Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

arvioitiin ilmaus p85 ja p110α PI3K alayksikköjä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) yksilöihin ja yhdessä mTOR ilme, ja tutkittiin vaikutukset kohdistuvat PI3K /AKT /mTOR väylän NSCLC solulinjoissa.

Methods

käyttäminen Automatisoitu Quantitative analyysi me määrällisesti ilmentymistä PI3K alayksiköiden kaksi kohorttia 190 ja 168 NSCLC näytteet ja korreloi sen kanssa mTOR ilme. Tutkimme vaikutuksia kahdessa PI3K-estäjien, LY294002 ja NVP-BKM120, yksin ja yhdessä rapamysiiniä 6 NSCLC solulinjoissa. Arvioimme aktiivisuus dual PI3K /mTOR-estäjä, NVP-BEZ235 yksin ja EGFR-inhibiittorin.

Tulokset

p85 ja p110α yleensä koekspressoitu (p 0,001); p85: n ilmentyminen oli korkeampi adenokarsinooman kuin okasolusyöpää. Korkea p85-ilmentyminen liittyy pitkälle ja huono selviytymistä. p110α ilme korreloi mTOR (ρ = 0,276). Kuudessa NSCLC solulinjoissa, lisäksi rapamysiinin että LY294002 tai NVP-BKM120 oli synergistinen. Jopa hyvin alhainen rapamysiini pitoisuuksina (1 nM) aiheutti herkistymisen PI3K estäjiä. NVP-BEZ235 oli erittäin aktiivinen NSCLC solulinjoissa IC

50s nanomoolialueella ja tuloksena alas-säätely Pakt ja pP70S6K. Lisäämällä Erlotinibi on NVP-BEZ235 johti synergistisiä kasvun estäminen.

Johtopäätökset

yhdistyksen välillä PI3K ilme, pitkälle ja eloonjäämisen NSCLC viittaa siihen, että se voisi olla arvokas lääke kohde. Samanaikainen esto PI3K ja mTOR on synergistinen

in vitro

, kaksikerroksiselle PI3K /mTOR-estäjä oli erittäin aktiivinen. Lisäämällä EGFR esto johti lisäkasvua eston. Kohdistaminen PI3K /AKT /mTOR-reitin eri tasoilla pitäisi testata kliinisissä kokeissa NSCLC.

Citation: Zito CR, Jilăveanu LB, Anagnostou V, Rimm D, Bepler G, Maira S-M, et al. (2012) Multi-Level kohdentaminen fosfatidyyli-3-Kinase Pathway in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 7 (2): e31331. doi: 10,1371 /journal.pone.0031331

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 06 tammikuu 2012; Julkaistu: 15 helmikuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Urakehitys Award of American Association for Cancer Research Tri Chao. Dr. Kluger tukee Yale SPORE in Skin Cancer, 1 P50 CA121974 (R. Halaban). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Drs. Rimm ja Camp ovat mukana perustamassa, osakkeenomistajaa ja konsultteja niminen yritys HistoRx joka on lisensoinut teknologian automatisoitu kudoksen analyysi Tässä tutkimuksessa käytettiin. Drs. Maira ja Hackl ovat työntekijöitä Novartis Company. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS ONE politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Yhdysvalloissa yksin, noin 222520 uutta tapausta diagnosoitiin ja noin 157300 kuolemantapausta johtunut keuhkosyövän vuonna 2010 [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) edustaa noin 80% kaikista keuhkosyöpää. Yleisimmät histologialtaan ovat adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä ja suuri solu syöpä. Valtaosa NSCLC potilaista diagnosoidaan pitkälle jossa kemoterapia voi parantaa selviytymistä ja lievittäminen oireita. Kuitenkin tavanomainen kemoterapia ei tarjoa parannuskeinoa kehittynyt ei-pienisoluisen keuhkosyövän ja saavuttanut tasanne tehon kanssa mediaanielossaolosta 8-10 kuukautta [2]. Lisäämällä uusia kohdennettuja hoitomuotojen kuten bevasitsumabi ja setuksimabi tavanomaiseen kemoterapiaan on parantanut mediaanielossaolosta noin 12 kuukautta potilailla, joilla on hyvä suorituskyky tila [3], [4]. Novel hoitomenetelmiä tarvitaan pikaisesti tähän yleinen sairaus.

fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /AKT /mTOR-signalointireitin vaikutuksia monia näkökohtia solujen kasvua ja selviytymistä [5]. Korjauksilla komponenttien PI3K /AKT /mTOR-reitin voi tapahtua monella tasolla ja johtaa konstitutiivisen aktivaation tämän reitin ja pahanlaatuisiksi.

PI3K ovat perhe entsyymejä, jotka fosfory- fosfatidyyli riumbifosfaatti ja fosfatidyyli trifosfaatiksi. PI3K: t ovat usein aktivoidaan reseptorityrosiinikinaasia (RTK) signalointia kuten kautta EGFR, IGF1-R: n ja HER-2 /neu [6] – [9]. On olemassa kolme luokkaa PI3K [10], [11]. Luokka I

PI3K on yleisimmin sekaantuneet tyyppi syövän ja sitä kutsutaan ”PI3K” loppuosassa tämän käsikirjoituksen. PI3K on heterodimeeri, joka koostuu p85 sääntely- ja p110 katalyyttinen alayksikkö.

Fosfatidyyli trifosfaatin välittää aktivoinnin AKT [11]. AKT puolestaan ​​aktivoi monissa solun proteiinien mukana proteiinisynteesiä, solujen kasvua ja selviytymistä myös mTOR [11] – [13]. mTOR säätelee käännös fosforyloimalla komponenttien proteiinisynteesiä koneita, kuten ribosomaalisen proteiinin S6 kinaasien (p70

S6K) ja 4E-sitovan proteiinin (4E-BP). Fosforylaatio 4E-BP johtaa vapautumisen translaation aloitus- tekijä, EIF4E, joka on osoitettu näytteille muuttaa ja anti-apoptoottiset aktiviteetti

in vitro

[13], [14]. PTEN kääntää PI3K opastinjärjestelmillä defosforyloimaan fosfatidyyli trifosfaatti [15].

NSCLC, PI3K /AKT /mTOR signalointi usein vapautettu mutaatioiden takia, jotka vaikuttavat yksi sen alkupään sääntelyviranomaisten, EGFR-reseptorin ja muiden komponenttien sisällä polku [16]. mTOR reaktiotien komponentit havaittiin olevan mutatoitunut 17 geenien ja yli 30% kasvaimista 188 keuhkojen adenokarsinooman, joka exome sekvensointi suoritettiin [16]. Lisäykset geenin kopioluvun

PIK3CA

, geeni, joka koodaa p110α, ja muutokset fosforyloidun AKT (Pakt) ilmentyminen on kuvattu syöpää edeltävä keuhkoputken epiteelisoluissa ja NSCLC [17] – [22]. Vaikka mutaatiot

PIK3CA

ovat suhteellisen harvinaisia ​​keuhkosyöpä,

PIK3CA

kopioi vahvistuksenkertojan on raportoitu 33,1% okasolusyöpä keuhkosyövän ja 6,2% adeno- keuhkosyöpä yhdessä suuressa sarjassa [ ,,,0],23]. PI3K signalointi on osoitettu välittävän bronchioalveolar kantasolujen laajentamiseen alulle onkogeeninen

K-RAS

[24]. Kasvaimeen liittyvien mutaatioiden p110α ovat onkogeenisiä

in vivo

hiirimallissa NSCLC [25]. Yli-ilmentyminen p85 ja p110 α on osoitettu korreloivan huonon erilaistumista ensisijainen keuhkosyövässä kohortin joka sisälsi 73 tapausta NSCLC [26]. Ryhmämme on aiemmin tutkinut ilmentymistä mTOR NSCLC ikäluokat ja Yhdistyksen parantunut tulos [27].

esto PI3K /AKT /mTOR signalointi kautta farmakologisen ja geneettisen lähestymistapoja indusoi antiproliferatiivisia vaikutuksia tiettyihin NSCLC solulinjoissa [17] – [21] ja keuhkosyövän hiiren malleissa [25], [28]. Useita PI3K-inhibiittorit ovat saatavilla prekliinisen tutkimuksen. Vanhemmat yhdisteitä kuten LY294002 tai wortmanniini on antituumorivaikutuksen kokeellisissa malleissa, mutta niiden huono liukoisuus, kapea terapeuttinen indeksi ja crossover estämällä muiden kinaasien ovat rajoittaneet niiden kliinistä soveltamista. Uudempi PI3K inhibiittorit ovat tulleet alkuvaiheessa kliinisissä kokeissa, ja toimintaa näiden aineiden olisi arvioitava sairauksien edellyttävät uusia lähestymistapoja, kuten NSCLC.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli kuvata ilmaus p85 ja p110 α-alayksiköiden luokan I

PI3K kahdessa suuret riippumattomat kohortteja NSCLC yksilöitä ja arvioimaan yhdessä kliiniset ja patologiset tekijöistä kuten aiemmin julkaistu mTOR ilme. Jotta saataisiin enemmän objektiiviset ja täsmälliset ilme toimenpiteitä, käytimme äskettäin kehitetty menetelmä automatisoitua, määrällinen analyysi (AQUA) on kudossiruina [29]. Tarpeettomana aktivaattorit PI3K /AKT signalointireitin ja negatiivista palautetta silmukoita [5] rajoittaa tehoa ainoana lääkkeenä hoitoja, meidän vieressä tarkoituksena oli tutkia, mitä vaikutuksia kohdistaminen PI3K /AKT-signalointireitin useilla tasoilla NSCLC solulinjoissa. Huomasimme, että korkeampi ilmentyminen p85 korreloi huonon säilymisen ja pitkälle. Expression of p110α korreloida mTOR. Samanaikainen esto PI3K ja mTOR johtivat synergistinen kasvua vaimentava. Lisäämällä EGFR esto entisestään kasvua estäviä vaikutuksia dual PI3K /mTOR-estäjä.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue Microarray (TMA) Hakemisto Rakentaminen

NSCLC kohortissa saatiin alkaen H. Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, FL). Moffitt Cancer Center kohortti (MTMA) sisältää porausnäytteistä ensisijainen NSCLC kasvaimista diagnosoitujen potilaiden välillä 1991 ja 2001. Follow-up aika vaihteli 0,8 kuukaudesta 146,4 kuukautta, keskimääräinen seuranta-ajan 52,3 kuukautta. Ikä diagnoosi vaihteli 40,8-84,4 (keski-ikä 69 vuotta). Kohortti sisältyi 54,5% miehistä ja 45,5% naisia.

Yale University kohortti (YTMA) rakennettiin parafinoidut formaliinikiinnitetyt kudosblokeista saatu Yalen yliopiston Patologian Archives. Näytteet toistoleikattiin vuosina 1995 ja 2003, joiden seurantaa alueella 0,1 kuukaudesta 182,25kuukausi, ja keskimääräinen seuranta-aika oli 41 kuukautta. Ikä diagnoosi vaihteli 21-90 (keski-ikä 65 vuotta). Kohortti sisältyi 51% miehistä ja 49% naisista.

TMA rakennettiin aikaisemmin kuvatulla [27]. Kaksi 0,6 mm ytimiä saatiin eri, edustavalla kunkin ensisijaisen NSCLC näytteen ja toisistaan ​​0,8 mm välein lasilevyille. Solulinja pelletit koostuvat SW480, HT29, A431, MB435, MCF7, BT474, ja SKBR3 käytettiin verrokkeina ja upotettiin array, kuten aiemmin on kuvattu [30]. Ikäluokat varten MTMA ja YTMA kerättiin hyväksynnällä institutionaalisten tarkastuslautakunta ja on käytetty ennen julkaisuissa [27], [31].

immunofluoresenssivärjäyksellä

TMA dioja värjättiin jokaiselle kahden tavoite markkereita, PI3K p85 ja p110α alayksiköistä. Värjäys suoritettiin AQUA kuten aiemmin on kuvattu [29] – [31]. Laseja inkuboitiin ensisijaisen vasta-ainetta laimennettuna Tris-puskuroituun suolaliuokseen, joka sisälsi 0,3% naudan seerumin albumiinia 4 ° C: ssa. Primaarisilla vasta-aineilla, joita käytetään vastaavien inkubaatiot olivat hiiren monoklonaalista anti-ihmisen PI3K p85, klooni 4 /PI3-kinaasi-(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) tai kanin anti-humaani-PI3K p110α kloonin C73F8 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), at 1:200 tai 01:50 laimennoksia, vastaavasti. Joko vuohen anti-hiiri tai vuohen anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi-koristeltu polymeerirungon (Envision, Dako Pohjois-Amerikassa, Carpinteria, CA) käytettiin visualisoimaan kohdeproteiiniin. Voit luoda kasvain maski, Levyjä samanaikaisesti inkuboitiin joko hiiren tai kanin anti-sytokeratiini klo 1:100. Visualisoimiseksi sytokeratiini värjäys vuohen anti-hiiri- tai anti-kani-IgG: llä konjugoituna Alexa 546 (Molecular Probes, Inc.) 1:200 käytettiin. Kohteena olevan merkkiaineen visualisoitiin Cy5-tyramide (NED Life Science Products). Peitelaseja asennettu pidentää Gold reagenssin kanssa 4 ”, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Invitrogen).

Automatisoidut Image Acquisition ja analyysi (AQUA) B

Kuvat analysoitiin algoritmeja jotka on kuvattu [29]. Kasvain oli erotettava peruskudoselementeistä mukaan sytokeratiinia signaali. Yhtyminen sytokeratiini solun pinnalla käytettiin paikantamaan solukalvon /sytoplasmisen osaston sisällä kasvaimen maski, ja DAPI käytettiin tunnistamaan ydin- osaston sisällä kasvaimen maskin. Tavoitteet visualisoitiin Cy5; Tämä aallonpituus käytetään kohteena merkintöjä, koska se ei ole alueella kudoksen autofluoresenssia. Useita monokromaattista, korkean resoluution (1024 x 1024 kuvapistettä, 0,5-um) harmaasävykuvat saatiin kultakin histospot käyttäen 10 × tavoite Olympus AX-51 epifluoresenssimikroskooppia automatisoidulla mikroskoopilla vaiheessa ja digitaalinen kuva hankinta vetämänä mukautettua ohjelmaa ja macrobased rajapinnat IPLabs ohjelmisto (Scanalytics, Inc.). Kuvia kunkin histospot olivat tarkistetaan yksittäin. Kaksi kuvaa otettiin kiinni kullekin histospot ja kunkin fluoresoivan kanavalle, DAPI, Alexa-546, ja Cy5; yksi kuva tasossa keskittyä ja yksi 8 ìm alapuolella. Osastoin- ja kvantifiointi kohdeproteiinin signaalin kunkin ennalta määritellyn osaston kullekin histospot suoritettiin seuraavasti. Ensinnäkin, Alexa-546 signaali, joka edustaa sytokeratiini värjäystä käytettiin tuottamaan epiteelisolujen peite, joka sulkee pois kaikki muut peruskudoselementeistä. Tämä signaali on binaarinen aidatulla tunnistamiseksi, onko pikseli kuuluu kasvain maskin (on) vai ei (off); kaikki valkoiset pikselit ovat osa naamion ja kaikki mustat pisteet eivät kuulu tähän lokeroon. Samoin ydin- osasto määritellään pikseleitä, jotka osoittavat DAPI värjäys tason sisällä keskittyä ja alueella määritelty kasvain maskin. DAPI kuva myös binarized tuottaa maskin kaikkien ytimien näytteessä vähentämällä ulos päällekkäisiä pikseliä sytoplasmisen naamio; kaikki valkoiset pikselit ovat osa tämän maskin vaikka kaikki mustat pisteet eivät ole. Varmistaa, että vain kohde-signaalin kasvain eikä ympäröivän elementtien analysoitu, RESA /paikka algoritmeja käytettiin. RESA algoritmi tarjoaa adaptiivisen kynnystysproseduuri järjestelmä. Yleisesti, formaliinilla kiinnitetyt kudokset voi esiintyä autofluorisaatiota ja joskus analyysi voi antaa useita tausta huiput. RESA algoritmi vahvistetaan hallitseva huippu ja asettaa sitten binary mask kynnys hieman suurempi intensiteetti tasolle. RESA eliminoi kaikki out-of-keskittyä tiedon vähentämällä prosenttiosuus out-of-keskittyä kuvan tarkennuksen kuva, joka perustuu pikseli pikselin analyysi kaksi kuvaa. Tämä lopulta saadaan tarkempi toimeksianto pikselien viereisten osastojen. Lopuksi hyödyntää paikka algoritmi määrittää jokaisen pikselin kunkin kuvan tiettyyn subsellulaarisessa. Kaikki pikselit, joita ei voida tarkasti valittu lokero, jossa on varmuudella 95% lopulta pois. Lisäksi kaikki pikselit joille intensiteetit ovat liian samanlaisia ​​ydin- ja kalvo osastoja, joten sitä ei voida tarkasti määritetty ei lueta mukaan. PI3K ilmentyminen automaattisesti määritettiin Cy5 kanavan kuvien saamiseksi suhteellinen pikselin intensiteetti signaalin peräisin tasosta keskittyä. Ensinnäkin, kukin pikseli on valittu subsellulaarisessa tai on suljettu pois, kuten edellä on kuvattu. Aqua sijoituksen tahansa solukomponenttien osastoja lasketaan yleensä keskimääräistä AQUA pisteet kustakin yksittäisiä pikseleitä ovat valittujen osastoon; kohdesignaalin (P85 tai P110α) pikseleistä sytoplasmassa normalisoitiin alueelle kasvaimen maskin ja pisteytettiin asteikolla 0-255 (AQUA pisteet). Histospots jätettiin jos kasvain maskin oli alle 5% koko histospot alueella.

Tilastollinen analyysi

JMP-versio 5.0 ohjelmistoa käytettiin (SAS Institute, Cary, NC). Prognostisia merkitys parametrien arvioitiin käyttämällä Coxin suhteellisten riskien mallia ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika päätepisteenä. Univariate selviytyminen analyysit kuvataan käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Yhdistyksen välinen jatkuva AQUA tulokset ja muut kliiniset /patologisten parametrit arvioitiin varianssianalyysillä. Kaikki raportoidut p-arvot perustuvat kaksipuolisen merkitys testaus. ANOVA ja t-testiä käytettiin vertaamaan jatkuvia mittauksia.

Solulinjat ja Western blotit

levyepiteelikarsinoomasolu linja H2170 ja adenokarsinooman solulinjoja H1650, HCC2935 ja HCC827 oli ystävällisesti Drs. John Minna ja Michael Peyton (Southwestern University). Levyepiteelikarsinoomasolu linjoja SK-MES-1 ja SW900 saatiin American Type Tissue Culture. Ominaisuudet kustakin solulinjasta lukien mutaatiostatuksesta tila

PIK3CA

,

K-RAS

ja

EGFR

on esitetty taulukossa S1. Adenokarsinooma solulinjat H1650, HCC2935 ja HCC827 on villin tyypin

PIK3CA

ja

K-RAS

mutta mutantti

EGFR

. Kaikki levyepiteelikarsinoomasolu linjoja SK-MES-1, H2170 ja SW900 on villin tyypin

EGFR

ja villin tyypin

PIK3CA

. SK-MES-1 ja H2170 on villin tyypin

K-RAS

. SW900 on mutantti

K-RAS

. Olimme kiinnostuneita verrataan vaikutuksia PI3K eston adenokarsinooma ja levyepiteelikarsinoomasolu linjat ja vertaamalla

EGFR

mutantin

EGFR

villityypin solulinjoilla. Kaikki ihmisen keuhkosyövän solulinjoja viljeltiin vakio-olosuhteissa (37 ° C, 5% CO

2-ilmakehä) ja kasvatettiin RPMI (Gibco ™, Invitrogen Corp, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. HBE135-E6E7 solulinja, joka on ei-transformoitu bronkoalveolaarisesta solulinja, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin Keratinosyyttien-Serum Free väliaineessa, jota oli täydennetty 5 ng /ml ihmisen rekombinantti-EGF: ää, 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta, 0,005 mg /ml insuliinia ja 500 ng /ml hydrokortisonia.

Proteiinikonsentraatiot solulysaattien laskettiin BCA (Bicinchoninic Acid) määritystä (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Proteiineja (50 ug) laimennettiin näytepuskuriin [2,5% SDS: ää, 10% glyserolia, 5% β-merkaptoetanoli, 50 mM Tris (pH = 6,8) ja 0,1% bromifenolisinistä] ja saatettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidia geelielektroforeesi (SDS-PAGE). Western-blottaus suoritettiin standardimenetelmillä käyttämällä seuraavia ensisijainen kanin anti-humaani-vasta-aineita: phosporylated AKT (Ser

473), fosforyloitu p70S6K (Thr

389), PI3K p110α, fosforyloitu S6 ribosomaalinen proteiini (Ser

235 /236), PARP (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) 1:1000, ja hiiren monoklonaalinen anti-ihmisen PI3K p85 tai anti-kaspaasi-2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) on 1:1000. Monoklonaalinen hiiri β-Actin (A2066 tai A5441, SIGMA, 1:200 tai 1:5000 vastaavasti) käytettiin verrokkina standardoida näyte lastaus. Havaitseminen proteiinit tehtiin peroksidaasikonjugoidulla anti-hiiri- tai anti-kani IgG sekundääriset vasta-aineet (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) ja ECL (PerkinElmer).

Antineoplastiset aineet ja elinkykyyn määritykset

solujen elinkelpoisuuden määritykset, 1 x 10

3-solut maljattiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle (BD Bioscience), ja annettiin kasvaa 24 tunnin ajan noin yhtymäkohta 30%. Huumeiden inhibitiokokeet, NVP-BEZ235 ja NVP-BKM120 (Novartis Pharmaceuticals, Basel, Sveitsi) ja LY294002 (LC Laboratories, Woburn MA) käytettiin hoitamaan keuhkojen soluihin eri konsentraatioissa. Yhdistelmä- kokeissa, mTORC1 estäjä, rapamysiinin ja EGFR-inhibiittorin erlotinibin (LC Laboratories) käytettiin.

Solujen elinkyky arvioitiin 72 tuntia käyttämällä CellTiter-Glo ™ Luminescent solunelinkykyisyysmääritys, mukaan valmistajan ohjeiden ( Promega, USA); yhtä suuri tilavuus Cell Titer-Glo ™ -reagenssia lisättiin kuoppiin ja sen jälkeen 10 minuutin inkuboinnin, luminesenssi merkittiin muistiin käyttäen Victor ™ X Multilabel levylukijaa (Perkin Elmer). IC

50-arvot määritettiin XLfit ohjelmisto (MathIQ versio 2.2.2, IDBS).

synergistinen lääkevaikutuskysely Analysis

Chou ja Talalay yhdistelmäindeksiä analyysimenetelmää käytettiin analysoida tulokset kombinatoorista huumekokeita [32]. NVP-BKM120 ja LY294002 käytettiin yhdessä mTOR-estäjä, rapamysiini. NVP-BEZ235 yhdistettiin erlotinibin, kukin omalla yksittäinen lääke IC

50 tai IC

25 pitoisuuksia. IC

50 ja IC

25-arvot kunkin lääkkeen ensin saatu yksittäisen lääkkeen luelinkykymäärityksillä ja sitten hyödynnetään suunnitella lääkeyhdistelmä kokeiluja. Taso synergia arvioitiin laajalla lääkkeen pitoisuuksia, keskittyen pitoisuus alle tai IC

50 kummankaan lääkkeen yksin. Tuloksemme analysoitiin synergistisiä, lisäaine tai antagonistisia vaikutuksia käyttämällä CalcuSyn- ohjelmistoa (Biosoft, Ferguson, Missouri, USA). Synergistinen vaikutus ilmaistaan ​​Combination Index (CI) on alle 0,9, lisävaikutus jonka CI 0,9 ja 1,1, ja antagonistinen vaikutus CI suurempi kuin 1,1.

Tulokset

ilmentäminen PI3K p85 ja p110á alayksiköiden ihmisen keuhkosyövän yksilöitä

MTMA, 166 ja 190 näytteet olivat täysin arvioitavissa osalta PI3K p85 ja p110α alayksikköä ilme, vastaavasti. PI3K eivät osoittaneet merkittäviä tumavärjäystä joko alayksikkö, ja siksi analysoidaan vain sytoplasmisen osaston. Värjäyskuviot sisällä kasvain maskin sisällä histospot olivat erittäin homogeenisia molempien alayksiköiden. AQUA tulokset vaihtelivat +7,12-127,04 (keskiarvo, 37.68, mediaani, 33.47) ja p85-alayksikköä ja 5,43-138,56 (keskiarvo, 24.35, mediaani, 20.26) varten p110α alayksikköä. Eräs esimerkki AQUA värjäytymisen histospots varten p85 ja p110α ilmentyminen on esitetty kuviossa 1 ja taulukossa S2. Histospots katsottiin un tulkittavissa, jos heillä oli riittämätön kasvainsolujen menetys kudoksen paikalla, tai runsaasti nekroottista kudosta. Näytteet, joissa on alle 5% kasvaimen alueelle täplää kohti ei sisälly AQUA analyysissä.

Anti-PI3K konjugoituna Cy5 mitataan PI3K alayksikön tasojen (alhaalla vasemmalla leukaneljännekselle, suurennus x 10). Anti-sytokeratiini konjugoituna Cy3 käytetään tunnistamaan kasvainsoluja sisällä histospot (ylhäällä oikealla neljännesten). Reiät täytetään luoda kasvain maskin (oikea alempi neljännesten). DAPI käytetään tunnistamaan ytimet (ylhäällä vasemmalla neljännesten). Ydinvoiman osaston sisällä kasvaimen maski vähennetään sitten maskin luoda sytoplasmisen osaston (ei esitetty). Oikea paneelit ovat 40 × suurennoksia PI3K p85 ja p110α alayksikköä positiivinen ja negatiivinen värjäytyminen, vastaavasti.

arvioinut assosiaatiot PI3K alayksikköä ilmaisun ja histologisia alatyyppi, jonka pariton t-testejä. Expression Sekä p85 ja p110α alayksiköt olivat merkittävästi korkeammat adenokarsinooman kuin okasolusyöpää (

P

0,0001 p85 ja

P

= 0,0356 varten p110α), kuten kuvassa 2, paneeli A B.

Merkittävästi suurempia ilmaus PI3K p85-alayksikön nähdään adenokarsinooma kasvaimia, että Moffitt Cancer Colson ja Yale University kohortin vastaavasti (paneeli A C). Huomattavasti korkeampi ilmentyminen PI3K p110α alayksikön adenokarsinooma kasvaimia nähdään Moffitt Cancer Colson ja Yale University kohortin vastaavasti (paneeli B mediaani, 32,70) ja p85-alayksikköä ja 9,17-86,91 (keskiarvo, 38,12; mediaani, 35.17) varten p110α alayksikköä. Paritonta t-testiä vahvisti havainnot MTMA; ilmaus p85-alayksikköä ja p110α alayksikkö olivat merkittävästi korkeammat adenokarsinooman kuin okasolusyöpää (

P

0,0002 p85 ja

P

= 0,0266 varten p110α), kuten kuvassa 2, paneeli C D. Korkea p85 ja p110α alayksikköä ilmaisun korreloi edennyt sairaus sairauden vaiheessa (

P

= 0,0075,

P

= 0,0093, vastaavasti), mutta ei iän ja sukupuolen (ei kuvassa).

Cox univariate selviytymisen analyysit jatkuvan AQUA tulokset, huomasimme, että korkea p85 ilmaus korreloi vähentynyt selviytymisen (

P

= 0,0198). AQUA tarjoaa jatkuva tuotanto tulokset, pikemmin kuin luokkiin ”high” tai ”low”, määritettynä patologit tulkitsemalla standardin immunohistokemiallisesti. Visualisoida yhdistyksen välillä jatkuvan PI3K tulokset ja selviytymistä, AQUA pistemäärät kahtia keskimääräisenä, mikä käyttö rutiinia tilastollisilla alueilla ilman taustalla perusteltua jako ilmaisun. Kaplan-Meier selviytymisen dikäyrät varten PI3K p85-alayksikköä ilmaisun ja eloonjäämisen ja

P

-arvot saatiin Mantel-Cox log-rank menetelmällä. Kuten on esitetty kuviossa 2, paneeli E F, löysimme merkittävä yhdistyksen välillä korkea p85 ilmaisun ja huono selviytyminen (

P

= 0,0075). Ei assosioitunut p110α ilmaisun ja selviytymistä.

monimuuttujamenetelmin p85 ilmaus ei säilyttänyt sen itsenäistä ennustearvoa, oletettavasti johtuen sen yhdessä histologisen alatyypin ja vaihe. Ainoa muuttuja liittyy selviytymisen monimuuttujamenetelmin oli Stage (

P

= 0,0000). Mitään tällaista assosiaatio p110α alayksikköä ilmaisun ja eloonjäämisen todettiin.

koekspressio PI3K p85 tai p110á kanssa mTOR ihmisen keuhkokasvaimia

assosiaatio aiemmin julkaistu mTOR ilmaisun [27] ja P85 ja p110α alayksiköt PI3K arvioitiin. Käyttämällä Spearmanin testi, mTOR ilmentyminen liittyi p110α ilme (ρ = 0,276,

p

= 0,0006), kun taas ei assosioitunut tasojen mTOR ja p85-alayksikköä.

in vitro

aktiivisuus NVP-BKM120 ja LY294002 keuhkon solulinjoissa

Koska yhdistyksen välillä PI3K ja pitkälle ja huono säilyminen,

in vitro

aktiivisuus PI3K-estäjien tutkittiin kuudessa ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Kaksi PI3K inhibiittorit käytettiin; tutkimme NVP-BKM-120, kliininen laatu PI3K estäjä kehitetään Novartis, ja LY294002, kaupallisesti saatavilla oleva yhdiste, joka on laajalti käytetty tutkimaan PI3K esto prekliinisen ympäristössä. Soluja käsiteltiin joko NVP-BKM120 pitoisuuksina välillä 0,01 nM 8200 nM tai LY294002 konsentraatioilla alueella 6,4 nM 20000 nM. Kaikki kokeet tehtiin kolmena kappaleena. 72 tunnin kuluttua inkubaation solujen elinkelpoisuus arvioitiin, ja IC

50 laskettiin kustakin solulinjasta, ja keskimäärin toista kokeita. Kuten on esitetty taulukossa 1, IC

50 NVP-BKM120 ja LY294002 inhibition vaihtelivat 716 nM 1265 nM ja 4123 nM 11925 nM, vastaavasti.

Sen testaamiseksi, kasvun esto aiheutettu NVP-BKM120 ja LY294002 ovat erityisiä tai ainakin parannettu pahanlaatuinen verrattuna normaaleihin soluihin, käytimme kuolemattomaksi, ei-transformoitu bronchoaveolar solulinja, HBE135-E6E7. Nämä solut olivat peräisin normaalista keuhkoepiteeliverrokkiin otettu mies käynnissä lobectomy okasolusyöpään [33]. NVP-BKM120 ja LY294002 oli vain vähän vaikutusta normaalia bronchoaveolar solut pitoisuus on noin 10 ja 5 taita keskimääräinen IC

50 näiden kahden lääkkeen, tässä järjestyksessä NSCLC soluissa. 13% kasvun estyminen nähtiin 10pM NVP-BKM120 mutta IC

50 ei tavoitettu korkeammilla pitoisuuksilla, ja vain 25%: kasvun esto saatiin 50 uM LY294002 hoitoon.

Koska ilmentymistasojen lääkekohteita joskus ennustaa lääkeaineen herkkyys, olemme tutkineet yhdistyksen välillä herkkyys /kestävyys NVP-BKM120 ja LY294002 ja PI3K tasolla. Olemme arvioineet kaksi PI3K alayksiköstä ja kokonais- ja fosforyloidun AKT immunoblottauksella. Mitään selvää assosioitunut esikäsittely tasojen PI3K (P85 tai p110α) tai kokonais- ja fosforyloitu AKT ja herkkyys /kestävyys NVP-BKM120 tai LY294002 (kuva S1).

Synergismi PI3K ja mTOR-inhibiittorit

vastustuskyky PI3K esto on havaittu eri sairauksien ja johtuvan lukuisia mekanismeja. Konstitutiivinen PI3K reitin aktivaatio voi johtua AKT aktivaation mTOR-C2 tai mTOR aktivoitumisen MAP kinaasireitin edustajia huolimatta erityisiä PI3K lääkkeen esto. Koska ilmentäminen rinnakkain välillä p110α ja mTOR nähneet meidän kliinisissä näytteissä, tutkimme synergiaan mTOR inbitor rapamysiini ja NVP-BKM120 ja rapamysiini ja LY294002. Pitoisuudet 1000 ja 500 nM NVP-BKM120 yhdistettiin konsentraatioalueella Rapamysiinin (1, 10 ja 100 nM) kuudessa NSCLC solulinjoissa. Synergia nähdään viidessä kuudesta solulinjoissa lainkaan pitoisuuksilla NVP-BKM120 kaikkien kolmen pitoisuudet rapamysiinin, ja kuudennessa solulinjassa (H1650), synergia nähtiin suurempia pitoisuuksia NVP-BKM120 (kuva 3 ja taulukot S3 ja S4). Sitten tutkittiin synergian LY294002 ja rapamysiini. Pitoisuuksia 5000 ja 2500 nM LY294002, yhdistettiin konsentraatioalueella Rapamysiinin (1, 10 ja 100 nM) kuudessa keuhkojen solulinjoissa. Synergia nähdään kaikissa kuudessa solulinjoissa kaikilla pitoisuuksilla LY294002 kaikkien kolmen pitoisuudet rapamysiinin, kuten on esitetty taulukossa S3. Kuvio 3 esittää synergia graafisesti käyttämällä H2170 ja SW900 esimerkkinä. Erityisesti erot nähdään elinkelpoisuutta lisätessään 1 nM, 10 nM tai 100 nM rapamcyin olivat melko samanlaisia.

Soluja käsiteltiin laskeva nanomolaarisia pitoisuuksien PI3K estäjän NVP-BKM120 tai LY294002, yksin tai yhdistettynä 1 nM, 10 nM tai 100 nM rapamysiini 72 tunnin ajan ja elinkelpoisuus mitattiin Cell Titer Glo määritys. Palkit osoittavat elinkelpoisuuden elinkelpoisten solujen prosentuaalinen suhteessa käsittelemättömiin soluihin. Kolme erillistä kokeet suoritettiin ja jokainen ehto mitattiin kolmessa jäljitellä kuoppiin.

Toiminta kaksinkertaisen PI3K /mTOR-estäjä NSCLC solulinjoissa

Koska synergia välillä nähdään PI3K estäjiä ja rapamysiiniä keuhkosyövän solulinjoissa, dual PI3K /mTOR-estäjä, joka on annettu kiinteä kasvain potilaiden vaiheen I kliinisissä kokeissa, NVP-BEZ235, tutkittiin. Kaikki kuusi keuhkosyövän solulinjat IC

50-vuotiaat, että NVP-BEZ235 yhdisteen olivat nM-luokkaa, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu HBE135-E6E7 soluja, jopa niinkin suuriin pitoisuuksiin kuin 1000 nM tai kaksikymmentä kertaa keskimääräinen IC

50 havaittu NSCLC solulinjoissa (taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NSCLC kasvua ja selviytymistä välittämän laajan molekyyli- tekijät ovat selektiivisesti herkkiä inhibitiolle PI3K NVP-BEZ235. Tavoitteet NVP-BEZ235 (Pakt, pP70S6K ja PS6) määritettiin immunoblot-analyysillä soluissa jopa 24 tuntia lääkkeen altistumista. Jokainen lääkealtistuksen yli 24 tuntia aiheutti merkittävän määrän kuolleita soluja ja roskat ja olisi rajoittanut tulkittavuutta.