Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jatkuva RET aktivointi on yleinen tapahtuma papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) ja medullaarinen kilpirauhassyövän (MTC). Näissä syövissä, RET aktivoi ERK /MAPK, PI3K /AKT /mTOR ja JAK /STAT3 reittejä. Tässä testasimme tehosta JAK1 /2- estäjä, AZD1480,

in vitro

ja

in vivo

kasvun kilpirauhassyövän ilmentävien solulinjojen onkogeenisia RET. Kilpirauhassyöpä solulinjoissa kätkeminen

RET Twitter /PTC1 (TPC-1),

RET

M918T (MZ-CRC1) ja

RET

C634W (TT) muutoksia, sekä TPC-1 ksenografteja, käsiteltiin JAK-inhibiittorin, AZD1480. Tämä estäjä johti kasvun inhibition ja /tai apoptoosin kilpirauhasen syövän solulinjat

in vitro

, sekä kasvaimen regressio TPC-1 ksenografteja, jossa se tehokkaasti estää STAT3 aktivaatio kasvainsoluissa ja strooman solut. Tämä esto liittyi vähentynyt proliferaatio, vähentynyt verisuonten tiheys yhdistettynä lisääntynyt kuolion. Kuitenkin AZD1480 tukahdutettu kasvu STAT3- puutoksisten TPC-1-solujen

in vitro

ja

in vivo

, jotka osoittavat, että sen vaikutukset tässä solulinjassa olivat riippumattomia STAT3 kasvainsoluissa. Kaikissa solulinjoissa, JAK-inhibiittori, vähensi fosfo-Y1062 RET tasoilla, ja mTOR efektori fosfo-S6, kun taas JAK1 /2 downregulation siRNA ei vaikuttanut solujen kasvuun eikä RET ja S6 aktivointi. Lopuksi, AZD1480 estää tehokkaasti proliferaatiota ja kasvaimen kasvua aktivoitua jälkikä- kilpirauhassyöpä solulinjoissa, todennäköisesti suoraan RET inhibition syöpäsoluissa sekä modulointi mikroympäristön (esimerkiksi kautta JAK /fosfo-STAT3 esto endoteelisoluissa). Näin ollen, AZD1480 olisi pidettävä terapeuttisena aineena hoidettaessa jälkikä- aktivoitu kilpirauhassyövän.

Citation: Couto JP, Almeida A, Daly L, Sobrinho-Simões M, Bromberg JF, Soares P (2012) AZD1480 Blocks kasvu ja kasvaimen kehittymisen sekä jälkikä- aktivoitu kilpirauhassyöpä Cell Lines. PLoS ONE 7 (10): e46869. doi: 10,1371 /journal.pone.0046869

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 06 syyskuu 2012; Julkaistu: 02 lokakuu 2012

Copyright: © Couto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Portugalin Foundation for Science and Technology (FCT). Joana s Couto tukena on FCT avustuksen SFRH /BD /40260/2007. Ana Almeida tukena on FCT avustuksen SFRH /BD /79135/2011. J. Bromberg tukee R01-CA87637-06, U54: CA148967, Marjorie ja Charles Holloway Foundation, Lerner Foundation, Sussman Family Fund ja Astra Zeneca. IPATIMUP on Associate laboratorio Portugalin tiede-, teknologia- ja korkeakoulutusministeri, joka on osittain tukee FCT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai käsikirjoitus valmisteilla.

Kilpailevat edut: Jacqueline Bromberg on saanut tutkimusrahoitusta AstraZeneca. Hän on ollut neuvoa-antava rooli AstraZeneca ja Mediummune ja sai Honoria luentoja. Ei ole olemassa patentteja tai tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

jäsensi aikana transfektio (RET) esikasvaintekijän koodaa yksi ensimmäisistä reseptorin (RTK: t), joiden todettiin olevan osallisena syövän [1]. RET ligandit kuuluvat glial solu- neurotrofinen (GDNF) perheen ja koskettaessa RET, aiheuttaa autofosforyloinnin solunsisäisen tyrosiinitähteissä, johon useat sovittimet sitovat [2]. Nämä sovittimet välittävät aktivointi useiden reittien kautta, mukaan lukien mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) signalointireitin, fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) reitti, c-jun N-terminaalinen Kinase (JNK) reitti, p38-reitin, SRC, ERK5, PLC-γ ja Signal muuntimet ja Activator of Transcription (STAT) 3 [3].

ensimmäinen onkogeenisia rooli RET kuvattiin yleisin hormonitoimintaa syöpä, papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) [4] , seurauksena genomista uudelleenjärjestelyjä johtaa Perustamiskokouksessaan aktivointi ja lisääntynyt solujen eloonjäämistä, lisääntymistä ja liikkuvuus [5].

RET Twitter /PTC uudelleenjärjestelyjä ovat toiseksi yleisin geneettinen muutos PTC, löytyy 30% tapauksista [6].

RET

pistemutaatioiden havaittiin myös medullaarinen kilpirauhassyövän (LVM) [7], [8], eli lähes kaikki perinnöllinen tapauksissa ja noin 50% satunnaista MTC [9].

onkogeeniset RET on liitetty välittämisessä kasvaimeen liittyvä tulehdus, kuten mutanttimuotoihin RET indusoi IL-8 [10] ja muiden inflammatoristen molekyylien [11]. Lisäksi RET /PTC voimistunut joukko inflammation- liittyvien geenien thyrocytes [12], [13] joista monet kuuluvat IL-6 /JAK /STAT3-reitin [14]. IL-6 /JAK /STAT3-signaloinnin liipaisee IL-6 kytkennän sen reseptori-kompleksin, joka käsittää reseptori IL-6 (IL-6R) ja signaalin siirtävää osaa, gp130 [15]. Myöhemmät fosforylaatio reseptoriin liittyvän Jaks välittää tyrosiinifosforylaation STAT, erityisesti STAT3. Lisäksi, IL-6 aktivoi ERK /MAPK ja PI3K /AKT reitit [16]. Vapautettiin JAK /STAT signalointi (hyperactivation) on kuvattu erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien syöpä [17] – [20]. Valikoiva JAK1 /2 pienimolekyylisiä inhibiittoreita, jotka on kehitetty hoitamaan JAK- mutatoitu myeloproliferatiiviset häiriöt [21], [22], ovat tällä hetkellä kliinisissä kokeissa erilaisia ​​syöpiä. AZD1480 on voimakas pienimolekyylinen JAK1 /2-inhibiittori [23], joka on alle vaiheen I kliinisissä kokeissa hoitoon myeloproliferatiivinen sairaus. Olemme tutkineet vaikutukset AZD1480 IL-6 /JAK ja jälkikä- riippuvainen signalointi (STAT3, ERK /MAPK ja PI3K /AKT) sekä sen biologisia vaikutuksia ihmisen kilpirauhassyöpä mallit (solu- linjat ja ksenograftimallissa). AZD1480 tehokkaasti esti kasvun ja kasvaimen kehittymisen kilpirauhassyövän solulinjojen kätkeminen kasvaimia synnyttävän

RET

muutoksia, todennäköisesti estämällä PI3K /AKT signalointi, käyttöä tukevat tätä estäjän potilaille kilpirauhassyöpä, erityisesti kehittyneitä MTC, joille ei ole olemassa tehokkaita terapeuttisia vaihtoehtoja.

tulokset

AZD1480 estää kasvun kilpirauhassyövän solulinjojen kätkeminen

RET

kasvaimia synnyttävän muutoksiin

tässä tutkimuksessa määritimme herkkyys kilpirauhassyövän solulinjojen kätkeminen onkogeenisia muotoja

RET

että JAK1 /2-estäjä, AZD1480. Erityisesti olemme analysoineet PTC-johdettu TPC-1 (

RET Twitter /PTC1 muuttamisen), MTC-johdettu MZ-CRC1 (

RET

M918T-mutaation) ja TT (

RET

C634W mutaatio) solulinjat. Vertailun vuoksi me käsitellään samalla solulinjojen kanssa MEK1 /2-inhibiittorin, AZD6244, jonka on osoitettu olevan alhainen teho

RET

-mutated soluihin [24], toisin kuin

BRAF

-mutated soluja. Mukaisesti, käytimme kaksi muuta kilpirauhassyöpä solulinjat, K1 (PTC-johdettu) ja C643 (anaplastinen kilpirauhasen carcinoma- peräisin) että satama

BRAF

V600E ja

HRAS

G13R mutaatioita, vastaavasti, koska valvonta AZD6244 tehoa. Soluja käsiteltiin yli 5 peräkkäisenä päivänä AZD6244, AZD1480 tai molempia huumeita, ja solutiheys määritettiin.

AZD1480 inhiboivat kaikki

RET

-mutated /järjestänyt solulinjoissa 1 (MZ-CRC1, TT) ja 2 päivää (TPC-1) käsittelyn (p 0,0001, Fig. 1A) ja vähän vähentynyt kasvun C643, mutta joilla ei ole vaikutusta K1 (Fig. S1). Havaitsimme, että AZD6244 vähän vähentynyt kasvun C643 ja MZ-CRC1 jälkeen 4/5 päivän hoidon jälkeen (p 0,001; Fig. 1A ja S1), ei ollut vaikutusta kasvuun TT (Fig. 1A) ja laski TPC- 1 kasvua 50% sen jälkeen, kun 5 päivää hoidon jälkeen. Sen sijaan, AZD6244 tehokkaasti esti kasvua

BRAF

– mutantti K1-solulinja (kuvio. S1). Ei lisäaineen tai synergistisen vaikutuksen yhdistettynä eston Meks ja Jaks havaittiin. AZD1480 ei estänyt kasvua ei-pahanlaatuisten rotan kilpirauhasen solulinja, PCCl3 (Fig. 1A). IC50: t AZD1480 määritettiin olevan korkea nM (~200-450 nM) näissä solulinjoissa (Fig. 1 B ja S2), ja pieneni ajan funktiona (48 ja 72 tuntia), mikä viittaa sytostaattinen vaikutus (Fig. 1 B).

(A) TPC-1, MZ-CRC1 ja TT solulinjoja käsiteltiin AZD6244 (1 uM), AZD1480 (1 uM), ja molempia lääkkeitä (1 uM kunkin) varten ilmoitettu aika. Rotta- johdettu kuin pahanlaatuinen kilpirauhasen solulinjassa, PCCl3, käsiteltiin AZD1480 (1 uM) tai kontrolli DMSO. Kasvu määritettiin Sulphordamine B määrityksessä. (B) Solulinjat hoidettiin 48 tai 72 tuntia eri pitoisuuksilla AZD1480 (0,1, 0,5 ja 1 uM), ja solutiheys määritettiin. Data näytetään keskimääräisenä ± SE kolmen riippumattoman kokeen. *** P 0,0001.

Koska herkkyys

RET

-mutated /jäsensi solulinjat AZD1480, me edelleen analysoineet solusyklin profiilia TPC-1, MZ- CRC1 ja TT käsiteltiin 72 tuntia AZD1480 (Fig. 2A). JAK estäjä johti G1 pidätykseen TPC-1 (94% verrattuna 79% kontrolliryhmässä, p = 0,01). Kolmen solulinjojen solujen prosenttiosuus S-faasi väheni jälkeen AZD1480 hoidon (TPC-1: 2% vs. 8% kontrolli, p = 0,01; MZ-CRC1: 4% vs. 11%, p = 0,004, TT: 6% vs. 11%, p = 0,09). Vastaavasti osuus solujen G2 /M oli myös vähentynyt TPC-1 solut, joita käsiteltiin JAK-inhibiittori (1% vs. 13% kontrolli, p = 0,01). In MZ-CRC1 ja TT, merkittävä kasvu subG1 väestöstä (osoittaa solukuolema) havaittiin (18% vs. 2%, DMSO-käsitelty, p = 0,04 ja 11% vs. 0,6%, p 0,0001 , vastaavasti) sen jälkeen, kun 72 tunnin AZD1480 hoidon. Vahvistaa vaikutuksen AZD1480 apoptoosin, solulinjat käsiteltiin AZD1480 48 tuntia ja värjättiin TUNEL reagenssin, paljastaen lisääntyminen apoptoottisten MZ-CRC1 (p = 0,02) ja TT (p = 0,1) solujen verrattuna ja DMSO käsitellyt solut (Fig. 2B). Kuten odotettua, AZD1480 ei aiheuttanut apoptoosia TPC-1 (Fig. 2B). Samanaikaisesti, havaitsimme kohonneita sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin, P27, ja alentuneet sykliini D1 ja anti-apoptoottisen proteiinin, BCL-2, in AZD1480- käsitellyissä soluissa (Fig. 2C).

(A) TPC-1, MZ-CRC1 ja TT käsiteltiin AZD1480 (1 uM, +) ja 72 tunnin ajan. Solut altistettiin sykliprofiilia analyysi virtaussytometrialla. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen (keskiarvo ± SE). (B) Soluja käsiteltiin AZD1480 (1 uM) 48 tunnin ajan ja apoptoottista solukuolemaa määritettiin TUNEL. (C) AZD1480 indusoi p27 säätelyä ja sykliini D1 ja BCL-2 downregulation in kilpirauhassyöpä solulinjoissa. TPC-1, MZ-CRC1 ja TT solulinjoja käsiteltiin AZD1480 (1 uM) 24 tunnin ajan. Solulysaatit koettimena ilmoitettua primaaristen vasta-aineiden, western-blottauksella. * P 0,05; *** P 0,0001.

AZD1480 indusoi regressio TPC-1 -ksenografteja

vaikutukset JAK estäjän

in vivo

kasvuun TPC- 1 solut arvioitiin ihon alle paljaiden hiirien kylkiin. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet -0,5 cm

3, hiiret käsiteltiin ajoneuvon, AZD1480 tai AZD6244 16 peräkkäisen päivän ajan (Fig. 3A). Kasvaimet verrokkihiiristä ja AZD6244- käsitellyt hiiret jatkui päivään 9 ja koska niiden suuren koon, hiiret tapettiin. Sen sijaan, AZD1480- käsitellyistä hiiristä osoittivat todisteita kasvaimen taantumisesta jälkeen 4 päivää, ja sen jälkeen 16 päivää, ne mitataan ~23% niiden alkuperäisestä koosta (Fig. 3A). Immunohistokemiallinen värjäys edustajan tuumorisektioiden osoitti merkittäviä fosfo-STAT3 downregulation by AZD1480 kasvainsoluissa ja strooman soluja (endoteelisolujen). MEK estäjä, AZD6244 vähensi fosfo- ERK1 /2 tasossa kasvaimissa (Fig. 3B). Histologisesti, useimmat kasvaimen massa (90%) välillä AZD1480- käsitellyt tuumorit koostui nekroottista kudosta, kun taas suurin osa kasvainten solujen valvontaa ja AZD6244 ryhmät olivat elinkelpoisia ja aktiivisesti lisääntyvissä, kuten nähdään Ki67-värjäys (Fig. 3C) . Lisäkarakterisointia näiden kasvainten paljasti väheneminen endoteelisolujen (Meca-32) sen jälkeen, AZD1480 hoidon, verrattuna kontrolliin ja AZD6244 ryhmien välillä (p = 0,06 ja p 0,0001, vastaavasti, Fig. 3C). Merkittäviä eroja ei havaittu apoptoottisten solujen määrässä (TUNEL), jonka osuus oli pieni koko kasvaimia.

(A) TPC-1-solut (10

6) injektoitiin ihon alle kyljissä nude-hiirissä. Kasvaimen engraftmentti (-0,5 cm

3), hiiret jaettiin neljään ryhmään (n = 5 /ryhmä), joilla on samankaltaisia ​​kasvaimen keskimääräinen määriä. Ryhmät käsiteltiin lääkkeen ajoneuvon (käsittelemätön), AZD6244, 25 mg /kg kerran päivässä, tai AZD1480, 30 mg /kg, kahdesti päivässä. Kasvaintilavuudet määritettiin kahdesti viikossa (keskiarvo ± SE). (B) AZD1480- ja AZD6244- käsiteltiin TPC-1 tuumorisektioiden immunovärjättiin fosfo-STAT3 ja fosfo-ERK1 /2 ilmaisua, vastaavasti. Fosfo-STAT3-positiivisten stromasoluja esitetään kanssa pisteviiva-(suurennus: 400x). (C) JAK estäjä laskee lisääntymistä ja vaskulogeneesiin TPC-1 -ksenografteja. H 0,001; *** P 0,0001.

AZD1480- välittämä kasvun estäminen on riippumaton STAT3

Jaks ovat pääasiallisia välittäjiä IL-6 /gp130 /STAT3 signalointi ja useissa syöpä malleja, JAK estäjät ”antituumorigeenistä vaikutukset välittyvät STST3. Sen määrittämiseksi, onko STST3 vaadittiin JAK-estäjän välittämän kasvun pysähtymisen, me vakaasti vähensi STST3 in TPC-1-soluissa käyttäen lyhyttä hiusneula, määritettynä western-blot ja immunohistokemia (Fig. 4A, C2). Soluja käsiteltiin AZD1480 neljän peräkkäisen päivän ajan ja

in vitro

solujen kasvua seurattiin, paljastaa merkittävän kasvun inhibitio TPC-1 shSTAT3 solujen (p 0,0001, Fig. 4B).

In vivo

kasvu arvioitiin injektoimalla shSTAT3 soluja ihon alle ja päästyään -0,5 cm

3, tuumoreita kantavaa hiirtä sai vehikkeliä tai AZD1480, 21 päivää. Kontrolliryhmä sai lopetettiin 8 päivää, koska suuri koko kasvaimia. AZD1480 indusoi regressio (kasvaimen tilavuus oli ~24% sen alkuperäisestä koosta; p 0,0001) TPC-1 shSTAT3 kasvaimia (Fig. 4C1). Fosfo-STAT3 vahvistettiin alennetaan kasvainsoluissa, että ajoneuvo- käsiteltyjen hiirten, mutta ei stroomasolujen, kun kasvain- ja stromal- fosfo-STAT3 vähensi merkittävästi AZD1480- käsitellyissä hiirissä (Fig. 4C2).

(A) STST3 oli pudotus in TPC-1-solujen lyhyt hiusneula. Fosfo-STAT3 ja STAT3 downregulation varmistettiin western-blottauksella. (B) TPC-1 shSTAT3 soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai AZD1480 (1 uM) ja kasvun esto määritettiin SRB-määrityksellä. Tulokset ovat keskiarvo ± SE kolmen erillisen kokeen. (C) TPC-1 shSTAT3 solua injektoitiin ihon alle sekä paljaiden hiirien kylkiin. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet -0,5 cm

3, hiiret tasaisesti kahteen ryhmään: yksi oli kontrolliryhmä (ajoneuvo) ja muita käsiteltiin AZD1480 30 mg /kg, kahdesti päivässä. (C1) Kasvaimen tilavuus mitattiin ilmoitettuina ajankohtina. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SE. (C2) edustaja H 0,0001.

AZD1480 estää RET Y1062 fosforylaation ja loppupään PI3K /AKT /mTOR signalointi

onkogeeninen RET efektori toteutustapoihin kuuluvat ERK /MEK, PI3K /AKT ja STAT3 [ ,,,0],3]. Koska merkittävää kasvua tukahduttava toimet JAK estäjän onkogeenisel-

RET

– muuttaneet TPC-1 ksenografti riippumatta STAT3, me arveltu, että AZD1480 voi olla suora vaikutus RET-välitteisen signaloinnin. Käsittelimme TPC-1, MZ-CRC1, TT (Fig. 5A) sekä mallin indusoituvan RET /PTC3 ilmentymisen PCCL3 (Fig. 5B), jossa AZD1480 ja /tai AZD6244, 24 tunnin ajan. Ilmaisu ja fosforylaatiota tasot RET sekä tärkeimpien efektorien JAK /STAT3, ERK /MAPK ja PI3K /AKT-reitin, nimittäin fosfo- STAT3 Tyr705, fosfori-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 ja fosfo-AKT Ser473 /phospho -S6 Ser235 /236, vastaavasti, tutkittiin western-blot analyysiä. AZD1480 ja AZD6244 alentaa tehokkaasti tasot niiden loppupään tavoitteiden fosfo-STAT3 ja fosfo-ERK1 /2, vastaavasti, kaikissa solulinjoissa (Fig. 5A, B). MZ-CRC1 ei ilmaissut fosfo-ERK1 /2 klo pohjapinta tasoilla (Fig. 5A). Lisäksi, AZD1480 vähensivät fosfo-ERK1 /2 PCCl3-RET /PTC3 ja TT, sekä fosfo-AKT, fosfo-S6 ja fosfo-RET kaikissa solulinjoissa (Fig. 5A, B). Sen sijaan, AZD6244 hoito lisäsi fosfo-STAT3 TPC-1-soluissa, lisääntynyt fosfo-AKT ja fosfo-S6 MZ-CRC1 soluja ja lisätä fosfo-RET in PCCl3-RET /PTC3 solut (Fig. 5A, B). Ei ole näyttöä siitä, jotka osoittavat toiminnallista yhdistyksen välillä RET ja Jaks. Sen määrittämiseksi, oliko laski fosfo-RET johtui off-tavoite vaikutukset AZD1480, me pudotus JAK1 /2 ilmentymisen TPC-1, MZ-CRC1 ja TT solujen lyhyt häiritseviä (si) RNA. 48 tuntia, JAK1, JAK2 ja fosfori-STAT3 tasot vaimentua kaikissa solulinjoissa, mutta ei vaikuttanut fosfo-RET, fosfo-ERK1 /2 ja fosfo-S6 (Fig. 6A). Toisin kuin AZD1480, JAK1 /2 pudotus ei laskenut leviämisen tahansa solulinjoista, kuten nähdään BrdU (Fig. 6B). Suoritimme in vitro kinaasimäärityksessä ja todennut AZD1480 suoraan esti RET kinaasiaktiivisuutta: 40% inhibition 0,001 uM, 90%: n inhibition 0,1 uM ja 99% 1 uM (kuvio. S3).

(A ) TPC-1, MZ-CRC1, TT ja (B) PCCl3-RET /PTC3 doksisykliini-indusoituva solulinjan käsiteltiin 24 tuntia AZD1480 (1 uM), AZD6244 (1 uM), tai molempia huumeita. Solun kokonaisproteiinista uutteet seulottiin vasta-aineiden kanssa osoitettujen efektorien JAK /STAT3, ERK /MAPK ja PI3K /AKT signalointireittejä sekä fosfo-RET Y1062. Alemmassa paneelissa TPC-1, DMSO (D) kaista on ei-viereiset AZD6444 (6244) kaista, samassa geelissä. (C) TPC-1 -ksenografteja edustavia leikkeitä tutkittiin aktivointiin STAT3 (fosfo-STAT3), ERK /MAPK (fosfori-ERK1 /2) ja PI3K /AKT (fosfo-S6) signalointireitteihin. Kvantifiointi graafisesti (keskiarvo ± SE). * P 0,05; ** P 0,001.

(A) ilmentymistä JAK1 tai /ja JAK2 säädeltiin vähentävästi siRNA in TPC-1, MZ-CRC1 ja TT solulinjoissa. Tasot ilmoitetaan proteiinit ja niiden fosfory- tila määritettiin 48 tunnin kuluttua, western-blot-analyysi. (B) Solujen proliferaatio mitattiin BrdU, 48 tuntia transfektion jälkeen yhdistelmä siRNA: iden kohdistaminen sekä JAK1 ja JAK2. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SE kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05.

tutki fosforylaation tasoja STAT3, ERK ja S6 TPC-1 -ksenografteja vehikkeliä, AZD1480 ja AZD6244. Samoin kuin havaittiin TPC-1 ja muut RET-solu- linjojen

in vitro

, JAK estäjä johtanut merkittävään laskuun fosfo-S6 ja fosfo-STAT3 tasot (p 0,001) kasvain, kun taas mitään vähenemistä ei havaittu ajoneuvoon tai AZD6244- käsitellyt tuumorit (Fig. 5C). Fosfo-ERK pysyivät ennallaan välillä ohjaus ja AZD1480 ryhmiä ja merkittävästi vähentynyt (p = 0,01) että AZD6244- hoidetussa ryhmässä (kuvio. 5C).

Keskustelu

RET

geeni muutokset ovat onkogeenisiä ”kuljettajat” in kilpirauhassyöpä synnyssä, erityisesti MTC ja PTC. Onkogeeniset RET on voimakas aktivaattori ERK /MAPK ja PI3K polkuja ja voi indusoida tulehduksellisten välittäjäaineiden, kuten CCL2, CXCL-1, GM-CSF, IL-1β: n ja IL-6 [5], [25] – [ ,,,0],27]. Lisäksi RET /PTC ja mutantti RET voi aiheuttaa fosforylaatio STAT3 joko suoraan [14], [28] tai JAK-riippuvaisella tavalla [29]. Jaks ovat tyrosiinikinaaseja, jotka välittävät IL-6- riippuvainen STAT3 aktivointi, joka on osoitettu edistävän syövän etenemistä lukuisia esimerkkejä kiinteitä kasvaimia. Tärkeää on, JAK2 aktivoivat mutaatiot ovat kriittisiä patogeneesissä myeloproliferatiivisiin häiriöitä ja joka on johtanut kehitystä Jaks pienmolekyylisalpaajien [22], [23]. Tässä olemme tutkineet biologisia vaikutuksia JAK1 /2-inhibiittorin, AZD1480, kasvuun PTC- ja MTC- peräisin kilpirauhasen syöpä solulinjoja kätkeminen aktivoimalla

RET

/PTC uudelleenjärjestelyjä ja

RET

mutaatiot, vastaavasti. Havaitsimme, että AZD1480 esti kasvua TPC-1, MZ-CRC1 ja TT IC

50s 500 nM, joka on 2 10-kertaisesti alle raportoitu muiden syövän solulinjat [23], [30]. Lohko kasvun johtui G1 solusyklin pysähtymisen TPC-1-soluissa, kun taas MZ-CRC1 ja TT, JAK esto huomattavasti apoptoosin. Toisaalta, joka on MEK1 /2-estäjä, AZD6244, ei muuttaa

in vitro

kasvua MZ-CRC1 ja TT. Ei lisäaineen tai synergiavaikutukset

in vitro

kasvua havaittiin yhdistämällä molempien estäjiä. Päinvastoin, AZD6244 (mutta ei AZD1480) tehokkaasti inhiboi kasvua

BRAF

V600E- mutantin solulinjan, K1. Sekä AZD1480 ja AZD6244 oli minimaalinen vaikutus kasvuun

RAS

– mutantti solulinja, C643. Epäherkkyys RET-aktivoidun kilpirauhasen syöpäsolujen MEK inhibition on aiemmin osoitettu, toisin kuin korkea herkkyys kilpirauhassyövän solut, jotka ekspressoivat

BRAFV600E

[31]. Tämä vastus saattaa heijastaa kykyä onkogeenisten RET aktivoida vaihtoehtoisten signalointireiteissä, erityisesti PI3K /AKT /mTOR-reitin [32]. Lisäksi AZD6244 aiheutti säätelyä fosfo-RET Y1062 on PCCl3-RET /PTC3 malli sekä mTOR -efektiboksejamme fosfo-S6 ja fosfo-AKT, in MZ-CRC1. Yliaktivaatio on mTOR reitin vastauksena MEK esto voidaan mahdollisesti selittää lievittämiseen palautteen eston ja on aiemmin raportoitu muissa malleissa [33], jossa se välittää solun resistentiksi AZD6244 [34], [35].

Lisäksi, AZD1480 voimakkaasti inhiboi

in vivo

kasvua TPC-1 ksenografteja, jolloin kasvaimen regressio, kun taas kasvainten AZD6244- käsiteltyjen hiirten kasvoi hieman enemmän kuin kontrollien tuumoreiden, viittaa siihen, että hoitoon

RET

-mutated kilpirauhassyövän tällä estäjä voi edistää kasvaimen kasvua. In TPC-1 kasvaimia, ja samalla vaikutukset

in vitro

, AZD1480 estetty leviämisen mutta ei merkittävästi vaikuttamatta apoptoosin. Kuitenkin

in vivo

, havaitsimme merkitty kasvaimen regressio, jossa kasvaimia näyttämällä laajoja nekroottisen kudoksen ja merkittävä väheneminen verisuonten. Jälkimmäinen on saattanut aiheuttaa laskun ravinteiden ja hapensaanti kasvaimia, todennäköisesti selittää korostuvat kuolion ja näin ollen kasvain vähentäminen. Tällaiset vaikutukset kasvaimen kasvuun on aiemmin kirjattu muihin syövän malleissa (keuhko-, rinta-, eturauhas-, aivot) [23], [36], [37]. Näissä malleissa, JAK inhibitio oli erityisen tehokas fosfo-STAT3-positiivisia kasvaimia /solulinjat. Kuitenkin, AZD1480 on myös osoitettu estävän kasvua syöpäsolulinjojen riippumatta STAT3 aktivoinnin, erityisesti suurilla annoksilla [23], mikä johtuu mahdollisesti off-tavoite vaikutuksia lääkkeen. Tuoreessa raportissa, AZD1480 tukossa sekä JAK /STAT3 ja FGFR3 signalointia myeloomasoluja [30]. Sen testaamiseksi, kasvua estäviä vaikutuksia AZD1480 olivat riippuvaisia ​​STST3 meidän malleja, koputimme alas STAT3 in TPC-1-soluissa. STAT3 puutos näissä soluissa ei vaikuttanut niiden herkkyys JAK eston verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi AZD1480 oli samalla tehokkaita estämään kasvun STAT3- puutoksisten TPC-1 ksenografteja, mikä näkyy laajaa kuolion, samoin AZD1480 saaneista vanhempien TPC-1 kasvaimia. Lisäksi olemme tippuu alas JAK1 ja JAK2 ilmaisun TPC-1, MZ-CRC1 ja TT-solulinjoissa siRNA, joka ei ollut mitään vaikutusta niiden leviäminen. Nämä tiedot osoittavat, että AZD1480 estää niiden kasvun, RET-aktivoidun kilpirauhassyöpä solulinjoissa

in vitro

ja

in vivo

riippumatta JAK /STAT3 signalointi syöpäsoluissa.

Olemme pyrkineet tunnistamaan mekanismeja selittää kasvua estäviä vaikutuksia AZD1480

in vitro

ja

in vivo

. Kaikissa solulinjoissa, AZD1480 tehokkaasti pienentää fosfo-STAT3 tasoilla, myös C634W mutantti TT solulinjan, vaikka tämä onkogeenisiä muotoa RET kuvattiin aktivoimalla STST3 riippumatta Jaks, kahdella telakointi sivustoja RET (Tyr752 ja Tyr928) [28] . Ehdotamme, että tulokset vaihtelevat käytön vuoksi erilaisen JAK estäjä, eri potencies, kuin se, jota Schuringa

et

al

.

Toistaiseksi ei tiedot ovat osoittaneet rooli Jaks RET aktivointi (Y1062 fosforylaatio) eikä aktivoituessa sen loppupään MAPK ja PI3K polkuja. Olemme todenneet, että AZD1480 estetty RET Y1062 fosforylaatiota TPC-1, MZ-CRC1, TT, sekä ehdollisessa malli

RET /PTC3

ilme. Vaikka AZD1480 ei estänyt ERK /MAPK-reitin useimmissa solulinjoissa, se esti aktivoinnin PI3K efektorien AKT ja S6. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, että AZD1480- käsiteltiin TPC-1 ksenografteja, jossa ei ole eroja ERK /MAPK tasot havaittiin, ja fosfo-S6 oli merkittävästi vaimentua. Olemme osoittaneet, että nämä vaikutukset olivat riippumattomia Jaks, kuten fosfo-RET, fosfo-ERK ja fosfo-S6 tasot eivät muuttuneet upon JAK1 /2 knockdown siRNA. Olemme osoittaneet, että AZD1480 suoraan inhiboi kinaasiaktiivisuutta rekombinantti-RET annoksesta riippuvalla tavalla, joka todennäköisesti korostetaan estävä ja mutantti-RET erityisiä vaikutuksia AZD1480 kasvuun ja eloonjääminen kilpirauhasen syöpäsoluja. Todellakin,

in vitro

kinaasimäärityk- aiemman raportin ovat osoittaneet, että AZD1480 voi estää -50% ja 90% RET aktiivisuus 0,1 ja 1 uM pitoisuuksina, vastaavasti [23].

johtopäätös, osoitimme, että JAK1 /2-estäjä, AZD1480, voi estää kasvun ja aiheuttavat solukuoleman kilpirauhassyövän solulinjojen kätkeminen eri muodossa onkogeenis-

RET in vitro

ja

in vivo

. Näissä soluissa AZD1480 todennäköisesti estää RET suoraan, mikä tämän seurauksena saarron PI3K /AKT /mTOR-reitin, joka näyttää olevan ensisijaisen kasvaimia synnyttävän voima ajo RET-aktivoitujen solujen. Vaikka nämä vaikutukset olivat riippumattomia STST3 vuonna kilpirauhasen syöpäsoluja, AZD1480 esti fosfo-STAT3 stroomassa, erityisesti endoteelisolujen. Itse asiassa, JAK-inhibiittorit ovat tunnettuja modulaattoreita microenvironment estämällä angiogeneesiä ja myeloidisolun mobilisaatio on STAT3- riippuvaisella tavalla [36], [38]. Koska merkittävää laskua verisuonikkuudesta AZD1480- käsiteltyjen kasvainten ja seurauksena tuumorinekroositekijä, ehdotamme, että fosfo-STAT3 esto mikroympäristössä (endoteelisolujen) toimii yhdessä RET esto syöpäsoluissa aiheuttamaan kasvaimen regression. Lisäksi emme voi hävitä, että muut RET-riippumaton tyrosiinikinaaseilla (kuten FLT1, FGFR [23]), voidaan vaikuttaa AZD1480, edistää kasvua pidätys jälkikä- aktivoitujen solujen ja kasvaimia.

Tärkeää on, MZ -CRC1, joka satamat M918

RET

mutaatio liittyy MEN2B oireyhtymä, oli erittäin herkkä kasvua estäviä vaikutuksia AZD1480. Potilaat diagnosoitu MEN2B kehittyvät nopeasti etenevä, multifokaalinen MTC kanssa imusolmukemetastaaseja, yleensä vaaditaan täydellistä kilpirauhanen ennen 1 vuoden ikäisille [39]. Suurempi herkkyys MZ-CRC1 jotta AZD1480 verrattuna TT (kätkeminen vähemmän aggressiivisia C634W mutaatio), saattaa selittyä eri valmiuksia MEN2A- ja MEN2B- RET mutantit aktivoida loppupään polkuja, eli PI3K /AKT-reitin [40]. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat käyttöä AZD1480 hoitoon aggressiivisen muotoihin kilpirauhassyöpä, erityisesti MEN2B- MTC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki menettelyt eläinten tutkimus sisältyivät protokolla (numero 0011091) hyväksymä MSKCC Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IUAC) jälkeen Laboratory Animals Welfare Act oppaasta Care ja koe-eläinten käyttöä ja suuntaviivoja ja politiikoista Jyrsijöiden koetta.

Soluviljely ja huumeiden

TPC-1, K1, C643 (edellyttäen professori Marc Mareel, Belgia) ja TT (hankittu American Type Culture Collection – ATCC) [29], [ ,,,0],41] solulinjoja ylläpidettiin RPMI, 10% FBS: ää, 1% PenStrep. PCCl3-RET /PTC3 saatiin tohtori James Fagin ja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [13]. MZ-CRC1 (toimitti Dr. Robert hofstra, Alankomaat) [29] ja 293T (ATCC) ylläpidettiin DMEM, 10% FBS, 1% PenStrep. Kaikki soluviljelmässä reagenssit olivat GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA. AZD1480 [23] ja AZD6244 [24] olivat lahjoja Dennis Huszar ja Michael Zinda (AstraZeneca, London, UK).

Lentivirusvektorikonstruktit infektiot ja stabiilien solulinjojen

STST3 shRNA lentivirus konstruktio on aiemmin kuvattu [42]. Viruksen osaset kuljettavat konstruktit tuotettiin 293T-soluissa. Viruspartikkelit supernatantissa saostettiin käyttäen polyetyleeniglykolia virus saostusliuosta (System Biosciences LLC, Mountain View, CA, USA). Lentiviruksen rakenteet sisälsivät kopiointikasettiin koodaavan parannettua vihreää fluoresoivaa proteiinia [42], jotka mahdollistivat valinta solujen lajittelua.

kokosoluproteiinikuviot tiivisteet ja Western blotting

Solut lyysattiin radioimmunologisissa määritys puskuri, täydennetty proteaasi ja fosfataasiestäjät (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Proteiinit kvantifioitiin käyttäen modifioitua Bradford (Biorad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Hybond ECL kalvoja (GE Healthcare, Little Chalfont, Englanti). Ensisijainen vasta-aineet fosfo-STAT3 (Tyr705), STAT3, fosfori-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ERK1 /2, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfo-S6 (Ser235 /236), ja S6 olivat Cell Signaling Technologies, Inc, Danvers, MA, USA. Sykliini D1 vasta-aine oli peräisin Neomarkers, Fremont, CA, USA. Actin vasta-aine, fosfo-RET (Y1062), yhteensä RET (C-19) ja p27 olivat Santa Cruz BT, Santa Cruz, USA, BCL-2-vasta-aine oli peräisin DAKO, Glostrup, Tanska, ja α-tubuliinin oli Sigma Aldrich , St. Louis, MO, USA. Peroxidase- konjugoitua sekundaarista vasta-aineet olivat peräisin Santa Cruz BT.