Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kliiniset kokemukset histonideasetylaasi estäjien (HDACIs) potilailla, joilla oli kiinteitä kasvaimia on ollut pettymys; kuitenkin, molekyylimekanismi hoidon epäonnistumisen ei tunneta. Siksi pyrimme tutkimaan molekyylimekanismi hoidon epäonnistumisen HDACIs esillä olevassa tutkimuksessa. Olemme havainneet, että HDACIs Trichostatin A (TSA) ja Suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA), voivat aiheuttaa epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi eturauhassyöpä (PCa) soluja, jotka on liitetty muutoksiin solun morfologiassa yhdenmukainen lisääntyneen ilmentymisen transkription tekijät ZEB1, ZEB2 ja Slug, ja mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista, N-kadheriinin ja fibronektiinin. CHIP testi osoitti asetylaatio histoni 3 proksimaalinen promoottorit valittujen geenien, joka oli osittain vastuussa lisääntyneen ilmentymisen EMT markkereita. Lisäksi TSA hoito johti lisääntyminen edelleen ilmaus Sox2 ja Nanog PCA solujen EMT fenotyyppi, joka liittyy syövän kantasolujen kaltaisia ​​cell (CSLC) ominaisuuksiltaan lisääntynyt solun liikkuvuus. Tuloksemme viittaavat siihen, että HDACIs yksinään johtaisi kasvaimen aggressiivisuus, ja siten strategioita palataan EMT-fenotyyppi mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtyminen (MET) fenotyyppi tai käänteinen CSLC ominaisuuksia ennen käyttöä HDACIs olisi hyödyllistä toteuttaa arvo of HDACIs hoitoon kiinteiden kasvainten erityisesti PCa.

Citation: Kong D, Ahmad A, Bao B, Li Y, Banerjee S, Sarkar FH (2012) histonideasetylaasi- estäjät Pakotettava epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon in Eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 7 (9): e45045. doi: 10,1371 /journal.pone.0045045

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2012 Hyväksytty: 11 elokuu 2012; Julkaistu: 14 syyskuu 2012

Copyright: © Kong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA108535-06 ja 5R01CA083695-09) myönnetty FHS (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erilaisia ​​geneettisiä ja genomisten muutosten, kuten monistuksia, translokaatiot, deleetiot, ja pistemutaatioita on uskottu liittyvän syövän kehittymisen. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että epigeneettisellä muutokset ovat mukana myös syövän kehittymisessä [1]. Tärkeimmät muutokset ihmisillä ovat DNA: n metylaation ja posttranslational histonimodifikaation kuten asetylaatio, metylaatio, fosforylaatio, jne, jotka ovat mukana vapautuneilla geenien ilmentymisessä välittämän transkription säätelyyn [1], [2]. Asetylointi ja deasetylointi histonien on merkittäviä rooleja transkription säätelyyn geenien eukaryoottisolut. Asema histoni asetylaatio on riippuvainen tasapaino toiminnan histoni liasetyylitransferaasi (HAT) ja histonideasetylaasi (HDAC). HDAC poista asetyyliryhmiä alkaen lysiiniä histonissa häntää, joka edistää tiivistetympi kromatiinirakenteeseen, jolloin tukahduttamisessa geenin transkription rajoittamalla saavutettavuus transkriptiotekijöiden [3]. Lisääntynyt ilmentyminen ja toiminta HDAC: t syövän kudoksissa johti järkevä suunnittelu histonideasetylaasi estäjien (HDACIs) mahdollisina terapeuttisina aineina syövän hoidossa. Useita HDACIs on käytetty vaiheen I ja II kliinisen tutkimuksen hoitoon useita hematologisten maligniteettien ja myös kiinteitä kasvaimia [4]. Useimmat positiivisia vastauksia HDACIs todettiin potilailla, joilla on hematologisia maligniteetteja, kuten ihon T-solulymfooma ja perifeerisen T-solu lymfooma. Kuitenkin tulokset kiinteitä kasvaimia, tähän asti, on ollut pettymys. Tähän mennessä useita mekanismeja, joiden vastustuskyky indusoidaan käsittelyn aikana kiinteiden kasvainten HDACIs on selvitetty, mukaan lukien lisääntynyt ilmentyminen monilääkeresistenssigeeniä, MDR1 (ABCB1), lisääntynyt anti-apoptoottisia proteiineja ja aktivoimalla solujen eloonjäämistä reitti [3] , ja tällaiset havainnot ei ole vielä käännetty kliinisen lääketieteen. Siksi parempi ymmärtäminen molekyyli- determinantit vastustuskyky HDACIs voisi tarjota perustan kehittää uusia terapeuttisia strategioita, joilla voidaan parantaa hoitotuloksia potilaiden diagnosoitu kiinteitä kasvaimia.

Epithelial-to-mesenkymaalitransitioon (EMT ) uskotaan liittyvän lääkeresistenssideterminantit [5], [6]. Biologiaan EMT on ratkaiseva trans-eriyttäminen prosessi, joka tapahtuu alkionkehityksen aikana ja aikuisen kudoksissa seuraavissa haavan paranemisen ja elinten remodeling vastauksena vammoja, ja myös esiintyy syövän etenemisen [7], [8]. Tämän prosessin aikana epiteelisolujen hankkia mesenkyymisolun morfologia kautta alas-säätely epiteelin markkereita ja säätely ylöspäin mesenkymaalisten markkereita, mikä johtaa lisääntyneeseen muuttavien kapasiteettia, invasiivisuus ja kestää paremmin kemoterapiaa, ja jotka kaikki ovat osallisina syövän etenemisen [ ,,,0],7] – [15]. Lisäksi solut EMT fenotyyppi on samoja ominaisuuksia syövän kantasolujen kaltaisia ​​cell (CSLC), joka antaa lääkeresistenssin näihin soluihin ja edistää syövän uusiutuminen ja etäpesäkkeiden [10], [11], [16], [17]. Kong et ai., Todettiin, että yli-ilmentyminen PDGF-D johti induktion EMT fenotyypin PC3 eturauhassyöpä (PCa) soluja, jotka oli liitetty menetys epiteelin markkerit ja saada ilmentymisen mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin , vimentiinistä sekä ylössäätöä transkriptiotekijöiden kuten ZEB1, ZEB2 ja Slug, mikä parantaa solujen vaeltamiseen, invaasiota i

n vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

[9 ]

, [18],

[19]

. Lisäksi PDGF-D yli-ilmentävien PC3-solut (PC3 PDGF-D solut) kanssa EMT fenotyyppi näkyvissä CSLC allekirjoitukset, mikä oli yhdenmukainen lisääntyneen ilmentymisen Oct4. Nanog, Sox2 ja Lin28B, mikä parantaa klonogeeniset kyky ja kyky uusiutua [10].

Klarmann et al. osoittaneet, että invasiivisia soluihin matrigeelin koki EMT fenotyyppisen muuntaminen ja näyttää lisääntyneen ilmentymisen CD44 ja laski ilmentymä CD24, ja lisääntynyt Hedgehog signalointi. Lisäksi invasiivisia soluja DU145 soluja ja soluja ihmisen ensisijainen PCa ovat tuumorigeenisemmiksi NOD /SCID-hiirissä verrattuna ei-invasiivisia soluja [20]. Mekanistisesti yhteistyö välillä RAS aktivaation ja menetys PTEN johti hankintaan varsi /kantaisä subpopulaatio mesenkymaalisten ominaisuuksia, ja nämä solut olivat erittäin metastaattinen kun potilaalle tehdä elinsiirron [21]. Alhainen ilmentyminen ETS transkriptiotekijän ESE3 /EHF osoitettiin liittyvän lisääntynyt biokemiallisten uusiutuminen ja vähentää eloonjäämisaste PCa potilaiden jälkeen eturauhasen, jonka todettiin olevan sopusoinnussa induktio EMT ja hankinnan CSLC allekirjoituksia, jotka johtivat kasvaimeen aloittamista ja metastaattisen ominaisuudet Eturauhassyövän soluja [22]. Androgeenipuutteen hoitoon (ADT) on yleisesti käytetty metastaattisen PCa, ja Jennbacken et ai. osoittivat, että ADT voisi lisätä N-kadheriiniekspressiota, tunnusmerkki EMT, joka oli yhteydessä lisääntyneeseen etäpesäkkeiden [23]. Lisääntynyt ilmentyminen N-kadheriinin ei-metastasoituneen, androgeeniriippuvainen PCA eläinmallissa johti kastraatio vastus, lisääntynyt invaasio ja metastaasi, mikä oli sopusoinnussa havaintojen osoittavat kohonnut ilmentyminen N-kadheriinin perus- ja etäpesäkkeitä sairastavia potilaita kastraatio resistenttejä (PCA CRPC) [24]. Lisäksi viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että ADT voisi aiheuttaa EMT ja johtaa hankinnan CSLC allekirjoitusten sekä normaaleilla hiiren eturauhasessa ja ihmisen LuCaP35 eturauhasen kasvain eksplanttien. Samanlaisia ​​muutoksia mesenkymaalisten ominaisuudet havaittiin myös eturauhaskasvaimissa saaneilta potilailta ADT [25]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että induktio EMT ja CSLC allekirjoitukset johtaa terapeuttiseen kestävyys ja johtaa eturauhassyövän etenemiseen.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että hoito Eturauhassyövän soluja TSA tai SAHA aiheuttama EMT fenotyyppi välittyvät ylös -regulation transkriptiotekijöiden ja mesenkymaalisten merkkiaineiden kautta edistää asetylaatio histoni 3 proksimaalinen edistäjiä geenejä. Lisäksi TSA käsittely johti myös lisätä ilmaus kantasolujen merkkiaineiden EMT fenotyypin PCa soluja. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​lisääntynyt solun liikkuvuus TSA tai SAHA käsitelty PCa soluja. Tuloksemme antavat mekanistinen perusta pettymys tulokset HDACIs hoidettaessa kiinteitä kasvaimia, ja viittaavat lisäksi siihen, että käänteinen EMT fenotyypin tai CSLC ominaisuuksien perusteella uusi lähestymistapa ennen HDACIs voisi tulla järkevä strategia kiinteiden kasvaimien hoitoon erityisesti PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuurin kunto

LNCaP ja PC3-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja ylläpidetään RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 10 umol /l Hepes, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Stabiilit solulinjat yli-ilmentävät PDGF-D (tarkoitetut PC3 PDGF-D) tuli kuten aiemmin on kuvattu [19], ja niitä viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen), jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mmol /L glutamiinia, 10 umol /l Hepes, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki soluja ylläpidettiin 5% CO

2-kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa ja genotyyppisesti ominaista tukea aitouden näiden solujen, mikä oli sopusoinnussa sen alkuperästä.

Tutkimus reagenssit ja vasta-aineet

Trichostatin A (TSA) saatiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO) ja Suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) hankittiin Aton Pharma, Inc, (Lawrenceville, NJ). Vasta-aineita asetyyli-histoni H3 (Lys9), HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, Slug, Sox2 ja Nanog ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineita N-kadheriinin ja vimentiinista ostettiin BD Biosciences (Bedford, MA) ja Abcam (Cambridge MA), tässä järjestyksessä. Vasta-aineita ZEB1, fibronektiinin ja E-kadheriinin saatiin Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Vuohen anti-kani-lgG (H + L), HRP-konjugaatilla ja vuohen anti-hiiri-IgG (H + L), HRP-konjugaatti ostettiin Bio-Rad (Reinach, BL). Vasta-aine glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) saatiin Affinity Bioreagents (Golden, CO). Alex Fluro 594 vuohen anti-kani-IgG- tai Alex Fluro 594 vuohen anti-hiiri-IgG ja Alexa Fluor 594 phalloidin F-aktiinin värjäytyminen ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

(A ja B) PC3-soluja käsitelty TSA ja SAHA 24 tuntia ilmoitetuilla annoksilla. Valomikroskooppikuvat PC3-solujen käsitelty TSA ja SAHA näytteillä fibroblastisella-tyyppinen fenotyyppi, kun taas solut, joita käsiteltiin DMAO ohjaus näkyy pyöristetty epiteelisolujen morfologia (alkuperäinen suurennos, × 100). (C) PC3-soluja ympättiin kammiossa. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin 400 nM TSA tai 5 uM SAHA vielä 24 tuntia. Tulokset immuno-fluoresenssia värjäytymistä vimentiinista ja ZEB1 (Red) osoitti, että hoito PC3-solujen TSA ja SAHA lisääntynyt ilmentyminen vimentiinista ja ZEB1 (keskimmäinen ja oikea paneeli) verrattuna kontrollisoluihin (vasen paneeli). Falloidiinia värjäys osoitti F-aktiini (punainen) uudelleenjärjestely TSA ja SAHA käsiteltiin PC3-soluissa. Nuclear DNA värjättiin DAPI (Blue, alkuperäinen suurennos, x 200).

Kokonais-RNA eristettiin PC3-soluja käsiteltiin 200 nM ja 400 nM TSA (A) tai 2,5 uM ja 5 uM SAHA (B) 24 tuntia. Tulokset reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että suhteellinen mRNA ilmaus ZEB1, ZEB2, Slug, Twist, N-kadheriinin, vimentiinistä ja MMP2 nostettiin hoidon jälkeen verrattuna DMSO-kontrollin (arvo kontrolli suunniteltiin 1, * p 0,01).

Cell migraatiokokeessa

Solun migraatiokokeessa suoritettiin käyttäen 24 hyvin TranswellTM läpäisevä tukee 8 um huokosia (Corning, Lowell, MA) ohjeiden mukaan valmistajan toimittamia. Lyhyesti, PC3-solut käsiteltiin TSA, SAHA tai DMSO ohjaus 6 tuntia kerättiin ja suspendoitiin seerumittomassa RPMI 1640 -alustassa ja 1 x 10

5 solut kussakin kuopassa siirrostettiin Transwell inserttejä. Pohjakaivoa täytettiin 0,5 ml: lla väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. 24 tunnin inkubaation, siirtyneet solut määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9].

Western blot -analyysi

Yhteensä solulysaatteja valmistettiin hajottamalla solut RIPA-puskurissa. Proteiini mitattiin käyttämällä proteiinia määritysreagenssit (Pierce, Rockford, IL). Proteiineja, joilla on sama määrä alistettiin SDS-PAGE erottaa ja siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosakalvoille. Kun oli salvattu 3% maidon proteiini havaittiin inkuboimalla vastaavien primaaristen vasta-aineiden seurasi inkubointi vastaavien sekundaarisia vasta-aineita, kuten aiemmin on kuvattu [26].

Reaaliaikainen RT-PCR

kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA). Jäljelle jäänyt DNA poistettiin käyttäen RNaasi-vapaata NDase (Qiagen). High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Fostor, CA) käytettiin käänteistranskriptio yksi mikrogramma RNA cDNA mukaan valmistajan ohjeiden. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen alukkeita määrittää geenin ilmentyminen käyttäen SYBR® Green RT-PCR-reagenssit (Applied Biosystems). Suhteellinen määrä mRNA normalisoida ilmaus GAPDH. Primer sekvenssit esitetään taulukossa 1.

CHIP Pitoisuus

SimpleChIP® Entsymaattinen Kromatiini IP Kit (magneettiset helmet) ja 6-Tube magneettierotukset teline ostettiin solusignaloinnin ja käytetään suoritettaessa CHIP määritystä mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, PC3-solut käsiteltiin 400 nM TSA ja 5 uM SAHA tai DMSO-kontrollin 16 tuntia ja 37% formaldehydiä, lisättiin (lopullinen formaldehydin pitoisuus oli 1%) silloittamiseksi proteiinien DNA: han ja sekoitetaan, ja sitten inkuboitiin 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa . Glysiini lisättiin ruokia ja soluja inkuboitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen jääkylmällä PBS, ydinvoima otteet soluista wee valmis. Rajat liittyvät kromatiinin valmiste, ydin- suspensio lisättiin Micrococcal nukleaasi sulattaa DNA pituus on noin 150-900 bp ja Micrococcal nukleaasi inaktivoitiin EDTA ja sonikoitiin sitten useita pulsseja rikkoa tumakalvon. Puhdistuksen jälkeen DNA-fragmentti koko määritettiin elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä ja tulokset osoittivat, että alueet DNA koko oli noin 150-900 bp pituudeltaan. Sillä kromatiinin immunosaostus, 15 ug kromatiinin DNA-alibittipuskuriin (kunkin immunosaostus) inkuboitiin immunosaostus vasta-aineella: Ac-H3, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, ja negatiivinen kontrolli (normaali kanin IgG) 4 ° C kierto. Inkuboinnin jälkeen yön yli, 30 ui ChIP Grade proteiini G Magneettiset helmet lisättiin ja inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa Kromatiini eluoitiin Antibody /Protein G Helmet ja ristisidosten purettiin inkuboimalla proteinaasi K 2 tuntia 65 ° C. DNA puhdistettiin käyttäen Spin sarakkeet. Kvantifiointi DNA suoritettiin PCR: llä käyttämällä spesifisiä alukkeita geenin promoottori vimentiinin, ZEB2, Slug ja MMP2. Alukesekvenssit näiden geenin promoottorit on esitetty taulukossa 1. suhteellinen määrä promoottori-DNA oli normalisoitu tulo. IgG: tä käytettiin viite-ohjaus ja lasketaan yksikön arvo 1,0.

(A) Kokonais-RNA eristettiin LNCaP-soluja käsiteltiin 200 nM ja 400 nM TSA 8, 16 ja 24 h. Suhteellinen mRNA ilmentymä ZEB1, Slug, vimentiinistä ja N-kadheriinin nostettiin seuraavat TSA hoidon verrattuna DMSO-kontrollin (arvo kontrolli suunniteltiin 1, *, p 0,05; **, p 0,01). (B) LNCaP-soluja käsiteltiin 400 nM TSA 8 h 72 h. Western blot-analyysi osoittaa, että TSA hoito edistänyt asetylaatio histone3 (Ac-H3) 8 h ja 16 h hoito. Ilmaisu Mesenkymaalisten markkereita, kuten fibronektiini (Fibron) ja vimentiinista kohotettiin 24 tunnin kuluttua hoidon TSA. (C) PC3-soluja käsiteltiin 400 nM TSA: ssa 4 tuntia ja 32 tuntia. Hyper-asetylaatio histoni 3 nähtiin 4 h 32 h hoidon samanaikaisen lisääntyneen ilmentymisen ZEB1 kussakin aikapisteessä hoidon. Tehostettu ekspressio vimentiinista jälkeen havaittiin 16 h hoidon TSA.

(A) Kokonais-RNA eristettiin LNCaP-soluja käsiteltiin 2,5 uM ja 5 uM SAHA 8, 16 ja 24 h. Tulokset reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että suhteellisen mRNA: n ilmentymisen transkription tekijöitä, kuten ZEB1 ja Slug säädeltiin niin aikaisin kuin 8 h hoidon SAHA, kun taas vimentiinistä ja N-kadheriinin, lisättiin sen jälkeen 16 h hoidon verrattuna DMSO ohjaus (arvo kontrolli suunniteltiin 1, *, p 0,05; **, p 0,01). (B) LNCaP-soluja käsiteltiin 5 uM SAHA 8 h 72 h. Western blot-analyysi osoittaa, että SAHA hoito edistänyt asetylaatio histone3 (Ac-H3) 8 h 72 h hoidon. Fibronektiini (Fibron) lisäsi merkittävästi 24 tunnin kuluttua hoidon ja vimentiinista dramaattisesti kohonnut 16 h hoidon SAHA. (C) PC3-soluja käsiteltiin 5 uM SAHA 4 h 32 h. ja lisääntyneen ilmentymisen ZEB1 havaittiin 4 h 32 h hoito, mikä liittyi Hyper-asetylaatio histoni 3. Tehostettu ilmentymistä vimentiinista havaittiin 32 tunnin hoidon SAHA.

Immuno -fluorescence Mikroskopia

Immuno-fluoresenssi värjäys suoritettiin kuten on kuvattu aiemmin laboratoriossamme [18]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT). Kun oli pesty 3 kertaa PBS: llä, solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 PBS: ssa 10 minuutin ajan, ja sitten blokattiin 10% vuohen seerumia. Soluja inkuboitiin 40 minuutin ajan vasta-aineiden vimentiinista (pre-laimennettu) ja ZEB1 (01:50) 5% vuohen seerumia, pestiin ja sitten inkuboitiin vielä 40 minuuttia Alex Fluro 594 konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:250) at huonelämpötila. F-aktiini värjäys, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 PBS: ssa 10 minuutin ajan, ja sitten inkuboitiin 0,33 uM Alexa Fluor 594 phalloidin 40 minuutin ajan 4 ° C: ssa . Pesun jälkeen objektilasit asentaa kiinnitysväliaine sisälsi anti-fade reagenssi ja DAPI. Solut tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopissa. Kuvat otettiin kiinni ja analysoitiin käyttämällä Advanced Sport ohjelmistoa (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Cell Irti määritys

solun irtoaminen määritystä, solut ympättiin 24-kuoppalevyille 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. 8 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin 400 nM TSA ja 5 uM SAHA tai DMSO-kontrollin 20 tuntia. Irrottamiseen solujen viljelmästä levyt, elatusaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 0,125% trypsiiniä EDTA huoneenlämpötilassa 3 minuutin ajan. Inaktivoinnin jälkeen trypsiinin lisäämällä elatusainetta, joka sisälsi 5% FBS: ää kuoppiin, irrotetuista soluista kerättiin putkiin. Jäljelle jääneet solut inkuboitiin 0,25% trypsiiniä EDTA: ta 5 minuuttia 37 ° C: irrottamiseksi kaikki solut viljelymaljoilta ja solususpensiot kerättiin uusiin putkiin. Solut laskettiin ja tiedot esitettiin prosentteina irrottaa soluja (inkuboitu 0,125% trypsiiniä EDTA) ja solua yhteensä.

Data Analysis

Kokeet suoritettiin kolmella tai useammalla eri toistoja. Tiedot esitettiin keskiarvoina ± SE. Kahden pyrstö opiskelijan

t

testiä käytettiin vertailuissa näiden kahden ryhmän välillä. ANOVA käytettiin vertailtaessa enemmän kuin kaksi ryhmää. Arvot p 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

HDACIs aiheuttama EMT Fenotyyppikuvaus eturauhassyöpäsoluissa

vaikutusten tutkiminen HDACIs solumorfologiaan, me käsitelty PC3 solut TSA tai SAHA, ja huomasimme, että PC3-solut käsitelty TSA tai SAHA näkyy pitkänomainen /epäsäännöllinen fibroblastit morfologia. Sen sijaan, PC3-solut käsiteltiin DMSO osoitti mukulakivi ulkonäkö, tyypillinen morfologia epiteelisolujen (Fig. 1A ja B). DU145 ja ARCaPE soluja käsiteltiin TSA tai SAHA näytetään myös pitkänomainen /epäsäännöllinen fibroblastit morfologia (tuloksia ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että eturauhassyövän hoitoon solujen HDACIs johtaa induktioon EMT fenotyypin. Edelleen vahvistaa, onko HDACIs voi todella aiheuttaa EMT PC3-soluissa, määritimme ilmaus vimentiinista ja ZEB1 käyttäen immunologiseen fluoresenssivärjäyksellä. TSA ja SAHA aiheuttama EMT fenotyyppi oli yhdenmukainen lisääntyneen ilmentymisen vimentiinista ja ZEB1 (Fig. 1 C, ylemmän ja keskimmäisen paneeli). Lisäksi F-aktiini uudelleenjärjestely ja hajanainen kuvio havaittiin myös PC3-soluissa käsitelty TSA ja SAHA (Fig. 1 C, alempi paneeli), jotka korreloivat EMT fenotyyppiin.

(A) PC3 ja LNCaP soluja käsiteltiin TSA tai SAHA eri annoksilla 48 tuntia. Western blot-analyysi osoittaa ekspressiota epiteeli- ja meshenchymal markkereita sekä asetylointi tila. (B) TSA hoitoa 48 h lisääntynyt ilmentyminen Sox2 ja Nanog annoksesta riippuvaisella tavalla PC3 PDGF-D-soluissa. Up-regulation vimentiinista nähtiin jälkeenkin 50 nM TSA hoidon. (C) Solujen irrottaminen määritys suoritettiin sen jälkeen, kun 400 nM TSA tai 5 uM SAHA hoitoa 20 tuntia. TSA ja SAHA merkittävästi edistänyt PC3 solu- irrottautuminen kulttuuri pinnat (**, p 0,01). (D) Näytetään lisääntynyt suuntaukset solujen migraation PC3-solujen käsitelty TSA ja SAHA.

(A) CHIP -koe sen määrittämiseksi sitoutuminen HDAC: iden ja asetylointi tilan histoni 3 edistäjiä EMT liittyvät tekijät kuten vimentiinista, ZEB1, Slug ja MMP2 in PC3 soluissa käsitelty TSA ja SAHA 16 tuntia käyttämällä HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6 ja Ac-H3-aine (*, p 0,05; **, p S: SAHA).

HDACIs lisääntyneen ilmentymisen transkriptiotekijöiden ja mesenkyymikasvaimia merkkiaineet

EMT liittyvien transkriptiotekijöiden kriittisiä rooleja ekspressiota sääteleviä epiteelin ja mesenkymaalisten markkereita. PC3-solut käsiteltiin TSA merkitsevästi sääteli mRNA ilmentymä ZEB1, ZEB2, Slug, Twist ja snail1 24 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 2A), joka liittyi lisääntynyt ilmentyminen N-kadheriinin ja vimentiinista. On tunnettua, että solut EMT fenotyyppi hankkia lisääntynyt solun liikkuvuus, ja huomasimme, että TSA hoito lisäsi ilmentymisen MMP2 (Fig. 2A), joka oli yhteydessä lisääntyneeseen solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Vahvistamaan, onko HDACIs toimivat indusoivia EMT, me valitsemme toisen HDACI, SAHA, joka on hyväksynyt FDA sen kliinistä hyötyä. Mielenkiintoista, SAHA käsittely johti myös hankintaan EMT fenotyypin sopusoinnussa lisääntynyt EMT merkki ilme (Fig. 2B). PC3-solut ovat androgeenireseptorin (AR) negatiivinen PCa solulinjassa. Sen arvioimiseksi, onko HDACIs voi myös aiheuttaa EMT AR positiivinen PCa soluja (kuten LNCaP), käsittelimme LNCaP solut SAHA ja löysimme lisääntyneen ilmentymisen ZEB1 ja Slug mRNA jo 8 h hoidon ja se oli edelleen lisääntynyt kuluttua 16 h hoidon. Ilmaisu pieneni hieman, mutta silti se oli merkitsevästi suurempi 400 nM TSA hoidetussa ryhmässä kontrolliin verrattuna (kuvio. 3A, yläpaneeli). Ilmentyminen vimentiinista mRNA lisääntyi myös 16 h hoidon ja korkealla tasolla 24 tuntia, mikä oli sopusoinnussa lisääntynyt proteiinin taso 24 tunnin kuluttua hoidon TSA (Fig. 3B). Kuitenkin N-kadheriinin mRNA-tasot nousivat jo 8 h hoito. Sen määrittämiseksi, onko muuttunut mRNA: n ekspressio liittyy tilan kromatiinin asetylointi, testasimme tasot asetyloitu-histoni 3 (Ac-H3) käsiteltyjä soluja 400 nM TSA. LNCaP-soluja käsiteltiin TSA osoitti merkittävästi lisääntynyt Ac-H3 8 h kuluessa hoidon, mutta laski sen jälkeen hieman 16 h (Fig. 3B), joka on yhdenmukainen ilmaus ZEB1 ja Slug, kun taas lisääntynyt proteiinin ilmentymisen vimetin ja fibronektiinin jälkeen havaittiin 24 h jälkeen (kuvio. 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ZEB1 ja Slug osallistuvat säätelyyn vimetin ja fibronektiinin. Sen sijaan, PC3-solut käsiteltiin TSA näkyvissä korkea Ac-H3 4 h 32 h hoidon kanssa samanaikaisesti lisääntyneen ilmentymisen ZEB1, kun taas tehostettu ilmentyminen vimentiinista proteiinin jälkeen havaittiin 16 tunnin hoidon TSA (Fig. 3C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös SAHA käsiteltiin LNCaP ja PC3-solut (Fig. 4A, B ja C). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että HDACIs indusoivat EMT takia muuttunut asetylaatio asema, sopusoinnussa lisääntynyt ilmentymä EMT markkereita.

Rekrytointi HDAC: ien erilaiset tekijät johtaa deasetylaation histoni, mikä geeni hiljaisuus lukien hiljentäminen EMT: liittyviä geenejä. Anto HDACIs aiheuttaa asetylaatio histoni, joka voisi aktivoida mesenkymaalisten liittyvien geenien ilmentymisen, jolloin hankinta EMT.

HDACIs indusoima Stem Cell tussit ja Lisääntynyt soluliikkuvuus

tulokset Western blot-analyysi osoitti, että suuremmat annokset TSA (400 nM) ja SAHA (5 uM) voisi edistää asetylaatio histoni ja siten säätelee ilmentymistä EMT liittyvät tekijät (Fig. 3B ja C: Fig. 4B ja C). Annos kineettinen tutkimus osoitti, että niinkin vähän kuin 0,1 uM TSA tai SAHA voi aiheuttaa asetylaatio histoni 3 (lisääntynyt Ac-H3) annoksesta riippuvalla tavalla PC3-soluja, jotka oli yhdenmukainen tehostettu ilmentyminen vimentiinista ja N-kadheriinin (kuvio . 5A). Kuitenkin, E-kadheriinin ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi. Solujen EMT fenotyyppi on osoitettu olevan lähteen syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja CSLCs) [10], [11], [16]. Tämän kysymyksen, PC3 PDGF-D solujen EMT ominaisuuksia hoidettiin TSA alemmilla annoksella alueella 50 200 nm. Tulokset Western blot-analyysi osoitti, että solujen käsittely TSA lisäsi ekspressiota kantasolujen markkereita, kuten Sox2 ja Nanog annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5B). Vaikka PC3 PDGF-D soluilla korkea vimentiinin, ilmentyminen vimentiinista lisättiin vielä TSA käsitellyissä soluissa (kuvio. 5B). Solut, joissa EMT ja /tai CSLC allekirjoituksia oli kohonnut solun liikkuvuus. Solujen irrottaminen ensisijaiselta sivusto on edellytys solujen vaeltamiseen, ja mielenkiintoisesti, TSA tai SAHA hoitoon merkittävästi edistänyt irtoaminen PC3-solujen viljelmän levyn pintaan (Kuva. 5C), joka oli yhdenmukainen lisääntynyt suuntausten solumigraation (Fig. 5D) .

Hyper-asetylaatio promoottorit mukaan HDACIs vastasi asetukseksi EMT liittyvät tekijät

tasot histoni asetylaatio keskeisessä asemassa ovat kromatiinin remodeling johtaa geenien transkription säätelystä. Asetylaatio lysiiniä histoni hännät liittyy geenin transkription aktivaatio johtuu rennommin kromatiinin valtio, joka edistää saatavuutta transkription komplekseja transkription aloituskohdasta. Sen arvioimiseksi, onko TSA ja SAHA hoito voisi vaikuttaa tilaan asetylointi in histoni 3 edistäjiä EMT liittyvät tekijät, suoritimme CHIP määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, määrä Ac-H3 liittyy proksimaaliseen promoottorit vimentiinin, ZEB2, Slug ja MMP2 lisääntyivät merkittävästi PC3-soluissa käsitelty TSA ja SAHA verrattuna DMSO käsiteltiin kontrolli-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HDACIs aiheuttama hyper-asetylointi in histoni 3 edistäjiä vimentiinista, ZEB2, Slug ja MMP2 on mekanistisesti vastuussa lisääntynyt ilmentyminen näistä tekijöistä. Asetylointi tila on riippuvainen toimintaa HDAC: iden ja niiden ekspressiotasot. Siten tasot HDAC: ien tutkittiin käsitellyissä soluissa TSA tai SAHA Western blot -analyysillä, ja kuten on esitetty kuviossa. 6B ja C, eikä TSA eikä SAHA hoitoa 16 tunnin osoitti muutoksia ilmaisua HDAC-entsyymeistä. Kuitenkin olemme huomanneet, että määrä HDAC1 liittyy promoottori vimentiinista ja Slug oli korkeampi TSA käsitellyissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi määrä HDAC2 liittyy promoottori vimentiinin, ZEB1 ja Slug oli suurempi sekä TSA ja SAHA: käsitellyissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 6A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HDAC inhibiters johtaa hyper-asetylointi in histoni 3 geenien promoottorit mukaan tukahduttaa toimintaa, mutta ei vähentää määrää HDAC: t on promoottorin kohdegeenien kuten vimentiinista, ZEB1, Slug ja MMP2, jolloin EMT allekirjoituksia eturauhassyöpäsolu- linjat (Fig. 7). Siten hyper-asetylaatio promoottorien mukaan HDACIs voi olla vastuussa sääntely EMT liittyvät tekijät.

Keskustelu

histonideasetylaasi- inhibiittorit (HDACIs) on osoitettu olevan lupaavia reagensseja hoitoon useita hematologisia maligniteetteja, mukaan lukien ihon T-solu lymfooma [27] – [29] ja perifeerisen T-solulymfooma kliinisissä kokeissa [30]. Kuitenkin kliinisissä tutkimuksissa HDACIs kiinteissä kasvaimissa ovat tuottaneet pettymyksen, joka on osittain voisi johtua hankinta vastustuskykyä HDACIs [3]. Lisäksi Resistenssimekanismit ei ole täysin selvitetty. Nykyisessä tutkimuksessa, huomasimme, että HDACIs kuten TSA ja SAHA voivat aiheuttaa epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi ja hankki syövän kantasoluja kaltainen solu (CSLC) ominaisuudet, jotka ovat olleet tiedossa edistää lääkkeille vastustuskykyisten, syöpä toistuminen ja etäpesäke [16], [17]. Tuloksemme ovat sopusoinnussa havaintojen osoittavat, että TSA hoito lisäsi ilmentymisen vementin, joka välittyi edistämällä asetylaatio proksimaalisen promoottorialueen vimentiinista geenin kautta lievittää tukahduttamisesta monimutkainen lukien ZBP-89 ja HDAC1 [31]. Esto vimentiinista ilmentymisen on osoitettu muuttaa eturauhassyövän solujen morfologia mikä vähentää tuumorin kasvua

in vivo

[32], ja näin ollen lisääntyneen ekspression vimentiinista odotetaan olevan aggressiivinen kasvainsolujen käyttäytymistä tukevat myös tulokset esitetään