Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ymmärtäminen molekyylitason ominaisuudet erityisten kasvaimia voi lisätä tietoa mekanismi (t) taustalla sairauksien kehittymisestä ja etenemistä. Tämä on erityisen merkittävää ja peräsuolen syöpä, joka on heterogeeninen kompleksi sairauksia kehitetään peräkkäin läpi monivaiheisen karsinogeeninen prosessi. Sellaisena se on todennäköistä, että kasvaimia, joilla on samanlaiset ominaisuudet, saattavat olla peräisin samalla tavalla ja on samanlainen molekyyli käyttäytymistä. Siksi erityinen kartoitus molekyylitason ominaisuudet voivat olla potentiaalisesti hyödyllisiä sekä kasvainten luokittelun ja kehittämään asianmukaista hoito-. Tämä voidaan toteuttaa vain kehittämällä korkean affiniteetin molekyylinäytteitä kanssa kyky tunnistaa erityisiä merkkiaineita, jotka liittyvät eri kasvaimiin. Aptameerit helpoimmin vastata haasteeseen perustuu niiden kohde monimuotoisuus, joustava manipulointia ja helppous kehitystä.

Menetelmät ja tulokset

Käyttäen menetelmää kutsutaan solupohjaisille Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen rikastamiseen (cell-SELEX) ja peräsuolen syövän viljellyt solulinjat DLD-1 ja HCT 116, valitsimme paneeli kohdespesifisen aptameerien. Sitovat tutkimukset virtaussytometrillä ja konfokaalimikroskopialla osoitti, että näillä Aptameerien on suuri affiniteetti ja valikoivuus. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että nämä Aptameerien kumpikaan tunnistaa normaalit paksusuolen soluja (viljelty ja tuore), eivätkä ne tunnista useimpia muita syöpäsolun linjat testattu.

Päätelmä /merkitys

Valittu Aptameerien voi tunnistaa tiettyjä biomarkkerit liittyvät kolorektaalisyövissä. Uskomme, että nämä koettimia voitaisiin kehittää varhaisen taudin havaitsemista sekä ennustetekijöitä markkereita, peräsuolen syöpiä.

Citation: Sefah K, Meng L, Lopez-Colon D, Jimenez E, Liu C, Tan W (2010) DNA Aptameerit kuten Molecular Probes peräsuolen syövän tutkimus. PLoS ONE 5 (12): e14269. doi: 10,1371 /journal.pone.0014269

Editor: Dimitris Fatouros, Thessalonikin Aristoteles-yliopisto, Kreikka

vastaanotettu: 03 toukokuu 2010; Hyväksytty 16. lokakuuta 2010 Julkaistu: 10 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Sefah et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Work oli rahoitetaan seuraavasti: NIH: R01 GM079359: kehittäminen Molecular Probes for Biomedical Applications; NIH CA122648, rikastus ja havaitseminen kuorinnan syöpäsoluja. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä (10-15% kaikista syövistä) ja yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, arviolta puoli miljoonaa kuolemantapausta maailmanlaajuisesti ja yli viisikymmentätuhatta kuolemantapausta pelkästään Yhdysvalloissa.

CRC on heterogeeninen kompleksi aiheuttamien sairauksien tuhoisa geneettinen /epigeneettiset muutokset, jotka kertyvät peräkkäisellä tavalla läpi monivaiheisen karsinogeeninen prosessi [1]. Sen vuoksi on todennäköistä, että kasvaimia, joilla on vastaavia saattavat olla peräisin samalla tavalla ja on samanlainen molekyyli käyttäytymistä. Koska molekyyli- piirteitä tietyn kasvaimen heijastavat mekanismi (t) taustalla oleva sairauden kehittymistä ja etenemistä, implisiittisesti kasvaimen luokitus on merkittävä. Esimerkiksi molekyyli luokittelu leukemia ja lymfoomat on valtavasti parantaa ymmärrystämme näistä sairauksista [2], [3], [4]. Tutkimus molekulaarisen perustan kahden suuren oireyhtymää, familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP) ja perinnöllinen nonpolypsis CRC (HNPCC), on johtanut tunnistamiseen kaksi kanavat, joita nämä molekyyli tapahtumat voivat johtaa CRC [5]. Noin 85% CRC syntyy tapahtumista, jotka johtavat kromosomaalista epävakaus (CIN), jossa aneuploidiaa ja varhaisen inaktivaation adenomatoosi polypoosin coli (APC). Lisäksi 15% tulos prosesseista, jotka tuottavat mikrosatelliittien epävakautta (MSI), replikointi virhe tai menetys talonmies mismatch korjaus (MMR) liittyvä toiminto HNPCC [6], [7], [8], [9]. Vaikka olemme parantaneet ymmärrystä molekyyli tapahtumien taustalla kehittämiseen CRC, ei merkittävää vaikutusta potilaan hoitoon on johtanut. Vaikka merkittävää edistystä, joka tehty potilaiden hoitoon CRC käyttäen foolihapon (FA) -modulated 5-fluorourasiili (5-FU), noin 50% CRC potilaista kehittyy lopulta metastaattinen CRC (metastasoituneen kolorektaalisyövän). Kuitenkin uusien kemoterapeuttisten aineiden, kuten oksaliplatiinia ja irinotekaania, joko yksin tai yhdessä hyväksyttyjen biologisia tekijöitä, kuten bevasitsumabi ja setuksimabi, lupaa pidentää elinaikaa [10], [11].

Siksi jotta voidaan maksimoida käytettävissä hoitoja, on ratkaisevan tärkeää saada vieläkin paremman käsityksen molekyylitason mekanismit taudin kehittymistä ja etenemistä sekä parantaa merkittävästi ponnistelumme valottaa uusien terapeuttisesti merkityksellisinä tavoitteita ja molekyylimarkkereina. Tällaiset pyrkimykset auttaa laajentamaan ja monipuolistamaan tautien hallinta vaihtoehtoja. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että uuden taudin havaitseminen varhaisessa vaiheessa kautta massa seulonta ja interventio tässä vaiheessa voi vähentää riski kuolla CRC [12], [13]. Nämä havainnot vahvasti osoittavat kliinistä tarvetta biomarkkereiden varhaiseen havaitsemiseen CRC siten, että tauti voidaan tehokkaasti hallita.

Perimän tekniikoita, kuten DNA-siru analyysi, ja proteomiikka menetelmiä, kuten kaksiulotteinen (2 D) elektroforeesi ja massaspektrometriaa, ovat nyt yleisesti käytetään selvittämään ilmentymisen profiilit geenien ja proteiinien solujen, kudosten ja kehon nesteiden [14], [15]. Todellakin, tunnistaminen geenien ja proteiinien, jotka tyypillisesti tuotetaan kehityksen aikana syövän voi mahdollisesti paljastaa hyödyllistä biomarkkerit, jotka auttavat hallinnassa CRC. Vaikka proteomiikka on ollut hallitseva asema alalla biomarkkereiden kehitys [16] ja aikoo tehdä niin, nykyisen proteomic strategiat eivät ole luotu tarpeeksi merkkiaineita CRC.

Mielenkiintoista, CRC on yksi ensimmäisistä syöpien joille kasvainmerkkiaineet käytettiin apuna sairauksien hallintaa. Esimerkiksi karsinoembryonaaliselle antigeeni (CEA) on käytetty laajasti määrittämään prognoosi ja monitorissa taudin etenemistä ja hoidon jälkeen parantava resektio. Korkea CEA seerumissa liittyy syövän etenemisessä. Kuitenkin, jopa ilman syövän, korkea CEA on raportoitu olosuhteissa, kuten hepatiitti, pankreatiitti, tulehduksellinen suolistosairaus ja keuhkoahtaumatauti. Lisäksi, muut syövät, kuten haiman, mahalaukun, keuhko- ja rinta-, ovat kohonneet CEA, osoittaa spesifisyyden puutteesta tämän markkerin. Muut markkerit, kuten hiilihydraatti-antigeeni 19-9 (CA19.9), CA242, metalloproteinaasien-1 (TIMP-1), Tymidylaattisyntaasi, p53, ja

APC

geenin, kaikki ei ole tarpeeksi herkkä ja spesifinen. Ollakseen kliinisesti käyttökelpoinen, biomarkkereiden on oltava tehokkaita ja on korkea ennustearvo [7], mutta ei tällaista yksittäinen biomarkkereiden olemassa. Vaikka ei ole päästy yksimielisyyteen, näyttää siltä, ​​että rinnakkaisten biomarkkereita havaitsemiseen ja riskinarviointia yhden syövän suositaan yhden kattavan biomarkkerit, jotka voivat peräkkäin ennustaa riskiä jokin syöpä [7]. Tämä on vieläkin tärkeämpää, koska multiplexing menetelmät ovat tulossa enemmän normi kuin poikkeus.

biomarkkereita, jotka liittyvät suoraan kasvainsoluihin kun ne muuttuvat peräisin normaalius osaksi maligniteetti on merkittävää etua nämä merkit voivat olla hyödyllisiä välineitä kartoitus molekyyli- piirteitä sairaat solut. Kyky koettimien tunnistaa tärkeän kliinisestä näytteestä, kuten paisutettu pahanlaatuinen colonocytes sijaan normaalia colonocytes, olisi erityisen tärkeää CRC [16]. Tarkemmin, kun paisutettu soluja paksusuolen limakalvolla on sloughed osaksi jakkara, se on jo osoitettu, että DNA jakkara voidaan eristää ja altistetaan usean kohde-DNA-analyysi. Tämä määritys voidaan nykyisin arvioida 15 mutaatiostatuksesta hot spotteja, kuten k-ras, p53, APC, BAT-26 ja L-DNA. Vaikka DNA ulosteen markkereita ovat melko lupaavia, niitä ei käytetä laajasti kliinisissä ja siten koettimia, jotka voivat spesifisesti tunnistaa solut on tärkeää.

kehittämisessä herkkä, selektiivinen molekyylimarkkereita CRC, solupohjaisen aptameeriin valinta on merkittäviä lupauksen sen potentiaali tunnistamaan useita hyödyllisiä markkereita suhteellisen lyhyessä ajassa. Kahden viimeisen vuosikymmenen aikana huomattavia ponnistuksia on tehty kehittämään markkereita eri syöpien käyttäen prosessia kutsutaan Sytematic Evolution of ligandien Eksponentiaalinen rikastus (SELEX) [17], [18]. Tämän prosessin kautta, lukuisia oligonukleotidikoettimia (aptameerejä) on luotu, joka voi sitoutua spesifisesti proteiineja, jotka liittyvät limakalvojen eri kasvainsolujen [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Aptameerit ovat lyhyitä, yksijuosteisia oligonukleotideja (DNA tai RNA), tyypillisesti 100 mer, että on kyky sitoutua muiden molekyylien, joilla on korkea affiniteetti ja spesifisyys. Ne ovat kertyneet vastaan ​​erilaisia ​​tavoitteita pienistä molekyyleistä [27], [28], [29], [30] ja peptidit /proteiinit [31], [32], [33], [34], [35] , [36] ja kokonaisten solujen [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26] sekä bakteerien, virusten ja liittyvät proteiinit [37 ], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Solu-pohjainen valikoimastrategiassa luo aptameerien jotka sitoutuvat tuntemattomia tavoitteita niiden alkuperäisessä tilassa. Kuitenkin tavoite voidaan vielä todeta kautta affiniteetti uuttamalla ja massaspektrometriaa [44], [45]. Luoda enemmän herkkä ja valikoiva koettimia CRC, olemme kehittäneet paneeli DNA aptameereillä jotka tunnistavat peräsuolen syövän soluja. Nämä koettimet valmistettiin solu-SELEX käyttäen kolorektaalisyöpä viljeltyjä solulinjoja DLD-1 ja HCT 116. Initial ainesitoutumistutkimukset virtaussytometrialla ja konfokaalimikroskopialla käyttämällä näitä viljeltyjä solulinjoja osoittavat, että suurin osa meidän aptameereillä on suuri affiniteetti ja valikoivuus. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että nämä Aptameerien kumpikaan tunnistaa normaalit paksusuolen solut (viljelty), eivätkä ne tunnista enemmistö toisen syöpäsolun linjat testattu. Meidän tulokset osoittavat selvästi, että antureista tunnistaa tietyn kalvoon liittyvien proteiinien kolorektaalisyövissä. Uskomme, että nämä koettimia voitaisiin kehittää varhaisen taudin havaitsemista sekä ennustetekijöitä markkereita, peräsuolen syöpiä.

Tulokset

Viime vuosikymmenen aikana, useat aptameerejä on kehitetty erilaisia ​​tavoitteita , mukaan lukien puhdistettu molekyylit, sekä monimutkaiset tavoitteita, kuten elävien solujen eri syöpiä. Olemme käyttäneet solupohjainen SELEX strategia tuottaa paneeli DNA aptameerit ja peräsuolen syöpiä. Satunnainen ssDNA-pooli (noin 10

14) saatettiin peräkkäisiä sitovia ja eluoimalla valita altaan DNA-sekvenssit, joilla on kyky sitoutua pintaan merkkiaineiden kohdesolussa. DLD-1 ja HCT 116 käytettiin kohteina kanssa HCT1116 ja HT-29 vastaavina tarkastuksia erillisissä valintoja. Käyttöönotto vastavalinta tarjotaan mahdollisuus poistaa, mahdollisuuksien, yhteinen pinta markkereita, vaikka samaan aikaan rikastaa ero markkereita kohdesoluihin. DNA pool kerätään jokaisen kierroksen valinta monistettiin PCR, ja tuote käytettiin valmistettaessa ssDNA varten seuraavalla valintakierroksella. Tämän valinnan strategia, inkubointi DNA-poolin solujen kanssa suoritettiin viljelymaljoihin (yksisolukerrokset). Rikastuminen valinnan altaan peräkkäisillä valikoiman seurattiin virtaussytometrialla. Voidakseen käyttää solujen Virtaussytometrialla soluja viljeltiin yön yli ja hajotettiin käyttämällä lyhyen aikaa (30 sekuntia-1 min) trypsiinikäsittelylle ja /tai ei-entsymaattinen soluhajotusprosessin ratkaisu (MP Biomedicals). Lyhyt aika trypsiinikäsittelyllä ei ollut mitään havaittavaa vaikutusta suhteessa kykyyn valinnan altaan tunnistaa soluja, koska mitään eroa signaalin voimakkuuksien trypsiinin ja ei-entsymaattinen hoitovaihtoehtoja havaittiin (Text S1, kuva S1 ). Peak muutos (lisäys fluoresenssin intensiteetti verrattuna kirjasto) on osoitus fluoresenssin voimakkuus solun seurauksena leimatun DNA-sekvenssin sitoutumisen soluihin (kuvio 1). Kun yhä useammat valinta jaksoa, oli tasainen kasvu fluoresenssin voimakkuus kohdesolujen, mikä osoittaa, että DNA-sekvenssit, joissa parempi sitoutuminen kohdesoluihin olivat rikastettu. Kuitenkin, ei ollut merkittävää huippu muutos ohjaus- solujen, etenkin alussa ja puolivälissä valintakierroksen. Vuoteen 14

th kierroksen valinta, oli merkittävä kasvu fluoresenssisignaalissa kohde verrattuna kontrolliin soluihin. Lisäksi kaksi kierrosta (16

th kierros) johti kasvuun signaalin laatua valvonnan, mutta ei merkittävää lisäystä kohde. Tämä on mahdollista loppupää, kun valinta jatkuu edelleen, vaikka ei ole merkittävää signaalia eroa peräkkäisten altaat kohde. Erittäin rikastettua altaat kloonattiin ja positiiviset kloonit sekvensoitiin. Sekvenssianalyysi ovat mahdollisia DNA aptameeriin ehdokkaita ryhmiteltiin ryhmiin perustuu niiden sekvenssihomologian. Noin 8 erillistä homologisia perheitä ja monet satunnaistettu sekvenssit tunnistettiin varten DLD-1 valinta. Määrä sekvenssit erillisten homologisen perheitä vaihteli 6-110 (taulukko 1), jossa muutaman emäksen mutaatiot sisällä perheen. Edustavia sekvenssit eri perheiden valittiin testaamaan niiden vuorovaikutus kohde.

nuolien näyttää yhä valintakierroksen alkaen 5

th -16

th allas. Koska valinta edetessä oli korkeampi vastaavan fluoresenssin intensiteetin lisääntymisen kohde kuin kontrolli. Äkillinen lisääntyminen fluoresenssin signaalin ohjauksen 14

nnestä 16

th kierros ilman vastaavaa lisäystä kohde osoittaa korkeampi rikastamiseen.

kiertojärjestelmän vahvistus (RCA ) tuotteiden sekvensoinnin käytettiin alustava seulonta. Tuotteet valitusta kuopat laimennettiin 100 ul: H

20 ja käytetään PCR-monistuksen. PCR-tuotteet valmistamiseen käytettiin ssDNA ja sitten käytetään sitoutumismäärityksissä. Kahden sekvenssin, jossa on vähintään yhden emäksen mutaation valittiin perheiden sekvenssien kanssa on suurempi kuin 20 (taulukko 1). Käyttö RCA tuotteen antoi meille nopeamman menetelmän seuloa mahdollisten aptameeriin ehdokkaita. Sekvenssit sitovia signaali on suurempi kuin kontrolli (teksti S1, kuva S2) syntetisoitiin kemiallisesti ja leimattu fluoreseiini isotiosynaatti- (FITC) tai biotiinilla 3′-päässä. Kaikki syntetisoitu sekvenssit puhdistettiin HPLC: llä ja sitten mitata. Sitoutumisen määritykset suoritettiin käyttämällä virtaussytometriaa, kuten on kuvattu, ja sitova signaali suoraan havaittu FL1 FITC koettimia, FL2 ja streptavidiini-konjugoitua PE tai FL3 varten streptavidiini-konjugoitua PE-Cy5.5. Alkuperäisen sitoutumismääritykset kanssa syntetisoitiin sekvenssien nimetty KDED1 on KDED20 havaittiin monia sekvenssit sitoutumisen solun kohde (kuvio 2). Jotkut sekvenssit kuuluvat samaan perheeseen, ja siksi aiotuista sitoutumisesta samaan kohde, osoitti erilaisia ​​sitovia signaali vahvuuksia kohde. Näitä ovat KDED2 /KDED15; KDED1 /KDED5; KDED9 /KDED10, KDED3 /KDED19 ja KDED7 /KDED18.

Solut liukenevat ei-entsymaattinen dissosiaation ratkaisu. Solut pestiin ja niitä inkuboitiin eri aptameeriin ehdokkaat (sininen histogrammi). Fluoresenssin signaali havaittiin streptavidiini-PE-Cy5.5. Valitsemattomat kirjastoa käytettiin tausta fluoresenssisignaalisuhteet (musta histogrammi). Kaikki aptameerit A (KDED2), B (KDED5), C (KDED7), D (KDED15), E (KDED19), F (KDED20).

co-valintojen avulla DLD -1 (ilman negatiivinen valinta) ja HCT 116 kohteina, myös tuotti seuraavat aptameerejä: KC2D3, KC2D4, ja KC2D8 varten DLD-1: KCHA10 ja KCHB10 varten HCT 116 (kuva 3).

A (KC2D3 ), B (KC2D4), C (KC2D8). D (KCHA10), E (KCHB10).

Kaikki kehitetty aptameerit testattiin edelleen kaikki paksusuolen syövän solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt. Seuraavat aptameerejä osoitti tunnustamista vain solulinjan käyttää valinnassa: KDED2 /KDED15, KDED7 /KDED18, KDED9 /KDED10 ja KC2D3 (DLD-1) ja KCHB10 (HCT 116). Kuvio 4 esittää kuvallinen esitys vuorovaikutusta yksittäisten aptameerit ja kolme erilaista paksusuolen syövän solulinjoista. Korkeus kartion edustaa solujen prosenttiosuus, joka oli fluoresenssin intensiteetti ohjaimen yläpuolella kirjaston kanssa raja-arvo 5% fluoresenssi-signaalin intensiteettiä.

sitoutumismääritykset suoritettiin DLD-1, HCT 116 ja HT-29- . Taustafluoresenssi-intensiteetti kirjaston asetettiin alle 5% ja fluoresenssisignaali yksittäisten aptameerit määritettiin sitten ja käytetään kuvallinen esitys, kuten on esitetty.

määritettiin sitten näennäinen dissosiaatiovakiot (Kd) valitun aptameerejä, jotka vaihtelivat välillä 0,68 nM ja 302 nM (taulukko 2 ja kuvio 5). Jotta voitaisiin parantaa synteesin tehokkuutta ja joustavuuden lisäämiseksi kemiallisen manipuloinnin, jotkut aptameerit katkaistu, ja sitomiskyky ja näennäinen Kd katkaistun sekvenssit arvioitiin myös. Ennen kutakin katkaisu, mahdolliset rakenteet kunkin Aptameerin sekvenssin ennustettiin käyttämällä Integrated DNA Technologies oligoanalyzer alla valinnan olosuhteissa. Edullisin hiusneularakenteita valittiin ja roikkua emästä 3′- ja /tai 5′-päähän poistetaan, jokainen kerrallaan. Sarja typistyksiä tehtiin, ja jokainen näistä lopulta testattiin positiivisten solujen arvioida sitoutumisen. Supistuksista KCHA10 (KCHA10a) ei muuttanut ominaisuuksia aptameerin. Kuitenkin merkittävä parannus sitoutumisaffiniteetin havaittiin KDED7 katkaisu (KDED7a) ja erilaisia ​​KDED2 (KDED2a, KDED2a-1 ja KDED2a-3), kuten on osoitettu parantunut affiniteetit katkaistujen versioiden (taulukko 2). Esimerkiksi Kd KDED7 parani 157,3 nM 46,8 nM, noin 3-kertainen parannus, kun taas KDED2 parani 191,9 nM 29,9 nM, 6-kertainen parannus. Loput ei osoittanut havaittavaa sitoutumista kohde. Lähes kaikissa raportoiduissa määrityksissä, olemme käyttäneet kaikki yksittäiset sekvenssit (katkaistu ja täyspitkä) ja KDED2, koska ero sitoutumisaffiniteetin voi vaikuttaa herkkyys tietyssä määrityksessä.

Soluja inkuboitiin vaihtelevilla pitoisuudet Biotiini-leimatun aptameeriin kahtena kappaleena. Florescence signaali havaittiin streptavidiini-PE-Cy5.5. Keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus valitsematta kirjaston (tausta sitova) kullakin pitoisuudella vähennettiin fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo vastaavan aptameerin. Varsinainen fluoresenssi-intensiteetti on sovitettu Sigmaplot määrittää näennäinen Kd.

tutkitaan edelleen selektiivisyyttä testataan vuorovaikutusta aptameerejä ja viljeltiin normaaleissa solulinjoissa, sekä solulinjat muista syöpien, mukaan lukien leukemia, keuhkosyöpä, munasarjasyöpä, aivojen ja kohdunkaulan syövän. Kuten taulukossa 3 on esitetty, yksi testattu aptameerejä, KDED19 ja KC2D8 osoittivat merkittäviä signaalin voimakkuuden yläpuolella ohjaus kirjaston joitakin solulinjoissa. Esimerkiksi siellä oli merkittävä tunnustus (≥ +++) on KDED19 ja CaOV3, TOV21G, CEM ja H661, kun taas Hela ja U87MG oli vähentynyt signaali (taulukko 3). KC2D8 osoitti tunnustamista suuntaus on samanlainen kuin KDED19 kanssa testatuissa solulinjoissa (taulukko 3). Ei ollut havaittavissa signaalia muilta aptameerit minkä tahansa testatuista solulinjoista, mukaan lukien normaalin paksusuolen solulinjat (CCD18Co ja FHC) ja tuoretta ihmisen paksusuolen solujen (teksti S1, kuva S3). Tämä merkitsee sitä, että suurin osa kehitetty aptameerien ovat spesifisiä paksusuolen ja peräsuolen syöpiä (taulukko 3). Tämä havainto on merkittävä, sillä se tarjoaa monia mahdollisia vaihtoehtoja kehittää edelleen näitä aptameereillä peräsuolen syövän tutkimuksiin. Koska samankaltaisia ​​sitovia kuvio havaittiin KDED19 ja KC2D8, erityisesti signaalin CEM, päätimme käyttää Sgc8 näitä aptameerit seuraavassa kompetitiomäärityksin alustavan tarkistaa kohdemolekyylin.

Yleisesti, solu-SELEX strategia tuottaa erilaisia ​​aptameerien eri tavoitteita ja /tai samaan kohteeseen läsnä solunulkoiseen solujen pinnalla. Siksi suoritettiin kompetitiomäärityksin arvioida, jos jokin näistä aptameerit, erityisesti eri perheiden, voi vaikuttaa sitoutumiseen toiseen. Ilmeisesti se oli kohtuullista olettaa, että sekvenssit syntetisoitiin saman perheen kilpailevat; myös sekvenssit, jotka sitoutuvat eri solut eivät kilpaile keskenään. Esimerkiksi on mahdollista KDED2 kilpailla KDED15, mutta on epätodennäköistä, että se kilpailee KDED5 tai KCHA10. Tältä pohjalta teimme kilpailu KDED2 (FITC) vastaan ​​KDED7, KDED10, KDED18, ja KC2D3 (leimaamattomia), ja KCHA10 (FITC) vastaan ​​KDED5, KDED20, KC2D4, KDED19 ja KC2D8 (merkitsemätön), päättyen KC2D4, KC2D8 ja KDED19 vastaan ​​CEM aptameeriin Sgc8 (leimaamaton). Kymmenen kertainen ylimäärä leimaamatonta kilpailijaa inkuboitiin ensin DLD-1 ennen käyttöönottoa FITC-leimatun aptameeriin. Tämä varmistaa kilpailuetu ja mahdolliset kyllästää ja estää sitoutumisen toisen aptameerin, jos ne molemmat sitoutuneet samaan kohteeseen tai jos sitoutumisen yhden vaikutti sitovan toissijaisen aptameerin. Leimaamatonta KDED2 ja KCHA10 käytettiin näissä määrityksissä positiivisena kontrollina. KDED2 sitova ei vaikuttanut tahansa aptameerit testattu sitä vastaan. Samoin emme noudata mitään kilpailua KCHA10 ja kilpailevia Aptameerien. Oli kuitenkin merkittävää vaikutusta sitoutumiseen KDED19, KC2D4, ja KC2D8 läsnä ollessa 10-kertainen ylimäärä leimaamatonta Sgc8 (teksti S1, kuva S4). Tämä tulos viittaa siihen, että nämä Aptameerien eivät sido samaan kohde kuin Sgc8. Tämä ehdottaa, että KDED19, KC2D4 ja KC2D8 kilpailevat keskenään, vaikka emme suorita tällaista kilpailua määrityksen. Nämä aptameerit kehitettiin käyttämällä DLD-1, joka ei ole alkuperäistä esto käyttäen Sgc8. Tämä tukee ajatusta, että se on käytännössä estää tunnetun markkerin, jotta kehitystä koettimien kiinnostuksen kohteita.

Immunohistologiset kuvantaminen ja fluoresenssimikroskopiaan on käytetty laajalti tutkimuksessa kiinteitä kasvaimia, ja erityisesti paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. Siksi olemme myös arvioida, jos nämä Aptameerien voitaisiin käyttää kasvaimen kuvantamisen kanssa positiivisen solulinjan. Tässä alustavassa tutkimuksessa käytimme viljellyt solulinjat. Täällä suoritimme sitomiskokeita viljelymaljoilla samanlainen selektioprotokollaa mutta solujen yhtymäkohta on yli 60%. Pesun jälkeen signaali havaittiin PE-streptavidiinikonjugaattia tai streptavidiini-Alexa Fluor 633. Kuvio 6 esittää konfokaali kuvia KDED2, KDED3, KDED5 ja KDED7 havaittiin PE-streptavidiinin. Oli merkittävä signaalin voimakkuus testataan aptameerit verrattuna valitsematta kirjasto. Signaali kuvio osoittaa, että aptameerien sitoutunut pintaan kiinnittyneiden solujen viljelymaljaan.

Soluja inkuboitiin aptameerin konjugoitu biotiiniin ja sitova tapahtuma havaittiin PE-konjugoidulla streptavidiinilla. A (valitsematta kirjasto esittäen taustan sitova); B (KDED2); C (KDED3); D (KDED5) ja E (KDED7).

Samoin merkittävä fluoresenssisignaali havainnoitiin streptavidiini-Alexa Fluor 633 konjugaatit kun DLD-1 käytettiin toista vastaan ​​aptameerejä, kuten KCHA10, KC2D8, KDED18 , KDED19, ja KDED20 (kuvio 7), sekä HCT 116 soluja KCHA10 ja KC2D8. Kuten odotettua, KDED2 ei sido HCT 116. intensiteetti fluoroforin signaalin seurasi samaa kaavaa kuin virtaussytometrialla. Mielenkiintoista, KC2D8 osoitti voimakkaamman signaalin HCT 116 kuin DLD-1.

Soluja inkuboitiin aptameeriin konjugoitu biotiiniin ja sitova tapahtuma havaittiin AlexaFluor 633 konjugoitu streptavidiini. -Valittu kirjasto näyttää tausta sitova. Aptameerit osoittavat merkittävää sitova yli taustan signaali. Sillä DLD-1-soluissa, A = valitsematta kirjasto; B = KCHA10; C = KDED19; D = KC2D8; E = KDED18; F = KDED20 ja HCT 116 soluja, G = valitsematta kirjasto; H = KCHA10; I = KC2D8 ja J = KDED2a-3.

On tavallista olettaa, että aptameerit valittu vastaan ​​tuumorisolulinjat sitoutua pintaan proteiineja. Tämä on osoitettu useimmissa SELEX protokollat, joihin liittyy kasvaimen solulinjojen [44], [45]. Jotta ei kokonaan kääntää Jonkin SELEX tiedot muille, teimme määrityksiä alustavasti määrittää molekyylejä solun pinnalla, johon valittu aptameerit sitoisi. Tässä määrityksessä DLDL-1-soluja käsiteltiin trypsiinillä ja /tai proteinaasi K: ssa 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Inkubointijakson jälkeen, proteaasiaktiivisuus pysäytettiin lisäämällä jääkylmää viljelyväliaineeseen, joka sisälsi FBS: ää. Solut pestiin nopeasti kaksi kertaa sentrifugoimalla ja sitten inkuboitiin aptameerejä. Käsittelemättömistä soluista käytettiin positiivisena kontrollina. Kuvio 8 esittää vasteen aptameerin sitoutumisen jälkeen proteaasiaktiivisuutta. Paitsi KDED5 ja KCHA10, kaikki muut Aptameerien hävisi tunnustamista sekä trypsiini ja proteinaasi K-käsiteltyjä soluja. Fluoresenssisignaalien vähennetty tausta, joka osoittaa, että solujen käsittely proteaasien aiheuttamaa ruoansulatusta kohdeproteiinin. Sillä KDED5 oli merkittävä väheneminen signaalin voimakkuuden, mutta KCHA10 signaali pienentää vain vähän, mikä osoittaa, että tavoitteita ei kokonaan vaikuta hoitoon.

Soluja käsitellään trypsiinillä ja proteinaasi K: ssa 15 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin aptameeriin. Käsittelemättömän solu inkuboitiin aptameerin käytettiin positiivisena kontrollina. Musta histogrammi, (valitsematta kirjasto käsittelemättömät solut); punainen (aptameeriin kanssa käsittelemättömät solut); sininen (valitsematta kirjasto trypsiinillä käsitellyistä soluista); violetti (aptameeriin trypsiinillä käsiteltyjä soluja) ja kalkki (aptameeriin proteinaasi K: lla käsitelty). Seuraavat Aptameerien arvioitiin; A (KDED2); B (KDED5); C (KDED10); D (KDED18); E (KDED20); F (KCHA10); G (KC2D3); H (KC2D4), I (KC2D8). Lukuun ottamatta KDED5 ja KCHA10 joka vähensi vain vähän, signaalin kaikkien muiden vähenee merkittävästi.

suunniteltu kaksi mahdollista syytä: 1) riittävästi aikaa proteaasikäsittelyn ja /tai 2) kohde-molekyylejä, joilla on huomattavia osia muut kuin proteiinia, kuten hiilihydraatti- tai voimakkaasti glykosyloitunut proteiini ei täysin alttiina proteaasidigestion. Vastauksena, teimme pitkän aikaa (30 min ja 1 tunti) proteaasikäsittelyn suurempia pitoisuuksia proteinaasi K: sekä glykosidaasikäsittely. Kasvu proteaasin pitoisuus, sekä pitkä inkubaatioaika, ei vaikuttanut sitoutumiseen näiden kahden aptameerit. Lisäksi solujen inkubaation O-kytketty ja N-sitoutuneiden glykosidaaseja seurasi proteaasikäsittely ei vaikuttanut merkittävästi sitoutumista näiden kahden aptameerit. Uskomme, että glykosidaasista määritykset voi olla ratkaiseva, koska emme löytäneet kirjallisuudesta tukea tehokkuuden Tämän määrityksen avulla viljeltyjä solulinjoja sijasta puhtaan glykoproteiinin.

kehitys Aptameerien jotka sitoutuvat kohde vaihtelevilla olosuhteissa varsinkin fysiologisessa lämpötilassa ja viljelyväliaineessa, on tärkeää. Tämä lisää joustavuutta, jolla nämä Aptameerien voidaan hyväksyä ja toteuttaa monilla määrityksessä alustoilla. Siksi arvioitiin sitoutumisen aptameerit 37 ° C: ssa elatusaineessa, ja molemmissa olosuhteissa samanaikaisesti. Kuten kuviossa S5 (teksti S1), KDED2, KDED2a, KDED2a-1 (sama aptameeri, mutta erilainen sekvenssi pituudet) ja KCHA10 ylläpitää merkittävää sitoutumista DLD-1-soluja. Signaalivoimakkuudet eivät olleet merkittävästi erilaisia ​​kuin määrityksissä 4 ° C: ssa. Toisaalta, toinen aptameerit oli vähentänyt signaalin intensiteetti DLD-1. Signaali ero voi olla seurausta ero affiniteetti yksittäisten aptameereillä. Esimerkiksi KDED2 (parempi affiniteetti) ja KDED15 kuuluvat samaan perheeseen, mutta KDED15 eivät osoittaneet merkittäviä sitova 37 ° C: ssa. RPMI-1640 kokeissa KEDE2, KDED2a ja KDED2a-1 osoittivat yhtä suuri sitomiskyky, jopa silloin, kun inkubointi suoritettiin 37 ° C: ssa. KDED5 ja KCHA10 oli vähentynyt, mutta merkittävä sitoutuminen, toisin kuin jäljellä aptameerit (teksti S1, kuva S6), joista kävi ilmi, miltei ole sitovia. Tämä havainto on tärkeää kehittää edelleen Aptameerin perustuvissa määrityksissä, kuten täsmähoitoihin, apoptoottiset ja luelinkykymäärityksillä fysiologisissa olosuhteissa.

Keskustelu

järjestelmällinen kehitys nukleiinihappokoettimet molekyylielektroniikkaan tunnustamista on tuotti suuren määrän hyödyllisiä aptameereillä erilaisiin sovelluksiin eri aloilla, kuten biotekniikan, biolääketieteen, farmakologian, mikrobiologian ja kemian. Olemme käyttäneet solu-SELEX tuottaa paneeli DNA aptameereillä joilla on erityinen tunnustus kolorektaalisyövissä. Tässä raportissa, käytimme DLD-1 ja HCT 116 kohdesolulinjana linjat, ja valinta suoritettiin viljelymaljasta. Uskomme, että tämä järjestelmä on tarkka esitys natiivin tilan pinnan markkereita. Yhdessä valintojasi DLD-1, toimme negatiivisen valinnan kanssa HCT 116 solulinja tavoitteenaan valitsemalla paneelin Aptameerien monipuolista tunnustusta kuvioita peräsuolen syöpiä. Perinteisesti, jotta voidaan varmistaa tehokkuuden negatiivisen valinnan, ohjaus solulinja on usein 5- 10-kertainen ylimäärä kohdesolulinjana. Kuitenkin näissä järjestelmissä, koska valinta tehtiin viljelymaljalla, inkubaatiota volyymit rajoitettu koko viljelymaljalla voisimme käyttää. Näin ollen, vain noin 2-kertainen ylimäärä ohjaus solulinjaa käytettiin. Siksi ajateltu, että suhde positiivisen ja negatiivisen solulinjoissa oli riittämätön mahdollisesti poistaa huomattavan määrän sekvenssien sitoutumisen yhteisen markkereita. Uskomme kuitenkin, että se toimitti meille mahdollisuuden rikastamiseksi Aptameerien joilla voi olla ero sitovia kuvioita peräsuolen syövän solulinjoista.

Sequential sitova ja eluointi DNA-kirjaston altaan positiiviset ja negatiiviset solut lopulta tuotettu DNA