Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer-kives (CT) antigeenejä ekspressoidaan pääasiallisesti kives tai istukassa , mutta puuttuu useimmista aikuisen kudoksissa. Aikana pahanlaatuisiksi CT geenit ovat usein aktivoidaan. CT antigeeni 16 (CT16, Sivu5) ilmennetään usein pitkälle melanooman mutta sen biologinen toiminta on ollut tuntematon. Jotta voidaan tutkia roolia CT16 solujen eloonjäämisen koputimme sen alas A2058 melanoomasoluissa käyttämällä erityisiä siRNA: t ja altistuvat solujen syöpälääkkeen sisplatiinin tiedetään aiheuttavan apoptoosia. Tämän seurauksena, solujen eloonjääminen oli merkittävästi vähentynyt. Tutkia vaikutuksia CT16 solun eloonjäämiseen tarkemmin, solujen geeniekspressioprofiilit tutkittiin sen jälkeen, kun CT16 hiljentämisen CT16 positiivinen A2058 melanoomasoluja, samoin kuin sen jälkeen, kun CT16 yliekspressio CT16 negatiivinen WM-266-4-melanoomasoluja. Niistä 11 geenit sekä voimistuvan CT16 hiljentämisen ja vaimentua mukaan CT16 yli-ilmentyminen tai päinvastoin, 4 geenit olivat potentiaalisesti apoptoottisia tai antiapoptoottisten geenejä. CT16 tunnustettiin positiivisena säätelijänä antiapoptoottisten metallotioneiinin 2A ja interleukiini 8 geenejä, kun taas se esti ilmaus apoptoosin indusoiva dickkopf 1 (DKK1) geeni. Lisäksi CT16 tehostettu ilmentyminen rasvahapon sitovan proteiinin 7, joka on tunnettu promoottori melanooma etenemisen. Vaikutus CT16 on DKK1 ilme oli p53 itsenäinen. Lisäksi CT16 ei säännellä apoptoottisten geenien kautta DNA: n metylaatio. Kahdenkymmenen -melanoomaetäpesäkemallilla kudosnäytteitä keskimääräinen DKK1 mRNA-tasolla on merkitsevästi (p 0,05) alhaisempi korkean CT16 ilmentävien kasvainten (n = 3) verrattuna kasvaimia, joilla on alhainen CT16 lauseke (n = 17). Siten, tuloksemme osoittavat, että CT16 edistää selviytymistä melanoomasolujen ja on näin ollen potentiaalinen kohde tulevaisuudessa lääkekehityksessä.

Citation: Nylund C, rappu P, Pakula E, Heino A, Laato L, Elo LL, et ai. (2012) melanooma-Associated Cancer-Kivesten Antigen 16 (CT16) Säätelee ilmentäminen Apoptotic ja antiapoptoottisten Geenit ja edistää solujen Survival. PLoS ONE 7 (9): e45382. doi: 10,1371 /journal.pone.0045382

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 4. toukokuuta 2012 Hyväksytty: 17 elokuu 2012; Julkaistu: 21 syyskuu 2012

Copyright: © Nylund ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat TYKS EVO avustus (projektit 13040 ja 13041, https://www.tyks.fi), Lounais varat Suomen Cancer Research Foundation (https://www.cancer.fi), Suomen Akatemia (http : //www.aka.fi), Sigrid Juseliuksen säätiö (https://www.sigridjuselius.fi) ja Suomen Syöpäyhdistys (https://www.cancer.fi). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer-kivesantigeenien (CTA: t) muodostavat heterologisen ryhmän proteiineja, jotka ilmaistaan ​​sukusolujen ja trofoblastit [1]. CTdatabase Ludwig Institute for Cancer Research (https://www.cta.lncc.br/index.php) [2] luetellaan yli 140 Toimintakehotukset. CTA: t voidaan jakaa X-kromosomin koodaaman (X-CTA: t) ja ei-X-kromosomin koodaaman CTA: t (ei-X-CTA: t). Yleisin mekanismi CTA-geenin aktivointi on promoottori demetylaatio [1]. Gametogeneesiin ja kasvaimen kehittymisen on monia vastaavia ja yhteisiä tapahtumia, kuten globaali hypometylaatio ja CTA ilmaisun [3]. On kuitenkin epäselvää, onko ilmaus Toimintakehotukset on ainoastaan ​​seuraus demetylaatio tapahtumista yhteisiä kasvainten synnyssä vai onko Toimintakehotukset on aktiivinen rooli syövän etenemiseen.

mukaan CTdatabase, monet ei-X- CTA: t näyttävät olevan rooli spermatogeneesiin ja sperman toimintahäiriöitä normaalissa kiveksissä. Sen sijaan, biologisen roolin X-CTA on enimmäkseen tuntemattomia. Toiminto geenituotteiden koodaaman kaksi X-CTA perheitä, MAGE ja SSX, on aiemmin tutkittu. MAGE-A-antigeenejä on raportoitu suoraan vuorovaikutuksessa p53 ja tukahduttaa sen toiminta [4], [5]. Lisäksi, MAGE-proteiinit, on osoitettu muodostavan kompleksin telineet proteiini, KRAB-liittyvä proteiini 1 (KAP1) ja tukahduttaa p53-riippuvaista apoptoosia [6]. MAGE on myös osoitettu olevan vuorovaikutuksessa RING E3 ubikitiinillä ligaasien ja parantaa ubikinaa- aktiivisuutta RING verkkotunnuksen proteiinien kohti tavoitteitaan, kuten p53 [7]. SSX perheenjäsenet, joka voi fuusioituvat SS18, seurauksena tietyn kromosomaalisen translokaatio ihmisen nivelkalvon sarkooma [8], on ehdotettu toimivan transkription säätävät [9]. Hiivan hybridi-seulonta ja glutationi-S-transferaasin pull-down määrityksissä ovat osoittaneet, että SSX2-proteiini sitoutuu RAB3IP ja SSX2IP proteiinit [10]. Toisaalta, SSX proteiineja on raportoitu colocalize jäsenten kanssa Polycomb ryhmäkompleksi [11], ja myöhemmissä tutkimuksissa näyttöä roolin SSX proteiinien histonimodifikaation ja DNA: n metylaatio on havaittu [12], [13] .

CT16 (tunnetaan myös nimellä Sivu5, GAGEE1, CT16.1) on X-CTA ja sen lähimpiä sukulaisia ​​kuuluvat eturauhasen liittyvä antigeeni perhe (PAGE geenejä), joka puolestaan ​​liittyy XAGE ja GAGE geeniperheiden [14]. CT16 ensin julkaistiin tutkimus, jossa Unigene tietokannasta etsittiin geeniryppäät sisältävien ilmenevän geenin osiksi peräisin yksinomaan sekä normaalin ihmisen kiveksen ja kasvaimen cDNA-kirjastoja. Ilmaisu on CT16 melanoomissa sekä keuhkojen ja munuaisten syövät osoitettiin mRNA-tasolla [15]. Äskettäin raportoimme ilmentymistä CT16 mRNA 11 ulos 22 melanoomaa ihon etäpesäke. Lisäksi olemme osoittaneet, että vaikka homologia tunnettujen eturauhasen liittyviä antigeenejä CT16 ei ole ilmaistu ensisijainen eturauhassyövän [16]. Olemme myös kehittäneet herkkä määritys mittaamaan CT16 suoraan potilaiden seerumit ja osoittivat, että 14 ulos 23 (61%) potilailla, joilla on metastaattinen melanooma oli havaittavissa CT16 tasoilla [16].

biologisen roolin CT16 on tuntematon , mutta on olemassa joitakin raportteja oletetun toiminnot CT16 homologeista. Yksi GAGE ​​perheenjäsen ottaa 30% identiteetti CT16 on raportoitu estävän apoptoosia ja vuorovaikutuksessa nucleophosmin /B23 ja interferoni säätelytekijänä 1 [17]. Samoin, se on äskettäin osoitettu, että eturauhassyövän liittyvän antigeeni 4 (page4), joka on 43% identtisyys CT16, on anti-apoptoottinen proteiini [18]. Samassa tutkimuksessa, kirjoittajat kertoi myös, että Sivu4 on luontaisesti epäjärjestyksessä proteiini (IDP), joka sitoutuu runsaasti GC sekvenssit kaksijuosteisen DNA [18]. NMR-analyysi CT16 on ilmoittanut, että se on IDP [19]. Itse asiassa, sekvenssin analyysi IUPred algoritmia (https://iupred.enzim.hu) [20], ennustaa, että kaikki proteiinit, jotka liittyvät CT16 ovat luonnostaan ​​epäjärjestyksessä. Pakkosiirtolaisten ovat proteiineja, jotka eivät muodosta jäykkä 3-D rakenne fysiologisissa olosuhteissa [21]. Lisäksi äskettäin

in silico

analyysi viittaa siihen, että useimmat Toimintakehotukset ovat maansisäisten [22]. Noin 25% nisäkkään proteiinien ennustetaan olevan maansisäisten, ja noin 75% nisäkkään signaloinnin proteiinien ennustetaan olevan pitkän häiriintyneestä alueilla [23]. On ehdotettu, että maansisäisten usein useita toimintoja, ominaisuus kutsua kuin pimeä [24]. Siten myös CT16 ja CT16 liittyviä Toimintakehotukset voi olla eri toimintoja riippuen biologisen yhteydessä ja solusijaintipaikan.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet roolin CT16 melanooma. Osoitamme, että hiljentäminen on CT16 siRNA: illa parantaa sisplatiinin solukuolema. Transcriptome analyysi hyödyntäen CT16 yli-ilmentymisen ja knockdown paljasti, että CT16 säätelee negatiivisesti, luultavasti välillisesti ilmentyminen antiapoptoottista proteiinia DKK1. Osoitamme, että tämä asetus on p53 riippumaton ja CT16 ei ole vaikutusta metyloinnin selviytymisen säännellä geenejä. Ehdotamme myös, että ihmisen melanooma iho etäpesäkkeitä näytteitä korkean CT16 mRNA-tasolla voi olla vähemmän DKK1 mRNA kuin ne, joilla on alhainen CT16 mRNA-tasolla.

Tulokset

CT16 ilmaistaan ​​-melanoomaetäpesäkemallilla ja Melanoomasolulinjojen on proteiini tasolla

Olemme aiemmin raportoineet spesifisten polyklonaalisten vasta-aine ihmisen rekombinantti CT16 [16]. Tässä vasta-ainetta käytettiin tarkistaa CT16 ilmennetty proteiini tasolla melanoomaa ihon etäpesäke. Pakastetut kudosnäytteet tutkittiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä. CT16: n ilmentyminen oli nähtävissä vain -melanoomaetäpesäkemallilla kudoksissa, jotka ilmaistaan ​​CT16 mRNA: ta (kuvio 1A, B). Lisäksi määrä CT16-spesifistä värjäytymistä korreloivat hyvin mRNA-tasot (kuvio S1). Ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä käytettiin negatiivisina kontrolleina eivät osoittaneet värjäytymistä CT16 (kuvio 1C). Kives näytettä käytettiin positiivisena kontrollina ja CT16 sijaitsi pohjapinta osastoon spermatogeenisten epiteelin, pääasiassa spermatogonioista (kuvio 1 D). Vuonna -melanoomaetäpesäkemallilla näytteiden CT16 näytti olevan pääasiassa sytoplasmista, vaikka joissakin soluissa tumat myös värjäytyivät positiivisesti (kuvio 1A).

CT16 havaittiin kudosnäytteistä kanssa CT16-spesifinen vasta-aine visualisoitiin Vectastain ABC-kitti, ja diaminobentsidiini, ja leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. (A, B) melanooma ihon etäpesäke näytteitä kahdesta potilaasta. (C) Ensisijainen eturauhassyöpä (negatiivinen kontrolli). (D) Kivesten näyte (positiivinen kontrolli). Sekä sytoplasminen ja ydin- CT16-spesifistä värjäytymistä näkyy suurennettu alue (upotus) melanooman ihon etäpesäke näyte. Kiveksissä näytteessä suurennus näkyy CT16-spesifistä värjäytymistä spermatogonioiden. Mittakaavapalkki kiveksissä kuva edustaa suurennus kuin 150 pm kaikkien kuvien.

solunsisäinen sijainti CT16 tutkittiin edelleen SK-MEL-2 melanoomasoluja sekä WM-266- 4-melanoomasoluja stabiilisti transfektoitu CT16 cDNA-sisältävät tai ehjä (kontrolloida cDNA), joka sisältää ekspressiovektorin. CT16 ilmaus CT16 transfektoitujen solujen oli tarkistettu sekä mRNA ja proteiini tasolla (kuva S2). Immunofluoresenssimäärityksellä käyttäen CT16-vasta-ainetta (kuvio 2A) vahvisti vasta- aineen, koska CT16 negatiivinen WM-266-4-soluja, jotka oli transfektoitu kontrolliplasmidilla osoitti jonkin verran tausta fluoresenssia vain (kuvio 2A). Vuonna CT16 positiiviset solut CT16 näyttää paikallistaa sekä tumassa (ilman nucleoli) ja sytoplasmassa. Vahvista sijoittuu tumaan, SK-MEL-2 tumauutteesta valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella. CT16 todettiin sekä ydin- ja sytosolifraktion, kun taas sytosolinen ohjaus proteiini MEK1 /2 oli läsnä vain sytosolifraktion (kuvio 2B).

(A) Kuvia osoitti ihmisen melanoomasolulinjoja leimattu kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen syövän kiveksen antigeeniproteiinin CT16 seurasi sekundäärinen vasta-aine Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani-IgG: tä (H L). Kuvat otettiin, on yhtä suuri altistuminen kertaa laadullisesti verrata ekspressiota CT16 antigeenin solulinjoissa. Fluoresenssi-intensiteetti WM-266-4, jotka on transfektoitu CT16 cDNA: n sisältävä plasmidi on samanlainen kuin CT16-positiivisia SK-MEL-2-soluja. WM-266-4 transfektoitu tyhjällä vektorilla näkyy vain tausta fluoresenssin. Mittakaavapalkki edustaa 20 um kaikissa kuvissa. (B) Western blot sytosolin ja ydinvoima jakeet SK-MEL-2-solujen. Havaitsemiseksi CT16, näytteet ajettiin 12% ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä, jossa CT16 yleensä vaeltaa, kuten kaksi tai kolme erillistä bändejä. MEK1 /2 havaittiin näytteissä ajettiin 12% denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä.

CT16 ei vaikuta solujen lisääntymisen

vaikutus CT16 proliferaatioon tutkittiin stabiilisti CT16 transfektoitu WM-266-4-soluja. Lisäksi kaksi siRNA: t vastaan ​​CT16 mRNA suunniteltiin ja tarkasti aiheuttaa yli 80%: n inhibition CT16 ilmaisun, joka kesti vähintään 96 tuntia (kuvio S3A-C). SiRNA: t pidettiin spesifinen CT16, koska ne eivät säätelemään muiden CT-antigeenejä, esim. MAGE-1 tai GAGE-1 (kuvio S3D). Tärkeintä melanoomasolulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa ei ilmaista PAGE2B, lähinnä homologi CT16 (kuvio S3E). Kumpikaan yliekspressio CT16 WM-266-4-solujen eikä hoito A2058 solujen CT16 erityisiä siRNA: t oli merkittävä vaikutus solujen lisääntymistä (kuvio 3A, B).

(EN) A2058-soluja käsiteltiin CT16 erityiset tai ohjaus siRNA alistettiin Cell tiitteri 96 runsaudenmäärityksessä. Liuotettu formatsaanituotetta väriaine kvantifioitiin spektrofotometrisesti 570 nm: ssä. (B) leviämisen WM-266-4 stabiilisti transfektoitu CT16 tai kontrolli-cDNA. (C) CT16 siRNA transfektoidut A2058-soluja käsiteltiin 50 uM sisplatiinia 17 tunnin apoptoosin indusoimiseksi ja solulysaateista blotattiin ja katkaistun kaspaasi-3. (D) A2058-soluja esikäsiteltiin ilmoitetuilla siRNA 48 h annettiin kiinnittyä xCELLigence levyn 10 tuntia. Solut altistettiin osoitti sisplatiinin on nolla-ajan, ja Cell Index myöhemmin mitattiin 10 minuutin välein 30 tuntia. Virhepalkit edustavat standardipoikkeamat kolmesta kokeesta. Solu-indeksi Kaikkien näytteiden normalisoidaan 1: n nolla-ajan. (E) Poikkileikkaukset kolmena ajankohtana on xCELLigence kokeen. Tähdet osoittavat merkittävää eroa ohjaus siRNA hoito,

P

0,001 (ANOVA, Tukeyn HSD).

CT16 edistää melanooma solujen selviytymistä

Voit testata edelleen biologista merkitystä CT16 olemme alttiina melanoomasolujen apoptoosia indusoiva syöpälääkkeen, sisplatiinin. A2058-soluja käsiteltiin ensin joko CT16 erityisiä siRNA: t tai valvoa siRNA 48 tuntia, ja lisäyksen jälkeen sisplatiini soluviljelmiä seurattiin 30 h 10 minuutin välein käyttäen xCELLigence tekniikkaa. Tätä tekniikkaa, soluja kasvatetaan pinnalle, jossa on integroituja mikro-elektrodit, ja sähköisen impedanssin elektrodien välillä aiheuttama solujen mitataan. Suhteellinen muutos mitataan sähköisen impedanssin ilmaistaan ​​Cell Index (CI). Sekä solujen lukumäärä ja morfologia vaikuttavat CI, ja solujen irtoaminen ja kuolema nähdään lasku CI.

Sisplatiini vähentynyt CI CT16 siRNA käsiteltyjen solujen merkittävästi enemmän kuin kontrolli siRNA käsiteltyjen solujen (kuvio 3D, E ). Ero oli ilmeisintä, kun sisplatiini pitoisuus 50 uM, käytettiin. Sen sijaan, CT16 ei ollut vaikutusta eloonjäämiseen, kun läsnä on staurosporiinin (0-600 nM) (ei esitetty). Näin ollen näyttää siltä, ​​että CT16 estää sisplatiinilla indusoitua mutta ei staurosporiini indusoidun kuoleman A2058-melanoomasolujen.

läsnä sisplatiinin CT16 siRNA: iden voisi lisätä kaspaasi-3, kuten on esitetty Western-blottauksella vasta-aineita, jotka spesifisesti tunnistavat lohkaista kaspaasi-3 (kuvio 3C). Siten CT16 voisi suojata melanooman soluja apoptoosin.

CT16 säätelee eloonjäämistä liittyvien geenien

edelleen tutkia roolia CT16 solujen eloonjäämistä, kaksi transcriptomic profilointi kokeita suoritettiin. Ensimmäisessä kokeessa, CT16 positiivinen A2058 melanoomasoluja käsiteltiin CT16 erityisiä siRNA ja verrataan sitten A2058 soluissa, joita käsiteltiin ohjaus siRNA. Toisessa kokeessa, stabiilisti kontrolloida cDNA transfektoitiin WM-266-4 melanoomasoluja verrattiin stabiilisti CT16 cDNA transfektoitujen solujen. Microarray tiedot on talletettu, mukaan MIAME ohjeiden, NCBI: n Gene Expression Omnibus [25], hakunumerolla GSE31352 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31352 ). Sijoitus Tuote algoritmia käytetään valitsemaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien [26]. Algoritmi havaitsee geenejä, jotka johdonmukaisesti joukossa kaikkein ylä- tai vaimentua geenien poikki toistojen. Käyttö riveissä sijaan ilmaisun arvojen lisää luotettavuutta melulta. Geenit kanssa sijoitus tuote väärien löytö määrä (FDR) 0,05 toimitettiin geeni ontologian analyysiä GoTermMapper työkalu, joka kartoittaa geenit valituille solukomponenttiin ja biologisen prosessin geeni ontologian luokat (GO slims). Yleinen jakauma solukomponenttiin tai biologisen prosessin differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin olevan samanlaiset sekä CT16 yli-ilmentymisen ja taintumisen kokeita (kuva 4). Tunnistamaan biologisia prosesseja differentiaalisesti ilmaisi geenit voivat osallistua, toiminnallinen merkintä analyysi suoritettiin käyttäen DAVID työkalu. Vain väleissä Benjamini-Hochberg FDR 0,05 sisällytettiin tuloksiin. Geenit, jotka voimistuvan CT16 yli-ilmentyminen oli huomattavasti rikastettu biologisissa prosesseissa, jotka edistävät eloonjäämistä tai liittyvät tulehdus, kemiallisen homeostaasin sekä vastauksena ärsyke ja loukkaantumisesta (taulukko 1). Geenit, jotka vaimentua jonka CT16 yli-ilmentyminen oli merkittävästi yliedustettuna ainoastaan ​​antigeenin käsittely ja esittely peptidi- tai polysakkaridi-antigeeni kautta luokan II MHC-prosessin (taulukko 1). Analyysi ilmentyvät eri geenien CT16 Knockdown kokeessa ei paljastanut mitään biologisia prosesseja Benjamini-Hochberg FDR 0,05 (ei kuvassa).

ilmentyvät eri geenit CT16 Knockdown ja yli-ilmentyminen kokeiluja analysoitiin erikseen. Määrä geenejä lisätty huomautusta, joka tietyn luokan on suluissa. Kartoitus GO hoikka ontologian tehtiin GoTermMapper (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).

Voit rajoittaa määrän geenejä tutkitaan, valitsimme vain geenit, jotka vaimentua mukaan CT16 erityisiä siRNA ja voimistunut vuoksi CT16 yli-ilmentymisen tai

päinvastoin

(sijoitus tuote FDR 0,1 kummassakin kokeessa). Niistä yhteensä 11 geenien täyttävät nämä kriteerit, 5 on aiemmin raportoitu liittyvän syövän etenemiseen (taulukko 2). Näiden kokeiden perusteella CT16 kirjattiin positiivisena säätelijänä antiapoptoottisten metallotioneiinin 2A (MT2A) ja interleukiini 8 (IL8) geenejä, kun taas se esti ilmaus apoptoosin indusoiva dickkopf 1 (DKK1) geeni. Lisäksi CT16 tehostettu ilmentyminen rasvahappoa sitovan proteiinin 7 (FABP7), tunnettu edistäjä melanooman etenemisen. Ero sääntely FABP7, MT2A ja DKK1 geenien vahvistettiin reaaliaikaisen qRT-PCR-analyysi CT16 yli-ilmentävät WM-266-4-soluja (kuvio 5A, kuvio S4).

(A) tarkastaminen ero DKK1 mRNA: n ekspression (WM-266-4: llä transfektoitujen solujen ohjattu cDNA- tai CT16 cDNA. by qRT-PCR: llä. (B) Differential DKK1 mRNA: n ekspressio oli myös toistettavissa A2058 soluissa, joita käsiteltiin osoitetulla siRNA 48 h. (C) Western blot DKK1 viljelyväliaineessa on A2058-soluja käsiteltiin osoitetulla siRNA 48 h. (D) DKK1 on vaimentua melanooman näytteitä, joilla on korkea CT16 ilmaisua. CT16 ja DKK1 mRNA-tasot melanooman ihon etäpesäkkeiden kudosnäytteiden havaittiin qRT-PCR: llä.

p

arvo saatiin testaamalla ero DKK1 mRNA tasolla välillä melanooma näytteiden korkean CT16 mRNA tasolla ( 22% of β-aktiini-mRNA) ja heikosti CT16 mRNA tasolla ( 7% of β aktiini-mRNA) by Tukey-Kramer-testi.

testaamiseksi valintakriteerit geenien taulukossa 2, käytimme reaaliaikaisia ​​qRT-PCR analysoida kolme geeniä, CTSL, DDAH1 ja BIRC5 jotka vaimentua mukaan CT16 erityisiä siRNA ja voimistunut vuoksi CT16 yli-ilmentymisen tai

päinvastoin

mutta oli listalla tuote FDR 0,1. Näissä mittauksissa vaikutus CT16 ilmentymiseen ei ole voitu vahvistaa (kuva S4). Täten valittu sijoitus tuote FDR kynnysarvon tehokkaasti suodattaa pois vääriä positiivisia, säilyttäen todellinen itse.

CT16 on negatiivinen säätelijä DKK1 melanooman

solunulkoinen Wnt antagonisti DKK1 valittiin lisätutkimuksia, koska se on aiemmin osoitettu aktivoivan apoptoosin ja vaimentua melanooman ja muiden syöpien [27], [28]. Kaksi itsenäistä CT16 siRNA lisääntynyt DKK1 mRNA tasoilla A2058-soluissa (kuvio 5B). Vaikutusta CT16 on DKK1 ekspressio vahvistettiin myös proteiinin tasolla soluviljelyväliaineen A2058 soluissa Western-blotit. Knockdown by CT16 erityisiä siRNA lisännyt kertyminen DKK1 proteiinin keskipitkällä (kuvio 5C).

löytää todisteita, että CT16 myös säätelee DKK1 ekspressiotasot kasvaimissa, 20 melanoomaihosyöpien etäpesäke näytteet analysoitiin reaaliaikainen qRT-PCR. CT16 mRNA-tasolla suhteessa p-aktiini oli alle 7% 17 näytettä, jotka oli ryhmitelty niin alhainen CT16 melanooma näytteitä. CT16 mRNA oli yli 22% of β-aktiini kolmessa näytteiden ryhmiteltiin korkea CT16 melanooma näytteitä. Mielenkiintoista, korkea CT16 näytteissä oli merkittävästi (p 0,05, Tukey-Kramer-testi) alempi keskimääräinen DKK1 mRNA-tasolla verrattuna matalan CT16 näytteistä (kuvio 5D), mikä viittaa siihen, että korkean CT16 taso voi olla yksi syy on aiemmin kuvattu downregulation DKK1 ilmaisun melanoomaan.

CT16 säätelee kohdegeenien on p53 ja DNA: n metylaatio riippumattomasti

molekyylitason interaktioiden X-CTA: t ovat käytössä vain harvoissa tapauksissa. Koska MAGE proteiinien tiedetään vaikuttavan p53 toimintoihin (Yang et al., 2007), halusimme tutkia vaikutuksia eri CT16 positiivisissa solulinjoissa. Ei muutosta p53-proteiinin ekspressiota havaittiin immunoblottauksella in CT16 siRNA pudotus SK-MEL-2-soluja verrattuna kontrolliin siRNA käsiteltyjen solujen (kuvio S5a). Samanlainen tulos saatiin myös välillä CT16 ja ohjaus cDNA transfektoidut WM-266-4 soluissa (kuvio S5B). Testasimme myös vaikutukset CT16 ihmisen osteosarkooma Saos-2-solut, jotka ovat tunnettuja ei ole p53-ilmentymistä. Negatiivinen p53 Saos-2-soluissa varmistettiin qRT-PCR: llä (ei esitetty). Tulos osoitti, samoin kuin A2058 soluissa, selkeä säätelyä, ja DKK1 jälkeen CT16 Knockdown, mikä osoittaa, että p53 ei osallistu prosessiin (kuvio S5c). Ei ollut CT16 mitään vaikutusta konformaation muutoksen p53 raakauutetta WM-266-4-soluja (kuvio S5d). Lisäksi ei ollut mitään eroa p53 vakauden välillä CT16 siRNA käsitelty A2058-soluihin ja kontrollisolujen jälkeen proteiinisynteesin inhibitio kanssa CHX Kuvio S5E). Mukaisesti, että mitään merkittävää rikastumista p53 kohdegeenien joukossa differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin (ei esitetty). Yhdessä nämä tulokset tukevat ajatusta, että p53 eivät välittävät vaikutuksia CT16 tai osallistua apoptoosin.

Jotkin X-CTA: t vaikuttavat myös geenin metylaatio ja translaation jälkeiset modifikaatiot in histonien. Tämän tutkimiseksi, genomin laajuinen promoottori-spesifinen kromatiinin immunosaostusanalyysille WM-266-4, jotka on vakaasti transfektoitu CT16 tai kontrolli-cDNA suoritettiin käyttämällä DNA: n metylaation erityisiä ja asetyloitu histoni H3 spesifisten vasta-aineiden ja microarray, joka kattaa 30000 ihmisen promoottorit. Näyte-erityisiä geenejä, eli niiden huiput (havaitaan ja arvioidaan NimbleScan ohjelmisto), jolla FDR 0,05 otokseen ja FDR≥0.2 valvonnassa tai päinvastoin, analysoitiin DAVID. Ei ollut merkittävästi rikastettu geenien tahansa geeni ontologian luokkien joukossa näyte-geenit (ei esitetty). Vertasimme myös luettelot differentiaalisesti geenien WM-266-4 solulinjat näytteen-geenistä-luettelot sekä metylaatiospesifisen ja histoni asetylaatio erityisiä immunosaostuksella analyysit (taulukko S1). Tulokset viittaavat siihen, on olemassa yhteys histoni H3 asetylaatio ja geenin ilmentymistä CT16 säädeltyjen geenien. On kuitenkin epäselvää, CT16 on mukana histoni asetylaatio tapahtumiin tai perustuisi pelkästään heijastaa tunnettu yhteys histoni H3 asetylaatio ja geenien ilmentymisen. Toisin kuin histoni H3 asetylaatio, DNA: n metylaatio ei osoittanut korrelaatiota CT16 geenien viittaa siihen, että muutokset geenien ilmentyminen profiilin CT16 ei välittämä DNA: n metylaation.

Viime aikoina on osoitettu, että luokan I MAGE-proteiinit, säännellä KAP1 ja KRAB verkkotunnuksen sinkkisormen transkriptiotekijä välittämä geenin repression kautta vuorovaikutuksessa KAP1 [34]. Kuitenkin, se ei ole kovin todennäköistä, että myös CT16 olisi vuorovaikutuksessa KAP1, koska KAP1 tavoitteet tunnistettu genomin laajuinen kromatiinin immunosaostusanalyysi KAP1 sitoutumisen [35] ei ole rikastettu joukossa differentiaalisesti ilmentyvien geenien joko CT16 pudotus tai yliekspressio kokeissa ( ei ole esitetty).

Olemme aiemmin mahdottomana, että CT16 voivat suoraan sitoutua GC-rikas sekvenssit kaksijuosteisen DNA [19] samalla tavalla kuin sen paralogi page4 [18]. Täällä emme voineet osoittaa lokalisoinnin CT16 välittömään promoottorit sen kohdegeenien (kuva S6). Täten mekanismi CT16 toiminta, kuten toiminta useimmat muut X-CTA, on edelleen tuntematon.

Keskustelu

tehokas metastaattisen melanooman on suuri ratkaisematon ongelma. Siksi on kiireesti saada uutta tietoa molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät selviytymisen ja lääkeresistenssin melanooma. Viimeaikaiset tulokset kliinisistä tutkimuksista ovat luoneet optimismia että lähitulevaisuudessa uusi tiettyjen huumeiden, kuten ipilimumab [36] ja BRAF inhibiittorit [37], voidaan käyttää pysäyttää etenemisen kehittynyt sairaus. Kuitenkin monet ihosyövän näyttävät myös kehittää resistenssin uuden lääkkeen molekyylit nopeasti, joskus kuukausien [38].

Olemme äskettäin raportoitu, että ilmaus CT16 usein indusoituu ihmisen melanooman. Lisäksi seerumin CT16 voidaan mitata ja käyttää seuraamaan taudin etenemistä [16]. Tässä osoitamme, että CT16 suojaa melanoomasoluja vastaan ​​sisplatiinin (50 uM) solukuolema. Platina-kompleksit sitoutuvat ja ristisidoksia DNA: ta, joka johtaa apoptoosin. Mielenkiintoista on, CT16 ei voinut estää staurosporiini solukuolema. Staurosporiini on alkaloidi, joka estää laajan kirjon proteiinikinaasien [39], ja näin ollen voi aktivoida apoptoosin useita eri mekanismien [40]. Solun toiminnot useimmat CTA: t eivät ole tiedossa, mutta lisäksi CT16 myös tiettyjä muita X-CTA on liitetty solujen selviytymiseen. Transfektio munasarjojen syöpäsolujen MAGE-A2 ja MAGE-A6 voi aiheuttaa paklitakselin ja doksorubisiiniresistenssiä tuntemattoman mekanismin [41]. Lisäksi GAGE-7 on kuvattu toimia anti-apoptoottisen proteiinin HeLa-soluissa [17], [42]. Viimeksi eturauhassyövän liittyvän antigeenin, page4, on raportoitu estävän stressin aiheuttama solukuolema [18].

Perustuen genomin koko geenin ilmentymisen analyysi, CT16 voi säädellä negatiivisesti spesifisiä biologisia prosesseja, kuten apoptoosin ja antigeenin esittelyn lisäämiseksi selviytymisen syöpäsolun. Mekanismi CT16 toiminta näyttää olevan ainakin osittain liittyy siihen, että se voi säädellä ilmentymistä apoptoottisten ja antiapoptoottisten geenien, kuten metallotioneiini 2A, IL-8 ja DKK1. Nämä kolme geeniä olivat yksitoista geenejä, havaittiin säänneltävä CT16 sekä CT16 hiljentämisen ja yli-ilmentymisen kokeiluja. Metallotioneiini 2A on tunnettua suojata HeLa-soluja vastaan ​​ROS-indusoidun kuoleman [30], kun taas IL-8 estää perävaunu ja lääkkeen indusoiman apoptoosin eturauhassyöpäsolujen [33] ja lisää tuumorigeenisyyteen ja metastaattisen potentiaalin melanoomasolujen [32]. Mitä mielenkiintoisinta on, CT16 havaittiin olevan negatiivinen säätelijä DKK1, geenin kuvattu merkittävästi vaimentua on pahanlaatuinen melanooma [43]. DKK1 on solunulkoinen inhibiittori anti-apoptoottisten Wnt-signalointireitin [44], jotka voivat indusoida apoptoosia melanoomasoluissa [27]. Näin ollen, lasku DKK1 ilmentymisen katsotaan olevan tärkeä selviytymismekanismi melanoomasoluissa. Kun analysoimme 20 melanoomaa ihon etäpesäkkeiden niiden DKK1 ja CT16 mRNA: n ilmentymisen, kolme näytettä osoitti poikkeuksellisen korkealla CT16 tasot ja samanaikaisesti erittäin alhainen DKK1 ilme. Näin ollen tietomme osoittavat, että CT16 yliekspressio on yksi, mutta luultavasti ei ole ainoa mekanismi, joka johtaa DKK1 tukahduttaminen melanooma. CT16 myös parantaa ilmaisun rasvahappojen sitovan proteiinin 7 (FABP7), tunnettu promoottori melanooman etenemisen [29].

tarkka mekanismi, kuinka CT16 säätelee näiden geenien ilmentymistä jää tutkittavaksi. Page4, joka on paralogi on CT16, on äskettäin osoitettu sitoutuvan suoraan DNA [18]. Lisäksi sekä CT16 ja Sivu4 ovat luontaisesti huonokuntoinen proteiineja [18], [19], [45]. Kuitenkin, CT16 DNA: han sitoutumisen ei ole havaittu [19]. Tästä syystä, vaikka homologia page4 ja CT16 vaikutusmekanismi voi vaihdella huomattavasti näiden kahden proteiinin välillä. Lisäksi olemme jätetty kaksi muita tunnettuja mekanismeja CTA-X toimintaa. Meidän tiedot osoittavat, että p53 ei välittävät vaikutusta CT16 huolimatta siitä, että MAGE-proteiinit, toimii tällä tavalla. Kumpikaan voisi havaitsemme yhteyden DNA: n metylaation ja CT16 säännelty geenejä.

Lopuksi viimeaikaisesta edistymisestä kehittämisessä lääkehoidon edenneisiin melanooman on johtanut kiireesti kehittää uusia biomarkkereiden taudin etenemisen. Olemme hiljattain ehdottaneet, että seerumin CT16 tasoja voitaisiin käyttää seurata hoidon tehokkuutta ja otaksuttu pahenemisvaiheita. Tässä me raportoimme, että CT16 edistää myös sairauden patogeneesiin säätelemällä sekä apoptoottisten ja antiapoptoottisten geenien ja edistää melanooma solujen eloonjäämistä. Siksi CT16 on otaksuttu kohdemolekyyli lääkekehityksen tavoitteena voimistaa apoptoosin indusoivia lääkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kliiniset tutkimukset hyväksyttiin institutionaalisten Review board Turun yliopistollisen sairaalan, ja kutakin potilasta edellyttäen kirjallinen lupa osallistua kokeisiin ja /tai sallia hänen /hänen kudosnäytteitä voidaan käyttää tutkimustarkoituksiin.

Solulinjat ja transfektiot

melanoomasolulinjojen A2058, SK-MEL-2, ja WM-266-4 alun perin saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA) on todistaa oikeaksi Health Protection Agency Culture kokoelmat (Porton Down, UK) käyttämällä STR analyysimenetelmä. Melanooman solulinjoja pidettiin 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. CT16 cDNA, mukaan lukien lopetuskodoni kloonattiin PCR-ekspressiovektorin CT16 [16] ja insertoitiin

Xba

I ja

Eco

RI sivustoja pEXPR-IBA103 plasmidi (IBA GmbH, Göttingen, Saksa). Määränä, joka on 1 ug CT16 cDNA-sisältävät tai ehjä (kontrolloida cDNA) pEXPR-IBA103 transfektoitiin WM-266-4-soluihin käyttäen Fugene 6-transfektioreagenssia (Roche, Basel, Sveitsi) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kun oli inkuboitu 48 h G418-resistentit solut valitaan 0,8 mg /ml G418: aa (Invitrogen). Stabiilisti transfektoituja soluja ylläpidettiin alustassa, joka sisälsi 0,2 mg /ml G418: aa.