Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cabozantinib on estäjä useiden reseptorityrosiinikinaaseissa lukien MET ja VEGFR2. Vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa edennyt eturauhassyöpä (PCA), cabozantinib hoito paransi luun skannaa 68% arvioitavissa potilaista. Tutkimuksemme tavoitteena oli määrittää ilmaus cabozantinib tavoitteiden aikana PCa etenemistä ja arvioida sen tehosta hormoni-herkkä ja kastraatio kestävä PCa prekliinisissä malleissa samalla rajata sen vaikutukset kasvaimen ja luun. Käyttämällä immunohistokemia ja kudossiruina sisältävän normaalin eturauhasen, ensisijainen PCA ja pehmytkudoksen ja luun etäpesäkkeitä, meidän tiedot osoittavat, että tasot MET, P-MET, ja VEGFR2 lisääntyvät aikana PCa etenemistä. Tuloksemme osoittavat myös, että ilmaus cabozantinib tavoitteet ovat erityisen selviä luun etäpesäkkeitä. Arvioimaan cabozantinib Tehoa PCa kasvua luussa ympäristössä ja pehmytkudosten käytimme androgen-herkkien LuCaP 23,1 ja kastraatio kestävä C4-2B PCa kasvaimia.

In vivo

, cabozantinib esti kasvua PCA luun sekä kasvua ihonalaisen kasvaimia. Lisäksi cabozantinib hoito heikennetty luun vastaus kasvain ja lisännyt normaalin luun tilavuus. Yhteenvetona ekspressiokuviota cabozantinib tavoitteiden ensisijainen ja kastraatio kestävä metastasoitunut PCa, ja sen teho kahta eri mallia Eturauhassyövän viittaavat siihen, että tämä aine on hyvät mahdollisuudet tehokkaaseen hoitoon Eturauhassyövän eri vaiheissa taudin.

Citation: Nguyen HM, Ruppender N, Zhang X, Brown LG, Gross TS, Morrissey C, et al. (2013) Cabozantinib inhiboi androgeenin Sensitive ja kastraatio hylkivät Eturauhassyöpä ja vaikuttaa luun. PLoS ONE 8 (10): e78881. doi: 10,1371 /journal.pone.0078881

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2013; Hyväksytty: 16 syyskuu 2013; Julkaistu: 25 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Nguyen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimukset tässä käsikirjoitus oli osittain rahoittama Exelixis Inc. Kaksi yhteistyössä kirjoittajien (DTA ja FS) ovat työntekijöitä Exelixis. He olivat mukana tutkimuksen suunnittelu, tietojen analyysit ja käsikirjoitus valmisteilla.

Kilpailevat edut: Tutkimus rahoitettiin osittain Exelixis Inc., työnantaja Frauke Schimmoller ja Dana T. Aftab. Eva Corey on saanut tutkimusrahoitusta Exelixis, Inc., kautta Sponsored Research kanssa sopimuksen University of Washington. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Etäpesäkkeitä edelleen merkittävä syy sairastuvuuteen ja kuolleisuus miehillä kärsivät pitkälle edenneen eturauhassyövän (PCA). Huolimatta olemassa olevat aineet, jotka ovat tehokkaita edenneisiin PCA selviytymisen jälkeen kehitys kastraation resistenssin edelleen hyvin lyhyt. Siksi romaani, tehokkaita hoitoja vastaan ​​metastaattisen ja kastraatio-resistenttejä tarvitaan pikaisesti.

Cabozantinib on voimakas estäjä reseptorityrosiinikinaaseissa lukien MET ja VEGF-reseptori 2 (VEGFR2). Muut tavoitteet estävät cabozantinib kuuluvat AXL, FLT-3, KIT, ja RET [1,2]. Vaikutukset cabozantinib on arvioitu prekliinisissä ympäristössä useita syöpiä, mukaan lukien gliooma, rinta-, keuhko-, ja haimasyöpä. Näissä tutkimuksissa cabozantinib vähensi kasvainten invasiivisuus, proliferaation ja angiogeneesin ja lisäävät apoptoosia [1,2]. Prekliiniset tutkimukset mallissa haiman neuroendocrine syöpä saatiin jonkinlainen näkemys mekanismeihin cabozantinib toiminta, mikä viittaa toiminnallisen tasapainon MET ja VEGFR2 kautta osallistumisen HF1A [2-5]. Kuitenkin mekanismit, joihin liittyy muita tavoitteita cabozantinib, kuten RET, tärkeä tavoite medullaarinen kilpirauhassyövän [6,7], ja Axl tai KIT, ei ole laajasti tutkittu tai raportoitu. Ottaen huomioon rooleja näiden kinaasien kasvaindiagnostiikassa, cabozantinib esto tai kaikki nämä tavoitteet voivat olla hyödyllisiä hoidettaessa PCa hyökkää kasvainsolujen useita rintamalla. Tämän tyyppinen hyökkäys saattaa kohdistaa tehokkaasti heterogeeninen solupopulaatioiden, kuten Eturauhassyövän.

Cabozantinib äskettäin hyväksynyt FDA kliinisen hoitoon progressiivinen, metastaattisen medullaarinen kilpirauhassyöpä. Tämä hyväksyntä seurasi varhainen havaintoja cabozantinib tehoaa tämän taudin alkuvaiheessa I kliinisen tutkimuksen [5]. Cabozantinib on myös osoittanut rohkaisevia tuloksia metastasoituneen, kastraatio kestävä PCa (CRPC) faasin II adaptiivisen satunnaistettu lopettamisen tutkimuksessa. Huomattavia parannuksia luuston kuvauksissa havaittiin 68% arvioitavissa potilaista. Lisäksi 72% esillä heikentämiseen pehmytkudosvammoihin, ja 67% koki parannuksen Luukipua [3]. On kuitenkin tärkeää huomata, että 12 viikkoa tavoitteena vaste oli 5%, ja 75% potilaista osoitti stabiili tauti [3]. Kuitenkin mikään muu aine on osoittanut tämän tähdistössä vaikutusten miehillä CRPC, mikä osoittaa mahdollisesti ainutlaatuinen vaikutusmekanismi varten cabozantinib tässä sairaudessa ympäristössä.

MET ja sen ligandin, hepatosyyttikasvutekijän (HGF), on liitetty etenemistä moniin syöpiin. MET signalointi edistää solujen eloonjäämistä, lisääntymistä, invaasiota, etäpesäke, ja angiogeneesi

in vivo

ja

in vitro

[8]. PCA, MET ilmentyy ensisijaisesti PCa, ja korkeamman ilmentymisen havaitaan PCa etäpesäkkeitä luussa [9-11]. Lisäksi MET ilmentyminen liittyi PCa luokalla Gleason pisteet, ja huono ennuste [9], ja kohonneet plasmatasot HGF havaittiin olevan huono prognostinen indikaattori PCA potilailla [12]. Lisäksi prekliiniset tulokset ovat osoittaneet välistä ylikuulumista androgeenireseptorin (AR) ja MET signalointi, jossa AR signalointi saadaan aikaan välittömiä esto MET ilmaisun [13,14]. Siksi säätelyä MET signalointi voi liittyä etenemiseen PCa on kastraation vastarintaa. Näin ollen, useita uusia MET-inhibiittoreita kehitetään vastaan ​​erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien PCa [15]. Kuitenkin tarkistaa nykyisen kirjallisuuden osoitti vaihtelevia tuloksia MET eston PCA. MET-inhibiittorit PHA-665752 ja PF2341066 esti kasvua Eturauhassyövän soluja [16], ja knockdovvn MET ilmentymisen adenoviruksen esti PCa kasvua ja imusolmukkeesta (LN) etäpesäkkeitä [17]. Toisin BMS-777607, toinen MET estäjä, ei vaikuttanut merkitsevästi lisääntymistä PCa soluissa, mutta esti niiden invasiivisuus ja muuttoliike [18]. Klinikalla, useita aineita, jotka valikoivasti tavoite MET eivät ole osoittaneet aineellisen kliinistä hyötyä potilaille, joilla CRPC [19,20].

VEGFR2 soittaa myös tärkeä rooli useita syöpiä, kuten PCa. VEGFR signalointi on keskeinen angiogeneesin säätelyyn ja on lisääntynyt metastaattinen CRPC vaurioiden [21]. Lisäksi plasman ja virtsan VEGF liittyy huonoon ennusteeseen PCA [22,23]. Siksi VEGF /VEGFR2 signaloinnin on ollut tavoite uuden syövän hoitomuotoja. Estämällä VEGF-reitin laski kasvaimen kasvua ja verisuonistossa mallissa haiman saarekesolujen syöpään, vaikka tämä vaikutus ei jatkunut ja kasvaimet lopulta toistui [24]. Kliinisessä tutkimuksessa bevasitsumabia, rekombinantti anti-VEGF monoklonaalinen vasta-aine, yhdistettynä kemoterapiaan oli kohonnut ilman taudin etenemistä verrattuna lumelääkkeeseen ja solunsalpaajahoitoa. Kuitenkin tämä käsittely yhdistelmä ei merkittävästi parantaa yleistä eloonjäämistä verrattuna kontrolliryhmään [25]. Rajallinen vastauksista ja kehittynyt resistenssi VEGF-hoidon viittaavat siihen, että vaikka angiogeneesi läpi VEGF on tärkeä kohde syövän hoitomuotoja, kehittäminen onnistunut uusien lääkkeiden vaatii syvempää ymmärrystä tekijöistä, jotka helpottavat paeta antiangiogeenisiä hoidon ja mahdollistaa edelleen kasvain selviytymisen ja verisuonittumisen. Tässä mielessä, lisäykset MET aktiivisuutta on havaittu vastauksena antiangiogeenisen hoidon ja hypoksia [26,27]. Antoa jatketaan VEGF-estäjä sunitinibia kasvoi HGF ilmentymistä hiiren kasvain malli, ja sunitinibi oli tehoton, kun HGF oli samanaikaisesti [28,29]. Lisäksi VEGF: n on osoitettu suoraan aktivoida MET signaloinnin kautta neuropiliini-1 PCa riippumaton HGF [11]. Nämä tulokset osoittavat synergistisen toiminnan välillä VEGF ja MET signalointireitteihin ja viittaavat siihen, että hoito kohteena sekä näiden reittien, kuten cabozantinib, saattaa olla erittäin merkityksellinen kehittyneitä Eturauhassyövän.

haluttiin selvittää ilmentymisen tasojen cabozantinib ensisijainen tavoitteina vaativissa PCa ja arvioida sen vaikutuksia ihonalainen PCa kasvaimia ja ne kasvavat luun, erityisesti mitä tulee kasvaintaakkaa ja luun vaihtuvuus. Tuloksemme osoittavat, että tavoitteet cabozantinib ilmaistaan ​​PCa etäpesäkkeitä ja että cabozantinib kasvaimen kasvu estyy luun ja pehmytkudoksen ja sillä myönteisiä vaikutuksia luun sekä ehjä ja kastroitu uroshiirillä.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki ihmisen kudokset saatiin potilailta, jotka ovat allekirjoittaneet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja kun University of Washington IRB hyväksynnän. Kaikki eläinkokeet on kuvattu tässä käsikirjoituksen hyväksyttiin ja suoritetaan noudattaen University of Washington Institutional Animal Care ja käyttää komitean ja NIH ohjeita.

immunohistokemia (IHC) B

kudossiruina (TMA) käytettiin määrittämään MET, P-MET, ja VEGFR2 immunoreaktiivisuus normaalissa eturauhasessa (NP) ja PCa: 1) UWTMA48: NP ja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (60 kudokset, kaksi ydintä kohti kudosta) ja ensisijaisen PCa (61 kudokset, kaksi ydintä kohti kudos); 2) UWTMA52: Hyväksytty NP ja PCa toistuvaa ja kertaluonteisten potilasta (63 toistuvat ja 64 kertaluonteisia potilaita, kaksi ydintä jokaista NP ja PCA); 3) UWTMA21: PCa etäpesäkkeiden 44 potilasta (40 luumetastaaseja; 19 maksametastaaseista; 27 LN metastaaseja ja 7 muut pehmytkudoksen etäpesäkkeitä, kaksi ydintä kohti kudosta); ja 4) UWTMA48: 24 LuCaP PCa ksenograftimalleja koskemattomista, kastroitu ja dosetakseli-käsiteltyjen eläinten (kolme ydintä kohti kudosta). IHC suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä antigeenin hakuun [30]. Hiiren monoklonaalinen anti-MET-vasta-ainetta (lahja tri Knudsen [31]), kanin monoklonaalista anti-P-MET-vasta-ainetta (Cell Signaling, Boston, MA), ja kaniinin polyklonaalista anti-VEGFR2-vasta-ainetta (Cell Signaling, 55B11, Boston, MA) käytettiin. Erityiset immunovärjäyksellä arvioitiin patologi (XZ) käyttäen kolmea pisteen asteikolla: 2 = voimakas, 1 = heikko, ja 0 = poissa, ja solujen prosenttiosuus kussakin intensiteetti arvioitiin.

Tilastollinen analyysi IHC

Kunkin ytimen kussakin TMA, värjäys-indeksi n painotettua yhdistelmää 3-piste värjäytymisvoimakkuuksia, painoja antaman prosenttiosuus kudosvärjäyksellä at kukin intensiteetti; katso Menetelmät S1. Laskennallinen värjäytyminen indeksi on arvo välillä [0, 1], jossa 1 tarkoittaa 100% värjättyjen solujen intensiivisesti. Linear sekamalleja sovitettiin värjäytyminen indeksin ehtona on etäpesäkkeitä sijainti satunnaisvaikutusten kunkin potilaan tai eläimen. Arvioinnin perusteella oletuksista ja datan muuntaminen tarvittaessa sovitetun malleja käytettiin määrällisesti eroja immunoreaktiivisuus välillä metastaattisen paikoissa ja testata tilastollista merkittävyyttä. Graafinen profiilit havainnollistaa jakaumia värjäyksen intensiteetin rakennettiin laskemalla yksinkertaisesti keskiarvo kaikkien ei-puuttuvat osat kussakin värjäystä luokassa. Assosiaatioita ilmaus proteiinien ja kliinisten parametreja arvioitiin käyttäen lineaarista regressiomallit, ja yhdistyksille aika PSA toistumisen arvioitiin käyttämällä haurautta (satunnaisvaikutusten Coxin suhteellisten riskien) malleja.

Solulinjat

C4-2B-soluja (Urocor, Inc., Oklahoma City, OK), ja MC3T3-soluja (ATCC, Manassas, VA) pidettiin tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa. C4-2B-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja MC3T3-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää. LuCaP 23,1 PCa ksenografti ylläpidettiin ja sarjoittain pasasoitiin CB17 SCID-hiirissä [32].

Eläinkokeet

Tutkimus 1: sääriluunsisäinen LuCaP 23,1, 60 mg /kg cabozantinib.

Ehjä kuuden viikon ikäinen uros beige SCID-hiirten (Charles River, Wilmington, MA) injektoitiin LuCaP 23,1 yksisoluiset jousitus oikeaan proksimaaliseen sääriluut julkaisemassa aiemmin [33]. 200000 LuCaP 23,1 solua injektoitiin 20 ui RPMI 1640 oikeaan proksimaalisen sääriluun. Eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään (n = 5) tai cabozantinib ryhmä (n = 5), kun seerumin PSA-tasot saavutetaan havaittavissa (0,6 ng /ml, AxSYM Yhteensä PSA-määritys, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Cabozantinib liuotettiin H

2O ja tapahtui suun kautta 60 mg /kg, viisi kertaa viikossa kuuden viikon ajan. Ohjaus eläimet saivat letkuruokinnalla H

2O vain. Seerumin PSA-pitoisuudet ja kehon painot mitattiin viikoittain. Lopettamisen jälkeen tumored sääriluut ja normaali kontralateraalista sääriluut kerätty ja käsitelty analyysejä varten.

Tutkimus 2: sääriluunsisäinen C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib.

Tutkimus suunnittelu oli sama kuin tutkimus 1, paitsi että eläimet kastroitiin ja C4-2B solut injektoitiin sääriluut kaksi viikkoa kastraation [34]. C4-2B solut kerättiin kun ~ 50% konfluentteja, ja 200000 solua injektoitiin kussakin sääriluu. Eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään (n = 11) tai cabozantinib ryhmä (n = 10).

Tutkimus 3: Ihon alle C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib.

C4-2B (2×10

6, 1: 1 matrigeelin) solua injektoitiin ihonalaisesti kuohittu koirashiirillä . Eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään (n = 8) tai cabozantinib ryhmä (n = 12), kun tuumorin tilavuus oli 100 mm

3. 60 mg /kg cabozantinib annettiin suun kautta letkulla viisi kertaa viikossa yhdeksän viikon ajan. Eläimet lopetettiin kun kasvaimet saavuttivat 1000 mm

3 tai kun eläimet olivat vaarassa.

Tutkimus 4: sääriluunsisäinen LuCaP 23,1, 30 mg /kg cabozantinib.

Tutkimus suunnittelu oli sama kuin tutkimuksessa 1, paitsi että pienempi annos cabozantinib (30 mg /kg) oli käytetyt ja hoito kesti korkeintaan 15 viikkoa. Eläimet satunnaistettiin kontrolliryhmään (n = 10) tai cabozantinib ryhmä (n = 10).

Micro-CT

Scanco vivaCT 40 korkean resoluution μCT skanneria käytettiin analysoimaan 0,85 mm: n osa ulottuu proksimaalisen sääriluun metaphysis of tumored ja ei-tumored contralateral sääriluut (LuCaP 23.1: n = 3-5; C4-2B: n = 5-10 ryhmää kohti). Luun tilavuus (BV), kudoksen tilavuus (TV), trabekulaarisen erotus (Tb.Sp), trabekkelipaksuus (Tb.Th), ja trabekulaarisen numero (Tb.N) määritettiin ja BV /TV laskettiin.

tilastollisia analyysejä eläinkokeissa

Longitudinal kasvaimen mittauksen ja PSA seerumin olivat log-transformoitiin ja mallinnettu lineaarisia sekamalleja ehtona hoitoryhmässä satunnaisella vaikutuksia jokaiselle eläimelle; katso Menetelmät S1. Sen jälkeen standardi diagnostinen arviointi malli sovi, me simuloidaan 1000 aineistoja kustakin fi TTED malli laskettuna empiirinen keskiarvo ja 95%: n luotettavuusrajat kunakin ajankohtana, ja uudelleen fi t malleja näihin aineistoihin. Lopulliset tulokset ovat keinot ja 95% con fi kirjeenvaihtoon rajoja 1000 bootstrap rinnakkaista. Sen jälkeen vakiotarkistuksia of mallioletuksiin, 2-puolinen t-testejä sovellettiin testata eroja seerumin PSA, kasvaimen tilavuus, paino, ja IHC värjäys indeksitasolla. Tilastollista merkitsevyyttä erot luun parametrit määritettiin käyttäen 2-puolinen t-testi.

RT-PCR-analyysi

RNA: n uutto, cDNA-synteesi ja qPCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],35]. Alukkeet ja hehkutus ehdot on esitetty taulukossa S1. RNA uutettiin ihonalaisen kasvaimia. Suhteellinen ilmentyminen tavoite viestien määritettiin perustuen nelinkertainen laimentamisen calibrator cDNA. Käytimme LNCaP cDNA RET; PC-3 cDNA MET, Axl ja KIT, ja LuCaP 23,1 cDNA hiiren VEGFR2 (VEGFR2m). Merkinannoista normalisoitiin RPL13a tasolle.

In vitro kokeissa

Vaikutukset cabozantinib jakautumiseen, mineralisaatio, alkalinen fosfataasi (ALP) aktiivisuus, ja AR transkriptionaalisen aktiivisuuden arvioitiin

in vitro

kuten aiemmin on kuvattu [36]; katso Menetelmät S1.

Tulokset

Tasot MET, P-MET ja VEGFR2 aikana PCa etenemisen

Vastatakseen onko cabozantinib tavoitteet ilmaistaan ​​PCA arvioimme tasot MET, P-MET, ja VEGFR2 kudoksissa edustavat normaalissa eturauhasessa ja eri vaiheissa PCa etenemistä.

NP vs ensisijainen PCa.

MET ja P-MET: Tuloksemme osoittivat, että MET on läsnä suurina määrinä NP ja ensisijainen PCa soluja, mutta siellä oli vain marginaalinen todisteita eroja näiden kudosten (keskiarvo värjäys indeksi NP: 0,96, 95% CI 0,93-0,98; PCa: 0,92, 95% CI 0,88-0,96; p = 0,06); katso kuva S1. Huolimatta korkea MET NP ja PCA minimaalinen immunologista P-MET havaittiin näissä kudoksissa, eikä ollut mitään näyttöä eroja näiden kudosten (keskiarvo värjäys indeksi NP: 0,16, 95% CI 0,00-0,32; PCa: 0,11; 95% CI 0,00-0,27; p = 0,49); katso kuva S1. Ei ollut todisteita siitä, että MET tai P-MET immunoreaktiivisuus liittyy riski biokemiallisten uusiutumisen jälkeen kontrolloi iän, Gleason summa, ja kasvaimen tilavuus.

VEGFR2: Normaali eturauhanen epiteelisolujen ja PCa solujen molemmat osoittautunut alhaiseksi VEGFR2 immunoreaktiivisuus , ja siellä oli marginaalinen osoituksena korkea VEGFR2 PCA vs NP (keskiarvo värjäys indeksi NP: 0,03, 95% CI 0,00-0,05; PCa: 0,07, 95% CI +0,03-,11; P = 0,02); katso kuva S1. Voimakas värjäytyminen oli läsnä strooman ja verisuoniston sekä NP ja PCa. Samanlaisia ​​MET, ei ollut näyttöä siitä, että VEGFR2 ilmentyminen liittyi riski PSA uusiutumisen jälkeen kontrolloi iän, Gleason summa, ja kasvaimen tilavuus.

Ensisijainen PCa vs etäpesäkkeitä.

Koska raportoitu korotuksia MET PCA etäpesäkkeitä [12], ryhdyimme arvioida, onko tämä kasvu voidaan havaita kudoksista meidän kohortin potilaista. Tätä vertailua varten, käytimme tulokset etäpesäkkeitä on TMA 21 ja yhdistetyt tulokset PCA kudokset UWTMA48 ja UWTMA52 (127 potilasta). MET havaittiin PCa etäpesäkkeet erittäin vahvaa näyttöä suurempi immunoreaktiivisuus värjäytymisen luuetäpesäkkeissä (BM) verrattuna ensisijaisen PCa (keskiarvo värjäys indeksi ensisijainen PCa: 0,83, 95% CI 0,82-0,87; BM: 0,94, 95% CI 0,89-0,98 ; P = 0,0002); katso kuva 1. Sen sijaan, MET tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kaikissa pehmytkudoksen etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PCa (keskiarvo värjäys indeksi maksa: 0,70, 95% CI +0,62-+0,77, P 0,0001; LN: 0,78, 95% CI 0,71-+0,83 P 0,0001 ja muut pehmeät: 0,79, 95% CI 0,67-+0,93, P = 0,01).

IHC ja analyysit tehtiin, kuten on kuvattu menetelmät-osassa. Graafinen profiilit havainnollistaa jakaumia värjäystä intensiteetin rakennettiin laskemalla yksinkertaisesti keskiarvo kaikkien ei-puuttuvat osat kussakin värjäystä luokassa. Kussakin sivusto, keskimääräinen värjäys indeksi on merkitty täynnä oranssi ympyrä ja oranssi pylväät edustavat 95% CI. Edustavia esimerkkejä värjäys on esitetty kullekin proteiinille. A. MET ilmentyy voimakkaasti sekä ensimmäisen ja metastaattinen PCa, vaikka se on merkittävästi lisääntynyt BM ja vähenivät pehmytkudoksen etäpesäkkeitä vs. ensisijainen PCa. B. P-MET tasot ovat korkeampia BM, LN ja muut pehmytkudoksen etäpesäkkeitä, kun taas mitään muutosta ei havaittu maksassa etäpesäkkeitä verrattuna ensisijainen PCa. C. VEGFR2 ilmentyminen lisääntyy merkittävästi yli PCa etäpesäkeleesioita verrattuna ensisijainen PCa. Kuvat otettiin 400 x suurennuksella.

P-MET havaittiin PCa metastaasit voimakkaiden osoituksena korkea immuunivaste BM verrattuna ensisijaisen PCa (keskiarvo värjäys indeksi ensisijainen PCa: 0,22, 95% CI 0,17 -0,26; BM: 0,37, 95% CI 0,30-0,45; p = 0,003); katso kuva 1. P-MET tasot olivat myös korkeampia kaikissa pehmytkudoksen etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PCa, joskaan eivät kaikki erot olivat suuria (keskimääräinen värjäys indeksi maksa: 0,28, 95% CI 0,13-0,38, p = 0,35; LN: 0,46, 95% CI 0,35-,56, P = 0,0001, muut pehmeät: 0,51, 95% CI 0,27-0,70, p = 0,006).

VEGFR2 havaittiin PCa metastaasit erittäin vahvaa näyttöä suurempi immunoreaktiivisuus BM verrattuna pääasiallinen PCa (keskiarvo värjäys indeksi ensisijainen PCa: 0,10, 95% CI 0,07-0,14; BM: 0,25, 95% CI 0,19-0,31; p = 0,0001); katso kuva 1. tasot VEGFR2 oli myös korkeampi kaikissa pehmytkudoksen etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PCa, joskaan eivät kaikki erot olivat suuria (keskimääräinen värjäys indeksi maksa: 0,29, 95% CI ,17-,38, P = 0,0005, LN: 0,40, 95% CI +0,29-+0,46, P 0,0001 ja muut pehmeät: 0,19, 95% CI 0,04-0,38, p = 0,28).

PCa etäpesäkkeitä.

Koska microenvironment vaikuttaa geenien ilmentymisen profiilit kasvainsolujen, me analysoi myös MET ilmentymisen tasoja metastaattisen sivuston. Tasot MET olivat merkitsevästi korkeammat BM verrattuna maksaan, LN, ja muut pehmytkudoksen etäpesäkkeitä (keskiarvo värjäys indeksi BM: 0,94, 95% CI +0,91-+0,98; tarkoita värjäys index maksa: 0,59, 95% CI ,52-0,66, P 0,0001; LN: 0,67, 95% CI 0,61-0,73, P 0,0001 ja muut pehmeät: 0,68, 95% CI ,57-+0,83, P 0,0001).

tasot P-MET olivat heikosti tai ei-merkitsevästi erilainen BM verrattuna maksaan, LN, ja muut pehmytkudoksen etäpesäkkeitä (keskiarvo värjäys indeksi BM: 0,37, 95% CI 0,32-0,44; maksa: 0,28, 95% CI 0,13-0,36, p = 0,10; LN : 0,46, 95% CI 0,34-0,53, p = 0,05; pehmeä muut: 51%, 95% CI +0,27-+0,69); katso kuva 1. Kuitenkin, koska eri käsittelyä BM ja pehmytkudoksen etäpesäkkeitä (BM käsittely vaatii kalkin) ja alhainen vakaus fosforylaation happamissa olosuhteissa, todelliset määrät P-MET saattaisi olla suurempi BM kuin meidän tiedot osoittavat.

VEGFR2 tasot olivat merkittävästi erilaiset BM verrattuna LN etäpesäkkeitä (keskiarvo värjäys indeksi BM: 0,25, 95% CI 0,21-0,31; LN: 0,40, 95% CI ,30-+0,45, P 0,0001), mutta ei maksa tai muuta pehmeää kudosta etäpesäkkeitä.

assosiaatioiden MET, P-MET, ja VEGFR2 värjäys indeksin ja AR, PSA, ja PSMA.

Ylikuuluminen välillä AR, MET ja VEGFR2 signalointi on raportoitu CRPC (13,14 ). Siksi arvioimme assosiaatioita MET, P-MET ja VEGFR2 värjäytymistä (määritelty tässä tutkimuksessa) ja AR, PSA, ja PSMA värjäys (historiallisista data) in etäpesäkkeitä. Analyysissä, joka perustuu lineaariseen sekoitettu malli (katso Methods S1), ei havaittu mitään merkittäviä assosiaatioita tahansa paria valitun proteiinien BM tai pehmytkudoksen metastaaseja (tuloksia ei ole esitetty).

Cabozantinib tavoitteita PCA ksenografteissa

qPCR.

määrittämiseksi ilmentymisen valittujen cabozantinib tavoitteiden PCA, arvioimme tasoa MET, hiiren VEGFR2 Axl, KIT, ja RET mRNA 24 eri LuCaP PCa ksenografteissa että tarkasti mallintaa heterogeenisyys Eturauhassyövän ihmisellä [37]. Meidän qPCR tulokset osoittavat, että kaikki cabozantinib tavoitteet on ilmaistu näissä malleissa erisuuruisia; katso kuva S2A. Kerrostetaan malleja neuroendokriinisten kasvaimet (NE) ja adenokarsinooma (AD) paljasti suuren kohtalaisia ​​todisteita korkeampi kaikkien tavoitteiden NE LuCaP malleissa (n = 4) verrattuna AD-mallit (n = 20) katso kuva S2B. Koska välinen ylikuuluminen AR, MET, ja VEGFR2 signalointi on raportoitu, me tarkasteltiin myös ilmaus cabozantinib tavoitteiden korreloi AR ilme tai vastauksia kastraatio. Tätä varten me luokiteltu ksenograftit kuin ”erittäin herkkä kastraatio”, jos kastraatio aiheutti yli 3-kertainen eloonjäämishyötyä. Analyysimme ei havaittu merkitseviä välisiä AR ja cabozantinib tavoitteita. Lisäksi vaikka keskimääräinen mRNA tasot cabozantinib tavoitteet olivat korkeampia mallit eivät reagoi hyvin kastraatio, nämä erot eivät saavuttaneet merkitystä.

IHC.

Saadakseen paremman käsityksen cabozantinib n mahdolliset vaikutukset potilailla, joilla on edennyt CRPC jotka ovat ADT ja /tai hoidosta dosetakselilla selvitimme tasoja MET, P-MET, ja VEGFR2 vuonna LuCaP kasvaimia ehjä, kastroitu, ja dosetakseli-käsiteltyjen eläinten. Meidän analyysit osoittavat kohtalaista näyttöä siitä, että MET ja P-MET ekspressiotasot korreloivat negatiivisesti poikki kasvaintyypeille (R = 0,29; p = 0,02), ja marginaalinen näyttöä siitä, että keskimääräinen MET ja P-MET värjäystä indeksit ovat 5-6% korkeammat kasvaimissa jälkeen doketakselihoidon kuin kasvaimia ehjä eläimistä (P = 0,08 ja P = 0,05, vastaavasti). Analyysimme ei ilmennyt näyttöä siitä, että ekspressiotasot muuhun paria proteiinien korreloivat poikki tai sisällä kasvaintyypeille (kaikki P 0,14), tämä tarkoittaa MET ja P-MET värjäystä indeksit ovat erilaiset kasvaimet kerättiin ehjiä ja castrate eläimiä, tai että keskimääräinen MET ja P-MET värjäys indeksit eroavat huomattavasti LuCaP ksenografteissa että näyttää korkea ja matala vastaus kastraatio; katso kuva S2C. VEGFR2 ei osoittanut mitään merkittävää immunologista tuumorisoluissa meidän malleja.

Prekliiniset tehokkuustutkimuksissa

lisätä ymmärrystämme cabozantinib vaikutuksista PCa luuetäpesäkkeistä, tutkimme sen vaikutuksista seerumin PSA, kehon paino, ja luun vaihtuvuutta malleissa Eturauhassyövän kasvun luun. Samoin arvioimme muutoksia seerumin PSA, kasvaimen tilavuus ja kehon paino Hoitovasteet sisältämiin eläimiin ihonalainen kasvaimia.

Cabozantinib estää kasvaimen kasvua luuhun.

tehon arvioimiseksi cabozantinib kasvuun Eturauhassyövän luussa, käsittelimme ehjä tai castrate sisältämiin eläimiin sääriluunsisäinen LuCaP 23.1 tai C4-2B kasvaimia, vastaavasti. Valitsimme nämä kaksi mallia, koska LuCaP 23.1 aikaansaa lausutaan osteoblastien reaktio ja C4-2B aikaansaa sekoitettu osteoblastic /osteolyyttinen vasteen. Lisäksi LuCaP 23,1 edustaa androgen-herkkien PCa taas C4-2B edustaa kastraatio-resistenttejä. Meidän qPCR tulokset osoittavat, että MET, VEGFR2m, KIT, RET ja AXL ilmaistaan ​​LuCaP 23.1. Vuonna C4-2B kasvaimet havaitsimme VEGFR2m, Axl ja RET, hyvin alhainen MET eikä signaalia KIT (tulokset on esitetty kuviossa 2A). Näiden reseptoreiden ekspression in LuCaP 23,1 ja C4-2B kasvaimia tukevat olettamusta, että cabozantinib muuttavat biologia näiden kasvainten. Cabozantinib (60 mg /kg) esti kasvua sekä kasvainten luun osoituksena seerumin PSA-tasot; katso kuva 2B. Weekly muutoksia seerumin PSA oli merkitsevästi erilainen ohjaus ja cabozantinib ryhmien LuCaP 23.1 malli (P 0,0001), jossa PSA kasvoi 76% viikossa kontrolliryhmässä mutta 0,2% viikossa, cabozantinib ryhmässä. PSA muutokset olivat merkitsevästi erilainen ohjaus ja cabozantinib ryhmien C4-2B mallissa (P = 0,0066), jossa PSA kasvoi 35% viikossa kontrolliryhmässä mutta laski 2,9% viikossa, cabozantinib ryhmässä. Cabozantinib myös esti leviämisen jäljellä elinkelpoisten solujen kasvaimia perustuen BrdU värjäys; katso kuva 2C. Tuumorin etenemiseen oli myös havaittavissa, kun arvioimme AR ja PSA immunoreaktiivisuus; LuCaP 23,1 ja C4-2B kasvaimia eläimistä hoidettiin cabozantinib osoittivat vähemmän intensiivistä AR ja PSA värjäytymistä jäljellä tuumorisoluja sekä suuret nekroottisen alueita; katso kuva 2D E. C4-2B-solut ilmentävät alempia PSA, kuten nähdään kuviosta 2B, ja että näkyy myös paljon pienempi PSA immunoreaktiivisuus näissä kasvainsoluissa.

. Tasot cabozantinib reseptorien LuCaP 23.1 ja C4-2B ihonalainen kasvaimia. qPCR käytettiin RNA eristettiin ihon alle kasvaimien ilmentymistasojen määrittämiseksi MET, VEGFR2m, Axl, RET ja KIT. Kalibroida signaalin käytimme nelinkertaiseksi laimennus LNCaP cDNA (RET), PC-3 cDNA (MET, AXL, KIT) ja LuCaP 23,1 (VEGFR2m). Valinta calibrator cDNA perustuu signaalin kuhunkin viestin. Signaali oli normalisoitu taloudenhoito geeni RPL13a. Tuloksemme osoittavat, että LuCaP 23,1 kasvaimet ilmentävät kaikki cabozantinib tavoitteiden ja C4-2B kasvaimet ilmaista VEGFR2m, Axl ja RET, alhainen MET, eikä KIT. Näissä qPCR kokeissa mittasimme suhteelliset tasot kohde transkriptien eikä niiden todellisen määrän vuoksi emme voi verrata ekspressiotasoja eri tavoitteet toisiinsa, ja kantaa siitä RET, joka antoi korkeamman signaalin, voidaan ilmaista suurempi kopio numero vs MET, ja siksi on tärkeämpää näissä malleissa.

B. Lineaariset mallit PSA kasvu osoittavat, että cabozantinib vähenee PSA-tasot sekä androgen-herkkien LuCaP 23,1 ja kastraatio kestävä C4-2B malleja. C. BrdU-värjäys sääriluut osoittaa, että cabozantinib vähentää leviämisen androgen-herkkä ja kastraatio-resistenttejä kasvainsoluja luun, 2-puolinen t-testiä käytettiin määrittämään olevien erojen merkitsevyys. D E. AR ja PSA immunoreaktiivisuus on läsnä hallita kasvaimia. Cabozantinib hoito johti laskua AR ja PSA immunoreaktiivisuus molemmissa malleissa (LuCaP 23,1 (D) ja C4-2B (E)). C4-2B solut ilmentävät alempia PSA verrattuna LuCaP 23,1, ja värjäytyminen on heikompi näissä kasvain. Lisäksi suuri nekroottisen alueilla kasvain on läsnä käsitellyssä sääriluiden (merkitty punaisella asterics). F. 60 mg /kg cabozantinib on hyvin siedetty jopa 4 viikkoa androgen-herkkien LuCaP 23.1 eläimiä. Tämän jakson jälkeen huomattavia BW pienenee vs. kontrolli havaittiin (jopa 17%), mutta koska vaihtelu ja eläinten lukumäärä, nämä vähennykset eivät saavuttaneet merkitystä. 60 mg /kg cabozantinib on hyvin siedetty jopa 5 viikkoa kastraation kestävä C4-2B malli, jossa on 12% merkittävää laskua viikolla 6. merkitys määritettiin vertaamalla ilmoittautuminen BW BW kullakin viikolla käyttäen 2-puolinen t- testata. Keskiarvo ± SEM ryhmien piirretään.

Cabozantinib muuttaa luun sisään tumored luun.

Me tehdään yksityiskohtainen analyysi cabozantinib vaikutuksista luun /kasvain mikroympäristölle mukaan μCT. Olemme valinneet tämäntyyppisen analyysin sijaan histomorfometrisysteemiä analyysin koska μCT arvioi koko sääriluu 3D kun histomorfometrisysteemiä analyysit tehdään yleensä yhdellä 2D longitudal osassa sääriluu. Analyysi trabekkeliluun osoitti LuCaP 23,1 kasvu johtaa merkittävään kasvuun luun tilavuus (tumored sääriluut: 0,42 ± 0,06 (keskiarvo ± SEM), normaali sääriluut: 0,09 ± 0,01, 5-kertainen BV /TV, P = 0,02) . Korotukset lieventyneet cabozantinib, jolloin 52%: n lasku BV /TV verrattuna kontrolliin LuCaP 23.1 sääriluut. Tämä lasku näkyi muuttuneissa trabekulaarisen numero (Tb.N), trabekkelipaksuus (Tb.Th), ja trabekulaarisen erottaminen (Tb.Sp); katso taulukko 1. C4-2B kasvua luussa aiheutti myös kohtalaisesti näyttöä BV /TV kasvaa (40%: n lisäys, P = 0,06).

tukeminen Information

Kuva S1.