Krooninen sairaus

tiivistelmä

α-Actinins (ACTNs) tiedetään silloittamiseksi aktiinisäikeiden pesäkekohdissa kiinnikkeistä vaeltavat soluissa. Niistä neljä isoformia nisäkkäiden ACTNs, ACTN1 ja ACTN4 ovat ekspressoituvat. Äskettäin ACTN4 ilmoitettiin parantaa syövän solun liikkuvuus, invaasio, ja etäpesäkkeitä. Kuitenkin mekanismi, jolla ACTN4 ajaa nämä pahanlaatuiset fenotyyppejä edelleen epäselvä. Tässä osoitamme, että ACTN4, mutta ei ACTN1, indusoi kypsymättömien paikallisessa tarttumisessa DLD-1-soluissa, mikä johtaa nopeaan liikevaihdon polttovälin kiinnikkeistä. Mielenkiintoista, zyxin (ZYX) kokoonpano paikallisia tarttumista oli merkittävästi vähentynyt ACTN4 ilmentävien DLD-1-soluissa, kun taas rekrytointi paksilliini (PAX) esiintyi normaalisti. Toisaalta, in ACTN1 ilmentäviä DLD-1-soluissa, PAX ja ZYX olivat yleensä rekrytoitiin paikallisia tarttumista, mikä viittaa siihen, että ACTN4 nimenomaan heikentää polttovälin tarttuvuus kypsyminen estämällä rekrytointia ZYX keskeiselle komplekseja. Käyttäen puhdistettua yhdistelmä-DNA-proteiineja, olemme huomanneet, että ZYX sitoutuminen ACTN4 oli puutteellinen olosuhteissa, joissa ZYX sitoutuminen ACTN1 havaittiin. Lisäksi Matrigel hyökkäys SW480-soluja, jotka ilmentävät korkeita endogeenisten tasojen ACTN4 proteiinin inhiboi ektooppinen ilmaus ACTN1. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että ZYX viallinen sitoutumista ACTN4, joka sijaitsee paikallisessa tarttumisessa sijaan ACTN1, indusoi kypsymättömien paikallisessa tarttumisessa, jolloin parantamiseksi solun liikkuvuus ja invaasiota.

Citation: Fukumoto M, Kurisu S, Yamada T, Takenawa T (2015) α-aktiniinin-4 Parantaa peräsuolen syöpäsoluinvaasiota tukahduttamalla Focal Adhesion Kypsytys. PLoS ONE 10 (4): e0120616. doi: 10,1371 /journal.pone.0120616

Academic Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

vastaanotettu: 05 lokakuu 2014; Hyväksytty: 24 tammikuu 2015; Julkaistu: 10 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Fukumoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Japan Society for Promotion of Science (JSPS) kautta JSPS Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen Grant 25860215 (S. Kurisu ) ja JSPS Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen Grant 23227005 (T. Takenawa). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

α-Actinins (ACTNs) on läsnä kaikissa solun tukirangan proteiinien silloittamiseksi aktiinisäikeiden klo noudattamista risteyksissä epiteelisoluissa ja paikallisia tarttumista in polarisoituneet vaeltavien soluissa [1,2]. Paikallisessa tarttumisessa, ACTNs vuorovaikutuksessa erilaisia ​​muita fokaalisen adheesion liittyneet proteiinit, kuten vinkuliini (VCL) [3,4] ja integriinit [5,6], ja sitten linkki aktiinisäikeiden jotta paikallisia tarttumista [7-9]. On neljä isomuotoa ACTNs nisäkässoluissa [10-12]. ACTN1 ja ACTN4 ovat läsnä kaikissa kutsutaan ei-lihas- isoformit, kun taas ACTN2 ja ACTN3 nimenomaisesti ilmaistu lihaskudoksen. Joukossa ACTNs, ACTN4 osallistuu pääasiassa solun liikkuvuus ja syövän invaasio [12-21]. Aikana solun liikkeen ACTN4 ekspressiotaso lisääntyy selvästi ja ACTN4 keskittyy kärjessä vaeltavia solujen [12]. ACTN4 Knockdown estää migraation ja invaasion syöpäsolujen [15-18,20-22], kun taas sen yliekspressio peräsuolen syöpäsolut indusoi imusolmuke etäpesäke immuunivajaissa hiirissä [13]. Lisäksi ACTN4 proteiinin ekspressio liittyy läheisesti huonoon lopputulokseen potilailla, joilla on rintasyöpä [12], peräsuolen [13], haiman [20,23], munasarjasyöpä [19], virtsarakon [21], ja keuhkojen [24] syöpä. Kuitenkin miksi ACTN4 sijaan ACTN1, usein liittyy syövän pahanlaatuisten kasvainten huolimatta yhtäläisyyksiä domain rakenne, aktiini-sitova ja-silloituksen toimintaa, ja Ca

2 + -sensitivity välillä vielä selvittämättä [25] .

Focal adhesions ovat suuria integriini-pohjainen, dynaaminen makromolekyylirakenteita jotka yhdistävät soluväliaineen kanssa solunsisäisen kimput aktiinisäikeiden kutsutaan stressiä kuituja. Focal tartunta on ensisijainen rakenne, joka välittää solunulkoinen vetovoiman soluun. Siten tartuntalujuus solujen alustan ja käyttöikä tai dynamiikkaa paikallisessa tarttumisessa vaikuttaa kriittisesti dynaaminen järjestäminen solun muoto, mukaan lukien solun liikkuvuus. Siirtymiseen soluun lamellipodioihin, orastava kiinnikkeistä, jotka koostuvat aihekokonaisuuksien integriinien ja muut sytoplasman proteiineja, kuten polttoväli adheesiokinaasi (FAK), ACTN, ja vinkuliinin (VCL) aluksi muodostuu. Nämä ovat lyhytikäisiä rakenteita, jotka joko liikevaihdon nopeasti noin 60 sekunnissa, tai kypsä suurempiin (noin 1 um) pistemäisiä kiinnikkeistä kutsutaan polttoväli komplekseja joka kestää useita minuutteja. Focal kompleksit edelleen kasvaa keskustaa kohti otetaan pitkänomainen paikallisia tarttumista ja, samanaikaisesti, siihen liittyvä aktiini stressi kuidut tullut paksumpi [26]. Polymerointi lamellipodial aktiini katalysoivat aktiini nukleaatiossa edistämällä tekijät, WASP perhe verprolin-homologista proteiinia (WAVE) proteiinit ja aktiini liittyvä proteiini 2/3 (Arp2 /3) kompleksi, joka tarvitaan myös kokoonpanoon orastavan kiinnikkeistä. Lamellipodial aktiinisäikeiden, yhteistuumin ACTNs, muoto esiasteiden jotka toimivat templaatteina kypsymisen orastavan kiinnikkeistä sisällä paikallisia tarttumista [27,28]. Kypsymisen orastavan fokaalisen adheesion osallistumisen yrityksen rakennustelineiden proteiinien eli paksilliini (PAX) ja zyxin (ZYX), muodostaen vakaita paikallisia tarttumista [7,26,29-31]. PAX näyttää säädellä siirtymistä syntymässä adhesions keskeiselle komplekseja läpi useita fosforyloituja tyrosiinitähteitä PAX. Toisaalta, ZYX osallistuminen paikallisessa tarttumisessa on suhteellisen myöhään tapahtuma, joka tapahtuu sen jälkeen, kun polttoväli komplekseja muodostuu. Siten ZYX arvellaan mukana muodostumista ja uudelleenorganisointi täysin kypsiä, keskihakuisia polttoväli kiinnikkeistä. Mukaisesti, tuoreet raportit viittaavat siihen, rooli ZYX stressin kuitu paksuuntuminen vasteena mekaaniseen rasitukseen [32]. ACTN1 on perinteisesti ajateltu olevan linkkeri välillä integriini kompleksit ja stressiä kuituja, koska ACTN1 voi sitoutua suoraan integriinin β1, VCL, ja ZYX [33,34]. Kuitenkin rooli ACTN4, jolla on korkea aminohapon samankaltaisuuden (86%) ja ACTN1, ei ole tarkasti testattu, niin toiminto ja proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia fokaalisen adheesion muodostumista.

Tässä tutkimuksessa osoitamme vastakkaiset vaikutukset kuin lihaksen ACTNs in fokaalisen adheesion kypsymisen peräsuolen syöpäsoluja. ACTN1 säätelee positiivisesti fokaalisen adheesion muodostumista, kun taas ACTN4 indusoi epävakautta ja nopeasta kierrosta paikallisessa tarttumisessa in ACTN4 yli-ilmentäviä soluja. Osoitamme myös, että ensimmäisen kerran, selvä ero kahden ACTN isoformien ZYX sitova. ACTN4 ei sitoudu ZYX, joka todennäköisesti taustalla havaittu korkea kiertonopeus paikallisessa tarttumisessa in ACTN4 yli-ilmentäviä soluja, kun taas ACTN1 sitoutuu ZYX kuten aiemmin raportoitu. ACTN4 jättäminen sitoutua ZYX tiiviisti yhdistää syövän synnyssä, koska vaarannu solu-kasvualusta tarttumista usein johtaa lisääntyneeseen syövän solun liikkuvuus ja invasiivisuus.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

anti-ACTN1 vasta-ainetta (H00000087) hankittiin Abnova (Taipei City, Taiwan). Anti-ACTN4 vasta-aine (ALX-210-356) ostettiin Enzo Life Sciences (Plymouth Meeting, PA, USA). Anti-RhoA (sc-418) ja anti-myosiinin sääntelyyn kevytketju (MRLC) (sc-28329) vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Anti-fosfo-MRLC (T18 /S19) vasta-aineen (# 3674) ja anti-His-tag-vasta-ainetta (# 2365) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-FLAG (F3165), anti-VCL (V9131), anti-ZYX (HPA004835), ja koko ACTN (A5044) vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-PAX vasta-ainetta (610051) hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Anti-fosfo-SRC (Y418) vasta-aine (44-660G) ja anti-fosfo-FAK (Y397) vasta-aine (44-624G) hankittiin Life Technologies (

Carlsbad

, CA, USA). Anti-aktiini-vasta-aine (MAB1501) hankittiin EMD Millipore (Bedford, MA, USA). Rodamiinileimattu phalloidin ostettiin Life Technologies. Growth Factor Reduced Matrigel (# 354230) hankittiin Corning (New York, NY, USA). Actin proteiinit puhdistettiin kanin luustolihasten (AKL99-A) ostettiin Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO, USA).

Soluviljely

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa DLD-1 , HT-29, LoVo, NCI-H508, ja Caco-2 oli antelias lahja tri T. Azuma (Tokio Dental College, Tokio, Japani). Ihmisen kolorektaalisyöpä solulinjaa SW480 oli antelias lahja tri K. Nagano (Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokio, Japani). DLD-1 ja LoVo alun perin ostettu JCRB Cell Bank (Osaka, Japani). HT-29, NCI-H508, Caco-2, ja SW480 olivat American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kaikki solulinjat, paitsi SW480, viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Wako, Osaka, Japani), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 4 mM L-glutamiinia, ja penisilliiniä /streptomysiiniä. SW480-soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Wako, Osaka, Japani), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. FreeStyle 293F-soluja viljeltiin FreeStyle 293 Expression väliaineessa (Life Technologies).

Plasmidit ja transfektio

Täyspitkä ihmisen ACTN1, ACTN4, ja ZYX cDNA saatiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen DLD-1 solun cDNA: ta templaattina. Seuraavat deleetiomutantit ZYX monistettiin PCR: ZYX-N (aminohapot [aa] 1-51) ja ZYX-C (aa 52-572). Kaikki cDNA: t sekvensoitiin ja alakloonattiin sitten pCMV2A, pCMV4A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), pEGFP-N2, pEGFP-N3, pEGFP-C1, pmCherry-N1 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Japani), pGEX-6P-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), ja pFastBacHT A (Life Technologies). GFP-vinkuliinin (VCL) konstrukti on aiemmin kuvattu [35]. Sillä ACTN stabiili ekspressio DLD-1-soluissa, cDNA: t, jotka koodaavat GFP, ACTN1-GFP, ja ACTN4-GFP monistettiin PCR: llä ja insertoitiin pIRESpuro3 vektoriin (TAKARA BIO Inc.).

Plasmidit transfektoitiin DLD- 1 tai SW480-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia tai FreeStyle 293F solujen FreeStyle Max mukaista reagenssia valmistajan ohjeiden (Life Technologies).

RNA-interferenssi (RNAi) B

Pieni häiritsevät RNA: t (siRNA: t) kohdistaminen ihmisen ACTN1 ja ACTN4 (siGENOME SMARTpool) ja siGENOME kuin kohdistaminen ohjaus siRNA Pool # 2 ostettiin GE Dharmacon (Lafayette, CO, USA). siRNA: t transfektoitiin DLD-1-solujen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Life Technologies) lopullisessa pitoisuudessa 10 nM. Transfektoituja soluja viljeltiin kasvatusväliaineessa 48-72 tunnin ajan ennen kuin altistetaan western blotting tai immunofluoresenssivärjäyksen.

Generation vakaa DLD-1-ACTNs-GFP-solulinjojen

DLD- 1-solut transfektoitiin pIRESpuro3-GFP, -ACTN1-GFP, tai-ACTN4-GFP. Yksittäiset pesäkkeet eristettiin 2 viikon kuluttua puromysiiniselektion (1,5 ug /ml). Proteiinin ilmentyminen solulysaateista arvioitiin immunoblottauksella anti-GFP-vasta-ainetta. Tuloksena Solut kutsutaan kuin DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP tai DLD-1-ACTN4-GFP.

puhdistus rekombinanttiproteiinien

Ihmisen täyspitkän ZYX ja ZYX-C kloonattiin pCMV2B koodaava vektori on N-terminaalinen FLAG-tag ja transfektoitiin FreeStyle 293F-soluissa. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla 48 tuntia transfektion jälkeen, ja pelletti suspendoitiin uudelleen immunosaostuksella (IP) puskurissa (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa [EDTA], ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia [PMSF]) täydennettynä leupeptiiniä ja aprotiniinin. Solut hajotettiin sonikoimalla ja sentrifugoitiin 100.000 x

g

30 min. Supernatantti inkuboitiin anti-FLAG M2 affmiteettigeeliin (Sigma-Aldrich) ja 2 tuntia, ja sitten pestiin neljä kertaa IP-puskurissa. FLAG-ZYX-täynnä ja-ZYX-C sitoutuneen anti-FLAG M2 geeliä oli heti käytettiin avattavan määrityksessä. Ihmisen ZYX-N kloonattiin pGEX-6P-1 vektorin. Tätä konstruktia käytettiin transformoitaessa BL21 (DE3) pLysS

Escherichia coli

-soluja (Promega, Madison, WI, USA). Solut, jotka ilmentävät GST-fuusioproteiinit kerättiin, suspensoitiin uudelleen lyysipuskuriin (40 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 5 mM EDTA, ja 1 mM PMSF: ää, ja Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet [ ,,,0],Roche, Basel, Sveitsi)], lyysattiin sonikoimalla ja sentrifugoitiin 12000 x

g

30 min. Supernatantti inkuboitiin Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) 2 tuntia ja sitten pestään lyysipuskurilla. Sitoutunut GST-ZYX-N eluoitiin glutationin.

His-merkitty ihmisen täyspitkää ACTN1 ja ACTN4 ilmennettiin Sf9-soluissa käyttäen Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Life Technologies). Yhdistelmä-DNA-proteiinit puhdistettiin käyttämällä Ni-NTA-agaroosi (Qiagen, Venlo, Alankomaat).

Immunofluoresenssimikroskopia

Solut transfektoitiin plasmideilla tai siRNA: t ja uudelleen maljattiin Matrigel-päällystetyt peitinlasit jälkeen 24- 48 h transfektion jälkeen. Solujen annettiin kiinnittyä ja levitä 24 tuntia, ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen läpäiseväksi käyttäen 0,2% Triton X-100 fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), 5 min. Peitinlasit pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten sitä käsiteltiin sekundaarisia vasta-aineita 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Alexa Fluor 568 vuohen anti-kani IgG: tä (H + L) Vasta ja Alexa Fluor 647 vuohen anti-hiiri-lgG (H + L) Vasta-(molemmat Life Technologies) käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. Peitinlasit asennettiin kanssa Permafluor vesiliuosta kiinnitysväliaine (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja havaittujen käyttäen FluoView 1000-D -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani).

Western blotting

Kaikki käytetyt solut western blotting ympättiin muovimaljoihin esipäällystetty Matrigel. Solut lyysattiin Laemmli-näytepuskurissa, sonikoitiin lyhytaikaisesti katkaista DNA: ta, ja keitettiin 95 ° C: ssa 5 min. Western-blottaus tehtiin standardimenetelmillä detektiolla alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri tai kani-IgG-vasta-aineita (Promega). ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) käytettiin määrällisesti kaistaintensiteettejä.

kvantifiointi paikallisessa tarttumisessa ja stressi kuidut

Focal kiinnikkeistä oli esitetty seuraavassa. Solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-VCL-vasta-aineen ja rodamiini–falloidiinia tai anti-PAX ja anti-ZYX vasta-aineita. Kuvat saatiin konfokaalimikroskopiaa ja kynnysarvo kolme kertaa tausta. Focal tarttuvuus numerot kvantitoitiin laskemalla VCL tai PAX laattoja. Määrällisesti fokaalisen adheesion kypsyyttä, PAX- ja ZYX-positiivista plakkia pinta-alayksikköä kohti (DLD-1-solut) tai solua kohti (SW480-solut) laskettiin. Kahdeksan kahdeksankymmentä solut saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta analysoitiin. Suhde ZYX-positiivinen PAX-positiivisia (yhteensä) plakkia laskettiin kunkin solun ja sitten keskiarvo solujen välillä. Määrällisesti fokaalisen adheesion koko, keskimääräinen pinta-ala on PAX-positiivista plakkia laskettiin kunkin solun ja sitten keskiarvo solujen välillä. Kaikki kuvankäsittely tehtiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Stressi kuidun muodostuminen esitetty seuraavassa. Solut transfektoidaan ohjaus, ACTN1, ja ACTN4 siRNA: t, tai solut, jotka ilmentävät GFP, ACTN1-GFP tai ACTN4-GFP värjättiin anti-VCL vasta-aine ja rodamiini-phalloidin ja kuvattiin konfokaalimikroskopialla samoissa hankinta asetuksia. Falloidiinia signaalit kynnysarvo samalla tasolla ja solujen prosenttiosuus muodostavien havaittavissa stressi kuituja kytketty VCL plakkeja ainakin toinen pää oli määrällisesti. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Ainakin 23 solua pisteytettiin kullekin kokeen.

Live-solun kuvantaminen DLD-1-soluissa ja vaihtuvuus analyysi

DLD-1 transfektoitujen solujen GFP-VCL ja mCherry, ACTN1-mCherry, tai ACTN4-mCherry valittiin uudelleen päällystetty Matrigelillä-pinnoitettu, 35 mm lasi-bottom astiat (Iwaki, Tokio, Japani) 24 h transfektion jälkeen. Noin 16 tunnin kuluttua uudelleen pinnoitus, solut havaittiin yli 2 h yhteensä sisäisen heijastuksen fluoresenssi (TIRF) mikroskopialla (Olympus). Ennen keräämistä kuvien, väliaine korvattiin CO

2-riippumatonta väliaineessa (Life Technologies), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 4 mM L-glutamiinia. Kuvat otettiin yhden kehyksen minuutin välein 120 minuutin ajan. Kuvioitua kiinnikkeistä sopivat kriteerit, jotka he olivat paikallistettu ulkoneva lamellipodioihin. Sekvenssi kymographs saatiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Viiveen muutosta fluoresenssin voimakkuus GFP-VCL piirrettiin käyttämällä Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA), ja määrien fokaalisen adheesion kokoonpano, vakautta, ja purkaminen määritettiin aikaisemmin kuvatulla [28]. Nämä mittaukset tehtiin 2-10 kiinnikkeistä solua kohti 8-10 solusta jokaista kunnossa.

Matrigel invaasiomääritys

invaasiomääritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36], jossa on jonkin verran muutoksia. DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, ja DLD-1-ACTN4-GFP-soluja (2,0 x 10

5-solut seerumivapaassa DMEM) ympättiin ylempään osastoon BD BioCoat Matrigel Invasion jaosto (BD Biosciences) ja inkuboitiin 10% FBS: ää DMEM pohjalle hyvin ja seerumivapaassa väliaineessa yläkammiossa. Jälkeen 26 h, solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä PBS: ssä 30 minuutin ajan. Solut pestiin PBS: llä ja tunkeutuu GFP-positiiviset solut alapinnalle suodattimen kalvon havaittiin konfokaalimikroskopialla. Solut kuuden satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs- päällekkäistä kammiot laskettiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. SW480-solut transfektoitiin GFP tai ACTN1-GFP plasmidit. 24 tunnin kuluttua solut (5,0 x 10

5 solua) ympättiin ylä- kammioon ja inkuboitiin 10% FBS RPMI 1640 pohjassa hyvin ja seerumivapaassa väliaineessa yläkammiossa.

Pull down-määritys

GST-ZYX-N sitoutuneet proteiinit Glutathione Sepharose 4B inkuboitiin puhdistettua His-ACTN1 tai His-ACTN4 proteiineja sitomispuskuriin (lyysipuskuria 1,0% naudan seerumin albumiinia [BSA]) 2 h, pestiin kolme kertaa sitomispuskurilla, ja sitoutuneen ACTNs analysoitiin SDS-PAGE: lla. FLAG-ZYX-koko ja FLAG-ZYX-C-proteiinien sitoutuneen anti-FLAG M2 affmiteettigeeliin sekoitettiin puhdistettua His-ACTN1 tai His-ACTN4, inkuboitiin 2 h IP-puskurissa, ja sitoutuneen ACTNs analysoitiin. Määrät aktiivista RhoA määrä määritettiin avattavassa määrityksiä GST-Rhotekin-RBD, kuten aiemmin on kuvattu [36]. Signaali-intensiteetit mitattiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Tilastollinen analyysi

monivertailuja,

P

arvot syntyvät yksisuuntaisella varianssianalyysillä (yksisuuntainen ANOVA) käyttäen Dunnettin testi monivertailuja. Kahden ryhmän analyysien Opiskelijan

t

-testissä käytettiin. Analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 6 ohjelmisto (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).

Tulokset

ACTN1 ja ACTN4 ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa

ACTN4 on raportoitu parantaa solun liikkuvuus ja edistää imusolmuke etäpesäke kolorektaalisyövän [13]. Kuitenkin, ei ole selvää, ovatko nämä vaikutukset ovat syynä ACTN4 isoformi ominaisia ​​toimintoja vai ACTN1 klassisen isoformi pystyy aiheuttamaan syöpää fenotyyppejä kuten ACTN4 ei. Ensin määrällisesti suhteellisen ekspressiotasot endogeenisen ACTN1 ja ACTN4 proteiineja useissa paksusuolen syöpäsolulinjoissa käyttäen puhdistettua yhdistelmä-DNA-proteiinien, kuten ulkoisen valvonnan (kuvio 1A). ACTN4 ekspressio oli korkeampi kuin ACTN1 kaikissa soluissa, paitsi DLD-1-soluja. DLD-1 solut ilmensivät ACTN4 alhaisella, mutta samanlaisia, taso kuin ACTN1 (kuvio 1 B). Siten selventämiseksi ero funktio ACTN1 ja ACTN4, käytimme DLD-1-soluissa, koska vaikutukset kohdunulkoisen ilmentymisen tai vaiennettu ACTNs oli havaittavissa.

(A) Western blot-analyysi ACTN1, ACTN4, ja aktiini ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa. ACTN1 ja ACTN4 proteiinin tasot mitattiin verrattuna yhdistelmä-DNA-His-tag ACTN1 ja ACTN4 proteiineja, joita käytetään ulkoisia standardeja. Aktiini käytettiin lastaus ohjaus ja puhdistetun kanin luurankolihaksen aktiini käytettiin ulkoisena standardina. (B) Band intensiteetit kvantitoitiin, ja moolisuhteet ACTNs laskettiin ja edustettuina mol-% vastaan ​​aktiini. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Differential roolit ACTN1 ja ACTN4 muodostumiseen paikallisessa tarttumisessa

ACTN1 ja ACTN4 ilmentymisen DLD-1-soluja on vaiennettu siRNA (kuvio 2A). ACTN1 Knockdown vähensi stressiä kuituja ja paikallisia tarttumista. Kuitenkin ACTN4 knockdown yllättäen lisääntynyt stressi kuituja ja paikallisia tarttumista (kuvio 2B-2D). Nämä tulokset osoittavat, että sekä ACTN1 ja ACTN4 ovat mukana muodostumista stressiä kuitujen ja paikallisia tarttumista DLD-1-soluissa, mutta selvästi vastakkaisiin tavalla: ACTN1 parantaa sitä, kun taas ACTN4 estää sen. Vastakkaisia ​​rooleja ACTNs myös noudatettava ektooppinen ilmentyminen ACTN1-GFP ja ACTN4-GFP DLD-1-soluissa (kuvio 2E). ACTN4 yli-ilmentyminen tukahdutti muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista (kuvio 2F-2H). Toisaalta, ACTN1 yli-ilmentyminen indusoi kehittymistä rasitukseen liittyviä säikeitä ja paikallisia tarttumista.

(A) ACTN1 ja ACTN4 ekspressio vaiennetaan siGENOME SMARTpool siRNA DLD-1-soluissa. Tehokas Knockdown vahvistettiin western blottauksella käyttämällä ACTN isoformi vasta-aineita. Nuolenpää osoittaa endogeenisen ACTN1. Tähti osoittaa epäspesifisen crossreacting band. (B) Soluja transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA: t värjättiin vinkuliinin (VCL) ja F-aktiini ja niitä tarkkailtiin konfokaalimikroskopialla. Nuolet ja arrowheads osoittavat paikallisia tarttumista ja stressi kuituja, vastaavasti. Asteikko bar = 10 um. (C) prosenttiosuudet siRNA käsiteltyjä soluja muodostavat rasitukseen liittyviä säikeitä piirretään. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01. (D) Keskipiste tarttuvuus määrä solua kohden siRNA-käsiteltyjen solut piirretään. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 71 solujen valvontaa, 73 solua si-ACTN1 soluja, ja 55 solua si-ACTN4 soluja. *

P

0,05. (E) Ohimenevä ilmentyminen ACTN1-GFP: n ja ACTN4-GFP DLD-1-soluissa varmistettiin western-blottauksella käyttämällä ACTN isoformi-spesifisiä vasta-aineita. (F) GFP, ACTN1-GFP, ja ACTN4-GFP ilmennettiin DLD-1-solut, jotka sitten värjättiin VCL ja F-aktiini ja noudatettava konfokaalimikroskopialla. Nuolet ja arrowheads osoittavat paikallisia tarttumista ja stressi kuituja, vastaavasti. Asteikko bar = 10 um. (G) Prosenttiosuudet transfektoitujen solujen muodostavat rasitukseen liittyviä säikeitä piirretään. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tfx osoittaa transfektion. **

P

0,01. (H) Keskipiste tarttuvuus määrä solua kohden ilmentävien solujen GFP, ACTN1-GFP, ja ACTN4-GFP piirrettiin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 130-solujen GFP, 52 solua ACTN1-GFP, ja 73 solua ACTN4-GFP. *

P

0.05.

Major molekyylejä, jotka välittävät tietoja tarttuvuus muistolaatat aktiini stressiä kuituihin kuuluvat myosiinin II, FAK, SRC-perheen kinaaseja, ja Rho perhe GTPaasit. Siten tutkimme proteiineja, jotka osallistuvat muodostumiseen paikallisessa tarttumisessa western-blottauksella soluissa, joissa ACTN ilmentyminen oli vaiennetaan siRNA (S1 Kuva). Fosforylaation myosiinin sääntelyn kevytketjujen (MRLC) on treoniini 18 ja seriini 19, ja tyrosiinifosforylaatio FAK ja SRC ei ole muutettu. RhoA aktiivisuus väheni nimenomaan ACTN1 siRNA käsiteltyjä soluja. Vaikka lasku myosiinin II toimintaa ACTN1 tai ACTN4 pudotus soluihin on aiemmin raportoitu [14,17,37], emme voineet havaita merkittäviä muutoksia MRLC fosforylaatioon. Lisäksi lasku havaittiin RhoA aktiivisuus oli vaatimatonta (alle 40% vähennys ACTN1 siRNA). Nämä muutokset eivät korreloineet fenotyyppisiä muutoksia muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista havaittiin ACTN pudotus soluissa kuvassa 2B-2D ja 2F-2H. Lisäksi toiminnan säätelijöitä orastavan tarttuvuus muodostumista eli FAK ja SRC, oli samanlainen ohjaus ja ACTN1 /4 siRNA-käsitellyissä soluissa, mikä viittaa siihen, että korjauksilla stressisäikeiden muodostumisen ja fokaalisen adheesion numerot vastauksena manipuloinnin ACTN ilmaisun voisi johtua ero toimintaan myöhään toimivien molekyylien vaiheittaisen kypsymisen paikallisessa tarttumisessa kuten säätelijöinä keskipiste monimutkaisten vakauden tai säätelijöitä keskihakuisen fokaalisen adheesion kokoonpano.

ACTN4 parantaa fokaalisen adheesion vaihtuvuus

Seuraavaksi koekspressoi ACTN1-mCherry tai ACTN4-mCherry GFP-VCL ja havaitut VCL time-lapse kuvia TIRF mikroskoopilla jäljittää kokoonpanoa ja purkamista paikallisia tarttumista. Kuten kuviossa 3A, S1 Elokuva, S2 elokuva, ja S3 elokuva, kiertonopeus paikallisessa tarttumisessa in ACTN4 ilmentävien solujen ilmestyi nopeammin kuin kontrolli tai ACTN1 ilmentäviä soluja. Aika, joka tarvitaan yhden tarttumista purettava oli 34 min keskimäärin ohjaus mCherry ilmentäviä soluja, mikä osoittaa, että tartunta rajattujen GFP-VCL signaali oletetaan saavuttaa kypsä fokaalisen adheesion. Elinikä tällaisen paikallisessa tarttumisessa voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen; kokoonpano, vakautta, ja purkaminen (kuvio 3A). Mittasimme aika, joka tarvitaan jokaisessa vaiheessa (kuvio 3B-3D). In ACTN4-ilmentäviä soluja, tarvittava aika vakauttamista ja purkaminen oli lyhyempi kuin kontrolli tai ACTN1-ilmentäviä soluja. Nämä tulokset osoittavat, että ACTN4-ilmentävien solujen elinikää paikallisessa tarttumisessa lyhenee johtuen nopeutetun purkaminen nopeudella, mikä viittaa siihen, että paikallisessa tarttumisessa on destabiloitiin isoformi-spesifisellä tavalla, jonka ACTN4 yli-ilmentyminen.

(A) mCherry , ACTN1-mCherry tai ACTN4-mCherry olivat koekspressoitu GFP-VCL ja VCL Viivästys kuva havaittiin yhteensä sisäisen heijastuksen fluoresenssi (TIRF) mikroskopia jäljittää kokoonpanoa ja purkamista paikallisia tarttumista. Ylempi paneeli osoittaa edustaja kymographs GFP-VCL fluoresenssi pitkin 5-pm pitkät linjat vedetään alueilla laajentamalla lamellipodioihin. Fluoresenssin intensiteetti ylemmässä paneelissa piirrettiin aikaa vastaan ​​sekä esitetty kuvaaja pohjaan vastaavien kymographs. Liikevaihto vaiheet fokaalisen adheesion kokoonpano, vakautta, ja purkaminen on esitetty punaisina katkoviivat mCherry vektori kuvaajan. (B-D) Kesto Kunkin liikevaihdon vaiheen esimerkkinä vasemmalla kaavion A analysoitiin myös määrällisesti 51 kiinnikkeistä varten mCherry ilmentäviä soluja, 57 kiinnikkeistä varten ACTN1-mCherry ilmentävien solujen, ja 64 kiinnikkeistä varten ACTN4-mCherry ilmentävien solujen . Tiedot esitetään laatikko ja viiksi tontteja laatikoita edustavien kahdeskymmenesviides-seitsemäskymmenesviides prosenttipiste valikoima ja viikset edustavat kymmenes-yhdeksäskymmenes persentiili alue. N. S., ei merkittävää, **

P

0.01.

ZYX värväyksen polttoväli komplekseja heikentävät ACTN4 ilmentävien solujen

Koska paikallisessa tarttumisessa ovat horjuttaa ACTN4 ilmentyminen DLD-1-soluissa, me arveltu, että ACTN4 estää proteiinien toimintaa mukana muutosta polttovälin komplekseja keskihakuisia polttovälin kiinnikkeistä. Erityisesti olemme tutkineet lokalisointia ZYX, joka raportoidaan paikallistamiseksi spesifisesti kypsillä keskihakuista paikallisessa tarttumisessa [30]. Käytimme PAX yleisenä markkeri paikallisessa tarttumisessa koko kypsymistä. Kuten on esitetty ylärivillä kuvion 4A, GFP-proteiinia ekspressoivien ohjaus DLD-1-solut muodostivat PAX-positiivista plakkia, että lamelli- solun kehällä. Nämä plakit oletetaan vastaavan sekä polttovälin komplekseja ja keskihakuisia paikallisia tarttumista. Näistä laattoja, kypsä keskihakuisia paikallisia tarttumista voidaan erottaa perustuen ZYX rinnakkaispaikantumisen. Keskimääräinen määrä PAX- ja ZYX-positiivisia plakkeja kontrolli solut 0,14 ja 0,073 per neliö mikrometriä, vastaavasti (kuvio 4B ja 4C). Näin ollen noin puolet paikallisessa tarttumisessa olivat ZYX-positiivisia ja näin ollen pidetään kypsinä hallinnassa soluissa. ACTN1-GFP- ja ACTN4-GFP-proteiinia ekspressoivien solujen muodostettu yhtä paljon PAX plakkeja, kuten havaittiin kontrollisoluissa, mikä viittaa siihen, että ACTNs on vain vähän vaikutusta muodostumista polttoväli komplekseja (kuvio 4B). Sitä vastoin sekä määrä ja suhde ZYX-positiivisten plakkien ACTN4 ilmentävien solujen merkittävästi vähennetty 0,049 plakkia /um

2 ja 40%, vastaavasti, verrattuna valvontaa ja ACTN1-ilmentäviä soluja (kuvio 4C ja 4D). Lisäksi, hallitseva muoto polttoväli kiinnikkeistä ACTN4 ilmentävien solujen muutettiin pyöreä, dot-rakenne toisin kuin pitkänomaisen keskihakuisia kiinnikkeistä, jotka havaittiin usein ohjaus- ja ACTN1-ilmentävien solujen (katso nuolet kuviossa 4A, alhaalta rivi). Muodon muuttumisesta näkyi koko PAX-positiivista plakkia, joka tuli pienempi ACTN4 ilmentäviä soluja (kuvio 4E). Nämä tulokset osoittavat, että polttoväli kompleksit eivät pääse kypsynyt keskihakuisia polttoväli kiinnikkeistä ACTN4 ilmentäviä soluja. Lisäksi, ACTN4 erityisesti estää asianmukaisen rekrytointi ZYX keskeiselle komplekseja, mikä voi selittää fenotyypin erot ACTN1- ja ACTN4-ilmentäviä soluja.

(A) GFP, ACTN1-GFP, ja ACTN4-GFP ( näkyy vihreänä) ilmennettiin DLD-1-solut, jotka värjättiin PAX (sininen) ja ZYX (punainen) proteiineja ja kuvattiin alle konfokaalisella fluoresenssimikroskoopilla. Boxed alueet vasemmassa reunassa osoittavat reuna-lamellit käytetään PAX ja ZYX plakin kvantifiointiin. Sarja laajentuneen kuvia boxed alueet näkyvät oikealla. Nuolet ja arrowheads osoittavat PAX-positiivisia ja PAX /ZYX-double-positiivista plakkia, vastaavasti. Mittakaava = 30 pm. (B-C) numerot PAX ja ZYX plakkien pinta-alayksikköä kohti reuna lamellien laskettiin GFP-, ACTN1- tai ACTN4-ilmentäviä soluja. Kahdeksan kuuteentoista solut analysoitiin ryhmää kohti. Virhepylväät viittaavat standardipoikkeamat solujen välillä. N. S., ei merkittävää, *

P

0,05, **

P

0,01. (D) suhde ZYX-positiivinen PAX-positiivista plakkia, eli yhteensä plakin kiinnikkeistä. Virhepylväät viittaavat standardipoikkeamat solujen välillä. N. S., ei merkittävää, **

P

0,01. (E) PAX plakin koko GFP-, ACTN1- tai ACTN4 ilmentäviä soluja mitattiin vähintään 171 kiinnikkeistä 8-11 solua per ryhmä. Virhepylväät viittaavat standardipoikkeamat solujen välillä. N. S., ei merkittävää, *

P

0,05, **

P

0,05.