Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (PCSCs) ollaan erittäin tutkitut pääosin johtuen niiden maksuosuuksien eturauhasen kasvaimien syntyyn kuitenkin käsityksemme PCSC biologian, mukaan lukien niiden kriittisiä polkuja, edelleen puutteellisesti. Kun taas epidermaalinen kasvutekijä (EGF) on käytetty laajalti säilyttää PCSC soluissa in vitro, on tärkeää EGF-riippuvaisten signalointi- ja sen loppupään reittejä PCSC itseuudistumisen eivät ole hyvin karakterisoitu. Tutkimalla DU145 pallo solujen populaatio eturauhassyöpäsolujen kara kaltaisia ​​ominaisuuksia, me raportoimme tässä, että kasvutekijän reseptorin (EGFR) signalointi on keskeinen rooli etenemisessä DU145 PCSCs. Aktivointi EGFR signaloinnin kautta lisäämällä EGF ja ektooppinen ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen EGFR mutantti (EGFRvIII) kasvoi pallo muodostumista. Kääntäen, EGFR signalointi käyttäen EGFR: n estäjien (AG1478 ja PD168393) ja knockdown EGFR estivät merkittävästi PCSC itseuudistumisen. Yhdenmukainen MEK-ERK-reitin ollessa tärkeä kohde EGFR signaloinnin aktivointi MEK-ERK-reitin osaltaan EGFR-helpotti PCSC leviämistä. Modulointi EGFR signalointi vaikuttaa solunulkoisen signaalin liittyvistä kinaasi (ERK) aktivoituminen. Inhibitio ERK aktivointi läpi useita lähestymistapoja, kuten hoito MEK estäjän U0126, ektooppinen ilmentyminen dominanttinegatiivivaikutus MEK1 (K97M), ja knockdown joko ERK1 tai ERK2 johti vankka väheneminen PCSC leviämistä. Yhdessä esillä tutkimus antaa näyttöä siitä, että EGFR signalointi edistää PCSC itseuudistumisen osittain aktivoimalla MEK-ERK-reitin.

Citation: Rybak AP, Ingram AJ, Tang D (2013) eteneminen Ihmisen eturauhasen Cancer Stem-Like cells kautta EGFR välittämän ERK aktivointi. PLoS ONE 8 (4): e61716. doi: 10,1371 /journal.pone.0061716

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 marraskuu 2012; Hyväksytty 17. maaliskuuta 2013 Julkaistu: 19 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Rybak et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tukea (RMS 79-71) Kanadan Institutes of Health Research DT ja taloudellisen tuen St. Josephin HealthCare Hamilton, oN, Kanada, että Hamilton Center for Munuaiset Research (HCKR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on miesten yleisin maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miehillä länsimaissa [1], [2]. Prosessin aikana eturauhasen tumorigeneesin, onkogeeninen signalointireittien edistää etenemistä hormoniriippuvaista karsinoomien ja hormoniresistentti eturauhassyöpä (HRPC), The vähentämään merkittävästi eturauhassyövän kuolemantapauksia [3], [4]. Vaikka tarkkaa mekanismia vastuussa taudin alkamisen ja etenemisen eturauhassyöpä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia, eturauhassyöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (PCSCs) pidetään laajalti kriittiseksi eturauhasessa kasvainten synnyssä ja sen kehitystä kohti HRPC tauti [5] – [7].

huolimatta yhä enemmän todisteita viittaa olemassaolosta PCSCs tunnistaminen ihmisen PCSCs in vivo on näytti olevan haastava tehtävä. Tämä haaste on suurelta osin epäyhtenäisyyttä eturauhassyövän ja rajoitettu näytteet saatavissa kliinisistä lähteistä. Meidän rajoitettu ymmärrys PCSCs on myös osaltaan kyvyttömyys eristää ja levittää PCSCs ihmisen ensisijainen karsinoomia. Voidaan parantaa tietämystä ja PCSCs, useat tutkimusryhmät, myös meidän, on rikastettu PCSCs ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Tämä johtuu suurelta osin sen osoittaminen, että syöpä kantasolut (CSCS) voidaan tutkia alalla dosviljelmämäärityksessä seerumittomissa (SF) media olosuhteissa. Tätä määritystä on käytetty johtamaan ja levittää CSCS aivoista [8], rintojen [9], paksusuolen [10] ja eturauhasen syöpäsolujen [11] – [16] in vitro. Vielä tärkeämpää on, alalla kulttuurin lähestymistapa on saanut leviämistä eturauhassyövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka näyttävät CSC ominaisuudet itseuudistumisen ja kyky aloittaa kasvaimen muodostumisen in vivo [11], [12], [15], [17] .

Sphere kulttuuri yleisesti liittyy etenevä kantasolujen kaltaisia ​​soluja SF-alusta täydennettynä epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) [8] – [13]. Vaikka läsnäolo sekä EGF ja bFGF mahdollistaa sukupolven pallojen DU145 soluista [11], [12], [17], onko tämä on ihanteellinen edellytys pallo sukupolven ja PCSC ylläpidon pidemmän aikaa jää epäselväksi. Meidän äskettäisessä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että EGF on ratkaiseva merkitys pitkän aikavälin etenemisen DU145 PCSCs, ja että nämä kantasolujen kaltaisia ​​soluja kykenee aloittamaan kasvainten merkittävästi parannettu kyky ei-lihavilla, diabeettiset /vaikeaa yhdistettynä immuunivajavaisiin (NOD /SCID) hiiriä [11]. Kuitenkin rooli EGFR signalointi, yhdessä sen loppupään polkuja, joita tarvitaan DU145 PCSC eteneminen on vielä ominaista.

Pyrkimyksissämme edistää tätä tietoa, osoitamme tässä, että EGFR-ERK yhteys näyttelee tärkeä rooli leviämisen DU145 PCSCs. Vaikka nämä PCSCs pystyvät leviämään ilman eksogeenisen EGF, aktivointi EGFR signalointi on kriittinen ylläpito DU145 PCSCs koe manipulointi EGFR signalointi vaikuttaa DU145 PCSC leviämistä. Lisäksi modulaatio EGFR signaloinnin DU145 PCSCs vaikuttavat syvästi ERK aktivointia. Lisäksi esto ERK aktivoinnin avulla on MEK-inhibiittorin, ektooppinen ekspressio määräävän-negatiivinen MEK1 (K97M), ja pudotus endogeenisen ERK1 tai ERK2, kollektiivisesti vähentää leviämistä DU145 PCSCs. Yhdessä nämä tulokset korostaa panosta MEK-ERK signalointi EGFR-välitteisen PCSCs itseuudistumisen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture ja eteneminen DU145 PCSCs

DU145 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja 293T ihmisen alkion munuaisen solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), ja viljeltiin mukaisesti ATCC ohjeiden.

DU145 ihmisen eturauhassyövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja eristettiin ja kasvatettiin, kuten aiemmin on julkaistu [11]. Lyhyesti, DU145 yksikerroksinen solut entsymaattisesti hajotettiin yksittäisiksi soluiksi käyttämällä fenolipunaista TrypLE Express liuos (Life Technologies, Calsbad, CA, USA) ja 40 um solun- (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), ja sen jälkeen suspendoitiin uudelleen at sub-klonaalisia (5 solua /ul) tiheys seerumivapaassa (SF) media (DMEM /F12, jonka 03:01 seos) (Life Technologies), joka sisälsi 0,4% naudan seerumin albumiinia (BSA) (BioShop Canada Inc., Burlington, oN, Kanada) ja 0,2 × B27 puuttuu vitamiini (Life Technologies) T75- pulloihin (15 ml kokonaistilavuus) on suunniteltu käytettäväksi jousitus soluviljelmässä (Sarstedt Inc., Newton, NC, USA). Kun tutkitaan vaikutus EGF: n hoidon alalla muodostumiseen, yhdistelmä-DNA-EGF: n (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) lisättiin konsentraationa 10 tai 20 ng /ml. Tyypillisiä palloja muodostetaan 10 12 päivää. Sphere soluja Saharan viljeltiin entsymaattisella dissosiaatiota, kireät, ja sitten suspendoitiin uudelleen edellä väliaineessa alemmilla kloonitiheydessä.

Sphere Formation Analyysit

arvioimiseksi muodostumista ensisijainen palloja, DU145 solut sub-konfluentteja (-80%) yksikerrosviljelmiä suspendoitiin uudelleen edellä SF-väliainetta tiheyteen 2,5 x 10

3 solujen yksittäisiin kuoppiin 24-kuoppaiselle viljelylevylle (3 syvennystä per käsittely) (Corning, Corning , NY, USA). Solut ympättiin tilavuudessa 0,5 ml /kuoppa, toisin kuin 1 ml /kuoppa, kuten aiemmin on julkaistu [11]. Pallot, jotka muodostivat yli 12 päivän viljelyn laskettiin. Mitata palloja muodostavan kapasiteetin toissijaisista tai vakiintunut aloilla, spheres solut yksilöllisesti entsymaattisella dissosiaatiota, kireät, ja sitten maljattiin tiheydellä 5 x 10

2 tai 1 x 10

3 solua /kuoppa 24 -kuoppaiset levyt (3 syvennystä per käsittely), ellei toisin mainita. Pallot, jotka muodostivat laskettiin 12 päivän kuluttua viljelyn.

Plasmidit ja Virus Production

EGFRvIII /pLNCX luovutti ystävällisesti Dr. Khalid Al-Nedawi (Hamilton Centre for Munuainen Research, Hamilton, ON, Kanada). EGFR (K721A) /pLHCX luovutti ystävällisesti Dr. Joan Krepinsky (Hamilton Centre for Munuaiset Research). Rakentaminen MEK1 (K97M) /pLHCX on aiemmin kuvattu [18]. Lyhyen hiusneula ERK1 ja ERK2 kohdistaminen (shERK1 ja shERK2, vastaavasti) vektorit konstruoitiin hehkutus ja subkloonaamalla aiemmin julkaistu kohdennussekvenssiä (ERK1: GCCATGAGAGATGTCTACA; ERK2: GAGGATTGAAGTAGAACAG) [19] kuin hiusneula osaksi pRIH retrovirusvektoriin, mukaan meidän julkaistuista ehdoista [18]. Lyhyen hiusneula ohjaus (shLacZ) vektori sisältää sekvenssin kohdistaminen

Escherichia coli

β-galaktosidaasi (shLacZ kohdesekvenssi: GCAGTTATCTGGAAGATCA). Korkeita tiittereitä tyhjän vektorin (EV) /pLNCX, EGFRvlll /pLNCX, EV /pLHCX, EGFR (K721A) /pLHCX, MEK1 (K97M) /pLHCX, shLacZ /pRIH, shERK1 /pRIH ja shERK2 /pRIH retrovirus valmistettiin käyttämällä 293T-soluihin , kuten aiemmin on kuvattu [18]. DU145-solut infektoidaan seuraavaksi erityisiä retrovirus, ja infektoidut solut valittiin hygromysiinin (0,5 mg /ml; Life Technologies) ja pLHCX ja pRIH-pohjainen infektiot, tai G418: aa (1 mg /ml; Sigma-Aldrich) ja pLNCX-pohjainen infektioita. Kohdunulkoinen EGFRvIII ja MEK1 (K97M) lauseke, tai knockdown endogeenisten ERK1 tai ERK2, varmistettiin Western blot -analyysillä.

Short-hiusneula EGFR kohdistaminen lentivirusvektoreita ostettiin Sigma-Aldrich, jossa kohdesekvenssit (shEGFR1 : GCTGCTCTGAAATCTCCTTTA; shEGFR2: GCCACAAAGCAGTGAATTTAT) kloonattiin hiusneulan pLKO.1 vektori, kun taas ei-spesifinen shRNA (plasmidi 1864; Addgene, Cambridge, MA, USA) käytettiin kontrollina (shCTRL). Tuotanto shEGFR ja shCTRL lentivirukselle toteutettiin transfektoimalla kukin shRNA plasmidi (10 ug) plasmideilla (10 ug kutakin) tarpeen kolmannen sukupolven lentiviraalinen tuotanto (pRSV-REV, pCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE) [ ,,,0],20], jonka toimitti ystävällisesti Dr. Bryan E. Strauss (University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brasilia), 293T-soluihin käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää. Kuusikymmentä tuntia (h) transfektion jälkeen, supernatantit, jotka sisältävät VSV-G-pseudotyypitettyä, replikaatiokyvyttömäksi lentiviruksen Partikkelit otettiin talteen, suodatettiin 0,45 um: n suodattimen ja sentrifugoitiin 2 h 48000 g. Viral pelletit suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan väliainetta, joka sisälsi 10 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich) ja lisättiin yksikerrossoluissa 2 tuntia kostutetussa 37 ° C: ssa inkubaattorissa, ajoittain sekoittaen 20 minuutin välein, jotta solun infektio. Infektio on valittu puromysiiniä (1 ug /ml; Sigma-Aldrich).

infektion alalla solujen shEGFR2 ja shCTRL lentivirus pelletit suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan seerumitonta väliainetta, joka sisälsi 0,4% BSA: ta, 0,2 × B27 (puuttuvat vitamiini) ja 10 ug /ml polybreeniä ja lisättiin yksilöllisiä (3 x 10

5) soluissa 2 tuntia kostutetussa 37 ° C inkubaattorissa, ajoittain sekoittaen 20 minuutin välein, jotta solujen infektio. Sphere solut myöhemmin ympättiin tiheydellä 10

4 solua /ml T75 pulloissa nimetty jousitus soluviljelmässä (Sarstedt Inc.). Puromysiinin (1 ug /ml) lisättiin alalla viljelmiä 48 tuntia infektion.

riippumattomaan kasvuun määritys

DU145 alalla soluviljelmiä maljattiin yksittäisiin kuoppiin kuusi hyvin levyille tiheytenä 10

4 solua /kaivo, kuten aiemmin on kuvattu [11]. 8 viikon kuluttua, vaihekontrasti kuvat on otettu 5 satunnaisesti aloilla per kuoppa käyttäen Zeiss Axiovert 200 M mikroskooppi (AxioVision 3.1 -ohjelmisto) klo 25X suurennus, ja pesäkkeitä, jotka sisälsivät ≥50 solut laskettiin. Vaihekontrasti kuvat sittemmin käsitelty käyttäen CorelDRAW Graphics Suite X4 ohjelmistot (Corel, Ottawa, ON, Kanada).

EGFR ja MEK Inhibitiotutkimuksissa

EGFR: n estäjien AG1478 ja PD168393 (Calbiochem, Darmstadt, Hesse, Saksa) ja MEK-inhibiittori U0126 (Promega, Madison, WI, USA) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma-Aldrich) ja käytettiin annettuina pitoisuuksina. DMSO annettiin identtinen tilavuus kontrollina (mock hoito). EGFR-inhibiittoria (AG1478 tai PD168393), MEK (U0126) tai DMSO (mock) hoito annettiin ajankohtana kylvö alalla soluja. Sphere muodostuminen kvantitoitiin kuten aiemmin on esitetty. EGFR ja MEK1 kinaasiaktiivisuutta (määritettynä EGFR ja ERK1 /2-fosforylaation tila, vastaavasti) varmistettiin Western blot -analyysillä.

Vasta-aineisiin perustuvia EGFR toiminnan estävää kokeita alalla soluissa suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, atsidi-free-EGFR esto hiiren monoklonaalista (Ab-1, klooni 528) vasta-aineen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) tai hiiren IgG2a-isotyyppiä kontrollivasta-aine (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

DU145 Kuulat Jatkokäytetty puuttuessa Eksogeeninen Mitogeenien Näyttö EGFR Signal Activation

Olemme aiemmin raportoitu, että vaikka EGR lisäravinteen merkittävästi edistänyt sukupolvi ja leviämistä DU145 pallojen muodostumista pallojen ei vaadi lisäämättä eksogeenistä EGF [11] viittaa siihen, että EGFR signalointi voi aktivoitua ilman eksogeenista EGF. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, olemme luoneet pallojen DU145 soluista puuttuessa (EGF) ja EGF (10 tai 20 ng /ml EGF; 10EGF tai 20EGF, vastaavasti) ja sen jälkeen kasvatetaan nämä perustettu alueille, kolme kanavaa, alle samanlaiset olosuhteet, joissa ensisijainen aloilla kertyi ennen arvioidaan niiden palloja muodostavan kapasiteetin. Kuulat syntyy EGF media ehto voidaan ylläpitää johdonmukaisesti vähintään kolme kanavaa. Lisäksi kyky tuottaa ja ylläpitää aloilla että EGF kunnossa (kuva 1A) esittää, että eteneminen alle EGF-vapaa (myös lisäämättä muiden ulkoisten kasvutekijöiden) viljelyliuosolosuhteissa on luontainen ominaisuus DU145 PCSCs. Tätä mahdollisuutta tukee se, että pallojen lukumäärä säilyy ymppäyksen jälkeen 5 x 10

2 solua /kuoppa oli noin puolet siitä, lisättyjen ymppäyksen jälkeen 1 x 10

3 solua /kuoppa (kuvio 1A). Lisäksi tämä mahdollisuus on myös linjassa viime havainto, että EGF aloilla on tuotettu EGF median yli 15 peräkkäistä kohtia, että johdonmukaisesti kuten kuviossa 1A, kun tämä käsikirjoitus valmistettiin (data ei esitetty). Vaikka EGF parannettu alalla eteneminen verrattuna alalla kasvatettujen solujen EGF media (10EGF ja 20EGF verrattuna EGF), 20EGF ei edelleen edistää alan määrä verrattuna 10EGF hoitoon. Tämä viittaa siihen, että EGF-indusoitu kynnyksen olemassa (kuvio 1A).

A) EGF lisää alalla muodostumista riippumaton solun istutustiheyteen. DU145 aloilla syntyi ja pidettiin seerumivapaassa väliaineessa, joka sisälsi 0,4% BSA: ta ja 0,2 x B27 (SF), ja johon on lisätty tai ilman EGF: n (10 tai 20 ng /ml; 10EGF tai 20EGF, vastaavasti) ja kolmen kanavan perustaa EGF- ilmainen (EGF) ja EGF-stimuloidun pallo kulttuureissa ennen koetta. Sphere soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

2 ja 1 x 10

3 solua /kuoppa (1 x 10

3 ja 2 x 10

3 solua /ml, vastaavasti) 24 kuoppaiset levyt (kolme toistoa käsittelyä kohti). Kuusi koetta suoritettiin. Kuulat ylläpidetään EGF-täydennetty SF medianäyttö parannettu pallo numeroita verrattuna EGF alalla kulttuureissa. Kuulat ylläpidetään SF väliaineessa, joka sisälsi 10 ng /ml EGF eivät näy lisäkorotukset palloja muodostavan kapasiteetin. B) hoito EGF aloilla kasvavien pitoisuuksien kanssa EGF (+ 10EGF tai + 20EGF, vastaavasti) lisääntynyt pallo muodostumista, ja C) parantaa aktivointi EGFR signaloinnin (EGFR fosforylaation Tyr1068, EGFR-P). Sphere numerot näytetään keskiarvona ± SEM Neljän itsenäisen kokeen (*

p

0,05 verrattuna vastaaviin EGF media kunnossa, kaksisuuntaisia ​​riippumatonta Opiskelijan

t

-testi).

sen tutkimiseksi, palloja syntyy ja ylläpidetään EGF median ehto reagoida EGFR signaalin aktivointia, olemme viljelty perustettu, EGF-vapaa palloja läsnäollessa eksogeenisen EGF. Ei ainoastaan ​​nämä EGF-vapaa pallo solut reagoivat eksogeenisten EGF kohtelun ympättiin Saharan klonaalinen tiheydet 5 x 10

2 ja 1 x 10

3 solua /kuoppa (1 x 10

3 ja 2 × 10

3 solua /ml, vastaavasti) (kuvio 1 B), mutta ne reagoivat myös EGF samalle tasolle kuin aloilla tuotetaan ja ylläpidetään EGF sisältävässä väliaineessa (vertaamalla Kuva 1B Kuva 1A). Nämä havainnot osoittavat, että ilman eksogeenisten EGF, pallojen ehkä aktivoida EGFR signalointi. Tämän tueksi mahdollisuutta, fosforylaatio EGFR at tyrosiinin (Y) 1068 (EGFR-P), joka on yleisesti käytetty korvikemarkkerilta EGFR signaalin aktivoinnin [22], oli helposti havaittavissa EGF ja + EGF (10EGF ja 20EGF) pallo solujen (kuvio 1C). Yhdessä edellä havainnot tukevat käsitystä, että EGFR signalointi on tärkeä rooli leviämisen DU145 PCSCs.

pakotetulta EGFR Signal Activation Renders DU145 PCSCs jättäminen reagoivat EGF Hoito

Edelleen selvittää rooli EGFR signaalin aktivoinnin DU145 PCSCs, konstitutiivisesti aktiivisen EGFR-mutantti, EGFR variantti III (EGFRvIII) [23], on yli-ilmentynyt DU145 yksikerrossoluissa (kuvio 2A). EGFRvIII-ilmentävien solujen näytetään kohonneet Tyr1068 fosforylaatiota (EGFR-P) ja ERK aktivointi (Thr202 /Tyr204 fosforylaatio ERK1 /2, ERK1 /2-P) SF media (kuvio 2A), mikä osoittaa, että ektooppinen EGFRvIII ilmentyminen johti konstitutiivista EGFR-signalointia. Verrattuna tyhjän vektorin (EV) transdusoidut DU145-solut, DU145 EGFRvIII-ilmentävien solujen tuottamat useampia primäärisiä aloilla, EGF media (kuvio 2B). Lisäksi EGF lisäravinteen edistänyt sukupolven ensisijaisen pallojen DU145 EV-soluissa, mutta ei EGFRvIII-ilmentäviä soluja (kuvio 2B). Kuitenkin EGFRvIII ilmentäviä pallo solut voivat muodostaa ensisijaisen pallojen EGF mediaa samalla tasolla kuin DU145 EV pallo soluja kasvatetaan läsnä eksogeenisen EGF (kuvio 2B). Näin ollen, DU145 EGFRvIII-ilmentävät soluilla vertailukelpoinen kyky ensisijaisen alalla sukupolvelle DU145 EV-soluja stimuloitiin rekombinantilla EGF: n (kuvio 2B). Samanlaisia ​​havaintoja saatiin myös vuonna alalla eteneminen (so tuotanto toissijaisen pallojen päälle kylvö 10

3 solua /kuoppa) (kuvio 2C). Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, että EGFR signalointi edistää leviämistä DU145 PCSCs.

A) Western blot-analyysi EGFRvIII ilmaisun ja aktivointi (Tyr1068 fosforylaatiota, EGFR-P) DU145 vanhemman (yksikerroksisen) soluja kasvatettiin seerumin täydennetty (10% FBS) ja seerumitonta (SF) media. EGFRvIII ilmentyminen DU145 soluissa aktivoituu ERK signalointi. ERK aktivaatio määritettiin tutkimalla fosforylaatio ERK1 ja ERK2 proteiinien Thr202 ja Tyr204 tähteitä, vastaavasti (ERK1 /2-P). B) Ensisijainen (1 °) ja C) toissijainen (2 °) pallo muodostumista seuraava EGFRvIII ilmentymistä DU145 soluissa verrattuna tyhjän vektorin (EV) kontrolli soluja. Solut ympättiin seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 0,4% BSA: ta, 0,2 x B27 ja puuttuu eksogeenisiä kasvutekijöitä (EGF), tai EGF täydentää (10 ng /ml; 10EGF) tiheydellä 2,5 x 10

3 (1 ° pallo muodostuminen) tai 1 x 10

3 solua /kuoppa (2 ° pallo muodostuminen) 24-kuoppalevyillä (0,5 ml /kuoppa; kolme rinnakkaista käsittelyä kohti). Kokeet tehtiin kolmena kappaleena. Sphere numerot näytetään keskiarvona ± SEM (

p

arvot osoitetaan vertailun saatiin kaksisuuntaisella riippumatonta Opiskelijan

t

-testi).

EGFR Blockade Vähentää kyky uusiutua of DU145 PCSCs

tutkimiseksi edelleen vaatimus EGFR signaloinnin lisäykseen (itseuudistumisen) ja DU145 PCSCs, tutkimme vaikutus EGFR signaalin estoa pallo ylläpitoon. Sphere soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla AG1478 (Tyrphostin), selektiivinen estäjä EGFR (erbb1) kinaasiaktiivisuutta, joka toimii sitomalla se ei-aktiivisessa muodossa [24]. AG1478 hoito tutkittiin 24 tunnin hoidon jälkeen, kuten EGF hoito saavutti korkeimman tason EGFR-P-alalla soluissa tänä ajankohtana (kuva S1). AG1478 pienensi EGFR aktivaation annoksesta riippuvalla tavalla in alalla solujen, kanssa ja ilman sitä lisäämättä eksogeenistä EGF: n (kuvio 3A). Lisäksi AG1478 vähensi annosriippuvaisesti alalla lisääminen, kuten pallojen lukumäärä syntyy vahvistettu pallo soluviljelmistä väheni AG1478 hoidossa, riippumatta siitä, onko eksogeenisen EGF oli läsnä (kuvio 3B). Samanlaisia ​​havaintoja saatiin myös käyttämällä EGFR estäjää PD168393 [25] (kuvio 3C). Tämä osoittaa, että EGFR signaloinnin estää kyky uusiutua ja DU145 PCSCs.

A) Western blot -analyysi kokosolulysaateista seuraavan 24 tunnin hoidon DU145 aloilla DMSO (D) tai lisääntyvien konsentraatioiden AG1478 ( 0,1-20 uM välillä), kun läsnä on tai ei ole eksogeenisiä EGF: n (10 ng /ml; 10EGF). Sphere muodostuminen EGF-free alalla solujen esti hoidon jälkeen EGFR: n estäjien B) AG1478 tai C) PD168393 eri annoksilla läsnä (10EGF) tai ilman sitä (EGF) eksogeenisen EGF: ää (10 ng /ml). Sphere-solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

3 solua /kuoppa (0,5 ml /kuoppa, kolme rinnakkaista käsittelyä kohti). EGFR-inhibiittoria (AG1478 tai PD168393) tai DMSO (mock) hoito annettiin ajankohtana kylvö. Muodostuneiden pallojen laskettiin 12 päivää post-kylvö. Sphere numerot näytetään keskiarvona ± SEM (

p

arvot osoitetaan vertailun saatiin kaksisuuntaisella riippumatonta Opiskelijan

t

-testi).

edelleen puuttua onko menetys EGFR signalointi vaikuttaa kyky DU145 PCSCs elättämiseen, DU145 yksikerrossoluissa tartutettiin shRNA -konstrukteilla kohdistaminen EGFR. Nämä rakenteet tehokkaasti tippuu alas EGFR, hieman vaihtelua tasot EGFR pudotus sijaitsee kyseisellä vakaa solulinjojen (kuvio 4A). ShEGFR rakentaa # 2 (shEGFR2) saavutettiin suurempi pudotus kuin shEGFR1 (95% vs. 70%, vastaavasti) (kuvio 4A). Vakaa EGFR pudotus solulinjoja voitiin pitää täysin mediassa. Kuitenkin, ektooppinen ilmentyminen EGFR (K721A), EGFR-mutantti, josta puuttuu proteiinin tyrosiinikinaasin aktiivisuuden [26], johti solukuoleman ja esti sukupolven stabiili solulinja, (tietoja ei ole esitetty). Käyttämällä näitä vakaa EGFR pudotus solulinjat, pystyimme osoittamaan, että EGFR Knockdown vuonna DU145 soluissa vähentänyt niiden kykyä tuottaa ensisijaisesti aloilla verrattuna shCTRL soluihin (kuvio 4B). Kyky EGFR Knockdown vaikuttamaan alan huolto tutkittiin myös. Vakaa EGFR Knockdown-alalla soluissa (kuvio 4C) vähensi myöhemmin pallojen muodostettu EGF media ehto (kuvio 4D).

A) DU145 yksikerrossoluissa tartutettiin EGFR shRNA lentiviraalinen rakentaa ja valita puromysiinin jotta saadaan aikaan vakaa solulinjojen. Western blot-analyysi eri EGFR pudotus (shEGFR) solujen suorittaa arvioimiseksi EGFR pudotus tehokkuutta verrattuna ei-spesifinen shRNA ohjaus (shCTRL) solulinjassa. B) Vakaa EGFR pudotus solut muodostavat vähemmän ensisijainen (1 °) aloilla verrattuna shCTRL soluihin. Solut ympättiin tiheydellä 2,5 x 10

3 solua /kuoppa (0,5 ml /kuoppa, kolme rinnakkaista käsittelyä kohti). Sphere numerot näytetään keskiarvona ± SEM Kolmen riippumattoman kokeen (*

p

0,05 verrattuna vastaaviin EGF media ehto kustakin solulinjasta, kaksisuuntaisia ​​riippumatonta Opiskelijan

t

-testi). C) Tehokas EGFR Knockdown vakiintuneilla DU145 aloilla voidaan saavuttaa. Soluja EGF-vapaa (EGF) aloilla infektoitiin shCTRL ja shEGFR2 lentiviruksen. Menetys EGFR-proteiinin ilmentymisen merkittävästi vähentää D) määrä DU145 pallojen kasvatettiin EGF-vapaan median olosuhteissa. EGFR pudotus (shEGFR2) ja shCTRL alalla solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

3 solua /kuoppa (kolme toistoa per solulinja). Määrä muodostuneiden pallojen laskettiin 12 päivää post-kylvö. Sphere numero näkyy keskiarvo ± SEM Kolmen riippumattoman kokeen (**

p

0,01, kaksisuuntainen riippumatonta Opiskelijan

t

-testi). E) EGFR Knockdown in DU145 alalla soluissa merkittävästi vähentäneet in vitro kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Kokonaismäärä siirtomaiden 5 random aloilla (at 25X suurennus) laskettiin ja edustettuina keskiarvo ± SEM Kolmen riippumattoman kokeen (**

p

0,01, kaksisuuntainen riippumatonta Opiskelijan

t

-testi). Edustavia vaihekontrasti kuvia pesäkkeiden näkyvät 50X suurennus (upotus). Mittakaava on sama kuin 100 pm.

Tärkeä osa solutransformaatioon in vitro, jotka läheisesti korreloi in vivo kasvainten muodostumiseen immuunipuutteisilla hiirillä [27] – [29], on kyky tuumorigeenisen solujen levittämään alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa. Puuttumaan onko menetys EGFR vaikuttaa kiinnittämisestä riippumaton kasvu DU145 PCSCs perustettu EGFR pudotus pallo soluja ympättiin seerumissa täydennetty, pehmeä agar sisältävässä väliaineessa. EGFR Knockdown-alalla soluissa johti vähemmän pehmeä agar pesäkkeet verrattuna shCTRL piiriin soluja erilaistumaan (ts. Seerumin täydennetty) olosuhteissa (kuvio 4E). Yhdessä olemme osoittaneet, että EGFR signalointi on kriittinen ylläpitämiseksi DU145 PCSC eteneminen, joka on sopusoinnussa havaittu väheneminen pehmeässä agarissa pesäkkeiden numerot seuraavat EGFR knockdown.

MEK-ERK Signaling Säätelee itseuudistumisen ominaisuudet DU145 PCSCs

Kun osoitus siitä, että EGFR signalointi on kriittinen sukupolvi ja ylläpito PCSCs, me tutki vielä loppupään mekanismeja havaitun EGFR toimintaa. EGFR signalointi on tunnettu aloittaa signaloinnin tapahtumia, joihin aktivoinnin PI3K-AKT ja Raf-MEK-ERK (mitogeeni aktivoitu proteiini-kinaasien; MAPK) polkuja [30]. Lisäksi, EGFR signalointi on osoitettu aktivoivan signaalin anturi- ja aktivaattori transkription proteiinien (STAT) [31], erityisesti STAT3-välitteistä signalointia, [32]. Aktivointi STAT3 liittyy fosforylaation Tyr705 [33], ja STAT3 on osoitettu aktivoidaan eturauhassyövissä [34], [35]. Meidän edellinen työ on ehdottanut, että meidän järjestelmässämme, muut loppupään signalointi proteiineja, pikemminkin kuin AKT, on kriittinen EGF-tehostetun DU145 pallo muodostumisen [11]. Vaikka AKT saattaa osaltaan DU145 alalla eteneminen, olemme edelleen laajentaa meidän edellisen raportin tutkimaan osuudet ERK-reitin kohti EGFR-riippuvaista etenemisen DU145 PCSCs.

Tässä pyrkimyksessä pystyimme osoittamaan, että EGF stimulaatio EGF-vapaa DU145 pallo solut johti ERK aktivointia, mutta ei STAT3 aktivointia, on ajasta riippuva tavalla (kuva S1). Lisäksi MEK-inhibiittori, U0126 [36], annoksesta riippuen vähensi kyky uusiutua ja DU145 PCSCs (kuvio 5A). Kuten odotettua, U0126 esti ERK-aktivaation DU145 PCSCs (kuva S2). Tulosten vahvistamiseksi syyllistämättä MEK-ERK signalointi DU145 PCSC eteneminen, olemme ilmaisseet hallitseva-negatiivisen MEK1 (K97M) [37] vuonna DU145 soluissa (kuvio 5B). MEK1 (K97M) soluilla vähentää ERK aktivaatio verrattuna tyhjän vektorin (EV) kontrollisoluja seuraavat FBS-stimulaation (10%) seerumin-puutteellisista soluista (kuvio 5B). Verrattuna EV-soluja, MEK1 (K97M) soluilla merkittävä väheneminen tuottaa ensisijaisen aloilla (kuvio 5C). Tukeakseen MEK-ERK signalointi on kriittinen EGFR välittämää sukupolven DU145 PCSCs, eksogeeninen EGF oli kykenemätön edistämään ensisijainen pallo muodostumista MEK1 (K97M) soluja (kuvio 5C).

A) esto ERK