Krooninen sairaus

tiivistelmä

Setuksimabi on kimeerinen hiiri-ihminen-monoklonaalinen vasta-aine, joka kohdistuu ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR). Kuitenkin EGFR määritettiin immunohistokemiallisesti ei ennusta kliinisiä tuloksia paksusuolen syöpä (CRC) hoidetuilla potilailla setuksimabia. Siksi arvioimme korrelaatio EGFR havaittavia määriä setuksimabi ja lääkeherkkyyksiä CRC solulinjojen (Caco-2, WiDr-, SW480 ja HCT116) ja A431 epidermoidikarsinooma solulinjassa. Käytimme virtaussytometrillä (FCM) havaitsemiseksi EGFR-biotinoidun setuksimabia solun pinnalla. Subkloonattiin solulinjat osoittavat korkeimman ja matalimman EGFR ekspressiotasoja valittiin jatkotutkimuksiin. Sytotoksiset määrityksiä käytettiin määrittämään ero vastauksia setuksimabia. Ksenograftimalleja Setuksimabihoitoa saaneilla intraperitoneaalisesti arvioida herkkyys setuksimabia. Vahva vastauksia setuksimabista oli erityisesti näytteillä alakloonattiin soluja korkea EGFR ekspressiotasot. Lisäksi setuksimabi esti kasvainten kasvua ksenograftimalleissa suuri tai pieni EGFR tasoilla 35% ja 10% -20%, tässä järjestyksessä. Olemme päätellä, että havaitseminen EGFR Setuksimabin lupaa tarjota uudenlainen, herkkä, ja erityinen menetelmä ennustamiseksi herkkyyden CRC setuksimabista.

Citation: Shigeta K, Hayashida T, Hoshino Y, Okabayashi K, Endo T, Ishii Y, et ai. (2013) Expression of epidermaalisen kasvutekijän reseptori tunnistanut Setuksimabia Osoittaa sen teho estää

In vitro

ja

In vivo

leviämisen peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (6): e66302. doi: 10,1371 /journal.pone.0066302

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 23 helmikuu 2013; Hyväksytty: 03 toukokuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Shigeta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Japanin opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede- ja teknologia Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) (# 23791559 KS, # 23791499 TH ja # 25293292 YK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on jäsen ihmisen EGFR perheen reseptorin proteiinityrosiinikinaaseja. Se on tärkeä terapeuttinen kohde metastaattisessa kolorektaalisyövässä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää), ja lisääntynyt EGFR on tunnusomaista monien ihmisen kasvaimissa [1], [2]. Aktivointi EGFR signalointireitin johtaa lisääntyneeseen kasvaimen leviäminen, angiogeneesi, etäpesäke, ja tuumorin invasiivisuuden sitoutumisen kautta useita erilaisia ​​ligandeja, mukaan lukien EGF: n kaltaiset molekyylit, transformoiva kasvutekijä-α (TGFa), ja neureguliinit reseptoriin n ektodomeenia [3]. EGFR aktivointi johtaa aloittamisen mahdollisesti onkogeenisten solunsisäisen signa-, mukaan lukien RAS-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK), fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) /Akt, fosfolipaasi C, signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription (STAT), ja SRC /FAK reitit [4] – [6].

kehitys monoklonaalisten vasta-aineiden on parantanut strategioita inhiboimaan EGFR inhibition syövän hoidossa. Setuksimabi (Erbitux, Merck-Serono, Darmstadt, Saksa) on kimeerinen monoklonaalinen vasta-aine (lgG1), joka sitoutuu ektodomeenia ihmisen EGFR ja kilpailukykyisesti inhiboi ligandin sitoutumista tukahduttaa kasvaimen proliferaatiota. Tehoa setuksimabia arvioitiin yhdessä irinotekaanin hoitoon metastasoitunutta kolorektaalisyöpää sairastaville potilaille, joiden kasvaimet ovat positiivisia EGFR (arvioitu immunohistokemiallisesti) ja kestävät FOLFOX tai FOLFIRI hoito [7] – [10].

Useat tutkimukset on tehty tunnistamaan tekijöitä, jotka voivat ennustaa hoitovastetta, ja CRC mutatoitunut

KRAS

tunnistettiin pääsääntöisesti ei vastaa anti-EGFR hoitoa. [11], [12]. Sen sijaan tekijät, kuten EGFR yli-ilmentyminen, monistaminen sen geenin, ja p53 mutaatioita korreloi vastetta setuksimabia; mutta ne eivät ole täysin tehokkaita ennustettaessa vastauksena setuksimabihoito [13], [14]. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet korrelaation EGFR tasoa ja tehoa setuksimabin [15]. Kuitenkin tämä korrelaatio näyttää olevan spekulatiivisia kliinisessä ympäristössä, ja jotkut tutkimukset raportoivat, että mitään suhdetta välillä on todettu intensiteetin immunohistokemiallisella värjäyksellä EGFR ja vastausprosentti [arviointi suoritettiin käyttäen Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) ], progressiivinen elinaika tai eloonjäämiseen kliinisissä tutkimuksissa [8], [16] – [18].

äskettäinen raportti osoitti, että mutaatio sisällä EGFR ektodomeenia antaa vastustuskyvyn setuksimabista estämällä sen sitoutumisen [ ,,,0],19]. Siksi me arveltu, että havaitseminen EGFR käyttäen immunohistokemiallista värjäystä käyttäen epäspesifistä IgG1-vasta-aine eroaa havaitsemista setuksimabi. Olemme lisäksi arveltu, että solukalvon erityisiä EGFR tasoilla, jotka voidaan havaita setuksimabi, voidaan vaikuttaa soluproliferaation inhibointi. Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet menetelmän, jossa käytimme biotinyloitu setuksimabia ensisijaisena vasta-aineena virtaussytometrialla (FCM) suoraan havaita EGFR CRC solulinjat. Tätä tekniikkaa käyttäen arvioimme suhdetta EGFR havaittavia määriä setuksimabia-herkkyydet CRC solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen biotinyloitua Setuksimabia

Mekanismi, jolla biotinyloitu setuksimabin sitoutuu EGFR on esitetty kuvassa 1a. Biotiini konjugoitiin setuksimabista käyttäen menetelmän mukauttaminen kuvanneet Medical Biologiset Laboratories Co., Ltd

(A) biotinyloitu setuksimabia käytetään primaarista vasta-ainetta havaitsemaan EGFR, ja avidiini-FITC sekundaarinen vasta-aine on käytetty FCM havaitsemiseksi antigeeni-vasta-komplekseja. (B: biotiini A: avidiini) (B) FCM analyysi EGFR mukaan A431-soluissa. Ohjaimia antihumaani, epäspesifinen IgG1-vasta-aine on leimattu FITC kuvataan punaisella ja setuksimabi-biotylated vasta-sinisellä. Fluoresenssin intensiteetti on noin 5-kertaa korkeampi suhteessa kontrollivasta-ainetta.

Colon Cancer Cell Lines ja tunnistaminen EGFR ektodomeeni Mutaatiot,

KRAS

,

BRAF

, ja

PIK3CA

neljä ihmisen CRC solulinjoissa, Caco-2, WiDr, SW480, HCT116, ja epidermoidikarsinooma A431 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , USA) ja niitä viljeltiin, kuten suositellaan. Authentication kaikkien solulinjojen suoritettiin tutkimalla mutaation tilan kunkin CRC solulinjan käyttäen Scorpion-aseiden tai direct sequence menetelmiä (toteuttanut SRS Co., Japani).

KRAS

(kodonit 12 ja 13),

BRAF

(eksoni 15), PIK3CA (eksonit 9 ja 20), ja EGFR ektodomeenin (S492) mutaatiot määritettiin osajoukko solulinjojen ja tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Caco-2, WiDr, SW480, ja A431 kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 5% 0,1 mM penisilliiniä-streptomysiiniä, ja HCT116 kasvatettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 5% 0,1 mM penisilliiniä-streptomysiiniä. Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

EGFR-biotinyloidun Setuksimabi ja arviointi EGFR eksressoitumistasojen käyttäen FCM

Käytimme biotinyloitu setuksimabia ensisijaisena vasta-FCM. Vahvista setuksimabin sitoutumista EGFR, FCM suoritettiin käyttäen A431-solulinjaa, joka ilmentää suuria määriä EGFR. A431-solut säädettiin 1 x 10

6 solua /putki ja pestiin kahdesti 2 ml: lla jääkylmää fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), ja esto suoritettiin 30 min käyttäen estäminen Reagenssit N102 (NOF Co., Tokio , Japani). Solut pestiin jälleen ja sitten biotinyloidun setuksimabi lisättiin 1 h soluihin, jotka pidettiin jään päällä. Antihumaani, epäspesifinen IgG1-vasta-aine on leimattu fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), käytettiin kontrollina. Sen jälkeen, kun solut on pesty jääkylmällä PBS: llä, avidiinilla FITC-vasta-ainetta (Streptavidin, Alexa Fluor® 488 konjugaatti, Molecular Probes®), sekundäärisen vasta-aineen, lisättiin 15 minuutin ajan jäillä. Lopuksi propidiumjodidi (PI) käytettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden.

BD FACS Aria ™ III solulajitteluanalyysi järjestelmä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), käytettiin FCM. EGFR-tasot arvioitiin laskemalla intensiteetti FITC-signaalin. Sen jälkeen, kun arvioidaan biotinoidun setuksimabin A431-soluja, EGFR tasot neljän jäljellä olevan CRC-solulinjoja arvioitiin samalla menetelmällä. Lisäksi sytogrammeja (vertailu FITC ja PE-signaali) ja histogrammit kunkin CRC solulinjaa verrattiin varten A431-soluissa käyttäen BD FACSDiva 6,0 (BD Biosciences).

Luodaan Subkloonit High and Low EGFR eksressoitumistasojen

Rajoittavan laimennoksen soluviljelmien suoritettiin 96-kuoppaisilla kudosviljelylevyillä ympättiin 0,8 solua /kuoppa elatusaineessa (DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 5% 0,1 mM penisilliiniä-streptomysiiniä) talteen terveiden ( 1 x 10

6 solua /ml ja 95% elinkelpoisuus) CRC soluviljelmissä. Kaksikymmentä subklooneja jokaisen CRC-solulinjoja eristettiin ja EGFR-tasot määritettiin käyttäen biotinyloitua setuksimabin kuten edellä on kuvattu. Solut, joissa on joko korkein tai alin EGFR tasot valittiin ja viljeltiin proliferaatiomäärityksissä ja käyttää ksenograftimallissa. Mutaatio tilan kunkin alakloonattiin CRC solulinjat tutkittiin uudelleen, onko olemassa mitään eroa luonnonvaraisen ja subklooni soluja.

Growth Suppression Pitoisuus

Solut (1000 ja 3000 solua /kuoppa) ympättiin välittömästi arvioinnin jälkeen FCM kuoppiin 96-kuoppaisella levyllä DMEM tai RPMI kuten edellä on mainittu, johon on lisätty 0,5% FBS: ää ja 5% penisilliini-streptomysiiniä. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla setuksimabia 24 tunnin jälkeen ja inkuboitiin 6 päivää. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi määrityksessä, ja muodostumista formatsaanin mitattiin sen absorbanssista 550 nm: ssä. Suhteellinen määrä solujen kasvua jokaista solulinjaa huomioon ottaminen analyysiin vähentämällä absorbanssi hetkellä 0 niistä ohjaus- ja hoitoryhmien.

ksenograftimalleja ja Setuksimabihoitoa

Kaikki eläin kokeiluja tässä tutkimuksessa oli hyväksynyt Animal Care ja käyttö komitean Keio University. Subkloonattiin johdetut solulinjat WIDR ja SW480 (2,0 x 10

6 solua) injektoitiin subkutaanisti oikealle ja vasemmalle puolelle taakse 5-viikkoisen naaras-nude-hiiriin. Ilmentymisen taso EGFR näistä subkloonattiin solujen arvioitiin FCM aina kokeen ja solut välittömästi injektoitiin. Tuumorin koko mitattiin käyttämällä paksuus, ja tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus = pituus x leveys x korkeus. Hiiriä hoidettiin 30 mg /kg setuksimabia intraperitoneaalisesti päivinä 0, 7, 14, ja 21 tai ajoneuvon ohjaus PBS (sama määrä kuin setuksimabi). Hoito aloitettiin, kun tuumorin koko oli noin 100 mm

3. Kasvainten koot mitattiin kahdesti viikossa päivään 28 asti, ja suhde kasvaimen tilavuutta, jotka määritettiin päivänä 0 laskettiin.

arvioitiin EGFR jälkeisessä hoidossa kasvainten immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttämällä anti-ihmis- , villityypin EGFR-vasta-aine eikä setuksimabi. Käsittely kudosnäytteiden tehtiin käyttäen kudostenkäsittelijä (Sakura RH-12DM-II, Japani). Lyhyesti kudosnäytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla 24 h, ja käsiteltiin sitten nousevassa sarjassa etanolia ja sen jälkeen poistetaan ksyleenillä ja upotettiin parafiiniin. Parafiini upotettu kudosnäytteet leikattiin paksuuteen 4 um käyttämällä mikrotomia (YAMATO ROM-380, Japani). Leikkeet kiinnitettiin starfrost /silaanilla päällystettyä dioja (MUTO Pure Chemicals NewSilane II, Japani) ja kuivattiin ilmassa. Päivänä värjäystä diat upotettiin ksyleeniin 10 min ennen nesteytystä etanoliin sarjassa. Leikkeitä inkuboitiin vetyperoksidia 10 minuutin ajan endogeenisen peroksidaasi- aktiivisuuden peittämiseksi. Esikäsittely deparaffiinized kudosleikkeiden kuumuutta epitooppisup- haku on tarpeen. Optimaaliset tulokset saadaan esikäsittelemällä kudoksiin kuumuutta epitooppisup- haku käyttämällä TE-puskuriin, pH 9,0. Minkä jälkeen leikkeitä inkuboitiin Anti-ihmisen villityypin EGFR (Dako, USA) primääristä vasta-ainetta (01:50) ja 4 astetta yli yön. Vahvista spesifisyys sitoutumisen, normaali hiiren seerumi IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina sijaan ensisijaisen vasta-aineen. Perusteellisen pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin 1 h toissijaisessa biotinyloidun vasta-aineen sen jälkeen DAB (DAKO REAL EnVision Detection System, USA) 8 min. Sitten leikkeitä vastapäivään Mayerin hematoksyliinillä ja kuivattu nousevassa laadut etanolia ennen clearing ksyleenissä ja asennus kannen alla lipsahdus. EGFR solukalvon positiivisuus katsottiin positiiviseksi EGFR värjäystä. Värjäytymisvoimakkuus pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1+ (heikko), 2 + (kohtalainen) ja 3+ (voimakas).

TILASTOANALYYSI

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Stata ohjelmiston versio 11.0. Erot kahden ryhmän analysoitiin käyttämällä paritonta Studentin

t

testi ja

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Detection EGFR biotinyloidulla setuksimabi

kyky biotinyloidun setuksimabin havaita EGFR käyttäen FCM arvioitiin käyttämällä A431 linja, joka ilmentää suuria määriä EGFR [20]. Biotinyloitu setuksimabia käytettiin primaarisena vasta-aineena ja FCM suoritettiin havaitsemiseksi FITC-signaalin. Vahva FITC-intensiteetti havaittiin kontrolliin verrattuna FITC-leimattua IgG (Fig. 1 B). Tämä havainto viittaa siihen, että EGFR ilmaisema A431 rivi voidaan arvioida käyttämällä biotinyloitua setuksimabi.

mutaatio tila

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

ja EGFR S492 ektodomeeni

mutaation tilan kunkin CRC solulinjan on esitetty taulukossa 1.

KRAS

mutaatiot kodoneissa 12 ja 13, jotka ennustavat tehokkuutta setuksimabihoidon, ei ole havaittu Caco-2 ja WIDR. Sen sijaan, kodoni G13D mutaatio havaittiin SW480 ja HCT116. Kodoni 12 mutaatiota ei havaittu neljää CRC-solulinjat. Eksoni 15 mutaatio

BRAF

havaittiin vain WIDR. Lisäksi

PIK3CA

mutaatiot eksoneissa 9 tai 20 havaittiin SW480 ja HCT116, vastaavasti. Lopuksi, EGFR S492 ektodomeeni mutaatiota ei havaittu kaikissa solulinjoissa.

Näistä tuloksista, päätimme Caco-2 solulinja, koska se ei ole mutaatio tahansa kolme geeniä, ja sen odotetaan olevan herkkä setuksimabista. HCT116 käytettiin negatiivisena kontrollina, koska se on PIK3CA eksonissa 20, joka on jo osoitettu olevan vastustuskykyisiä setuksimabin [21], [22]. Toisaalta, SW480 kanssa KRAS mutaatio p.G13D valittiin, koska tiedetään, että p.G13D-mutatoitu kasvaimet ovat herkempiä setuksimabin verrattuna muihin KRAS-mutatoituneen kasvaimia [23]. Meillä oli vahva kiinnostus tämän mutaation ja halusi arvioida hypoteesia ja kokeellista mallia voitaisiin soveltaa p.G13D-mutatoitunut kasvaimia. Lisäksi olimme kiinnostuneita myös vaikutus setuksimabin kanssa BRAF-mutaatio koska herkkyys setuksimabia aiemmin havaittu ksenograftimallia BRAF-mutatoituneen kasvaimia [24].

arviointi EGFR ekspressiotasot CRC Cell Lines

EGFR saavuttamiseksi kussakin CRC solulinjassa arvioitiin käyttämällä FCM biotinyloidulla setuksimabia. Intensiteetti FITC ja PE on esitetty cytogram, ja fluoresenssi FITC helposti havaittavissa kaikissa neljässä CRC solulinjoissa (Fig. 2A). Tämä tulos viittaa siihen, että nämä CRC-solulinjat ilmentävät EGFR, johon setuksimabia sitoutuu solun pinnalla). Kuten tiedot osoittavat kuviossa. 2B, WiDr ja SW480 solulinjat ilmensivät korkeimman EGFR.

(A) Kukin solulinja arvioitiin FCM biotinyloidulla setuksimabia. Kaikki neljä CRC solulinjat erosivat EGFR tasoilla. (B) Histogrammi jokaisen CRC solulinjoissa. Ilmentymistaso EGFR mitattiin intensiteetti FITC fluoresenssin.

perustaminen Cell Lines, että differentiaalisesti Express EGFR

EGFR voi olla yksi tärkeimmistä geenien määrittämiseksi fenotyyppi soluja. Siksi tapa hankkia erilaisia ​​solulinjoja, jotka oli vähiten vaikutusta geneettisen taustan ja osoitti erilaisia ​​EGFR oli toivottavaa. Rajoittavan laimennuksen jatkokloonauksen menetelmä on merkittävä tekniikka johtaa eri solujen, joilla on sama geneettinen tausta [25]. Pystyimme eristämään subkloonit CRC solulinjoja käyttäen rajoittavan laimennuksen tekniikalla ja määritettiin EGFR saavuttamiseksi kussakin. Kuviossa 3A, tulos FACS WiDr jatkokloonattiin solujen sekä erilaisia ​​EGFR ilmaisuja on esitetty. Sitten valitut solut alakloonatun solulinjat, jotka ekspressoivat korkeimmat ja matalimmat EGFR (Fig. 3B). Mutaatio tila

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, ja EGFR S492 ektodomeeni ei muuttunut kunkin alakloonatun solulinjoissa.

(A) histogrammi WiDr alakloonattiin solulinjojen joilla on eroja EGFR. Erilaisia ​​EGFR ilmaisuja nähtiin subkloonattiin solulinjoissa. (B) Korkean EGFR subkloonit korkea tai matala EGFR valittiin perusteella FCM tuloksia. Alakloonien peräisin neljästä CRC solulinjoista analysoitiin, ja Subkloonien näytteille korkein (sininen) ja alin (vihreä) tasot EGFR valittiin jatkotutkimuksiin. Valvonta on kuvattu punaisella viivalla.

herkkyys CRC Cell Lines setuksimabista

Olemme suorittaneet määrityksiä onko setuksimabi estää proliferaatiota CRC solulinjoissa. Kasvu Caco-2 ja SW480 voimakkaasti estyy, kun taas väli- estyminen WIDR eikä estoa HCT116 solulinjojen suurimmalla annoksella setuksimabin havaittu. Sen arvioimiseksi, onko EGFR taso korreloi leviämisen estäminen vaikutuksia setuksimabin, käytimme alakloonatun solulinjoja, joilla on korkea tai matala EGFR tasolle. Estävän lisääntymistä, subklooneja Caco-2, SW480, ja WiDr-, joka ilmaisi korkeimman EGFR, olivat erittäin alttiita vaikutuksia setuksimabin (Fig. 4). Kuitenkin vaste setuksimabia ei havaittu subklooneja näistä solulinjoista, joka oli alhainen EGFR ekspressiotasoja. Subklooneja HCT116, joka massakulttuurin oli minimaaliset vastaus setuksimabi, ei vastannut setuksimabista oliko heillä korkea tai matala EGFR tasolle.

Kun setuksimabia annosteltiin matalan CRC subklooneja alhainen EGFR, heikko solujen kasvun esto havaittiin. Kuitenkin kasvu alikloonien korkea EGFR voimakkaasti esti verrattuna.

Herkkyys Setuksimabin ksenoqraftit of Kloonattu CRC solulinjojen

Jokainen alakloonatun johdetut solulinjat WIDR ja SW480 inokuloitiin subkutaanisesti nude-hiiriin (setuksimabi, 30 mg /kg kerran viikossa 4 viikon ajan), ja ero herkkyyden setuksimabista arvioitiin

in vivo

. Setuksimabi esti kasvua WiDr soluja, jotka ilmaisivat korkeita EGFR 35% verrattuna käsittelemättömiin hiiriin. Sen sijaan, setuksimabin hoitoon WIDR jatkokloonin joka ilmaisi alhainen EGFR estyi 20% verrattuna käsittelemättömiin hiiriin (Kuva. 5A).

(A) ksenoqraftit johdettu WiDr jatkokloonin soluista Setuksimabihoitoa saaneilla. Voimakas kasvun estyminen nähtiin kasvaimia peräisin alakloonien korkea EGFR verrattuna niihin hiiriin; kuitenkin vain vähäinen esto kasvaimen kasvun aiheuttama ksenografteja alikloonien alhainen EGFR havaittiin. (B) Setuksimabi kasvaimien peräisin ksenografteista of SW480 alakloonit soluja. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös kasvaimissa peräisin SW480 ksenografteista eli vahvan kasvun estäminen kasvaimia peräisin alakloonien korkea EGFR verrattuna subklooneja alhainen EGFR. (C) vertailu kasvaimen koon päivänä 28. Kasvaimet johdettu alakloonien korkea EGFR olivat merkittävästi pienempiä hiirissä Setuksimabihoitoa saaneilla verrattuna kasvaimia peräisin alakloonien alhainen EGFR. (D) edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä 3+ EGF-R lauseke (i, A431), 2+ EGF-R lauseke (ii; WIDR korkea ja iii, SW480 korkea) ja 1+ EGF-R ilme. (Iv; WIDR Matala ja v; SW480 Low) ihonalaisen siirteen kasvain koolonsyöpäsolulinjaa.

ksenoqraftit johdettu SW480 alakloonien että ilmaistu korkeita EGFR estyi 35% verrattuna käsittelemättömään hiirillä. Kuitenkin ksenografteissa johdettu SW480 sublcones, että ilmaistaan ​​alhainen EGFR inhiboi vain 7% verrattuna käsittelemättömiin hiiriin (kuvio. 5B).

kasvaimia indusoitiin alakloonien johdettu WiDr tai SW480 kulttuureissa, tuumorin tilavuus ryhmien Setuksimabihoitoa saaneilla verrattiin käsittelemättömän ryhmien 28 päivän jälkeen (kuvio. 5C). Kasvaimen tilavuus oli merkittävästi vähäisemmät setuksimabi-käsiteltyjen ryhmien, jotka Siirto tehty ekspressoivien solujen kanssa korkeita EGFR. Sen sijaan, setuksimabi hoito ei aiheuta mitään merkittävää eroa kasvainten aiheuttamaa alakloonien, jotka ilmensivät alhaisia ​​EGFR.

perusteella immunohistokemiallisella värjäyksellä, ihonalainen transplantaation kasvain A431, positiivisen kontrollin, osoittivat 3+ EGFR ilmaisuja , kun taas korkea WIDR ja SW480 oli 2+ EGFR ilmaisuja. Sen sijaan alhainen WIDR ja SW480 kasvaimia osoitti vähemmän EGF-R-ekspressioon (kuvio. 5D). Nämä tulokset osoittivat, että jälkikäsittely kasvainten vielä ilmaista EGFR.

Keskustelu

Setuksimabilla, kimeeristä IgG1-vasta-aine, joka kohdentuu EGFR, tuotiin hoitoon metastasoituneen kolorektaalisyövän. Tunnistaa potilaat, jotka hyötyisivät eniten tästä biologisesta terapia, havaitseminen

KRAS

mutaatiot ehdotettiin pääasiallisena biomarkkereiden [11], [26], [27]. Onkogeenisia mutaatiot

KRAS

havaitaan noin 40% (20% -50%) satunnaista CRC [28] – [31]. Mutaatiot aiheuttavat konstitutiivinen aktivoituminen Ras /Raf /MAPK-signalointireitin, joka on riippumaton EGFR aktivaation ligandin sitoutumisen [32]. Karapetis

et al

. raportoitu merkittävää parannusta potilailla, joilla on villin tyypin

KRAS

vastauksena setuksimabihoidon [12].

EGFR tila arvioitiin käyttämällä immunohistokemiallista värjäystä pidetään toinen biomarkkeri tehoa anti-EGFR hoitojen . Siten EGFR taso odotettiin korreloivan herkkyys ja tehoa setuksimabi. Tästä huolimatta hypoteesi, johtuu useista tutkimusten mukaan EGFR aseman ja sen ekspressiotaso määritettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä ei aina vastaa tehoa anti-EGFR hoito [8], [16] – [18]. Niinpä vastaus setuksimabia havaittiin potilailla, joilla oli havaittavissa kasvain erityisiä EGFR, minkä perusteella voidaan päätellä, että vastaus setuksimabista on riippumaton EGFR kasvainkudoksessa [18].

tunnistaminen geneettisiä tekijöitä ensisijaisen vastustuskykyä EGFR kohdistettuja hoitoja CRC on selvästi etusijalla. Tulokset esitetään tässä tutkimuksessa viittaa siihen, että EGFR taso, joka havaitaan setuksimabi korreloi tehokkuuteen Setuksimabihoitoa. Lisäksi arvioinnissa EGFR käyttäen biotinyloitua setuksimabi menetelmä voi ennustaa kliinistä hyötyä Setuksimabihoitoa. Tässä olemme osoittaneet, että lisääntyminen CRC solulinjojen erittäin esti soluissa, jotka ilmaisivat EGFR korkealla tasolla, mikä viittaa siihen, että EGFR havaittavia määriä setuksimabia korreloi solujen herkkyys setuksimabista hoitoon. Tehoa Setuksimabin ksenograftimallia tutkittiin myös vertaamalla ksenografteissa CRC solulinjojen Subkloonien että ilmaistu korkea tai alhainen EGFR. Suurempaa kasvua estämällä kasvainten nähtiin kasvaimen aiheuttama alakloonien korkea EGFR verrattuna alhainen EGFR. Emme kuitenkaan ole tietoisia mistään tiedoista, joiden mukaan havaitseminen EGFR Setuksimabin liittyy herkkyys CRC setuksimabista hoitoon. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään yhdistyksen välillä EGFR ja herkkyys kasvainsolujen setuksimabista, nykyisen tulokset viittaavat siihen, että menetelmää ilmaista EGFR Setuksimabihoitoa voi tarjota uuden biomarkkereiden.

Valitsimme neljä CRC solulinjat, Caco-2, WiDr-, SW480 ja HCT116 meidän tässä tutkimuksessa. Nämä solulinjat on käytetty monissa muissa aikaisemmissa tutkimuksissa tehokkuuden arvioimiseksi setuksimabin hoidon. Tutkimme myös läsnäolon mutaatioiden

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

, ja EGFR ektodomeeni (taulukko 1). Voimakas vaste setuksimabia havaittiin Caco-2-solut, josta puuttui havaittava mutaatiot näissä kolmessa geeneistä; kuitenkin vaste havaittiin myös SW480-soluissa, jotka satamiin

KRAS

ja PIK3CA mutaatio. Ensinnäkin mitä

KRAS

mutaatio, tehoa setuksimabin liittyy pidentymistä ja ilman taudin etenemistä potilailla, joilla on kemoterapian tulenkestävä peräsuolen syövän p.G13D-mutatoitunut kasvaimia kuin muilla KRAS-mutatoitunut kasvaimia [23 ]. Toinen, jotka koskevat PIK3CA mutaatio, Ogino

et al.

Todettu, että

PIK3CA

mutaatiot liittyvät lyhyempi syövän erityisiä selviytymisen potilailla, joilla KRAS villityypin kasvaimia sarjassa vaiheen I-III peräsuolen syövistä [21]. Kuitenkin De Roock

et al.

Raportoidaan ensimmäisen kerran PIK3CA eksoni 20 mutaatiot liittyvät pahemmin verrattuna villin tyyppejä, kun taas eksoni 9 mutaatio havaittiin olevan mitään vaikutusta [22]. Näistä Aiemmissa raporteissa meidän tulokset olivat samansuuntaisia ​​kuin toisessa tutkimuksessa osoittavat, että setuksimabia tehokas SW480, joka on KRAS kodonin 13 mutaatio ja PIK3CA eksonin 9 mutaatio, kun taas mitään positiivinen vaikutus nähtiin HCT116 kanssa PIK3CA eksonin 20 mutaatio.

Tutkimme myös WiDr- ja SW480 CRC solujen tehon arvioimiseksi setuksimabin tehoa hiirellä ksenograftimallissa. Proliferaatiomäärityksessä osoitti, että vahva tai lievä vaste setuksimabia hiirillä Siirto tehty joko WiDr tai SW480. Caco-2, joka osoitti voimakas vaste setuksimabi, käytettiin myös perustaa ksenograftimallissa; mutta se ei ympätä hiiret. Kasvainten kasvua johdettu WiDr- ja SW480 ksenografteissa oli erittäin estyy kun subklooneja näytteillä korkea EGFR verrattuna alhainen EGFR. Tämä viittaa siihen, että ero määrän EGFR korreloi setuksimabin herkkyys. Kuitenkin rajoitus Tämän tutkimuksen on, että on olemassa mahdollisuus järkkymisvaaran EGFR tason aikana syövän etenemiseen. Vaikka uusi menetelmä mitata EGFR käyttäen setuksimabi vaatii lisävalidointia biomarkkerina tehokkuudesta anti-EGFR-hoidon, tulokset viittaavat siihen, että EGFR tasot korreloivat herkkyys CRC setuksimabista.

näennäinen väliset erot tulokset nykyisen tutkimuksen ja aiemmin raportoitu voidaan selittää seuraavasti: Ensinnäkin, EGFR ilmentyy 40% -70% peräsuolen syöpiä, ja todisteet osoittavat yhdistyksen pelastautumiskoulutukseen [33] – [35]. Menetelmät, joita käytetään arvioimaan määrä EGFR peräsuolen syövät ovat immunohistokemia, ligandin sitova, immunoblottaus, fluoresenssi in situ -hybridisaatioanalyysi ja erilaisia ​​molekyylipainon tekniikoita [36]. Kuitenkin arviointi EGFR voi vaikuttaa immunoreaktiivisuus normaaleissa kudoksissa, tasauspyörästö EGFR reaktiivisuus kasvainten eri alueilla suolen, ja heterogeenisuus reaktiivisuus sisällä kolorektaalisyöpää itse [17], [37]. Toiseksi Scartozzi

et al.

Raportoi, että EGFR tilaansa ensisijainen Kolorektaalituumorien eroaa metastaasien [38]. Kolmanneksi Montagut

et al.

Raportoitu, että EGFR S492R ektodomeeni mutaatio estää setuksimabi sitova ja antaa vastustuskyvyn setuksimabin [19]. Tämä havainto viittaa siihen, että EGFR kvantifiointi käyttäen immunohistokemia värjäystä havaitsee joko villityypin tai mutatoidun EGFR, jotka eivät sitoudu setuksimabi. Siksi uusi menetelmä voi ratkaista tätä ongelmaa, koska se riippuu kyvystä setuksimabin havaita EGFR.

Monet kliiniset kokeet ovat osoittaneet tehoa lisäämällä setuksimabin takia hoitoon metastasoitunutta kolorektaalisyöpää [7], [8], [39]. Van Cutsem

et al

. suoritti vaiheen III tutkimuksessa ensilinjan hoitoon, jossa setuksimabi lisättiin FOLFIRI ja 5-FU-pohjainen monilääke kemoterapiaa irinotekaanin [40]. Lisäämällä setuksimabia liittyy merkittävä kasvu mediaani ilman taudin etenemistä verrattuna ilman setuksimabia. Jonker

et al

., Toisessa vaiheen III tutkimuksessa, verrattiin anti-EGFR-vasta-hoito oireenmukaista hoitoa potilaille [10]. Tässä tutkimuksessa setuksimabia lisätään yhdessä oireenmukaista hoitoa ja liittyi merkittäviä parannuksia verrattuna oireenmukaista hoitoa yksin. Kuitenkin tulokset enemmistö tutkimukset osoittavat suuntaus parempi eloonjäämisen jos kemoterapia yhdistettiin setuksimabin mutta ei havaittu merkittävää vaikutusta CRC hoitoa.

Vastausprosentti setuksimabilla hoitoa CRC on 30% -40 % [10]. Todisteet viittaavat siihen, että

KRAS

mutaatiot ovat tehokkain ennustavat valitsemiseksi potilaille, jotka hyötyvät hoidosta; kuitenkin, nämä mutaatiot, sinänsä eivät tunnista paras vaste. Nykyinen tulokset viittaavat siihen, että tämä uusi menetelmä havaitsemiseksi EGFR käyttäen biotinyloitua setuksimabin avulla voi olla mahdollista havaita erittäin herkkien potilaiden villin tyypin

KRAS

. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan arvioimaan hypoteesia, kuvattua tekniikkaa tässä voi tarjota tarkempia viitteitä toteuttamiseksi hoitoon CRC Setuksimabihoitoa.

Yhteenvetona tuloksista tämän tutkimuksen osoittavat, että EGFR ekspressiotasot, jotka havaittiin setuksimabi, voidaan korreloida herkkyys setuksimabin estoa kasvainsolujen kasvua. Siksi uskomme, että nämä tulokset voivat tarjota uusi menetelmä määrällisesti EGFR, mikä mahdollistaa tehokkaamman valinnan CRC potilaat, jotka hyötyvät setuksimabihoito.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää H. Okazaki, K. Miyao, ja C. Saito niiden teknistä tukea ja hyödyllistä keskustelua.