Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hedgehog (HH) signalointireitin on kriittinen normaalille sikiön kehityksen, kudosten kuviointi ja solujen erilaistumiseen. Poikkeava HH signalointi osallistuu useisiin ihmisen syövissä. HH signalointi liittyy usean proteiinin cascade aktivoimalla GLI proteiinien transkriptionaalisesti säätelevät HH kohdegeenien. Olemme aiemmin raportoitu, että HH signalointi on välttämätön ihmisen paksusuolen syövän solujen selviytymistä ja estämällä tämä signaali aiheuttaa DNA-vaurioita ja laaja solukuolema. Kirjoittajat raportoivat, että HH /GLI akseli säätelee ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT), joka määrittää toistettavuusmahdollisuudet syöpäsoluja. Tukahduttaminen GLI1 /GLI2 toiminnot C-pää, katkaistu Gli3 repressori mutantti (GLI3R), tai GANT61, farmakologisen estäjä GLI1 /GLI2, vähentää hTERT-proteiinin ilmentymistä ihmisen paksusuolen syöpä, eturauhasen syöpä ja glioblastoma multiforme (GBM) solulinjat . Expression of N-pääte poistetaan olennaisesti jatkuvasti aktiivisen mutantin GLI2 (GLI2ΔN) lisääntynyt hTERT mRNA ja proteiinin ilmentyminen ja hTERT-promootterin ajetaan lusiferaasiaktiivisuuden ihmisen paksusuolen syöpäsoluja ja GANT61 inhiboi hTERT-mRNA: n ilmentymisen ja hTERT-promootterin ajetaan lusiferaasiaktiivisuus. Kromatiinin immunosaostukselle GLI1 tai GLI2 vasta saostetaan fragmentteja hTERT-promootterin ihmisen paksusuolen syövän soluja, jotka oli alennettu altistettaessa GANT61. Sitä vastoin ilmaus GLI1 tai GLI2ΔN ei-pahanlaatuisten 293T-soluissa ei ole muuttaa hTERT: in mRNA: n ja proteiinin, tai hTERT-promootterin ajettu lusiferaasiaktiivisuus. Lisäksi ilmaus GLI2ΔN lisäsi telomeraasin entsyymin aktiivisuus, joka väheni GANT61 anto ihmisen paksusuolen syöpä, eturauhasen syöpä, ja GBM-solujen. Nämä tulokset tunnistaa hTERT välittömänä kohteena HH signalointireitin, ja paljastaa aiemmin tuntematon rooli HH /GLI akselin säätelyssä toistettavuusmahdollisuudet syöpäsoluja. Nämä havainnot on merkitystä ymmärtämisessä tärkeä sääntelymekanismeja, jotka määrittävät toiminnot HH /GLI signalointi syöpäsoluissa.

Citation: Mazumdar T, Sandhu R, Qadan M, DeVecchio J, Magloire V, Agyeman A, et ai. (2013) Siili Signaling Säätelee Telomerase käänteiskopioijaentsyymi- Human Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e75253. doi: 10,1371 /journal.pone.0075253

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 13 elokuu 2013; Julkaistu: 25 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Mazumdar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat haluaisi tunnustaa taloudellisen tuen NCI palkinnon RO1 CA 87952 (JAH), ja Cleveland Clinic. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Klassinen HH signalointi käynnistyy, kun liukoisen HH ligandit, Sonic (SHH), Desert (DHH) tai Intian (IHH) HH sitoa niiden transmembraanireseptoriproteiinia Patched (Ptch), vapauttaen siten transmembraaniproteiini, Smoothenedin (Smo) mistä Ptch estoa. Smo myöhemmin aktivoi GLI perheen transkriptiotekijöiden, jotka säätelevät HH kohdegeenien. GLI perhe transkriptiotekijöiden sisältää GLI1, GLI2 ja Gli3. Nojalla C-pään aktivaattori ja N-terminaalin repressori verkkotunnuksia, GLI2 ja Gli3 on kontekstisidonnaisia ​​aktivaattori tai repressorin aktiivisuutta. GLI1 puuttuu repressorin verkkotunnuksen ja toimii pääasiassa aktivaattorina [1], [2]. GLI2 on C-terminaalinen aktivaattori ja N-terminaalinen repressorin domeenit [3]. GLI2 on raportoitu olevan alkuperäisen välittäjä HH signaloinnin tapahtumia, jotka sitten indusoi GLI1, mikä edelleen lisää HH kohdegeenin ilmentyminen [4]. Kun HH signalointireitin on aktiivinen, piilevä sytoplasman GLI proteiinit siirtyvät tumaan, jossa ne sitovat GACCACCCA tapaisia ​​elementtejä promoottorit HH-kohdegeeneissä [5], [6]. HH signalointi säätelee solutapahtumiin moduloimalla erityistä tavoitetta geenejä. Normaalissa alkionkehityksen, HH signalointi on olennaisen tärkeää, säännellään paikallisesti ja ajallisesti johtaen normaalia kudosta kuvioinnin ja erilaistumista. Coordinated HH signalointi osallistuu myös soluproliferaatioon ja selviytymistä, ylläpito stemness ja määrittäminen solun kohtalon [6]. Poikkeavasti aktivoitu HH signalointi on osallisena useita ihmisen syövissä ja se säätelee syöpäsolun lisääntymistä, eloonjääntiä, syövän kantasoluja toimintoja, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon ja etäpesäkkeiden [6]. Olemme raportoineet, että HH signalointi on kriittinen selviytymisen ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, ja estää nämä signaalit aiheuttaa nopeaa DNA-vaurioita, joka huipentui laajaan sytotoksisuuden [7], [8], [9], [10]. Rajoittamaton toistettavuusmahdollisuudet syöpäsolujen liittyy läheisesti syöpäsolujen selviytymisen kuitenkin roolia HH signaloinnin toistettavuusmahdollisuudet syöpäsolujen ei tiedetä.

Replikointi potentiaalia ihmisen somaattisten solujen rajoittaa erityinen heterochromatic rakenteet tunnettu telomeres päissä lineaarisen kromosomien [11]. Nisäkkäiden telomeerit koostuvat tandem TTAGGG sekvenssejä, jotka joutuvat lyhentää jokaisen DNA: n replikaation aikana [12]. Tavanomaisia ​​DNA-polymeraasit eivät kykene täysin replikoimaan päiden lineaarisen DNA-molekyylien; siten, telomeerisesti DNA odotetaan lyhentää jokaisen DNA replikaatiokierrossa. Kriittisesti lyhentää telomeres eivät suojele kromosomi päihin tuloksena peruuttamaton kasvun pysähtymisen ja rajoitettu solujen elinikää. Siksi telomere homeostaasiin on kriittinen solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Telomeraasi, joka on ribonukleoproteiini, joka koostuu RNA-komponentin (TR) ja käänteistranskriptaasia katalyyttisen alayksikön (TERT), replenishes telomeerien toistot ja siten säätelee solujen replikatiivisen potentiaalia [13]. Useimmissa aikuisten solujen, TR on konstitutiivisesti läsnä, mutta TERT ilme on tukahdutettu, jolloin rajoitettu leviämisen mahdollisuudet ja solujen elinikää [14], [15]. Aktiivisesti lisääntyvien solujen, kuten kantasolut ja syöpäsolut, TERT ekspressiota säädellään lisäävästi jolloin rajoittamaton replikatiivista potentiaalin ja kuolemattomia näiden solujen [16]. Ihmisen TERT (hTERT) ilmentyminen ja toiminta on osoituksena 75% ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, mutta vain 3-15% normaalista limakalvon ja ympäröivien ei-syöpäsolujen [17]. Yhteistuumin sen merkitys syövän solujen eloonjäämistä, hTERT on tiukasti säänneltyä useita aktivaattoreita ja repressoreihin, joista useat on tunnistettu.

Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että HH signalointi trancriptionally ylössäätelee hTERT. Suppressio GLI1 /GLI2 pienentää hTERT-proteiinin tasot ihmisen paksusuolen, eturauhasen ja aivojen syöpäsolujen. Yli-ilmentyminen GLI2ΔN nostivat hTERT mRNA, proteiini ja hTERT promoottori-odotuksiin lusiferaasi (luc) aktiivisuus koolonkarsinoomasoluissa. Blocking GLI1 /2-aktiivisuutta vähentää hTERT mRNA: n ilmentymisen ja suora vuorovaikutus GLI1 /GLI2 proteiineja ja hTERT-promootterin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Sen sijaan, GLI1 /GLI2ΔN ilmentymistä ei-syöpä 293T-soluissa ei muuttanut hTERT: in mRNA: n, proteiinin tai hTERT-promootterin-luc aktiivisuutta. Kumotaan HH signalointi syöpäsoluissa laski telomeraasiaktiivisuus, joka nostettiin GLI2ΔN ilmentymistä. Nämä tulokset osoittavat hTERT olla transkription kohteena HH signalointireitin ja tunnistaa aiemmin tuntemattoman rooli HH /GLI akselin säätelyssä toistettavuusmahdollisuudet syöpäsoluja. Nämä havainnot paljastavat uuden funktion HH signaloinnin lisäämisessä replikatiivista kykyä syöpäsoluja. Kiinnostaa, HH signalointi säätelee hTERT tilanteessa riippuvaisella tavalla ihmisen syöpäsoluja, toisin kuin pahanlaatuisia soluja, jotka voivat olla vaikutuksia syöpähoitojen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture ja reagenssit

HT29, SW480, HCT116 ja 293T-solut saatiin American Type Culture Collection. C4-2, DU145, ja PC3-solut olivat eräänlainen lahja tri Alexandru Almasan (Cleveland Clinic, OH). U87-solut olivat ystävällinen lahja Dr. Candece Gladson (Cleveland Clinic, OH). Solut rutiininomaisesti varmistettiin mikroskooppisen analyysin solumorfologian, kasvua ominaisuuksia, ja vastaus sytostaattien [anneksiini V /propidiumjodidia (PI) värjäys]. cDNA microarray geeni profiilit olivat myös ominaisuus ja solut todentaa puolivuosittain olevan mycoplasma-vapaa. HT29, HCT116, SW480, C4-2, DU145 ja PC3-soluja pidettiin 10% FBS-täydennetty RPMI kun taas U87 ja 293T-soluja pidettiin 10% FBS: ää täydennetyssä DMEM. Solut trypsinoitiin ja laskettiin käyttäen Z2 Coulter hiukkasten määrä ja koko analysaattori (Beckman Coulter). Western-analyysiä varten vasta-aine HSP90α /β ostettiin Santa Cruz Biotechnology; anti-GLI1 ja anti-hTERT vasta-aineet olivat peräisin Novus Biologicals, ja anti-GLI2 vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology. Anti-c-myc-vasta-ainetta (9E10) saatiin hybridooma Core, Lerner Research Institute. GANT61 hankittiin Calbiochem. Dr. Graham W. Neill (Queen Mary University of London, UK) ystävällisesti toimitti GLI1 ja GLI2ΔN plasmidien pBabe-Puro (PBP) nisäkkään ilmentämisvektoriin. Täyspitkä hTERT-PBP plasmidi oli lahja Dr. Robert Weinberg (Addgene plasmidi # 1771).

Western Blot analyysi

Yhteensä solulysaateista valmistettiin käyttämällä RIPA lyysipuskuria (Cell Signaling Technology ). Proteiinia (60 ug) erotettiin 10%: n tai 5% SDS-PAGE-geeleillä. Erotetut proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvot ja tämän jälkeen tukittiin estopuskurissa [5% rasvatonta kuivamaitoa 1 X Tris-puskuri Saline, jossa oli 0,1% Tween 20 (TBS-T)] 1 tunnin ajan. Membraanit pestiin 1 x TBS-T, inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa, pestiin ja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen 1 tunnin ajan, ja lopuksi kehitettiin käyttäen Super Signal Pico substraatille Pierce Biotechnology.

RNA: n eristäminen ja mRNA Analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Qiagen RNeasy mini kit mukaan valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA muunnettiin cDNA käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita (iScript Select cDNA synteesi kit, BIO-RAD), ja käytettiin reaaliaikaista mRNA ilmentymisen analyysi käyttäen 40 sykliä Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR instrumentointi ja ohjelmistoja. Alukkeet suunniteltiin käyttäen NCBI /Primer-BLAST ja käytetään tuottamaan PCR-tuotteita. GLI1, GLI2 ja GAPDH-alukkeita aikaisemmin kuvatulla tavalla [9].

hTERT forward-aluke: 5′-CCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3 ’.

hTERT reverse-aluke: 5′-CAGCCTTGAAGCCGCGGTTGA-3′.

GLI3R ja Ohimenevä transfektoinneilla

myc-merkitty C-terminaalissa poistetaan konstruktio GLI3R (lahja tri Ariel Ruiz i Altaba, University of Geneva Medical School, Geneve, Sveitsi) on kuvattu aiemmin (3). HT29-soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Lipofectamine 2000

(Invitrogen) kanssa GLI3R tai tyhjän vektorin pCS2-MT (lahjakas tohtori David Turner, The Molecular Behavioral Neuroscience Institute, University of Michigan, Ann Arbor , MI). Soluja käytettiin kokeissa 24 tunnin, 48 tunnin tai 72 tuntia transfektion jälkeen.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) Analysis

Soluja käsiteltiin GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan saatiin silloitettu 1% formaldehydi /PBS, 10 min, 37 ° C: ssa, joka päättyi glysiiniä, 5 min. Solut pestiin PBS: ssä ja valmistettiin tumauutteet. Tumat sonikoidaan kromatiinin fragmenttien (≈ 500-800 bp). Kromatiinin esipuhdistettiin seoksella proteinA-Sepharose ja proteiini G-Sepharose, joka blokattiin naudan seerumin albumiinia (1 mg /ml) ja lohen siemennesteen DNA: ta (1 mg /ml). 10% esiselkeytettiin kromatiinin käytettiin tulo-ohjausyksikön. Yhtä suuret määrät ja esipuhdistettiin kromatiinin fragmentit immunosaostettiin spesifisillä vasta-aineilla GLI1 (Novus Biologicals, CO), GLI2 (Cell Signaling Technology (MA), IgG (Abcam, MA; negatiivinen kontrolli) tai histoni H3 (Abcam, MA; positiivinen kontrolli ). menetelmät suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (3, 4). Immunosaostetut tuotteet pestiin laajasti ja eluoitiin. 30 ui eluoitua tuotetta käsiteltiin RNaasi A: lla ja proteinaasi K, jota seuraa käänteisfaasi silloittamalla ja DNA erikseen. Gene spesifisiä alukkeita määrällisesti määrät hTERT ja BCL-2-promoottorin DNA immunosaostettiin fraktioissa. PCR-tuotteet erotettiin 1% agaroosigeelillä, värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin UV-valon alla.

käytetyt alukkeet ChIP-analyysi ovat seuraavat:

hTERT-promootterin eteenpäin: 5′-TGATGGGGACCGTTCCTTCCATC-3 ’.

hTERT-promootterin reverse: 5′-ACACGGCCCACCCAGGGTTTA-3′.

BCL2-promoottorin eteen : 5′-CCGGACGCGC CCTCCC-3 ’.

BCL-2-promoottorin taakse: 5′-GGTGCCTGTCCTCTTACTTCATTCTC-3′.

Luciferase Assay

täyspitkän hTERT-promootterin (-3337 /+ 438), ja ylävirran deleetiomutantit (-1226 /+ 438 ja -233 /+ 438) -indusoituun lusiferaasireportterista konstruktiot ystävällisesti Dr. Ralf Janknecht, University of Oklahoma Health Sciences Center, OK [18] . HT29 tai 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ja 4 mg lusiferaasireportterigeenin ja 0,4 mg pRLTK (renilla lusiferaasi ohjaa TK-promoottori). 24 tunnin transfektion jälkeen solut analysoitiin käyttäen Dual lusiferaasi kit (Promega Corporation) mukaan valmistajan protokollaa. Lusiferaasiaktiivisuus detektoitiin käyttämällä Victor2 -monileimalukijaa, ja normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus kontrollina transfektiotehokkuuden.

Telomerase Toista Amplification Protocol (TRAP) Pitoisuus

Solut hajotettiin 1X CHAPS lyysipuskuria ja 0,25 ug lysaatit käytetään suorittamaan TRAP-määritystä. 1 ug TS aluke leimattiin päästään 3 ui γ

P32ATP (Perkin Elmer) käyttäen 1 ui PNK (NEB) 20 ul reaktioseosta 37 ° C: ssa 45 minuutin ajan ja puhdistettiin Sephadex G-25 sarakkeessa. Kussakin reaktiossa 2 pmoolia γ-32P end merkitty TS alukkeiden, ja reverse-alukkeita PCR-monistamiseen sekoitettiin 0,05 mM dNTP, 20 mM Tris • CI pH 8,3, 1,5 mM MgCl

2, 63 mM KCI, 0,05 % Tween 20 ja 1 mM EGTA: ta. 20 ng RNase A lisättiin Solulysaatista reaktioissa käsitelty RNaasi. Telomeraasia-välitteisen alukkeen pidennys suoritettiin 30 ° C: ssa 30 min, jota seurasi PCR-monistus käyttämällä TS: n ja reverse-alukkeita. Tuotteet TRAP määritykset analysoitiin 12,5% ei-denaturoivaa PAGE. TIFF-tiedostot skannatun geelin kuvat kvantifioitiin densitometrialla käyttämällä Image J ohjelmisto ja telomeraasiaktiivisuus määritettiin käyttäen kaavaa mainittuja valmistajan protokolla TRAPEZE Telomerase havaitseminen kit (Chemicon International Inc., MA).

tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

tulokset

HH Signaling ylössäätelee hTERT ilmentäminen ihmisen syöpäsoluja

säädeltyyn HH signalointi tiedetään edistävät solujen lisääntymistä, solusykliä ja solujen eloonjäämistä ihmisen syöpäsoluja, joten katsottiin, että aktivoitua HH reitti voi myös olla rooli toistettavuusmahdollisuudet syöpäsoluja. Telomerase keskeinen säätelijä toistettavuusmahdollisuudet ja läheisesti solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen, on siis vahva ehdokas sääntelyn aktivoitu HH signalointi syöpäsoluissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, välinen suhde HH /GLI signalointi-akselilla ja telomeraasi ekspressiota tutkittiin useissa ihmisen syöpäsolulinjoissa. Me kumosi HH /GLI signalointi akseli useissa ihmisen syöpäsolujen linjat farmakologiset inhibiittorit ja mitataan telomeraasia ilme. Ihmisen paksusuolen syöpäsoluja HT29 ja SW480, altistettiin GANT61 (20 uM), pieni molekyyli estäjä GLI1 ja GLI2 [9], 72 tuntia osoitettu alentunut vakaan tilan tasot GLI1, GLI2 ja hTERT-proteiineja (Fig. 1A). Vastaavasti, estää HH /GLI signalointia eturauhasen syöpäsolujen C4-2, DU145 ja PC3 osoittivat myös vähentynyt GLI1, GLI2 ja hTERT-proteiinin ilmentymistä (Fig. 1A). Anto GANT61 (20 uM) on GBM-solulinjaa U87 aikana 72 tunnin vähensivät GLI1, GLI2 ja hTERT-proteiinin ilmaisuja (Fig. 1 B). Olemme edelleen validoitu vaikutukset HH signalointireitin on hTERT ilmaisun geneettisesti muokkaamalla HH /GLI signalointireitille. Käytimme C-pää poistetaan mutantti Gli3 (GLI3R, myc-merkitty GLI3C’DCla1 [3]), joka tukahduttaa GLI1 ja GLI2 aktiivisuus [8]. Lapäisen transfektion jälkeen GLI3R osaksi HT29 (densitometrinen kvantifiointiin Fig. 2A) ja HCT116 (Fig. 2B) koolonsyöpäsolulinjoissa, GLI1, GLI2 ja hTERT-proteiinin tasot alenivat ajan 48 tunnin – 72 tunnin ajan. Toisaalta, stabiili ekspressio joko GLI1 tai GLI2ΔN, joka on N-pää poistetaan mutantti GLI2, jossa konstitutiivinen aktivaattori toiminto HT29 10 kohdat osoittivat lisääntynyt hTERT-proteiinin ilmentymistä (Fig. 2C).

:

HT29, SW480 (koolonkarsinoomasoluja), C4-2, DU145 ja PC3 (eturauhassyöpä solut) hoidettiin 72 tuntia joko DMSO (ajoneuvon hallintaan) tai GANT61 (20 uM).

B:

U87 (GBM solua) käsiteltiin GANT61 (20 uM) ja 0-72 tuntia. Vakaan tilan tasot GLI1, GLI2 ja hTERT-proteiinin määritettiin Western-analyysillä. HSP90α /β käytettiin latauskontrollina.

V:

HT29,

B:

HCT116-solut transfektoitiin ohimenevästi GLI3R (myc-merkityn) 48 h tai 72 h, vastaavasti. Vakaan tilan tasot GLI1, GLI2 ja hTERT määritettiin Western-analyysi edustettuina densitometrian että blotteja

jossa on yksi edustaja hTERT blot (upotus). Expression of GLI3R määritettiin käyttäen anti-myc-vasta-ainetta.

C:

PBP tyhjän vektorin (V) tai täyspitkä GLI1 cDNA PBP (GLI1) tai GLI2ΔN PBP (GLI2ΔN) ilmennettiin stabiilisti osaksi HT29, ja soluja viljeltiin 10 kohtia. Vakaan tilan tasot GLI1, GLI2 ja hTERT mitattiin Western blot. HSP90α /β käytettiin latauskontrollina. * P 0,0001.

GLI -transkriptiotekijät vuorovaikutuksessa hTERT promoottori ihmisen syöpäsoluja

Seuraavaksi tutkimme mekanismi, jonka HH signaaleja säätelemään hTERT ihmisen syövässä solut. Transkription säätelyyn hTERT ilme on yhteinen mekanismi hTERT säätelyyn ylöspäin syöpäsoluissa [19]. Koska GLI proteiinit ovat transkriptiotekijöitä, me arveltu, että GLI1 ja GLI2 kopiointia säädellä hTERT ilmentymistä syöpäsoluissa. hTERT-mRNA koholla sekä GLI1- ja GLI2 yli-ilmentäviä HT29 (Fig. 3A). Kun HT29-soluja altistettiin GANT61 (20 uM), hTERT-mRNA: n tasot olivat merkittävästi vähentynyt 24 tuntia ja pysyivät tukahdutetaan kautta 72 h (Fig. 3B). DU145 solut osoittivat laski GLI2 ja hTERT-mRNA-tasot altistuessaan GANT61 (20 uM), kun taas GLI1 transkriptioekspressiokuvio pysyi muuttumattomana 48 tuntia hoidon jälkeen (Kuva. 3C). Altistettaessa GANT61 (20 uM), U87-solujen osoitettiin vähennyksiä GLI1, GLI2 ja hTERT mRNA 24 h (Fig. 3d). Nämä tulokset vahvistivat transkription säätely hTERT ilmentymisen HH signalointireitin ihmisen syöpäsoluja.

V:

HT29, jotka ekspressoivat stabiilisti tyhjän vektorin (V), GLI1 (GLI1) tai GLI2ΔN (GLI2ΔN) analysoitiin hTERT, GLI1 ja GLI2 mRNA: n ilmentymisen määrää Real-Time PCR.

B:

Altistuminen HT29 solujen GANT61 (20 uM; 0-72 h) vähensi ilmentymistä hTERT mRNA, määräytyy Real-Time PCR.

C:

DU145,

D:

U87 solut altistettiin GANT61 (20 uM; 48 h tai 24 h vastaavasti) ja GLI1, GLI2 ja hTERT mRNA mitattiin Reaaliaikainen PCR. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 määrityksen. * P 0,05.

leikellä mekanismi transkription säätely hTERT ilmentymisen HH signalointireitin, me seurataan vaikutuksia HH signaloinnin hTERT-promootterin aktiivisuutta HT29. Täyspitkä hTERT-promootterin-driven lusiferaasi (FL hTERT prom-luc) reportteri ja PRL-TK oli ohimenevästi kotransfektoitiin HT29-johdettujen stabiilien solulinjojen yli-ilmentävät GLI1 tai GLI2 tai hTERT. Sekä GLI1 ja GLI2ΔN ilmentävien solujen osoitettiin 4-kertainen nousu hTERT-promootterin aktiivisuus 24 h transfektion (Fig. 4A). Tunnistaa minimaalinen promoottori pituus tarvitaan HH-riippuvaisia ​​vaikutuksia hTERT-promootterin aktiivisuus, FL hTERT-promootterin (-3337 /+ 438), ja alkupään deleetiomutantit (-1226 /+ 438 ja -233 /+ 438) -indusoituun lusiferaasin Toimittajat ovat transfektoida HT29 seurasi altistus joko ajoneuvon ohjaus- tai GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan. Tiedot osoittavat, että -1226 /+ 438-alue on minimaalinen vaatimus HH-riippuvaisen hTERT-promootterin aktivointi, vaikka vaikutukset ovat vähemmän kuin FL hTERT-promootterin (Fig. 4B). FL hTERT-promoottorin aktiivisuus väheni merkittävästi, kun esto GLI toimintaa GANT61 (20 uM) (Fig. 4B). Seuraavaksi tutkimme onko GLI transkriptiotekijöiden suoraan vuorovaikutuksessa hTERT-promootterin syöpäsoluissa.

In silico

analyysi hTERT-promootterin paljasti 7 oletetun sitoutumiskohtia GLI perheen transkriptiotekijöiden. Sekä GLI1 ja GLI2 vasta-aineet saostetaan fragmentteja hTERT-promoottorin ChIP analyysejä (Fig. 4C). PCR-monistus kromatiinin fragmenttien käyttäen spesifisiä alukkeita hTERT-promootterin alueiden johti amplikoneja, jotka sisälsivät atleast ydin (-226 /+ 360) hTERT-promootterin varmistettiin sekvensoimalla PCR-amplikonit. Sitoutuminen GLI1 ja GLI2 että hTERT-promootterin pienennettiin läsnä GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan (Fig. 4D). BCL-2, on aiemmin raportoitu tavoite sekä GLI1 ja GLI2, käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio. 4C ja 4D).

V:

Stable johdannaiset HT29 (kuvattu Fig. 2C) kotransfektoitiin kanssa täyspitkän hTERT-promootterin ajettu lusiferaasi (-3337 /+ 438), toimittaja ja renilla lusiferaasi (PRL-TK) rakentaa 24 tunnin ajan. Lysaatit valmistettiin, ja lusiferaasiaktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. hTERT-promootterin lusiferaasiaktiivisuus normalisoitu vastaan ​​renilla lusiferaasiaktiivisuus ja esitetään keskiarvona ± SD, n = 3

B:

HT29-solut ko-transfektoitiin joko täyspitkä (-3337 /+ 438) tai ylävirtaan Poistetaan mutantit (-1226 /+ 438 tai -233 /+ 438) hTERT prom-luc toimittajat ja PRL-TK seurasi altistus GANT61 (20 uM, 24 h) ja määrittäminen lusiferaasiaktiivisuus. hTERT-promoottorin lusiferaasiaktiivisuus normalisoitui vastaan ​​Renilla lusiferaasiaktiivisuus ja esitetään keskiarvona ± SD, n = 3

C:

HT29 käytettiin sirujen analyysi käyttäen vasta-aineita spesifisiä GLI1, GLI2 tai histoni H3 (positiivinen ohjaus, käytetään normalisointi).

D:

HT29 käsitelty GANT61 (20 uM, 24 h) jälkeen arvioitiin samalla Chip analyysi. Myöhemmät Real-Time PCR käytetään alukkeita, jotka reunustivat promoottoria alueet hTERT tai GLI kohdegeenin, BCL-2 (positiivinen kontrolli). * P 0,05.

HH /GLI Signaling ei säädetä hTERT Expression in Non-pahanlaatuinen 293T Cells

tutki tarkemmin sitä HH signalointi transkriptionaalisesti säätelee hTERT ei-pahanlaatuisia soluja. 293T-solut kokeellisesti transformoidaan, mutta niiltä puuttuu kyky helposti muodostaa kasvaimia karvattomissa hiirissä [20] ja osoittaa indusoituva HH /GLI signaloinnin akselilla [21]. Me transfektoitiin 293T-solujen, joko GLI1 tai GLI2ΔN ekspressioplasmideilla, ja mitataan hTERT ilmaisun western analyysi. Vaikka GLI1 ja GLI2 proteiinin ilmaisuja olivat merkittävästi koholla transfektoiduissa 293T-soluissa, hTERT-proteiinin ekspressio pysyi muuttumattomana 48 tuntia ja 72 tuntia (kuvio. 5A). hTERT yli-ilmentävät HT29-soluja käytettiin positiivisena kontrollina hTERT-proteiinin analyysi (Fig. 5A). Mittasimme hTERT-transkriptin lapäisen transfektion jälkeen GLI2ΔN 293T-soluihin. 48 h transfektion, 293T-solut osoitettu voimakkaaseen kasvuun GLI2 mRNA ja 5-kertainen nousu GLI1 mRNA-tasot, mutta ei merkitsevää nousua hTERT mRNA-tasolla (kuvio. 5B). Edelleen, ohimenevä kotransfektoimalla FL hTERT prom-luc-reportterin ja joko GLI1 tai GLI2ΔN ekspressioplasmideilla ei lisätä lusiferaasiaktiivisuus 293T-soluissa (kuvio. 5C). Nämä havainnot korostavat yhteydessä funktioiden HH-signalointireitin, joka selektiivisesti säätelee lisäävästi hTERT ilmentyminen pahanlaatuisten solujen toisin kuin pahanlaatuisia soluja.

V:

293T-solut olivat käsittelemättömiä (UT), ohimenevästi transfektoitu tyhjällä vektorilla (V) tai GFP-merkityn GLI1 (GLI1) tai GFP-merkityn GLI2ΔN (GLI2ΔN). Expression of GLI1, GLI2 ja hTERT määritettiin 48 ja 72 tuntia Western-analyysillä. HSP90α /β käytettiin lastaus ohjaus ja GFP käytetään merkitsemään eksogeenisesti ilmaistu GFP-leimatun GLI proteiineja. Kokosolulysaattia päässä HT29, jotka ekspressoivat stabiilisti hTERT (HT29 + hTERT) toimi positiivisena kontrollina.

B:

293T-solut transfektoitiin ohimenevästi vektorilla tai GLI2 (kuten on kuvattu kuviossa 5A) analysoitiin GLI1, GLI2 ja hTERT mRNA: n ilmentymisen kautta qPCR. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 määrityksen.

C:

293T-soluihin väliaikaisesti ko-transfektoitiin FL-hTERT prom-luc, renilla luceferase toimittajat ja vektori, GLI1 tai GLI2 (kuten on kuvattu kuviossa 5A). 24 tunnin transfektion jälkeen solut analysoitiin lusiferaasiaktiivisuus. hTERT promoottori perustuva lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitui vastaan ​​Renilla lusiferaasiaktiivisuus ja on esitetty keskiarvona ± SD, n = 3 * p 0,05.

HH /GLI Signaling säätelee hTERT entsyymiaktiivisuus ihmisen syöpäsoluja

Poikkeava voimistumista hTERT ilmentyminen liittyy lisääntynyt telomeraasin käänteistranskriptaasin entsyymin aktiivisuus syöpäsoluja. Näin ollen testasimme toiminnallinen merkitys HH /GLI /hTERT akselin mittaamalla telomeraasin entsyymiaktiivisuus syöpäsoluja. TRAP määritystä käytettiin aktiivisuuden määrittämiseksi hTERT päälle muuttamalla HH /GLI signalointiryöpyn. GANT61 (20 uM) hallinto vähentänyt telomeraasiaktiivisuutta 48 h, joka oli ennallaan jopa 72 tunnin in HT29 (Fig. 6A, määrällisesti kuvassa. S1). Kääntäen, pysyviä johdannaisia ​​HT29 ilmentävien GLI2ΔN havaittu olevan telomeraasiaktiivisuutta verrattuna vektorisäätö, kun taas GLI1 yli-ilmentäviä soluja oli vaatimaton kasvu telomeraasiaktiivisuutta (Fig. 6B, määrällisesti kuvassa. S1). hTERT yli-ilmentäviä soluja, joilla on kohonnut telomeraasiaktiivisuuden toimi positiivisena kontrollina (kuvio. 6B). Telomeraasiaktiivisuus vähennetty DU145 altistuneiden solujen GANT61 (0-30 uM) 48 tunnin ajan (Fig. 6C). U87-solut osoittivat myös vähennyksiä telomeraasiaktiivisuutta 48 tunnin altistumisesta GANT61 (20 uM), joka ylläpiti till 72 h (Fig. 6D). Nämä havainnot osoittavat, että HH signalointi ylössäätelee sekä hTERT ilmaisun ja telomeraasiaktiivisuus ihmisen syöpäsoluja.

V:

HT29-soluja käsiteltiin GANT61 (20 uM) ja 0-72 tuntia, ja lysaatit uuttaa välein TRAP analyysiä. 100 emäsparin DNA-ladder käytettiin molekulaarinen merkkiaine (M).

B:

HT29, jotka ekspressoivat stabiilisti vektorilla (V), GLI1 tai GLI2 (GLI2ΔN) (kuvattu kuviossa 3A) arvioitiin telomeraasiaktiivisuuden TRAP määrityksellä. hTERT yli-ilmentäviä soluja käytettiin positiivisena kontrollina.

C:

U87 ja

D:

DU145 soluja käsiteltiin GANT61 (0-30 uM; 0-72 h) ja telomeraasiaktiivisuus analysoitiin TRAP määrityksessä.

keskustelu

HH signalointi toiminta on välttämätön normaalille alkionkehityksen jossa se säätelee solujen erilaistumista ja urut muodostumista kaltevuus riippuvaisella tavalla [22]. HH signalointi säätelee solujen lisääntymistä transkriptionaalisesti moduloimalla geenejä, jotka ohjaavat solusyklin etenemistä, kuten sykliini D, sykliini E ja, myös Ptch välittämän sitomisen sykliini B cyctoplasm [23], [24], [25]. Aikuisen vaiheessa, aktiivinen HH signalointi jatkuu pieni joukko soluja, jotka antavat uusiutumispotentiaali kypsää elinten [26]. Dysregulaatio HH signalointi on raportoitu useita ihmisen syövissä, mukaan lukien tyvisolusyöpä [27], [28], medulloblastooman [1], [29], rabdomyosarkooma [30], gliooma [1], haiman adenokarsinooma [31], [ ,,,0],32], [33], eturauhassyöpä [34] ja paksusuolen karsinooma [7], [8], [9], [10]. Syöpäsoluissa, autokriinisellä ligandista riippuvaa ja onkogeenin ajettu ligandi-riippumattomien mekanismien ylläpitää aktiivista HH signalointikaskadissa. Poikkeava HH toimintaa ohjaa kasvaimen muodostumisen ja kasvaimen ylläpito indusoimalla pro-eloonjääntisignaaleja ja estämällä apoptoottisia signaaleja syöpäsoluja [9], [35]. Toinen tunnusmerkki syöpä on rajaton leviämisen potentiaalia syöpäsolujen johtaen kuolemattomuuteen kuitenkin linkin väärin säädellystä HH signalointi ei ollut tiedossa.

Telomeres ovat erikoistuneita nukleoproteiini- rakenteita kromosomin päät, jotka ovat tärkeitä kromosomi- vakauden ja kuolemattomuudesta solut. Normaalit somaattiset solut kohtaavat vähitellen poistuma telomere pituudet jokaisen DNA replikaatiosykli mikä rajoittaa solujen elinikää. Normaalit kantasolut ja syöpäsolujen paeta tätä tarkistaa ja täydentää niiden telomeerivasta pituudet kasvoivat telomeraasiaktiivisuutta. Telomerase on ribonukleopro- koostuu ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin entsyymiä, hTERT ja telomeraasi RNA, hTR [36], [37]. Syöpäsoluissa, hTERT ilmaisua poikkeavasti palautettu mikä lisää telomeraasiaktiivisuutta joka ylläpitää telomeeripituuden ja antaa rajattomat toistettavuusmahdollisuudet. hTERT ilmaisun ja telomeraasiaktiivisuuteen on läheistä [33] ihmisen syövistä [17], [38]. Transformation of telomeraasia negatiivisia normaaleja soluja in vitro edellyttää hTERT ilmaisun [39], rajaamista hTERT ilmaus kuin nopeutta rajoittava vaihe telomeeripituuden homeostaasin ja solutransformaatioon. Sääntely hTERT ilmaisun on tutkittu laajasti ja lukuisia positiivisia ja negatiivisia sääntelyviranomaisten on tunnistettu [40], [41].

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että HH signalointireitille takaa rajattomat toistettavuusmahdollisuudet syöpäsolujen säätelemällä hTERT ilmaisun ja toimintaa. Useamman ihmisen syövän solulinjoissa kuten paksusuoli-, eturauhas- ja aivot, tukahduttaminen GLI1 ja GLI2 ilmaisun käyttäen GANT61, joka on pienmolekyylisalpaaja- johti pienentyneeseen ilmentyminen hTERT mRNA, proteiini ja entsyymi aktiivisuutta. Tämä havainto osoitti sääntely akselin välillä HH signalointi ja hTERT ihmisen syöpäsoluja. Käyttämällä geneettinen lähestymistapa tukahduttaa GLI1 ja GLI2 käyttäen GLI3R, hTERT ilmaisua voidaan myös inhiboida koolonkarsinoomasoluissa. Pakko ilmentymisen GLI1 tai konstitutiivisesti aktiivisen mutantin GLI2 ilmaisun kasvoi hTERT mRNA ja proteiini ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa osoittavat HH /GLI-säätelyyn hTERT ilmaisua.