Krooninen sairaus

tiivistelmä

Zinc Finger (ZnF) 280B proteiini tunnistettiin odottamaton tavoittelema shRNA suunniteltu sGCα1. Lisäksi analyysi osoitti, että nämä kaksi proteiinia ovat yhteydessä toisella tavalla, jossa 280B up-regulation of sGCα1 ilmentymisen. Knock-down ja yli-ilmentyminen kokeet osoittivat, että 280B palvelee kasvua edistävän ja pro-PELASTAUTUMINEN eturauhassyövässä. Yllättäen kuitenkin nämä pro-syöpä toimintoja 280B eivät välittävät sGCα1, joka itse on samankaltaisia ​​tehtäviä eturauhassyöpä, mutta alassäädetty p53. P53-proteiini on toinen tavoite 280B eturauhassyövässä, mutta toisin sGCα1, p53 on alas-säädellä 280B. 280B indusoi p53 tumasta, mikä myöhemmin proteasomaalisten hajoamista. Proteiini vastuussa p53 sääntelyn 280B on MDM2, E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla joka edistää p53 hajoamista indusoimalla sen tumasta. Osoitamme tässä, että 280B ajan säätelee ilmentymistä MDM2 eturauhassyöpäsoluissa, ja tämä asetus on kautta MDM2 promoottori. Osoittamaan

in vivo

merkitystä tämän vuorovaikutuksen, ilmaus tutkimukset osoittavat, että 280B proteiini tasot ovat säädellään ylöspäin eturauhassyöpä ja nämä tasot vastaavat alentunutta tasoa p53. Niinpä lisäämällä ilmaus MDM2, The karakterisoimattomat 280B proteiini tarjoaa uuden mekanismin p53 tukahduttaminen eturauhassyövän.

Citation: Gao S, Hsieh CL, Zhou J, Shemshedini L (2013) Zinc Finger 280B säätelee sGCα1 ja p53 eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (11): e78766. doi: 10,1371 /journal.pone.0078766

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 14 elokuu 2013; Hyväksytty 23 syyskuuta 2013 Julkaistu 13 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat National Institutes of Health (NIH) R01CA127873-01A1. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

p53-tuumorisuppressorin on keskeinen asema koordinoinnissa soluvasteita erilaisiin rasituksia (mukaan lukien DNA-vaurioita, yli-ilmentynyt onkogeenien ja monipuolinen aineenvaihdunnan rajoitukset) [1]. Vastauksena solun korostaa, p53-ilmennys indusoituu ja proteiini kulkeutua tumaan ja sitoutua DNA: han sekvenssispesifisellä tavalla, jolloin aktivoimalla tai tukahduttaa kohdegeenit [2]. Siten p53 voi orchestrate biologisia tuotoksia kuten apoptoosin, solukierron pidätyksen, vanhenemista, tai modulaatio autophagy. Useita loppupään suorat tavoitteet ovat mukana anti-proliferatiivista p53, kuten pro-selviytymisen

suvivin

[3], ja solusyklin estäjä

p21 /CIP1

[4].

MDM2 (Mouse double minuutti 2 homologi) on tärkeä säätelijä p53 [5]. Pääasiassa MDM2 on E3 ligaasilla että alas-säätelee p53 kautta tumasta ja ubikitiinipromoottori riippuvaisen proteasomaalisten hajoaminen [6] – [9]. Lisäksi, histoni asetyyli transferaasi (HAT) proteiineja p300 ja CBP (CREB: tä sitova proteiini) vakauttaa p53 kautta asetylaatio, ja tämä stabiloiva vaikutus voidaan kumottu MDM2 muodostamalla ternäärinen kompleksi p53 ja p300 tai CBP [10], [11]. Mutaatiot p53 että johtavien menettämisestä toiminnon edustavat yleisin geneettinen muutos ihmisen syövissä [12], [13]. Mielenkiintoista, täydellinen menetys p53 löytyy vain edennyt eturauhassyöpä [14]. Myöhemmin määritettiin, että yhdistetty menetys p53 ja PTEN, tuumorisuppressori mukana PI3-AKT signalointi [15], oli riittävä ajamaan kehittämiseen invasiivisen eturauhassyövän [16]. Toinen tuumorisuppressori, NKX3.1, havaittiin lisäävän asetylaatio ja vakautta p53 kautta MDM2-riippuvainen mekanismeja [17].

Liukoinen guanylyl cyclase (sGC) on typpioksidin (NO) reseptorin, ja on hyvin tunnettu entsymaattinen aktiivisuus muuntaa guanosiini-5′-trifosfaatti (GTP) ja syklisen guanosiini-3 ’, 5’-monofosfaatti (cGMP). Tämä reitti on useimmiten mukana sydän-ja hermoston [18]. Olemme aiemmin raportoitu, että α1-alayksikön SGC (sGCα1; geenin nimi

GUCY1A3

) on suora kohde androgeenireseptorin (AR), ja sillä tärkeä rooli ajo eturauhassyövän soluproliferaatiota [19]. Olemme myös päättäneet, että sGCα1 toimii pro-selviytymisen toiminto eturauhassyövän estämällä p53 aktiivisuutta ja selektiivisesti estävät geenit, jotka osallistuvat apoptoosiin, mekanismin kautta p53: n sytoplasminen sitomiseen [20]. Mielenkiintoista, nämä pro-syöpä toiminnot sGCα1 ovat riippumattomia sGC entsyymin aktiivisuutta. Viime aikoina, terapeuttista potentiaalia kohdistaminen sGCα1 kehitettiin kautta sitova peptidi, jolla on voimakas syövän vastainen vaikutus [21].

sinkkisormia (ZnF) ovat yleinen DNA: ta sitova motiivi löydettiin useita transkriptiotekijöitä, ja C

2 H

2 motiivi on yleisin [22]. Tämä motiivi on tunnusomaista kaksi kysteiini ja kaksi histidiinitähdettä koordinoi yhden tai useamman sinkki-ionien ja työntyy sormen kaltainen rakenne, joka on vuorovaikutuksessa DNA: n kanssa [23]. Todisteet on syntymässä että ZnF proteiinit tärkeä rooli ihmisen syövissä. Esimerkiksi, ZNF23 inhiboi tuumorisolun kasvua parantamiseksi p27 /kip-1 ilmentymisen, ja ekspressiotasot ZNF23 proteiinin vähenevät huomattavasti ihmisen syövässä [24]. Kolorektaalisyövässä, ZKSCAN3 (ZNF306) ilmentyminen koholla ja alle-ilmentyminen ZKSCAN3 vähensi kasvainten muodostumiseen [25]. Lisäksi useat raportit osoittavat, että ZnF proteiinit voivat vaikuttaa p53 aktiivisuutta. ZNF668 tunnistettiin tuumorisuppressorina rintasyövässä, joka stabiloi p53 estämällä MDM2-välitteisen p53 ubikinaation ja hajoaminen [26]. ZNF307 estää aktiivisuutta p53 ja p21 lisäämällä transkription MDM2 ja EP300 [22].

Tutkiessani toiminta sGCα1 käyttäen RNAi tunnistimme Zinc Finger 280B (ZNF280B, sen jälkeen kutsutaan 280B) tavoitteeksi asetettiin yksi sGCα1 shRNAs. Rajoitetun tietoa saatavilla 280B ja mahdollinen suhde ZnF proteiinien p53 kannustanut meitä analysoida tarkemmin 280B mahdollisen roolin eturauhassyöpää. Tässä tutkimuksessa osoitamme toiminnallinen vuorovaikutusta 280B, p53, ja MDM2. Yli-ilmentyminen 280B merkittävästi vähentynyt p53 tasoja vähentämällä sen vakautta. Tämä vaikutus p53 vakautta välittää kyky 280B indusoida ilmentymisen MDM2 kautta positiivinen vaikutus MDM2-promoottori. Tukahduttamalla p53, 280B tarjoaa pro-selviytymisen ja kasvua edistävän toiminnot eturauhassyövässä. Tämän tueksi, korkea ilmentyminen 280B liittyy alhainen p53 tasot eturauhasen kasvain kudoksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja siRNA transfektio

LNCaP, C81 ja CWR-22Rv1-soluja kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (PrEC) viljeltiin PrEGM suosittelemia toimittajan (Lonza). Salatut ohjaus siRNA, sGCα1 siRNA, MDM2 siRNA (GAACAAGAGACCCUGGUUA) ja ZNF280B siRNA (GGAACAAUCAUGUGAGGAA) (Dharmacon) 40 nM lopullinen konsentraatio transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine Simax (Invitrogen).

Reporter Assay ja plasmiditransfektiolla

C81-soluja kasvatettiin 80-90% konfluenssiin RPMI-1640: 5% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua väliaine korvattiin seerumittomalla alustalla ja soluja transfektoitiin ohimenevästi p53-Luc reportteriplasmidilla tai MDM2-Luc reportteriplasmidilla, ja hallita siRNA, tai siRNA vastaan ​​ZNF280B ja p53. PCH110 koodaavalla plasmidilla b-galaktosidaasin tarkkailuun käytettiin transfektiotehokkuuden [27]. P53-Luc-plasmidi toimitti ystävällisesti Dr. Andrei Gudkov ja sisältää kolme p53: een reagoiva elementtejä. MDM2-Luc ja MDM2 ekspressioplasmidi toimitti ystävällisesti Dr. Jason M. Shohet. Transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen lusiferaasianalyysissä järjestelmän Promega.

Adenovirus ja lentivirustartunnat

C81-solut infektoitiin 5-50 MOI joko adenovirusta, joka ekspressoi ZNF280B (ABMGood)) tai tyhjä adenovirus kontrollina. 48 tunnin jälkeen solut altistettiin RT-PCR: ää ja western-blottauksella.

sGCα1 shRNA, tyhjä shRNA, ja paketti vektorit hankittiin Open Biosystems. Lentiviruksen partikkelit valmistettiin seuraten yhtiön protokollaa. LNCaP-solut infektoitiin lentiviruksen ja valitaan käyttämällä puromysiini pitoisuutena 4 mg /ml. 4 päivän jälkeen valinta, solut altistettiin MTT-määritystä, qRT-PCR, Western-blottauksella.

immunohistokemia

Immunohistokemiaa käytettiin verrattaessa tason ZNF280B normaalissa eturauhasessa kudoksissa ja kasvainkudoksissa saatu CHTN. ZNF280B-vasta-aine (1:200 laimennus; Sigma) käytettiin immunohistochemisty kuten aiemmin on kuvattu [27].

Proliferaatiomääritykset

Kun siRNA transfektion 3 päivää, 20000 soluja kustakin olosuhteesta ympättiin 24-kuoppaisille levyille. MTT-määritystä (Sigma) käytettiin aiemmin [21] määrittää solujen lukumäärän.

Western blotting ja Cell fraktiointi

Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu [19] käyttämällä ensisijaista vasta-aineita sGCα1 ( Cayman Chemical), ZNF280B (Abgent), MDM2 (Santa Cruz), Surviviinispesifisiä (Cell Signaling Technology), p21 (Cell Signaling Technology), p53 (Santa Cruz), β-Tubulin (Abcam), RARa (Santa Cruz), β- aktiini (Abcam).

C81-soluja käsiteltiin siRNA ja adenovirus otettiin talteen ja pestiin kerran kylmällä PBS: llä. 10% soluista oli tallennettu syötteenä ja jäljellä oleva osa jaettiin ydin- ja solulimafraktiot käyttäen Nuclear /Cytotsol fraktiointi Kit (MBL International). Fraktiot altistettiin sitten Western-blottaus mitata ZNF280B ja p53-proteiinin tasoja.

Semi-Kvantitatiivinen RT-PCR ja QRT-PCR

Yhteensä mRNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia seuraavan protokollan valmistuksesta ( Invitrogen), ja sille suoritettiin semikvantitatiivinen RT-PCR ja QRT- PCR-analyysit, kuten on kuvattu [28]. PCR-ylävirran ja alavirran alukkeet, joita käytetään kunkin geenin olivat:

surviviinia

, 5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3 ’ja 5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3’;

p53

, 5′-GGCCCACT TCACCGTACTAA-3 ’ja 5′-G TGGTTTCAAGGCCAGATGT-3’;

sGCα 1

, 5′-AGCAGTGTGGAGAGCTGGAT-3; ja 5′-CTGATCCAGAGTGCAGTCCA-3 ’;

p21

, 5′-GACACCACTGGAGGGTG ACT-3 ’ja 5’-CAGGTCCACATGGTCTTCCT;

GAPDH

, 5′-CGACCACTT TGTCAAGCTCA-3 ’ja 5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3’.

MDM2

, 5′-TTTCGCAGCCAGGAGCACCG-3 ’ja 5′-AGTTTCCTTCACGGGGCGCG-3’;

ZNF280B

, 5′-TCCCAAAAGGGCTAAACTCA-3 ’ja 5’GTCCTTTGGAAAAGC- TGCTG-3’.

Tulokset

sGCα1 siRNA tavoitteet 280B eturauhassyöpäsoluissa

tutkia roolia endogeenisen sGCα1 eturauhassyöpäsoluissa, käytimme shRNA että pudotus tämän geenin LNCaP. Viidestä eri shRNAs, kaksi oli tehokkain alaspäin säätäminen sGCα1 proteiinin ekspressiota: shRNA7 ja shRNA8 (tietoja ei ole esitetty). Näitä shRNAs käytettiin jatkotutkimuksiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1, shRNA8 oli tehokkaampi kuin shRNA7 tasoittamaan molemmilla tasoilla sGCα1 mRNA: ta (Fig. 1A) ja proteiini (Fig. 1 B); samanlaiset tulokset havaittiin siRNA7 ja siRNA8 (Fig. S1B, C). Mielenkiintoista kyllä, shRNA7 (ja siRNA7) oli huomattavasti nopeampaa kuin shRNA8 (ja siRNA8) estämisessä leviämisen LNCaP (Fig. 1 C ja kuvio. S1C). Tämä yllättävä tulos johti meidät harkitsemaan mahdollisuutta off-tavoite vaikutuksia toisen tai molempien shRNAs. Blast haku tunnistettu, että 17 21 nukleotidin siRNA7 sovitettu täydellisesti osan 280B geenin (Fig. 1 D); merkittävä osa siRNA8 vastasi HF1A geeni (tietoja ei esitetä). shRNA7 ja siRNA7 pystyivät merkittävästi alas-säädellä 280B sekä mRNA: n tasoon (kuvio. 1 E) ja proteiini (Fig. 1 F), kun taas shRNA8 /siRNA8 ei ollut mitään vaikutusta, LNCaP-solujen ja kahden hormonin riippumaton solulinjoissa C81 ja CWR-22Rv1; mielenkiintoisesti, ei shRNA8 eikä shRNA7 vaikuttaa HF1A ilmaisu (tuloksia ei ole esitetty). Ottaen huomioon nämä tiedot, me arveltu, että suurempi negatiivinen vaikutus solujen kasvuun shRNA7 /siRNA7, verrattuna shRNA8 /siRNA8, johtuu lisätty vaikutus shRNA7 /siRNA7 on 280B. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme 280B-erityinen siRNA, joka mielenkiintoisesti on merkittävä negatiivinen vaikutus LNCaP soluproliferaatioon (kuva. 1H). Hypoteesi suoraan testattiin suorittamalla kaksinkertainen knockdovvn sGCα1 käyttäen siRNA8 ja 280B-spesifisten siRNA (Fig. 1 G), joka esti solujen lisääntymistä voimakkaammin kuin joko siRNA8 tai 280B siRNA yksin ja lähes samassa määrin kuin siRNA7 ( kuva 1 H). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että 280B toimii pro-kasvun funktiona eturauhassyöpäsoluissa.

(A, B, C) LNCaP-solut infektoitiin tyhjä lentiviruksen tai lentivirukset ekspressoivat yhtä kahdesta eri sGCα1 shRNAs (7, 8 ) ja sGCα1 ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä (A) tai Western-blottauksella (B), ja solujen tiheys mitattiin MTT-määrityksellä (C). (D) Kaaviossa nukleotidihomologiaa välillä siRNA 7 ja 280B. (E, F) LNCaP, C81, ja CWR22-RV1 solut altistettiin samalle infektioiden ja 280B mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä (E) tai Western-blottauksella (F). (G, H) C81-solut transfektoitiin Control (Ctrl), sGCα1 siRNA (7,8), 280B siRNA, ja 280B sekä sGCα1 siRNA 8, ja sGCα1 mitattiin Western blottauksella (G), ja solujen tiheys oli toimenpide MTT: llä (H). Kaikki ekspressiotasot ovat suhteessa ensimmäiseen olosuhteissa (A, D), ja se oli asetettu 1. β-aktiini toimi latauskontrollina Länsi bloteissa. Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen plus SD. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,01).

280B up-regulation sGCα1 mRNA ja proteiini eturauhassyöpäsoluissa

roolin tutkimiseksi 280B eturauhassyöpäsoluissa, käytimme 280B-spesifinen siRNA (kuviosta. 1G). 280B siRNA pystyi alas-säädellä, kuten odotettua, 280B mRNA: ta ja proteiinia (Fig. 2A) ja yllättäen, sGCα1 ilmentymistä (Fig. 2A). Blast etsimään 280B siRNA-sekvenssi tunnistettiin vain 280B geenin suora kohde, ja osoitti selvästi, että sGCα1 ei ole sekvenssin samankaltaisuutta 280B siRNA-sekvenssin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että sGCα1 mRNA: ta ja proteiinia, on kohde 280B proteiinin, ei siRNA.

(A, B) LNCaP-solut transfektoitiin valvontaa tai 280B siRNA ja sGCα1 mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä tai Western-blottauksella (A) ja solujen tiheys mitattiin MTT-määrityksellä (B); vaihekontrasti kuvat otettiin päivänä 6 (B). (C, D) LNCaP-solut infektoitiin Tyhjä tai sGCα1 adenovirus transfektion jälkeen ohjaus (-) tai 280B siRNA (+), ja sGCα1 mitattiin Western blottauksella (C), ja solujen tiheys oli toimenpide MTT: llä (D ). Kaikki ekspressiotasot ovat suhteessa ensimmäiseen olosuhteissa (A), ja se oli asetettu 1. β-aktiini toimi latauskontrollina Länsi bloteissa. Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen plus SD. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,01).

Voit määrittää, onko alassäädetty sGCα1 vastaa alennettu solujen lisääntymisen johtuvat 280B Knockdown, me toisti transfektion kanssa 280B siRNA, joka sillä ennen (kts. 1H) johti merkitty hidastunut LNCaP solujen kasvua (Fig. 2B). Itse asiassa solut käsiteltiin 280B siRNA muutti morfologia ja alkoivat kuolla (Fig. 2B). Sen määrittämiseksi, onko sGCα1 yli-ilmentyminen voi pelastaa solut, siRNA-transfektoidut solut infektoitiin sGCα1 adenovirus, jolloin talteen sGCα1 proteiinin tasot (Fig. 2C). Yli-ilmentyminen sGCα1 ole pelastaa solut (Fig. 2D), mikä osoittaa, että sGCα1 ei joko voi tai ei ole riittävä pelastaa syöpäsolujen, joilla on vähentynyt 280B ilmaisun ja viittaavat siten siihen, että toinen 280B kohde on mukana.

280B down-regulation p53-proteiinin eturauhassyövän soluissa

Koska meidän edellinen työ osoitti, että sGCα1 estää p53 toimintaa eturauhassyövässä [20] ja muut työt on ilmoittanut, että ZnF proteiinit voivat vaikuttaa p53 signalointireitille [29] halusimme selvittää, 280B vaikuttaa p53. Mielenkiintoista, siRNA knock-alas 280B lisännyt p53-proteiinin tasot LNCaP, C81 ja CWR-22RV1 soluja (Fig. 3A). Sitä vastoin, adenovirus-välitteisen yli-ilmentyminen 280B merkittävästi vähentää p53-proteiinin tasoa (Fig. 3B). Vaikutus havaittiin vain p53-proteiinin, koska p53-mRNA-tasot eivät vaikuttaneet 280B (Fig. 3C, D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että 280B säätelee negatiivisesti p53 ainoastaan ​​proteiinin tason ja eroaa siten sen vaikutus sGCα1, joka on positiivinen ja havaittu sekä mRNA ja proteiini tasoilla.

(A, C) LNCaP , C81, CWR22-RV1-solut transfektoitiin kontrolli (-) tai 280B siRNA (+) ja p53, surviviini, p21, ja 280B ekspressiotasot mitattiin Western blottauksella (A) tai reaaliaikaisella PCR: llä (C). (B, D) C81-solut infektoitiin tyhjä (-) tai 280B adenovirus (+) ja p53, surviviini, p21 ja 280B ekspressiotasot mitattiin Western blottauksella (B) tai reaaliaikaisella PCR: llä (D). Kaikki ekspressiotasot ovat suhteessa ensimmäinen ehto (C ja D), ja se asetetaan 1: (E) C81-solut transfektoitiin 0,2 ug p53-Luc ja ohjaus (-), tai 280B (+) siRNA, että läsnäolo ohjaus tai p53 siRNA. Transkriptionaalista aktiivisuutta p53-aktiivisuus kvantitoitiin mittaamalla Lusiferaasiaktiivisuutta. Kaikki toimet ovat suhteessa ensimmäinen edellytys, ja tämä aktiivisuus oli asetettu 1. (F, G) Solut (E) alistettiin Western blotting p53, surviviinia p21, ja 280B (F), ja mittaus solutiheyden MTT: llä (G). β-aktiini toimi latauskontrollina Länsi bloteissa. Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen plus SD. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (P 0,02).

Koska 280B sivupersoonat p53-proteiinin tasoa, odotamme sen vaikuttavan p53 transkriptioaktiivisuuden. Tämä seurattiin reportterigeenimäärityksessä tai endogeenistä p53 geenien. Käyttäen lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisälsi p53: een reagoiva elementit [30], havaitsimme merkittävää kasvua p53 toimintaa vastauksena 280B siRNA transfektiota (Fig. 3E). Ohimenevä transfektoimalla 280B ekspressioplasmidin aiheutti pienen, mutta selvän laskun p53 aktiivisuuden (kuvio. S2). Tutkia endogeenisten geenien, olemme keskittyneet surviviinin ilmentymiseen ja p21, koska 280B siRNA merkittävästi esti solun kasvua (ks. 2B). Surviviini on p53-tukahdutettu geeni, joka välittää solujen eloonjäämistä ja p21 on p53 aiheuttama geeni, joka estää solusyklin etenemisen. Vastauksena 280B ehtyminen, Surviviinispesifisiä proteiini vähentää ja p21 korotettiin kaikissa kolmessa solulinjoissa (Fig. 3A). Reaaliaikainen PCR tiedot vahvistivat, että 280B vaikuttaa surviviini ja p21 mRNA-tasolla (Fig. 3C). Samaan aikaan vastakkaiset vaikutukset havaittiin, kun soluja käsiteltiin 280B yli-ilmentyminen, mikä korostaa surviviinin ja vähentää p21-proteiineja (Fig. 3B) ja mRNA: t (Fig. 3d).

Nämä havainnot viittaavat siihen, että 280B voi palvella pro-selviytymisen toiminto eturauhassyövässä. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me seurataan apoptoosin mittaamalla PARP pilkkominen. Sekä LNCaP ja CWR-22Rv1 soluista osoitti kohonneita pilkkoa PARP vastauksena 280B taintumisen (Fig. S3). Roolin tutkimiseksi p53 tässä prosessissa, käytimme etoposidi, joka odotetusti, indusoi korkeita p53 ja kohonnut PARP pilkkominen (Fig. 3F). Mikä tärkeintä, nämä vaikutukset olivat vähentyneet tai poissa, kun 280B oli yli-ilmentynyt (Fig. 3F), mikä osoittaa selvästi, että 280B voi suojata soluja Etoposide: n indusoiman apoptoosin.

seuraavan tutkia, jos p53 on osallisena kasvun inhibition aiheuttama 280B siRNA. Tätä varten käytimme siRNA vähentämiseksi endogeenistä p53 C81 soluissa, joka vahvistettiin alennettu reportterigeeniaktiivisuutta (Fig. 3E) ja p53-säänneltyjen proteiinien (Fig. 3G). Merkittävää on, että siRNA pudotus p53 kykeni lähes kokonaan pelastus solujen kasvu inhiboituu 280B siRNA ehtyminen (Fig. 3H), mikä viittaa vahvasti siihen, että kohonnut p53 on vastuussa solujen kasvua tukahdutti 280B pudotus.

280B destabilizes p53-proteiini eturauhasen syöpäsolujen jopa säätelevä MDM2

tiedot edellä osoittavat, että 280B estää p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja vähentää p53-proteiinin tasoa muuttamatta sen mRNA-tasolla mukaan 280B kohdistuu p53-proteiini. Sen määrittämiseksi, 280B voi vaikuttaa p53-proteiinin vakauteen, käytimme sykloheksimi- (CHX) mitata p53 puoliintumisajan. Under-ilmentyminen 280B erityisillä siRNA johtaa kasvuun p53 puoliintumisaika 14 min 24 min (Kuva. 4A), kun taas yli-ilmentyminen 280B laski heikosti puoliintumisajan (Fig. 4B).

(A, B) C81 solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai 280B siRNA (A) tai tartunnan tyhjiä adenoviruksella tai 280B adenoviruksen (B) 48 tuntia ja sitten käsiteltiin 100 mg /ml sykloheksimidiä (CHX) varten osoitetut kertaa, jonka jälkeen Western blotting käytettiin mittaamaan p53 tasolle. Vasen paneeli edustavat määrällisesti Western blotit. (C, D) C81 solut transfektoitiin 280B siRNA tai infektoitu 280B adenoviruksen ja altistettiin solufraktioinnin, jota seurasi Western-blottaus mitata sytosolisen (C) tai ydin (N) tasot p53 ja 280B. Huomaa, että suuremmat luvut kaistat edustavat suhteellisia tasoja p53-proteiinin, standardoitu β-aktiini tasot, ja ensimmäinen kaista asetetaan 1. (E) C81-solut infektoitiin tyhjiä adenoviruksella tai 280B adenovirus 48 tuntia ja sitten käsiteltiin 10 mM Nutlin-3A tai ajoneuvo, jota seurasi Western-blottaus mitata sytosolisen (C) tai ydin (N) tasot p53 ja 280B. Kaikissa kokeissa, β-aktiini toimi latauskontrollina. β-tubuliinia ja RAR, käytettiin markkereita sytosolin ja ydinvoima jakeet, vastaavasti (C, D, E).

Ymmärtääksemme paremmin 280B vaikutus p53-proteiinin vakautta, me seurataan p53 solunosasijaintia. Huomaa, että Western blotting varten β-tubuliinin (sytosolinen) ja RARa (ydin) vahvisti puhtaus kaksi solufraktioiden ja että 280B on pääasiassa tai yksinomaan tumaproteiini (Fig. 4C). Vähentäminen endogeenisen 280B proteiinin tasot johtivat merkittävästi kohonnut ydin- p53 mutta mitään muutosta sytosolin tasoilla (Fig. 4C). Täydentävä koe, yli-ilmentyminen 280B, vähentää ydin- p53 ilman uudelleen muuttamatta sytosolin tasolle (Fig. 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että 280B edistää p53 proteasomaalisten hajoamista indusoimalla p53 tumasta. Saadakseen todisteita tästä, p53 solunosasijaintia seurattiin läsnäollessa Nutlin 3A, estäjä MDM2 vuorovaikutusta p53 ja siten tumasta [31]. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, Nutlin-3A lähes täysin poistanut 280B välittämää väheneminen ydin- p53 tasoilla, tuloksena sopusoinnussa 280B rooli p53 tumasta.

Nuclear viennin p53 riippuu MDM2, joka on olennainen askel johtavan p53 proteasomaalisten hajoaminen [6], [7]. Olemme vahvisti tämän vaikutus eturauhassyövän soluissa, joissa MDM2-siRNA indusoi korkeampia ydin- p53, kun taas ohimenevä yli-ilmentyminen MDM2 vähentää näiden tasojen (Fig. S4), matkien 280 vaikutus p53. Koska ZnF proteiineilla on kyky säädellä transkriptiota, me arveltu, että 280B voivat vaikuttaa p53 säätelemällä ilmaus MDM2. Olemme alkoi tutkia tätä mahdollisuutta mittaamalla ilmentyminen MDM2, joka vähensi merkittävästi sekä mRNA ja proteiini tasoilla, kun 280B on tyhjentynyt (Fig. 5A). Sen sijaan, 280B yli-ilmentymisen vaikutus on päinvastainen, mikä on merkitty kasvaa sekä

MDM2

mRNA ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 5B). Koska

MDM2

mRNA vaikuttaa 280B, on mahdollista, että vaikutus on transkription. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, analysoimme potentiaalinen 280B toimintaa

MDM2

promoottori, käyttäen lusiferaasireportterigeeniin määrityksessä. Ohimenevä ilmentyminen 280B on C81-solujen määrä nousi

MDM2

promoottorin aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5C) ja siRNA ehtymisen 280B estetty

MDM2

promoottorin aktiivisuutta (kuvio. 5D). Nämä havainnot osoittavat selvästi, että 280B toimii

MDM2

promoottori ja viittaavat siihen, että promoottori voi olla suora kohteena 280B.

(A, B, E) C81-solut transfektoitiin (A , E) ohjaus siRNA (-) tai 280B siRNA (+) tai (B, E) infektoitiin Tyhjä adenovirus (-) ja 280B adenovirus (+) ja sille suoritettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä ja Western blot mitata ilmentymisen MDM2 ja 280B. (C, D) C81cells transfektoitiin 0,1 ug MDM2-Luc ja kotransfektoitiin (C) ohjaus siRNA (-) ja 280B siRNA (+), (D) Tyhjä pCIneo (-) ja 0,2 ug ja 0,4 ug 280B, ja seurata 280B toimintaa mittaamalla Lusiferaasiaktiivisuutta. (E) C81cells kotransfektoitiin tyhjä pCIneo (-) tai MDM2 (+) ja ohjaamaan siRNA (-) tai MDM2 siRNA (+), jota seurasi Western-blottaus mitata sytosolisen (C) tai ydin (N) tasot p53, 280B, ja MDM2. Kaikissa kokeissa, β-aktiini toimi latauskontrollina. p-tubuliinia ja Rara käytettiin markkereita sytosolin ja ydinvoima jakeet, vastaavasti (E). Kaikki p53-proteiini tasot olivat suhteessa ensimmäinen edellytys, ja se oli asetettu 1. Tähdellä * ja ** osoittavat tilastollinen merkitykset P 0,05 ja P 0,01, vastaavasti.

Ennen tutkimalla osallistuminen MDM2 in 280B välittämää tumasta p53 MDM2 ilmentyminen muuttunut C81 soluissa onko tämä vaikuttaisi 280B toimintaa p53 solunosasijaintia. Itse näin oli, sillä liiallinen ilmentyminen MDM2 vähensi tumakertymään p53 joka laukaisi 280B taintumisen (Fig. 5E). Täydentävässä kokeessa MDM2 Knockdown poistanut negatiivista toimintaa, 280B yli-ilmentyminen on ydin- p53 tasossa (Fig. 5E). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että 280B vaikutus p53 välittyy kautta 280B sääntely MDM2 ilmaisua. Huomaa, että MDM2 on ensisijaisesti sytoplasminen eturauhasen syöpäsoluja.

280B on yliekspressoitu eturauhasen kasvaimia ja korreloi alentunut p53-proteiinin

Jotta voitaisiin tärkeyden 280B eturauhassyövässä, ensin tutkittu ilmaus 280B paneelissa eturauhassyövän solulinjoissa ja yksi normaali solulinja. RT-PCR-tulokset osoittivat, 280B-mRNA-tasot olivat 6-7 kertaa suurempi syöpäsoluja kuin normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (PrEC) (Fig. 6A). Western blotting osoitti Sama toteamus, joilla on merkittävää proteiinin tasot eturauhasen syöpäsolujen ja ei mitään havaittavissa PrEC-soluissa (kuvio. 6A). Laajentaa huomautuksia hoitopaikassa, suoritimme immunohistokemia ottelu-pariksi kudokset 4 potilasta. Potilaat 2 ja 4 osoitti vahvempi 280B immunoreaktiivisuus kuin normaaleissa kudoksissa (kuvio. 6B), joka osoittaa, että 280B ilmentyminen on kohonnut joissakin eturauhassyövän kasvaimia. Kuten voidaan odottaa, transkriptiotekijän, 280B on ilmaistu yksinomaan solutumien kaikkien kasvainten (Fig. 6B). Kudos Tutkimus laajennettiin enemmän kudoksia ja etsimään mahdollista korrelaatiota 280B ja p53 ilme. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, 280B proteiini ekspressoituu 6 10 eturauhasen kasvaimia, kun taas vain 1 3 normaalin eturauhasen. Mielenkiintoista on, että p53-proteiini ilmentyy eniten näissä kasvaimissa (# 1 ja # 7), jotka eivät ilmennä havaittavia määriä 280B, ja alin p53 tasolla löytyy kasvain, jolla on korkein 280B ilmaisua. Nämä tiedot näyttää käänteinen suhde ilmentymisessä 280B ja p53 eturauhasen kasvaimia ja näin ovat yhdenmukaisia ​​tärkeä rooli 280B negatiivisena säätelijänä p53 eturauhasen syöpä.

(A) Reaaliaikainen PCR ja Western blotting käytettiin ekspression havaitsemiseksi 280B normaalissa eturauhasessa (PrEC) ja eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, C81, ja CWR-22Rv1). (B) Immuno-värjäys 280B 4 pareittain eturauhasen kudosten normaaliin verrattuna kasvaimeen. (C) Cell ote 4 normaalin eturauhasen kudosten ja 9 kasvaimen kudokset alistettiin Western blotting havaita 280B, p53, ja MDM2 ekspressiotasot. β-aktiini toimi latauskontrollina.

Keskustelu

Ennen tätä tutkimusta, 280B oli karakterisoimattomat proteiinia, jossa ainoat käytettävissä olevat tiedot kuvaavat suhdettaan suuri perhe sinkin sormi transkriptiotekijät [32]. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet kaksi tavoitteet 280B, sGCα1 ja p53, jotka molemmat ovat merkittäviä tehtäviä eturauhassyövässä. Ensimmäinen, sGCα1, on hyvin tunnettu rooli NO signalointi ja vähemmän tunnettu rooli eturauhassyövän etenemiseen. Suhteessa jälkimmäinen rooli, aiemmat tiedot ovat osoittaneet, että sGCα1 on tärkeä välittäjä androgeenin tukea eturauhassyövän soluproliferaation [33] ja repressori p53, joka tarjoaa syöpäsolujen pro-selviytymisen toiminto [20]. Meidän havainto, että 280B parantaa ilmaus sGCα1 on yhdenmukainen 280B ottaa pro-syöpä toimintoja, jotka on selvästi merkitty sen korkea ilmentyminen eturauhassyövässä ja sen pro-proliferatiivinen toiminto eturauhasen syöpäsoluja. Mielenkiintoista on, että positiivinen vaikutus 280B havaittiin sekä sGCα1 mRNA: ta ja proteiinia, viittaa siihen, että mRNA: n, ja ehkä sGCα1 promoottori, voi olla kohteena 280B. Käyttäen 1 kb: n venytys sGCα1 promoottorin, joka AR säädöksiä [33], emme havainneet 280B aktiivisuutta (dataa ei ole esitetty). Tämä voi johtua joko 280B vaikutus sGCα1 on ulkopuolella 1 kb alue, tai on transkription jälkeinen, mikä tutkitaan tulevaisuudessa. On huomionarvoista, että 280B jakaa rajallinen yhteinen DNA-sekvenssin kanssa sGCα1, sekvenssi, joka on kohdistettu siRNA7, joka päädytty 280B. Näiden tietojen on kiehtova harkita mahdollisuutta yhteisen endogeenisen miRNA tai siRNA, joka toimii molemmilla sGCα1 ja 280B. Jos tällainen sääntely RNA olemassa, tämä RNA voisi olettaa alassäädetty eturauhassyövässä koska sekä sGCα1 ja 280B ovat yli-ilmaistu tätä tautia. Tunnistaminen tällainen erityinen RNA on tärkeä tulevaisuuden tavoite lab.

Huolimatta positiivisen asetuksessa 280B on sGCα1, yli-ilmentyminen sGCα1 yllättävän onnistunut pelastamaan soluihin estyy 280B ehtyminen, mikä viittaa toinen tavoite 280B . Meidän haku johti p53. Toisin kuin sGCα1, p53 säätelee negatiivisesti 280B ja tämä asetus on suunnattu p53-proteiini. Under-p53 pystyy lähes kokonaan pelastus solujen inhiboida vähentynyt 280B ilmentymistä. Siten yhteydessä vähenemässä 280B ilmentymisen eturauhassyövän soluissa, mikä johti alenemisesta sGCα1 ja lisääntynyt p53, lisäys p53 oli pääasiallisesti tai yksinomaan vastuussa alennettu solujen kasvua ja luultavasti tehostetun apoptoosin.