Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa, mikä viittaa siihen, että uudet strategiat ehkäisyyn ja hoitoon PDAC ovat pikaisesti. K-ras-mutaatioiden havaitaan 90% haimasyövän, mikä viittaa sen rooli aloittamisesta ja varhaisissa kehitysvaiheissa PDAC. Saadakseen mekanistisen käsityksen siitä roolista mutatoidun K-ras, muutama hiiren on kehitetty kohdistamalla ehdollisesti mutatoitunut K-ras

G12D varten pääpiirteittäin PDAC. Merkittävä yhteistyö operativity on osoitettu kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden koostetussa hiirimallissa aktivoidulla K-ras ja INK4a /Arf puutos. Kuitenkin molekyylitason mekanismi (t), jolla K-ras ja INK4a /Arf puutos edistää PDAC ei ole täysin selvitetty.

Menetelmät /Principal Havainnot

arvioimiseksi molekyylimekanismin (s ), jotka ovat mukana kehittämässä PDAC yhdisteessä siirtogeenisiä hiiriä aktivoidulla K-ras ja INK4a /Arf puutos, käytimme useita menetelmiä, kuten reaaliaikainen RT-PCR, western blotting-määritys, immunohistokemia, MTT-määritystä, invaasio, EMSA ja ELISA. Huomasimme, että poistaminen INK4a /Arf K-ras

G12D ilmentävien hiirien johtaa PDAC, joka on osittain välittyvät aktivoitumisen Notch ja NF-KB signalointireitteihin. Lisäksi löysimme alas-säätely miR-200 perhe, joka voisi myös tärkeitä rooleja kasvaimen kehittymistä ja etenemistä PDAC yhdisteessä siirtogeenisiä hiiriä.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset viittaavat että aktivointi Notch ja NF-KB yhdessä menetys miR-200 perhe on mekaanisesti liittyy kehittymistä ja etenemistä PDAC yhdisteessä K-ras

G12D ja INK4a /Arf puutteellinen siirtogeenisiä hiiriä.

Citation: Wang Z, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Azmi AS, Gunn JR, et al. (2011) Aktivoitu K-ras ja INK4a /Arf puutos aikana yhteistyössä kehittämiskeskuksen haimasyövän aktivoimalla Notch ja NF-KB signalointireitteihin. PLoS ONE 6 (6): e20537. doi: 10,1371 /journal.pone.0020537

Toimittaja: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 02 toukokuu 2011; Julkaistu: 03 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute, National Institutes of Health myöntää 5R01CA131151, 5R01CA131151-S02, ja 5R01CA132794 (FH Sarkar) ja CA-075059 M. Korc. Kirjoittajat kiittää Puschelberg ja Guido perustan niiden antelias rahoitusosuudesta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on erittäin aggressiivinen pahanlaatuinen sairaus, joka on rankattu neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat, joiden mediaanielossaolosta 6 kuukautta, ja joiden arvioitu 43140 hiljattain diagnosoitujen tapausten ja noin 36800 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2010 [1]. On hyväksytty, että kehitystä PDAC tapahtuu läpi etenemistä esiasteleesioita kuten haiman epiteelinsisäisen neoplasia (Panin), jotka vaihtelevat huonolaatuisen PanINs (Panin-1A, Panin-1B) korkea-asteen PanINs (Panin-2, PANIN-3) [2], [3]. PDAC on osoitettu olevan monivaiheinen molekyyli etenemisen mukaan lukien korkean taajuuden aktivoimalla K-ras-mutaatioiden ja sen jälkeen inaktivoitumisen p16

INK4a, p53, Smad4, p14ARF tuumorisuppressorit ja muita geneettisiä poikkeavuuksia hiirimalleissa [4] – [ ,,,0],6] ja ihmisen [7]. Yleisin K-ras-mutaatio ihmisen PDAC on kodoni 12 (Kras

G12D), joka liittyy aktivointi GTPaasi-aktiivisuus. Siksi useat hiiri malleja PDAC on luotu kohdistamalla ehdollisesti mutatoitunut K-ras

G12D kerrata etenemistä PDAC [8] – [12]. Yksi yhdiste hiirimallissa, joka sisältää aktivoitua K-ras ja INK4a /Arf puutos osoitti yhteistyöhön tuottamaan metastaattisen PDAC [13], [14]. Kuitenkin molekyylitason mekanismi (t), jolla aktivoidaan K-ras ja INK4a /Arf puutos edistää PDAC aggressiivisuus ei ole täysin selvitetty.

Viime vuosina monet signalointireitteihin kuten Notch polku on tutkittu ja todettu on tärkeitä rooleja PDAC [15]. Notch signalointi on kriittisten toimintojen valvonnasta solujen kasvua, erilaistumista, apoptoosin, muuttoliike, invaasio ja etäpesäkkeiden PDAC [16]. Notch geenit koodaavat proteiineja, jotka voidaan aktivoida vuorovaikutuksessa perheen sen ligandien. Tähän mennessä neljä Notch reseptorit (Notch1-4) ja viisi ligandit (dll-1, dll-3, dll-4, Jagged-1, Jagged-2) on tunnistettu [17]. Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että toiminta Notch-signaloinnin tuumorigeneesissä voi olla joko onkogeeniset tai oncosuppressive, ja toiminto on myös yhteydessä riippuvainen PDAC [18], [19]. Notch signalointi usein vapautettu jopa säädelty ilmentyminen Notch reseptorien ja niiden ligandien PDAC [20]. Olemme osoittaneet, että alas-säätely Notch-1 käyttämällä erityisiä siRNA korreloi vähentynyt proliferatiivinen hinnat, lisääntynyt apoptoosi, vähentää muuttoliikettä, ja laski invasiivisia ominaisuuksia haimasyöpäsoluissa [21], [22]. Viime aikoina on havaittu, että aktiivinen Notch signalointi voi synergoida K-ras Panin aloittamista ja etenemistä invasiivisia adenokarsinooma [8], [23]. Inhibitio Notch signalointireitin johti tuumorin etenemisen hiirimallissa (K-ras, p53 L /+ hiirillä) ja PDAC [24]. Viime aikoina, Mazur et al. havaitsivat, että puute Notch-2 pysähtyy Panin etenemistä, pidentää elinaikaa estämällä Myc signaloinnin K-ras-ajettu haiman syövän synnyn [25]. Yllättäen Notch-1 on äskettäin löydetty tuumorisuppressorina mallissa K-ras aiheuttama PDAC [18], mikä viittaa siihen, että lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään roolia Notch signaloinnin PDAC.

Notch polku on raportoitu cross-talk NF-KB, yksi suurimmista transkriptiotekijän liittyy solujen kasvuun ja apoptoottisten säätelyreittejä haimasyövän. Tutkimukset ryhmämme paljasti, että Notch signalointi voivat aiheuttaa NF-KB-aktiivisuuden haimasyövän [21]. Äskettäin on osoitettu, että NF-KB-reitin tarvitaan kasvainten kehittymisen hiirimallissa (K-ras p53-L /L-hiiriä) keuhkojen adenokarsinooma [26]. Lisäksi todettiin, että geneettinen deleetio NF-KB-alayksikön p65 on K-ras-indusoidun keuhkosyöpä hiirimallissa keuhkojen kasvaimien synnyn läsnä ollessa ja poissa ollessa kasvaimen p53 [27]. Kuitenkin, se on suurelta osin epävarmaa, NF-KB: n on tarpeen K-ras-indusoidun PDAC etenemistä.

Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme molekyylitason muutoksia hiiren kasvaimia kehittyi yhdiste siirtogeenisiä hiiriä aktivoidulla K- ras ja INK4a /Arf puutos. Tässä osoitamme, ensimmäistä kertaa, että poistaminen INK4a /Arf K-ras ilmentävien hiirien johtaa PDAC, joka on osittain välittyvät aktivoitumisen Notch ja NF-KB signalointireitteihin. Lisäksi löysimme muutoksia ilmaus miR-200 perhe, joka voisi myös tärkeitä rooleja kasvaimen kehittymistä ja etenemistä PDAC yhdisteessä siirtogeenisiä hiiriä aktivoidulla K-ras ja INK4a /Arf puutos.

Tulokset

Notch signalointireitille ilmenee vahvasti Pdx1-Cre, LSL-K-ras

G12D; INK4a /Arf mouse

hahmottelevat mekanistinen roolia mutatoidun K-ras kehittämiseen ja etenemisen PDAC, arvioimme ilmentymistä Notch reitin hiirimallissa. Tässä mallissa onkogeenisiä K-ras (Kras

G12D) lyödään sisään omaan lokukseen ja kopiointia vaimennettu johtuen lisäämällä loxP-Stop-LoxP elementti (LSL). Kun LSL- Kras

G12D hiiret kasvatetaan siirtogeenisiä hiiriä, jotka ilmentävät Cre-rekombinaasia valvonnassa ja Pdx1 promoottorin, ekspressiota Cre-rekombinaasin haiman kantasolujen avulla poistamisen Floxed transkription STOP kasetti, joka johtaa aktivointi onkogeeniset K-ras-alleeli. Tässä mallissa ei ollut kasvaimia helposti havaittu jopa 30 viikon ikään LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre (vaadimme KC tässä käsikirjoitus) hiiriä, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimuksen [13]. Olemme myös löytäneet mitään todisteita PDAC että INK4a /Arf; Pdx1-Cre (me kutsutaan IC tässä käsikirjoitus) eläimiä enintään ikä 24 viikon samanlainen havainto dokumentoitu muiden ryhmien [13]. Kuitenkin kaikki 25 hiiriä LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre; INK4a /Arf (vaadimme KCI tälle käsikirjoitus) ryhmässä todettiin haiman kasvaimia vaihtelevat halkaisijaltaan 4-10 mm: n välillä 45-80 päivää (Fig. 1A). Yhdiste KCI hiirten kasvainten tuli kuolemaisillaan (Fig. 1A, selviytyminen käyrä). Kasvaimet varmistettiin histopatologinen tutkimus (Fig. 1 B). Ki-67, joka on tunnettu leviämisen markkeri, oli hyvin ilmaistu KCI haimatuumorien (Fig. 1 B). On raportoitu, että Notch signalointireitille on kriittinen rooli kehittymistä ja etenemistä haimasyövän. Siksi arvioimme ilmentymistä Notch geenien näissä siirtogeenisissä hiirissä kudoksissa. On tärkeää huomata, että olemme keskittäneet Tutkimuksia pilkotun Notch, koska se on aktiivinen funktionaalinen muoto Notch. Siksi Notch meidän kaikkien kuvassa legendat tarkoittaa aktiivista lohkaistun Notch. Olemme havainneet, että Notch-signaloinnin aktivoitiin kasvaimissa KCI hiirissä verrattuna haimasta KC ja IC hiirille (Fig. 1 C, D). Ekspression Notch-2 ja Notch-4 oli säädelty sekä mRNA ja proteiini tasoilla KCI hiirissä. Kuitenkin Notch-1 ilmentymisen osoittaneet mitään muutosta ja Notch-3 ekspressio lisääntyi vain mRNA-tasolla kasvaimissa KCI hiirissä, mikä viittaa siihen, että roolit Notch-2, ja Notch-4 voisi olla tärkeää etenemistä haimasyövän. Huomasimme myös, että kaikki viisi Notch ligandit olivat säädellään ylöspäin kasvainten johdettu KCI hiiristä (Fig. 2A, B). Näiden tulosten vahvistamiseksi, arvioimme ilmaus Notch loppupään geenejä, kuten Hes-1 ja Hey-1. Olemme havainneet, että ilmentyminen HES-1 ja Hey-1 lisättiin kasvaimissa KCI hiirissä (Fig. 2A, B), mikä oli odotettua, joka perustuu ylös-säädellään ilmentyminen Notch-2, Notch-4 ja niiden ligandit.

, Top vasen paneeli: kasvainvaikutuksen KCI hiirillä (N 25). Ohjaus hiiret: KC ja IC hiirillä. Oikean yläreunan: keskimääräinen pituus on kasvaimia KCI hiirillä (N 20). Pohjalevy: Kaplan-Meier haimakasvain elinaika käyrää KCI hiirille ja ohjaus eläimiä. Ohjaus hiiret: yhdistelmät KC ja IC hiirillä. B, Ylälevy: mikroskooppinen tarkastelu kasvaimia peräisin KCI hiiristä koostuvat soluista, jotka muodostavat kanavat paikkoihin (punaiset nuolet). Fokaalisesti kasvainsoluja levyinä. Solut ovat suuria, erittäin epätyypillisiä, suuret, pleomorphic ytimet ja näkyvästi 2-3 nucleoli (keltaiset nuolet) solua kohti. Sytoplasmassa on eosinofiilinen vaalean eosinofiilinen sulkeumat (vihreät nuolet) muutamassa soluissa antaa rhabdoid ominaisuus soluihin. Ympäröivät strooman näyttää spindled solujen pitkänomainen ytimet (mustat nuolet) ja hajallaan tulehduskeräytymää käsittää neutrofiilien, lymfosyyttien ja harvat plasman soluja. Pohjalevy: Ki-67 oli erittäin ilmaistu kasvaimia saatu KCI hiirten arvioitiin immunohistokemiallisesti. C, Notch signalointireitille oli säädelty mRNA tasolla arvioituna Reaaliaikainen RT-PCR kasvaimissa peräisin KCI hiirillä. D, Notch polku oli hyvin ilmaistu kasvaimia, jotka ovat peräisin KCI hiirten arvioitiin western blotting -analyysi ja immunohistokemia, vastaavasti.

A, ilmentyminen Notch ligandien ja Notch alavirran geenien nostettiin mRNA-tasolla arvioituna Reaaliaikainen RT-PCR kasvaimissa peräisin KCI hiirillä. B, ilmentyminen Notch ligandien ja Notch alavirran geenien ilmentyy voimakkaasti kasvaimia, jotka ovat peräisin KCI hiirten arvioitiin western blotting -analyysi. C, NF-KB p65 aktiivisuus lisääntyi kasvaimia johdettu KCI hiiristä ELISA. D, vasen paneeli, NF-KB p65 DNA-sitoutumisaktiivisuutta lisääntyy kasvaimia peräisin KCI hiiristä arvioituna EMSA. Oikea paneeli, fosfori-p65 oli hyvin ilmaistu kasvaimia saatu KCI hiirten arvioitiin immunohistokemiallisesti.

NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden aktivoitiin KCI hiirillä kudoksessa

NF KB: n on raportoitu rajat puhua Notch polku [28]. Olemme aiemmin ilmoitettua, että Notch-1 voi säätää ylös NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta haimasyövän [22]. Näin ollen, olemme tutkineet, onko myötävirtaan vaikutus Notch ylössäätöä voidaan mekaanisesti liittyvät NF-KB-reitin kasvaimissa näillä eläimillä. On hyvin tunnettua, että NF-KB-perheen koostuu homo- ja heterodimeerejä Rel-proteiinien; NF-κB1 (p50); NF-KB (P52), RelA (p65), RelB, ja c-Rel (Rel). NF-KB: n (p50 /p65) on kaikkialla läsnä, konstitutiiviset ja indusoituvat heterodimeerin. Yleisesti, DNA: ta sitovaa aktiivisuutta NF-KB: n perinteisesti viittaa p50 /p65 (p50 /RelA) heterodimeeri-välitteistä sitoutumista DNA: n, ja se on tunnettu säätelijä solujen eloonjäämistä ja anti-apoptoosin signalointia. Tumassa, p65 NF-KB-alayksikön on voimakas aktivaattori erilaisia ​​geenejä; Siksi arvioimme ydinvoiman ilmentymistä p65-proteiinin immunohistokemiallisesti. Nuclear proteiineja kasvaimia saatu hiiret altistettiin myös NF-KB: n p65: n ELISA, ja NF-KB: n p65: n DNA: ta sitova aktiivisuus mitattuna EMSA. Tulokset osoittivat, että NF-KB: n p65: n aktiivisuus arvioitiin ELISA: lla, ja NF-KB: n p65: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta aktivoitu kasvaimia, jotka ovat peräisin yhdisteestä KCI hiirissä (Fig. 2C, D). Nämä tulokset osoittivat, lisääntynyt ydinvoiman kertyminen p65 kasvaimissa KCI hiirissä, mikä viittaa siihen, että molemmat aktivointi K-ras ja INK4a /Arf puutos tarvitaan parannettu NF-KB: n aktivaation. Lisäksi immunovärjäytyminen osoitti myös, että fosfo-p65 oli hyvin ilmaistu ydinvoiman osastossa kasvainkudoksessa KCI hiirten (Fig. 2D).

NF-KB alavirtaan geenit aktivoituvat KCI hiirillä

on raportoitu, että Notch polku stimuloi NF-KB aktiivisuuden kohdunkaulan syöpäsolujen liittämällä kanssa IKK signalosomi kautta IKKα [29]. Aiempi tutkimus on osoittanut, että Notch polku säätelee IKKα ilmentymistä haimasyövän [30]. Näin ollen tutkimme ilmentymistä IKK proteiinin kasvainten KCI hiirillä. Olemme havainneet, että kaikki IKK perheenjäsenet, kuten IKKα, IKKβ ja IKKγ aktivoitiin kasvaimissa KCI hiirissä (Fig. 3A). Edelleen tutkia vaikutuksia NF-KB: n aktivaation, tutkimme ekspressiotasot tiettyjen NF-KB: n kohde- geenejä, mukaan lukien COX-2, sykliini D1, MMP-9, MMP-2, Bcl-2, c-myc, ja surviviini mukaan reaaliaikainen RT-PCR: llä ja western-blottauksella, vastaavasti, käyttäen kasvaimen kudokset saatu yhdiste KCI siirtogeenisiä eläimiä. Reaaliaikainen RT-PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että näiden geenien ilmentymistä aktivoitiin kasvaimissa KCI hiirissä (Fig. 3A, B). Olemme myös havainneet, että ilmentyminen Stat3 aktivoitiin kasvain muodossa KCI hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). On hyvin tunnettua, että nämä geenit kriittisiä rooleja solujen kasvua, invaasio ja metastaasi. Siksi nämä tulokset tukevat edelleen rooli NF-KB kasvaimen kasvua ja etenemistä yhdiste KCI hiirillä.

, Western blot-analyysi osoittaa ylöspäin säädelty ilmentyminen IKK, p65 ja NF-KB loppupään geenien kasvaimia peräisin KCI hiirillä. B, Real-time RT-PCR osoittaa lisääntyneen ekspression NF-KB: n alavirran geenien, kuten surviviinista, sykliini D1, Bcl-2, C-myc, MMP-2, ja MMP-9: n kasvaimia, jotka ovat peräisin KCI hiirillä. C, ilmentyminen miR-200 perhettä alassäädetty kasvaimissa KCI hiirten arvioituna reaaliaikaisen RT-PCR. D, reaaliaikainen RT-PCR osoittaa vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja lisääntynyt ilmentymä vimentiinista, ja vaatimaton kasvu ilmaus ZEB1 taas 30-kertainen ilmentymistä ZEB2 kasvaimissa johdettu KCI hiirillä.

mirna-200 perhettä alassäädetty KCI hiirillä

miR-200 perhe on todettu säännellä Notch signalointireitille [31]. MIR-200 perhe on viisi jäsentä: miR-200a miR-200b, miR-200c, miR-141 ja miR-429. Olemme havainneet, että Notch-1 voi olla yksi kohdegeenien miR-200 perhe (miR-200b miR-200c), koska yli-ilmentyminen näiden miRNA esti merkittävästi Notch-1 ilmentymisen eturauhassyövän [31] ja haimasyöpä ( julkaisematon data). Käsitellä onko miR-200 perhe on osallisena kasvainten KCI hiiriä, jotka osoittivat korkeaa ekspressiota Notch (Notch-2 ja 4) signalointireitin, tutkimme ekspressiota miR-200 perheen. Kuten odotettua, ilmentymisen miR-200a miR-200b ja miR-200c on merkittävästi vähentynyt kasvaimissa KCI hiirissä (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvaimia kehittyi yhdiste hiirillä voisi osoittaa aggressiivista käyttäytymistä niin hankinnan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi, joten olemme edelleen tutkittava molekyyli meikkiä kasvainten johdettu yhdisteestä KCI siirtogeenisiä hiiret jäljempänä esitetyllä tavalla.

Todisteet EMT fenotyypin kasvaimia johdettu yhdisteestä KCI siirtogeenisiä hiiriä

Viime aikoina monet tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-200 perheen säätelee EMT kohdistamalla sinkki sormen E -box sitova homeobox 1 (ZEB1) ja ZEB2. EMT on prosessi, jossa epiteelisolujen läpi merkittäviä morfologisia muutoksia ominaista siirtyminen epiteelin mukulakivi fenotyyppi pitkänomainen fibroblastivasteeseen fenotyypin. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-200a miR-200b, ja miR-200C oli säädellä vähentävästi gemsitabiinin kestävä haimasyöpäsoluissa, sopusoinnussa havaittu EMT fenotyyppi [32], [33]. Lisäksi olemme osoittaneet, että miR-200 perheen säätelee ilmentymistä ZEB1, Slug, E-kadheriinin ja vimentiinin, ja siten ehdotti uudelleen ilmentymisen miR-200 voisivat olla käyttökelpoisia käänteinen EMT fenotyyppi mesenkymaaliset-to- epiteelin siirtyminen (MET), joka on osittain dokumentoitu meidän tuoreen julkaisun [34]. Koska huomasimme alhainen ilmentyminen miR-200 perheen kasvainten KCI hiirillä, arvioimme EMT markkereita tutkia kasvaimet KCI hiirillä tehtiin EMT vai ei. Olemme löytäneet menetys E-kadheriinin ilmentymisen ja kohonnut ilmentyminen vimentiinista ja ZEB2 kasvaimissa KCI hiirillä, vaikka ilmentymisen ZEB1 osoittivat vaatimatonta kasvua (Fig. 3d), mikä viittaa siihen, että ekspression nämä tekijät voivat olla tärkeitä aiheuttamaan EMT fenotyypin kasvaimia KCI hiiriä, joka näyttää olevan sopusoinnussa aggressiivista käyttäytymistä kasvaimia kehittyi yhdiste KCI siirtogeenisiä hiiriä.

esto Notch reitin aiheuttamien alentunut syöpäsolun kasvua hiiren PDAC solulinja

arvioidaan tarkemmin mahdollista roolia Notch väylän haimasyövän, käytimme Rink-1 solulinja, joka oli peräisin KCI haiman kudoksista ja tutkittiin vaikutuksia inhibiittorit Notch reitin. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Rink-1-solut osoittivat nopeaa kasvua

in vitro

ja muodostivat kasvaimia nude-hiirissä [14]. Koska Notch signalointi on aktivoitu

kautta

aktiivisuutta γ-sekretaasin, useita muotoja γ y-sekretaasi-inhibiittorit, mukaan lukien DAPT ja L-685458 on käytetty inaktivoimaan Notch kautta. Niinpä määritettiin solujen elinkelpoisuus Rink-1-soluja käsiteltiin GSI, että MTT-määrityksellä, ja tiedot on esitetty kuvassa 4A. Hoitoon Rink-1-soluja 72 tuntia DAPT, ja L-685458 johti solujen kasvun inhibition. Sen määrittämiseksi, mitkä Notch-reseptori voisi olla tehokas terapeuttinen kohde haimasyöpä, vaikutus Notch 1-4 siRNA solujen kasvuun haimasyövän soluja tutkittiin. Teho GSI ja Notch siRNA varten knockdovvn Notch-proteiinin varmistettiin western blottauksella. Havaitsimme, että Notch-proteiini taso oli tuskin havaittavissa GSI käsitelty tai Notch siRNA transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4B). Erittäin kiinnostavaa, vain inaktivaatio yhden Notch-reseptorin ei merkittävästi estävät solujen kasvua (Fig. 4A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että inaktivointi useita Notch-reseptorien GSI ovat hyvä tapa hoitaa PDAC. Vahvista tämän päätelmän, testasimme ilmentyminen Notch kohdegeenien Rink-1-solut käsiteltiin GSI tai Notch siRNA. Koska vain Notch-2 ja Notch-4 siRNA hieman estivät solujen kasvua, havaitsimme ilmentymistä Notch kohdegeenien Rink-1-solut käsiteltiin näiden kahden siRNA. Kuten odotimme, olemme huomanneet, että GSI esti ilmentymisen Notch kohdegeenien, kuten HES-1, surviviinia, Bcl-2, c-myc, uPA enemmän määrin verrattuna Notch-2 siRNA tai Notch-4 siRNA transfektiolla (Fig. 4C). Siksi käytimme GSI seuraavissa kokeissa. Seuraavaksi testasimme hoidon vaikutuksia solujen elinkelpoisuuden klonogeeniset määrityksessä. GSI käsittely johti merkittävään inhibitioon pesäkkeen muodostumisen Rink-1-soluja verrattuna kontrolli (Fig. 5A). Kaiken kaikkiaan tulokset klonogeeniset määrityksessä olivat yhdenmukaisia ​​MTT data viittaa siihen, että inaktivointi Notch reitin voisi estävät solujen kasvua Rink-1-soluissa.

, Vasen paneeli, inhibitio Rink-1 solukasvua Notch 1-4 siRNA testattiin MTT: llä. Tulokset esitettiin graafisesti tarkoittaa ± SD kolmesta erillisestä kokeesta, jossa on kuudesta määrityksen koetta kohti jokaista kokeellista kunnossa. Keskimmäinen ja oikea paneeli: L-685458 ja DAPT olivat γ-sekretaasin estäjät (GSI), jotka estävät katkaisua Notch-reseptorin, estää Notch signaalitransduktion. GSI ehkäisi merkittävästi Rink-1 solujen kasvua. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille 5000 solua kuoppaa kohti ja käsitellään GSI 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen solujen tiheydet määritettiin MTT-määrityksellä. Kukin arvo on keskiarvo ± SD (n = 6) ja kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, verrattuna kontrolliin. B, Ilmaisu Notch polku oli säädellä vähentävästi Rink-1-solut käsiteltiin GSI tai transfektoitu Notch 1-4 siRNA arvioimana western blotting-analyysi. C, ilmentymistä Notch kohdegeenien oli säädellä vähentävästi Rink-1-solut käsiteltiin GSI tai transfektoitu Notch-2 siRNA tai Notch-4 siRNA arvioimana arvioituna reaaliaikaisen RT-PCR.

, Top, Vasen paneeli: Cell eloonjääminen Rink-1-soluja käsiteltiin GSI. Solut käsiteltiin GSI 72 tuntia oli kunkin klonogeeniset määrityksessä. Mikroskooppivaloku- ero pesäkkeiden muodostumista soluissa käsittelemättömän ja käsiteltiin GSI. Oikea paneeli: Oli merkittävä väheneminen pesäkkeenmuodostusta Rink-1-solut käsiteltiin GSI verrattuna kontrolli soluihin.

P

arvot edustavat vertailuja solujen käsitelty GSI ja ohjaus käyttämällä pariksi

t

testiä. Pohja, Vasen paneeli: karakterisointi apoptoosin jälkeen tehtiin propidiumjodidi (PI) ja anneksiini V-FITC värjäys apoptoosia havaitseminen pakki seurasi virtaussytometrianalyysillä kuluttua 48 h GSI hoitoon Rink-1-soluissa. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen kasvoi 10% vuoden ohjaimen 28-33% vuonna GSI käsitellyissä soluissa. Oikea paneeli: GSI aiheuttama apoptoosin Rink-1-soluissa. Rink-1 solut altistettiin GSI: ssa 72 tuntia. Apoptoosi mitattiin histoni DNA ELISA. Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± SD. * P 0,05, verrattuna kontrolliin. B, Top, Vasen paneeli, invaasiomääritys käytetään GSI käsitellyt solut näytetään alhainen tunkeutuminen soluihin Matrigel-pinnoitettu kalvo, verrattuna kontrolli soluihin. Oikea paneeli: Käyrät osoittavat arvon fluoresenssin tunkeutuneet Rink-1-soluissa. Arvot osoittavat vertaileva määrä tunkeutuneet Rink-1-soluissa. Pohja, Haavojen paraneminen määritys suoritettiin arvioimaan kapasiteettia solumigraation. GSI hoito pienensi soluvaelluksen Rink-1-soluissa. C, GSI esti NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta Rink-1-soluissa arvioituna EMSA. D, Real-time RT-PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että L-685458 esti surviviinin ilmentymistä, c-myc, Bcl-2, ja uPA-geenit.

inhibitio Notch reitin aiheuttamien apoptoottisten solukuolemaa Rink-1 solulinja

Seuraavaksi, tutkimme kokonaiskasvu estäviä vaikutuksia GSI johtuvat osittain induktion apoptoosin, jota tutkittiin käyttäen ELISA-määrityksessä. Nämä tulokset edellyttäen vakuuttavia tietoja että GSI indusoi apoptoosia Rink-1-solulinjassa (kuvio. 5A). Näiden tulosten vahvistamiseksi, käytettiin myös anneksiini V-FITC menetelmä havaita indusoiman apoptoosin GSI, joiden Rink-1-soluja käsiteltiin GSI 48 tuntia. Värjäämällä solut anneksiini V-FITC ja PI, FACS-analyysiä käytettiin erottamaan ja määritetään kvantitatiivisesti prosenttiosuus kuolleen, elinkelpoisia ja apoptoottisten solujen käsittelyn jälkeen. Olemme havainneet, että prosenttiosuus apoptoottisten solujen kasvoi 10% ohjaimen 28-33% in Rink-1-soluissa, kun GSI hoidon (Fig. 5A). Nämä tulokset edellyttäen vakuuttavia tietoja, jotka osoittavat, että inaktivointi Notch koulutusjakson voivat aiheuttaa apoptoosin Rink-1 haiman syöpäsoluja.

esto Notch koulutusjakson laski syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota

Notch polku uskotaan olevan kriittisesti mukana prosesseihin kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että haiman kasvaimia, jotka johtuvat yhdisteessä KCI hiirillä on laaja invaasio viereisiin elimiin, mukaan lukien pohjukaissuoli, vatsa, maksa, ja pernan [13]. Jotta voidaan paremmin arvioida onko Notch polku on kriittinen rooli hyökkäyksen, testasimme vaikutuksia inaktivaation Notch polku on syöpäsoluinvaasiota. Huomasimme, että GSI käsitellyt solut osoittivat alhaisempi läpi tunkeutuminen Matrigel pinnoitettu kalvo kontrolliin verrattuna soluihin. Arvo fluoresenssin tunkeutuneet Rink-1 syöpäsoluja oli pienentynyt noin 5-7-kertaisesti verrattuna kontrollisolujen (Fig. 5B). Jotta edelleen tutkia vaikutusta GSI solun muuttoliikettä ja invaasiota, teimme haavan paranemiseen määritys Rink-1-soluissa. Tulokset osoittavat, että GSI hoito esti kapasiteettia haavojen paranemisen Rink-1-soluissa (kuvio. 5B), mikä viittaa siihen, että GSI voi estää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Nämä tulokset viittaavat suoran roolin Notch signaloinnin Rink-1 syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota, ja nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aggressiivisuus kasvaimia kehittyi yhdiste KCI siirtogeeninen eläin.

esto Notch polku laski NF-KB DNA-sitoutumisaktiivisuutta

selvitti loppupään vaikutusta Notch-1 alassäätöä oli mekaanisesti liittyy NF-KB-reitin. Tumaproteiinien GSI käsitellyistä soluista tehtiin analyysi NF-KB: n p65: n DNA: ta sitova aktiivisuus mitattuna EMSA. Tulokset osoittivat, että GSI esti merkittävästi NF-KB: n p65: n DNA: ta sitova aktiivisuus verrattuna kontrolliin (kuvio. 5C). Nämä tulokset toimitti näyttöä tueksi mekanistinen ylikuulumisen Notch ja NF-KB haimasyövän. Lisäksi olemme myös havainneet, että GSI inhiboi NF-KB: n alavirran geenien ilmentymistä, kuten surviviinia, Bcl-2, c-myc, ja uPA (Fig. 5D).

yli-ilmentyminen miR-200b esti solujen kasvua Jaggedin ligandien

Viime aikoina on raportoitu, että miR-200 perheenjäsenten kohdistaa Notch reaktiotien komponenttien, kuten Jagged-1 [35], [36]. Jotta voidaan tutkia, onko miR-200 perheen säädellä Notch polku, transfektoimme miR-200B esiaste osaksi Rink-1-soluissa. Olemme vahvisti, että transfektio miR-200b esiaste lisääntynyt suhteellinen taso miR-200b Rink-1-solut (Fig. 6A). Yli-ilmentyminen miR-200b laski suhteellisen mRNA-tasoja Jagged-1, Jagged-2 ja niiden kohdegeenien reaaliaikaisella RT-PCR-määrityksen (Fig. 6A). Tiedot western blot-analyysi osoitti, että yli-ilmentyminen miR-200b laski suhteellisen proteiinin tasot Jagged-1 ja sen kohdegeenin kuten HES-1, Hey-1, ja Bcl-2 (Fig. 6B). Lisäksi olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-200b inhiboi solun kasvua Rink-1-solut (Fig. 6B). Seuraavaksi havaitaan, onko estyminen Jagged-1 voisi estävät solujen kasvua. Jagged-1 siRNA merkittävästi vähentynyt ilmentyminen Jagged-1 ja sen kohde Hes-1 ja Hey-1 mRNA ja proteiini tasoilla (Fig. 6C). Lisäksi olemme havainneet, että inhibitio Jagged-1 Jagged-1 siRNA inhiboi Rink-1 solun kasvua (Fig. 6C), mikä viittaa siihen, että Jagged-1 voisi olla potentiaalinen kohde haimasyöpä.

A, vasen paneeli, Re-ilmentyminen miR-200b perustettiin Rink-1-solujen transfektiolla sen esiaste. Keskimmäinen paneeli, Re-ilmentyminen miR-200b ei säätelemään Notch-reseptorien Rink-1-soluissa. Oikea paneeli, Re-ilmentyminen miR-200b säädellä ilmentymistä Jagged-1 ja Jagged-2 mRNA Rink-1-soluissa. B, vasen ja keskimmäinen paneeli, Re-ilmentyminen miR-200b esti ilmentymistä Jagged-1 kohdegeenien mRNA ja proteiini tasoilla Rink-1-soluissa. Oikea paneeli, Re-ilmentyminen miR-200b esti Rink-1 solujen kasvua testi MTT: llä. C, vasen ja keskimmäinen paneeli, Jagged-1 siRNA esti ilmentymistä Jagged-1 kohdegeenin Hes-1 ja Hey-1 mRNA ja proteiini tasoilla Rink-1-soluissa. Oikea paneeli, Jagged-1 siRNA esti Rink-1 solujen kasvua testi MTT: llä.

Keskustelu

PDAC on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [ ,,,0],1]. Vaikka jonkin verran edistystä kemoterapia, sädehoito ja kirurginen tekniikka, yleistä eloonjäämisaste viisi vuotta on vähemmän 4% kaikista potilaista diagnosoidaan PDAC [1]. Nämä pettymystä viittaavat siihen, että uusia ja vaihtoehtoisia lähestymistapoja ymmärtämään mekanismeja PDAC etenemisen kriittisesti tarvitaan. Siirtogeeniset hiiret ovat hyviä malleja tunnistaa patogeeninen rooli spesifisen geenin mutaatioiden ja ydin signalointireittejä liittyy haimasyöpä.

On tunnettua, että K-ras-mutaatioita havaittiin 80% -90% haimasyövän. Onkogeeniset K-ras osallistuu aloittamiseen tai alkuvaiheessa kehittämiseen PDAC. Siksi ehdollinen KC hiiret pidetään hyviä välineitä mekaaniset tutkimukset haimasyövän etenemisen. Koska KC hiiret jäljitellä hidas etenemistä Panin invasiivisen syövän noin 12-15 kuukausi [6], [37], mutta KC hiiret kasvatetaan monissa muissa hiiret osoittivat nopeaa kehityksen PDAC. Esimerkiksi Smad4 /DPC4 haploinsufficiency lyhentää elinikää KC hiirillä mediaanielossaolosta noin 8 kuukautta [10]. LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre; Trp53R hiirillä on lyhenee dramaattisesti mediaanielossaolosta noin 5 kuukautta [6]. Keskimääräinen elinaika KC hiirten LKB1 Heterotsygoottisuuden oli 4,5 kuukautta [11]. PTEN haploinsufficiency merkittävästi lyhentää elinikää KC hiirten keskimääräinen eloonjäämisaika on noin 3,5 kuukautta [9].