /PD-1 akseli on sisällä kasvain mikroympäristön valikoivasti [40, 41]. Tuloksemme viittaavat siihen, että kohdistaminen B7H1 saattaisi vahingoittaa ”prime syyllinen” syövän, syövän kantasoluja, kolorektaalisyövässä. Lisäksi jotkut B7H1

+ ilmenneen EMT-kaltainen fenotyyppi, vihjaten potentiaaliliitännästä immunoevasion ja EMT. Siirtogeenisissä hiirissä mallissa, se oli osoitettu, että ylössäätely B7-H1 ihon epiteelisoluissa edistänyt EMT ja nopeuttaa syövän syntymistä [42], mikä vastasi meidän toteamisesta B7H1 ilmentäviä syöpäsolut oli EMT fenotyyppejä kolorektaalisyövässä kudoksissa.

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat B7H1 ilmaisun ja EMT fenotyyppejä CD133

+ soluja, mikä osoittaa mahdollisia mekanismeja CSCS paeta immuunivalvonnan ja hyökätä kaukainen kudoksiin. Vaikka jotkut tutkimukset epäilyksenalaiseksi CD133 varten CSCS ”merkki, tulokset viittaavat siihen, että CD133

+ subpopulaatio sisältyi osa soluista ominaisuuksiltaan auttaa solujen hyökätä ja etäispesäkkeitä, erityisesti jossa ilmeinen EMT fenotyyppien ja ilmaista B7H1. Tällainen pieni osa syöpäsolut ovat voimakkaita tuumorigeenisyyteen ja voi hyökätä ja etäispesäkkeitä ilman immuunijärjestelmän hyökkäys, joka voi sulkea sen teoreettinen CSCS in toiminnalliset näkökohdat. On kuitenkin vielä epävarmaa EMT ja B7H1 ilmaus CSCS ovat kaksi itsenäistä tapahtumia tai sääntelee samaa signalointireitin samanaikaisesti. Kävi ilmi, että mTOR signaali ja hypoksia-indusoituva tekijä -1α, mikä oli tärkeä tekijä aiheuttaa EMT, säännellään CD133 ilmentyminen syöpäsoluissa [43], mikä osoittaa, että CD133 ilmentyminen ja EMT fenotyypit liittyivät hypoksia ja saattaa säädellä mTOR signaali. Lisäksi B7H1 säädeltiin PTEN kautta PI3K /AKT /mTOR signalointi haimasyövän [44]. Nämä tutkimukset ehdotti, että mTOR signalointi voisi olla mukana suhde EMT ja immuuni kiertämistä CSCS. Sen jälkeen yritämme saada selville tärkeitä reitin koskee EMT ja immunevasion in CSCS edelleen tutkimuksessa, joka voi olla ratkaiseva tavoite syövän hoidossa.

tukeminen Information

S1 Kuva. CD133 on tuskin ilmaistaan ​​paraneplastic kudoksessa.

Immunofluoresenssikoe jäädytettyjen osan paksusuolensyöpä näytteen osoittaa, että on olemassa alue suhteellisen normaali vieressä syövän pesiä, jossa CD133 (punainen) on melko heikompi (vasemmalla) kuin syöpä pesä (oikealla) . DAPI (harmaa) käytettiin tahraa ydinvoiman. Se näkyy edustaja paksusuolen kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma, T3N0M0. (Bar = 50 pm) B doi: 10,1371 /journal.pone.0135528.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Dr Yongwen Chen oivaltava kommentteja, Prof. Lieping Chen B7H1 vasta-aine ja Wei Sun ja Liting Wang erinomaista teknistä apua kuvakokoelmapaneelin laserkeilauksen konfokaali- fluoresenssimikroskooppiin.