Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Sulindaakilla on FDA-hyväksytty steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID), joka vaikuttaa prostaglandiinin tuotantoa estämällä syklo (COX) 1 ja 2. Sulindaakilla on myös kiinnosti yli vuosikymmenen aikana osoittautunut chemopreventive varten adenomatoottisten peräsuolen polyypit ja paksusuolen syöpä.

Keskeiset havainnot

esikäsittely ihmisen paksusuolen ja keuhkojen syöpäsoluja sulindaakilla parantaa tappaminen hapettavalla aineella, kuten tert-butyyli (TBHP) tai vetyperoksidia. Tämä vaikutus ei liity cyclooxygenase (COX) esto. Kuitenkin, käytetyissä olosuhteissa, on merkittävä lisäys reaktiivisen hapen (ROS) sisällä syöpäsolut ja mitokondrion kalvon potentiaalia, viittaa siihen, että solukuolema johtuu apoptoosin, joka vahvistettiin Tunel-määrityksellä. Sen sijaan tämä parannettu tappaminen ei havaittu normaalin keuhkojen tai paksusuolen soluja.

merkitys

Nämä tulokset osoittavat, että normaalit ja syöpäsolut käsitellä oksidatiivista stressiä eri tavoin ja sulindaakki voi parantaa tätä eroa. Yhdistelmä sulindaakin ja hapetusainetta voi olla terapeuttista arvoa.

Citation: Marchetti M, Resnick L, Gamliel E, Kesaraju S, Weissbach H, Binninger D (2009) Sulindaakilla Parantaa Killing syöpäsolujen Altistuvat Oksidatiivista stressiä. PLoS ONE 4 (6): e5804. doi: 10,1371 /journal.pone.0005804

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 helmikuu 2009; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2009; Julkaistu: 05 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Marchetti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain osaamiskeskuksena lääketieteellisessä ja Marine Biotechnology avustusta Floridan osavaltion (avustus 1140-190-43 myönnetään DB ja HW). Lisätukea saatiin National Institutes of Health (1 R15 CA 122001-01A1 myönnetty HW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sulindaakilla oli yksi ensimmäisistä ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (NSAID), jotka vaikuttavat prostaglandiinin tuotantoa estämällä syklo (COX) 1 ja 2 [1]. Yli vuosikymmenen ajan, sulindaakki on myös kiinnostava kuin chemopreventive hoito adenomatoottisten peräsuolen polyypit ja paksusuolensyöpä [2] – [5], erityisesti potilailla, joilla familiaalinen adenomatoottisen polypoosin [6]. Sulindaakilla on myös raportoitu chemopreventive aineena hiiren virtsarakon syöpä [7]. Anti-tuumorigeenisen aktiivisuus sulindaakin vastaan ​​paksusuolen syöpä voi sisältyä sekä COX esto [2] ja toimintoja, jotka ovat riippumattomia COX esto [8] – [11]. On raportoitu, että sulindaakki indusoi apoptoosia paksusuolen syövän soluja, [11], [12], joka näyttää liittyvän muutoksia geenien ilmentyminen [12] – [18].

Sulindaakilla on aihiolääke, joka on muuttuu aktiiviseksi COX-inhibiittorin, sulindaakkisulfidi [19]. Olemme aiemmin osoittaneet, että konversio sulindaakin ja sulindaakkisulfidin voidaan katalysoida msrA, jäsen metioniinisulfoksidi reduktaasin (Msr) entsyymien perheen, [20]. MSR-järjestelmä on tutkittu yksityiskohtaisesti viime vuosina, kun on osoitettu, että MSRA voi olla rooli ikääntyminen ja ikään liittyvien sairauksien [21] – [23]. Ilmeinen toiminto Msr on vähentää metioniinisulfoksidia (Met (o)) proteiineissa takaisin metioniini (Met) (katsaus [23]), vaikka se toimii myös osana ROS raadonsyöjä järjestelmä, jossa Msr järjestelmä sallii Met jäämiä proteiinia toimimaan katalyyttinen antioksidantteja [24]. Tuki raadonsyöjä rooli MSRA on tullut viimeaikaisten tutkimusten sekä PC-12 hermosoluihin, joissa MSRA yliekspressoitui [25], ja ihmisen linssin soluja, joissa MSRA ilmentyminen säädeltiin [26]. Täten on olemassa vankkaa näyttöä siitä, että MSR järjestelmä on tärkeä tehtävä suojella solujen hapettumista vastaan.

Koska sulindaakki on substraatti MSRA [20] oli kuitenkin järkevää, että tappaminen syöpäsolujen sulindaakki saattaa liittyä oksidatiivista stressiä. Lisäksi halusimme onko normaalit solut ja syöpäsolut vastasivat samalla tavalla (t) sen jälkeen, kun sulindaakki hoidon ja oksidatiivisen stressin. Alustavassa tutkimuksessa osoitimme, että kohtelu on okasolusyöpä solulinja sulindaakilla ja hapetusaineen johti lähes 500% kasvu solunsisäisten ROS tasoilla ja merkittävä solukuoleman. Sen sijaan normaalin ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä ei osoittavat kasvua ROS tasoilla tai solukuoleman. Nämä tulokset johtivat rajoitetun kliinisessä tutkimuksessa, joka osoitti lupaavia mahdollisuuksia käyttää paikallisen käytön sulindaakin ja vetyperoksidia hoitoon aurinkokeratoosien [27].

Tässä tutkimuksessa me laajennettiin nämä aikaisemmin tuloksia käyttämällä syövän solulinjoissa keuhkojen ja paksusuolen kudosta. Tarjoamme lisäksi näyttöä siitä, että tehostettu tappaminen havaittu sulindaakilla ja oksidatiivisen stressin liittyy mitokondrioiden johtaa solun kuolemaan apoptoosin kautta. Nämä uudet tiedot vahvistavat mahdollisuuksia nimenomaan parantaa terapeuttisen soveltamisen sulindaakin ja sen johdannaiset syövän hoitoon käyttämällä niitä yhdessä yhdisteen, joka tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS).

Tulokset

sulindaakki parantaa kasvainsolujen tappamista oksidatiivisen stressin, mutta ei liity joko COX inhibition tai Msr järjestelmän

Ihmisen keuhko- ja paksusuolen syövän solulinjat esi-inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa sulindaakin 48 tuntia. Ylimääräinen sulindaakki poistettiin pesemällä ennen 2 tunnin inkuboinnin kanssa TBHP, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Sulindaakilla käytettiin 500 uM lopullinen pitoisuus koska alustavat kokeet käyttämällä sulindaakki tässä pitoisuudessa ei ollut merkittävää vaikutusta solujen elinkelpoisuuden joko syöpäsolun linjat.

Jokaisessa tasyöpäsolulinja oli vähentyneen merkittävästi solujen elinkelpoisuuden läsnäolo TBHP esikäsittelyn jälkeen 500 uM sulindaakki (kuvio 1A ja 1 B). Elinkelpoisuus keuhkosyövän soluja esikäsitellään sulindaakki väheni yli 80%: ssa inkuboinnin jälkeen 2 h 240 uM TBHP verrattuna kontrollisoluihin, joita ei ole esikäsitelty sulindaakilla (kuvio 1A). Samanlaisia ​​vasteita TBHP havaittiin sulindaakilla käsiteltiin paksusuolen syövän soluja (kuvio 1 B), mutta pitoisuus on suurempi TBHP tarvittiin huomattava tappaminen paksusuolen syöpäsoluja. Sulindaakki myös parannettu tappaminen sekä syöpäsolulinjoissa, kun TBHP oli korvattu vetyperoksidilla, pitoisuuksina 1,0 mM ja 6,0 mM (kuvio 2).

Keuhkosyöpä soluja (A) tai koolonsyöpäsoluja (B) inkuboitiin, kun läsnä (▪) tai ilman sitä (□) 500 uM sulindaakin 48 tuntia. Solut pestiin sitten poistaa vapaan sulindaakki ennen inkubointia 2 h kanssa ilmoitetun pitoisuuden TBHP ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen MTS-määritys on kuvattu Materiaalit Menetelmät. Solujen elävyys ilmaistaan% valvonnan (soluja ei esikäsitelty sulindaakilla tai alttiina TBHP). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmaistuna%: n keskiarvo neljän samanlaiset näytteet edustavasta kokeesta. Merkitys erot käsiteltyjen solujen ja ilman sulindaakki, mutta altistuvat saman pitoisuuden TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001.

Keuhkosyöpä soluja (A) tai koolonsyöpäsoluja (B) inkuboitiin, kun läsnä (▪) tai ilman sitä (□) 500 uM sulindaakin 48 tuntia. Solut pestiin sitten poistaa vapaan sulindaakki ennen inkubointia 2 h kanssa ilmoitetun pitoisuuden vetyperoksidia. Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä MTS-määritys on kuvattu Materiaalit Menetelmät. Solujen elävyys ilmaistaan% valvonnan (soluja ei esikäsitelty sulindaakilla tai alttiina vetyperoksidia). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmaistuna%: n keskiarvo neljän samanlaiset näytteet edustavasta kokeesta. Merkitys eroja käsiteltyjen solujen kanssa ja ilman sulindaakki, mutta alttiina samalle vetyperoksidin pitoisuus: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001.

Useat riviä todisteet osoittavat, että tehostettu tappaminen syöpäsolujen sulindaakki ja oksidatiivisen stressin ei liity COX estoon. Kaksi muuta NSAID, asetyylisalisyylihappo (aspiriini) ja ibuprofeeni, 500 uM, ei lisätä herkkyyttä syöpäsolujen oksidatiivista stressiä (kuvio 3A ja 3B, vastaavasti). Kuten edellä todettiin, sulindaakki on aihiolääke, joka on muunnettava aktiivista COX-inhibiittorin, sulindaakkisulfidi [19], ensisijaisesti toiminnan msrA [20]. Sen määrittämiseksi, onko parannettu tappaminen sulindaakin käsiteltyjen syöpäsolujen TBHP mukana vähentäminen sulindaakin ja sulindaakkisulfidin, aktiivinen inhibiittori syklo-oksigenaaseja, Edellä kuvattujen kokeiden toistettiin käyttäen sulindaakkisulfoni, joka ei ole substraatti msrA (julkaisemattomia tuloksia), tai COX-estäjä [28]. Koska lisääntynyt myrkyllisyys sulindaakkisulfoni alempaa pitoisuutta (250 uM) käytettiin näissä kokeissa. Esikäsittely keuhkosyövän soluja 250 uM sulindaakkisulfoni (kuvio 3C), jota seurasi altistus TBHP saatiin vertailukelpoisia tuloksia, jotka nähdään käyttämällä 500 uM sulindaakki (vertaa kuviot 1A ja 3C). Samanlaisia ​​tuloksia käyttäen sulindaakkisulfoni saatiin myös paksusuolen syövän solulinjat (tuloksia ei ole esitetty). Siten kollektiivinen tulokset osoittavat, että lisääntynyt herkkyys sulindaakin käsiteltyjen syöpäsolujen oksidatiivista stressiä, käytetyissä olosuhteissa, ei liity joko Msr järjestelmää tai COX-estoon.

Keuhkosyöpä soluja inkuboitiin, kun läsnä ( ▪) tai ilman sitä (□) joko 500 uM asetyylisalisyylihappo (A), 500 uM ibuprofeeni (B) tai 250 uM sulindaakkisulfoni (C) 48 tuntia. Solut pestiin sitten poistaa vapaan NSAID tai sulindaakkisulfoni ennen inkubointia 2 h kanssa ilmoitetun pitoisuuden TBHP. Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä MTS-määritys on kuvattu Materiaalit Menetelmät. Solujen elävyys ilmaistaan% valvonnan (solujen ei altistu NSAID, sulindaakkisulfonin tai TBHP). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmaistuna%: n keskiarvo neljän samanlaiset näytteet edustavasta kokeesta. Merkitys erot käsiteltyjen solujen ja ilman sulindaakkisulfoni, mutta altistuvat saman pitoisuuden TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001.

Sulindaakilla ei paranna tappaminen normaalien solujen altistuvat oksidatiivista stressiä

Oli tärkeää määrittää tehostetun tappaminen vaikutus sulindaakin ja sulindaakkisulfonin syövän solujen läsnä TBHP (kuvio 1) myös esiintynyt normaalia, ei-kuolemattomien solujen. Kuvio 4 esittää vaikutuksen, joka esikäsitellään normaalin keuhkojen solut sulindaakilla tai sulindaakkisulfoni solujen elinkyky oksidatiivisen stressin käyttäen TBHP. Inkubointi normaalien keuhkojen solujen 500pM sulindaakki 48 tunnin ajan ennen altistamista TBHP paitsi ei lisännyt tappamista, mutta sulindaakki edellyttäen suojan aiheuttamaa oksidatiivista stressiä TBHP (kuvio 4A). Suojaava vaikutus oksidatiivisen stressin normaalien keuhkojen soluihin havaittiin myös silloin, kun soluja esikäsiteltiin sulindaakkisulfoni (kuvio 4B).

Normaali keuhko-soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan (A) läsnä ollessa (▪) tai poissa (□) 500 uM sulindaakin tai (B) läsnä ollessa (▪) tai ilman sitä (□) 250 uM sulindaakin. Katso materiaalit ja menetelmät sekä legenda kuvioon 1 lisätietoja. Merkitys erot käsiteltyjen solujen ja ilman sulindaakki tai sulindaakkisulfoni, mutta altistuvat saman pitoisuuden TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001.

Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin käyttäen normaalia koolonin soluihin. Ei ollut mitään vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen, kun läsnä on TBHP kun normaali paksusuolen solut esikäsiteltiin joko 500 uM sulindaakilla tai 250 uM sulindaakkisulfoni (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen, ei ole normaali keuhko eikä normaalin paksusuolen solujen osoitti parantaa tappaminen TBHP hoidon jälkeen sulindaakilla tai sulindaakkisulfoni, kuten havaittiin kaksi syöpäsolulinjoja.

Sulindaakilla esikäsittely keuhkosyöpään solujen johtaa kohonneet ROS ja mitokondrion kalvon potentiaalia

Keuhkosyöpä soluja käytettiin saada enemmän tietoa mekanismi parannetun tappava vaikutus ja sulindaakin läsnä ollessa TBHP. Sen tutkimiseksi, parannetun tappaminen syöpäsolujen havaittu sulindaakki ja oksidatiivisen stressin saattaisi aiheuttaa mitokondrioiden, tason muutokset solunsisäisten ROS määritettiin. Näitä kokeita varten keuhkosyövän soluja käsiteltiin sulindaakilla 48 tunnin ajan, altistettiin TBHP ja sitten solunsisäinen ROS tasolla visualisoitiin käyttäen fluoresoivaa väriainetta, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset on esitetty kuviossa 5. Verrattuna käsittelemättömiin keuhkosyövän soluja (kuvio 5A), soluja käsiteltiin sulindaakilla yksinään (kuvio 5B) tai TBHP yksinään (kuvio 5C) osoitti lievää kasvua (53-58%), on ROS tasojen perusteella ulkonäkö vihreän fluoresenssin. Kuitenkin, keuhkosyövän soluja, jotka oli esikäsitelty 500 uM sulindaakki, jota seuraa 2 tunnin inkubaatio 80 uM TBHP (kuvio 5D), oli 400%: n nousu solunsisäisessä vihreän fluoresenssin käsittelemättömiin soluihin verrattuna (vertaa kuvio 5A ja 5D). Nämä tiedot osoittavat selvästi, että esikäsittely keuhkosyöpä solut sulindaakilla johtaa suureen solunsisäisten ROS altistumisen jälkeen oksidatiivisen stressin, mikä tukee tuloksia ihosyöpä solujen raportoi äskettäin [27].

Paneelit osoittavat solunsisäinen ROS fluoresenssi. (A) käsittelemättömät solut; (B) käsiteltyjä soluja vain sulindaakki; (C) solut käsiteltiin vain TBHP; (D) käsiteltyjä soluja sekä sulindac ja TBHP. Inkuboinnin olosuhteet kuvataan kuviossa 1. Solut valmistettiin fluoresenssimikroskopiaa ja vihreän fluoresenssin signaali kvantitoitiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Fluoresenssi tasot ovat keskiarvo kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja ne on mukautettu prosenttiosuus eläviä soluja. SEM oli alle 10% kunkin näytteen. Fluoresenssin kasvua verrattuna kontrolliin solut paneeli A ovat: B, 53%; C, 57%; D, 401%.

edelleen tutkia mekanismi tappaa syöpäsoluja altistetaan oksidatiivista stressiä esikäsittelyn jälkeen sulindaakki, tutkimme, onko samanaikaisesti mitokondrion kalvon potentiaalia, joka on tunnettu aloittaa apoptoottisen solukuoleman. Vaikutukset mitokondrion kalvon potentiaalia arvioitiin käyttäen muutoksia fluoresenssin JC-1 väriaine, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tulokset on esitetty kuviossa 6. yläpaneelien punaisena fluoresoiva kuvia ja alapaneelit vihreä fluoresoiva kuvia. Mitokondrion kalvon potentiaalia johtaisi vähentyneeseen punaisen fluoresenssin ja vastaavan vihreän fluoresenssin lisäys. Suhteessa käsittelemättömiin soluihin (kuvio 6A) tai solujen käsiteltiin vain sulindaakki (kuvio 6B) tai TBHP yksinään (kuvio 6C), sulindaakki esikäsittely keuhkosyöpäsoluissa seuraa hapettava stressi (kuvio 6D) johti Mitokondrioiden kalvojännite osoituksena lähes 20-kertainen vihreän fluoresenssin (katso legenda kuvion 6 ylimääräisiä yksityiskohtia). Yhteenvetona, esikäsittely keuhkosyövän solut sulindaakilla seuraa käsittely TBHP johtaa huomattavaan kasvuun solunsisäisten ROS ja merkittävä mitokondrion kalvon potentiaalia. Nämä tulokset osoittivat, että solukuolemaa esiintyy apoptoosin kautta, joka vahvistettiin Tunel analyysi (Täydennyskuvio S1) B

Ylä paneeli näyttää punaista fluoresenssia kuvia matalammat paneelit osoittavat vihreä fluoresenssi kuvaa. Mitokondrion kalvon potentiaalia havaittiin lasku punaisen fluoresenssin samanaikainen kasvu vihreä fluoresenssi. Kokeellinen suunnittelu on kuvattu legendoja kuvion 1 (A) käsittelemättömät solut; (B) käsiteltyjä soluja vain sulindaakki; (C) solut käsiteltiin vain TBHP; (D) käsiteltyjä soluja sekä sulindac ja TBHP. Solut valmistettiin fluoresenssimikroskopiaa ja fluoresenssisignaali kvantitoitiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ovat keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta. SEM oli alle 10% kunkin näytteen. Kvantitatiivinen analyysi vihreän fluoresenssin ilmaistaan ​​seuraavasti mielivaltaisina yksikköinä: paneeli A -1,39; paneeli B -1,23; paneeli C -1,29; paneeli D -25,3.

Keskustelu

Sulindaakilla ja sen aineenvaihduntatuotteet kuten sulindaakkisulfidilla ja sulindaakkisulfoni, on osoitettu olevan syövän vastaista aktiivisuutta [29]. Yhdenmukaisesti aiempien tutkimus ihon syöpäsoluja [27], olemme osoittaneet, että tappaminen keuhkojen ja paksusuolen kasvainsolulinjoja voidaan parantaa merkittävästi, jos sulindaakki on yhdistetty hapettimen, kuten TBHP tai vetyperoksidia. Olemme myös osoittaneet, että sulindaakki esikäsittely voi parantaa tappaminen ihosyövän solujen aiheuttama arseenitrioksidi (tuloksia ei ole esitetty), joka tappaa syöpäsolut tuottamalla solunsisäisten ROS, kuten on raportoitu muualla keuhkosyövän soluja [30]. Tuntuu järkevältä, että sulindaakki voi parantaa tehoa tahansa syöpälääke, jossa vaikutusmekanismi liittyy hapettumista. Menestyksekäs soveltaminen useita lääkehoidon on hiljattain raportoitu kliinisessä tutkimuksessa, jossa lähes 300 potilasta riski toistumisen peräsuolen adenoomien jotka saivat yhdistelmä sulindaakin ja difluorometyyliornitiini, estäjä polyamiinin synteesin [31].

näyttää todennäköiseltä, että mekanismi selektiivisen tappamisen syöpäsolujen nähty näissä tutkimuksissa liittyy mitokondrioiden, mahdollisesti seurauksena lisääntynyt ROS tuotanto. Vaikka hoito syöpäsolujen sulindaakilla tai TBHP erikseen johtaa lievän nousun tasoa ROS (kuvio 5B ja [27], [32]), on dramaattinen kasvu solunsisäisen tason ROS soluissa esikäsitelty sulindaakki ja altistettiin sitten TBHP (kuvio 5D). Lisäksi, on olemassa merkittäviä häiriöitä mitokondrion kalvon mahdollisia samoissa koeolosuhteissa (kuvio 6), mikä viittaa siihen, että sulindaakki aiheuttaa apoptoosia syöpäsoluissa altistetaan oksidatiivista stressiä. Syövänvastainen vaikutus sulindaakin yksin on raportoitu liittyy apoptoottisen kuoleman [33]. Tuloksia sulindaakkisulfonin ja muut tulehduskipulääkkeet osoittavat, että vaikutus sulindaakin meidän järjestelmään ei sisälly COX esto tai Msr järjestelmään.

Tämänhetkiset tulokset osoittavat perustavanlaatuinen ero siinä, miten normaali ja syöpäsolujen vastaamaan oksidatiivisen stressi. Sulindaakki ja sen aineenvaihduntatuotteiden voidaan korostaa tätä eroa, mikä johtaa tehostetun tappaminen syöpäsolujen, mutta ei normaalien solujen, oksidatiivisen stressin. Se on vakiintunut, että syövän ja normaalit solut eroavat oksidatiivisen aineenvaihdunnan ja että syöpäsolut ovat korkeampi Glykolyysivaiheen kuin normaalit solut, ilmiö ensimmäisenä kuvasi Warburgin [34]. Siellä on myös vakuuttavia todisteita siitä, että syöpäsolut ovat tyypillisesti alle suurempi oksidatiivista stressiä verrattuna normaaleihin soluihin [35]. Ero normaali ja syöpäsolujen oksidatiivisen stressin, joka on raportoitu on sytotoksisuuden aiheuttama glukoosin poisto. Tutkimukset by Spitz ja työtoverit [36] ovat selvästi osoittaneet, että tämä vaikutus välittyy mitokondrion ROS tuotanto.

kuvatut tulokset tarjoavat lisää todisteita siitä, että yhdistelmä sulindaakin ja hapetusainetta saattaa olla kliinistä terapeuttista arvoa hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä. Aikaisemmassa alustavassa tutkimuksessa raportoitiin, että tulokset rajoitetun proof of concept ihmisen kliinisessä tutkimuksessa käyttäen sulindaakkia (1-5%) ja vetyperoksidia (25%) geelejä levitetään päivittäin kolme viikkoa aurinkokeratoosien (AK) toteutetaan yläraajoihin [27]. Päätyttyä kaikki kymmenen käsitelty AKs vähensi kooltaan esitetty kliinisen valokuvauksen viisi näytteille täydellinen katoaminen precancerous solujen jälkeen ihon koepala. Nämä alustavat tulokset takaa laajempia kliinisiä kokeita.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Sulindaakilla, asetyylisalisyylihappo (aspiriini), (S) – (+) – ibuprofeeni, ja tert butyyli-(TBHP) saatiin Sigma (St. Louis, MO). Sulindaakkisulfonin syntetisoitiin Custom Synthesis Inc. (Boca Raton, FL). Kaikki soluviljelyelatusaineella kuten naudan sikiön seerumia ja muita lisiä ostettiin American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).

Cell Culture

koolonisyöpäsolulinja (RKO), joka on keuhkosyövän solulinjassa (A549), ja fibroblastisolulinjat, jotka ovat peräisin normaalista ihmisen paksusuolen kudosta (CCD-18Co) ja normaalin ihmisen keuhkojen (MRC-5) saatiin ATCC: stä (Rockville, MD). Kaikkia solulinjoja pidettiin suositellun elatusaineesta. Normaali solulinjoja ei kuolemattomaksi ja varhaisen läpikulun soluja käytettiin kokeissa raportoitu tässä. Solulinjoja määritettiin olevan mykoplasmaa käyttäen VenorGeM® Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich), joka on erittäin herkkä PCR-määrityksessä.

solunelinkykyisyysmääritys

Ellei toisin ilmoiteta solut esikäsiteltiin sulindaakki, sulindaakkisulfoni tai muuta NSAID 48 tunnin ajan ennen altistamista TBHP: ssa 2 h. Solususpensiot (~100,000 solut), joka sisältää osoitetut täydentää maljattiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille käyttäen 100 ui osoitetun solususpensiota. Levyjä inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Elatusaine poistettiin sitten ja solut pestiin kerran tuoreella viljelyalustalla seerumin kanssa. Poistamisen jälkeen pesuliuos, tuoreella viljelyalustalla seerumia, joka sisälsi ilmoitetun lopullinen pitoisuus TBHP tai vetyperoksidia lisättiin soluihin, ja soluja inkuboitiin vielä 2 tuntia. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun sulindaakki on sisällytetty aikana 2 h hoito hapettavan aineen.

Solujen elinkelpoisuus määritettiin CellTiter 96 Aqueous One Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määritys käyttää uutta tetratsoliumyhdisteen, että metabolisesti aktiiviset solut muuntaa vesiliukoinen formatsaaniksi jonka toiminta solujen dehydrogenaaseja, joka mitataan absorbanssi 490 nm: ssä käyttäen kolorimetristä mikrotiitterilevylukijaa (SpectraMax Plus

384, Molecular Devices) . Tausta-absorbanssi vähennettiin kustakin näytteestä. On raportoitu, että jotkin syöpälääkkeiden voi aiheuttaa muutoksia absorbanssi MTS perustuvissa määrityksissä solun elinkelpoisuuden puuttuessa soluihin [37]. Vertailukokeet käyttämällä sulindaakki yksin, TBHP yksin tai yhdistelmiä sulindaakin ja TBHP pitoisuusvälillä käytettiin kokeissa ei havaittu kummankaan yhdisteen yksinään tai yhdessä absorbanssimittausten.

Solunsisäinen ROS Pitoisuus

Solunsisäiset ROS-tasot määritettiin käyttämällä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) Detection Reagents Molecular Probes (Eugene, OR), kuten muualla on kuvattu [38]. Kohonneita ROS johtavat kasvaneeseen vihreän fluoresenssin, joka visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla.

JC-1 määrityksessä mittaamaan mitokondrion kalvon potentiaalia

mitokondrion kalvon potentiaali määritettiin käyttämällä JC-1 väriaine Molecular Probes (Eugene, OR). Mitokondrion kalvon potentiaalia johtaa lisääntyneeseen vihreän fluoresenssin sytosoliin ja vastaava lasku mitokondrioiden punaisen fluoresenssin. Täten muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia määritettiin seuraamalla punaisesta vihreäksi värjäytysmuutoksen käyttäen FITC suodatinta (Zeiss käänteismikroskooppi-Axiovert 40 CFL). Kvantitointi Fluoresenssisignaalien käyttää sekä vakio densitometristä menetelmiä ja Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA), joka kuva-analyysi [39].

TUNEL Pitoisuus osoittaa apoptoosin

apoptoottisia soluja havaittiin käyttämällä DeadEnd (Promega) kolorimetristä TUNEL määrityksessä, jotka päättyvät tarroja hajanainen DNA. Solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä ennen läpäiseviksi 0,2% Triton-X-100. Sitten solut pestiin PBS: llä ennen inkubointia rekombinantti-terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) ja biotinyloitua nukleotidit 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, joka sisältää biotinyloidun nukleotidin 3′-päistä fragmentoitunutta DNA: ta. Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin streptavidiini (HRP-streptavidiini) huoneenlämpötilassa 30 min. HRP-streptavidiini leimatut solut detektoitiin vetyperoksidia ja diaminobentsidiini (DAB). Apoptoottiset solut visualisoitiin tummanruskea tuman värjäytymisen.

Tilastollinen analyysi

tulokset solujen elävyys kokeissa ilmaistaan ​​keskiarvo neljän toiston edustavan kokeen. Virhe palkit osoittavat keskivirheen keskiarvon (SEM). Keinot verrattiin käyttäen standardia t-testejä ja P-arvot osoitettu kuvassa legendoja. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kvantitointi Fluoresenssisignaalien käyttää sekä vakio densitometristä menetelmiä ja Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA), joka kuva-analyysi [39].

tukeminen Information

Kuva S1.

solukuoleman vuoksi Apoptosis. TUNEL-määritystä käytetään havaitsemaan apoptoosia keuhkosyövän soluja. (A) käsittelemättömät solut; (B-solut), käsiteltiin vain 500 uM sulindaakki; (C) solut käsiteltiin vain 180 uM TBHP; (D) soluja käsiteltiin sekä 500 uM sulindaakki ja 180 uM TBHP. Kohonneeseen apoptoosin osoitetaan tehostettu muodostuminen ruskea väri. Kokeellinen suunnittelu on kuvattu legendoja kuvion 1 käsikirjoituksen. Muita yksityiskohtia TUNEL määrityksen annetaan Materiaalit ja menetelmät.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0005804.s001

(0,22 MB TIF) B

Kiitokset

haluaa kiittää tohtori Daphna Sagher hänen apua ja hyödyllistä keskustelua. Haluamme myös kiittää Kelsey Binninger hänen apua kuvituksen.