Krooninen sairaus

tiivistelmä

tioredoksiinista reduktaasin 1 (TR1) on merkittävä redox säädin nisäkässoluissa. Kuten tärkeä antioksidantti selenoprotein, TR1 uskotaan osallistua syövän ehkäisyyn, mutta on myös tiedetään olevan yli-ilmentynyt useissa syöpäsoluja. Lukuisat syöpälääkkeet estävät TR1, ja tämän proteiinin on ehdotettu kohteena syövän hoidossa. Olemme aiemmin raportoitu, että vähentäminen TR1 tasojen syöpäsoluissa päinvastaiseksi monet pahanlaatuinen ominaisuudet viittaa siihen, että puute TR1 toiminto on antitumorigenic. Molekyylitason perustan TR1 rooli syövän kehittymisessä, mutta ei ymmärretä. Tässä huomasimme, että joukossa selenoproteins, TR1 on ainutlaatuinen yli-ilmennetään syöpäsoluissa ja sen knockdown hiirimallissa tasyöpäsolulinja vetämänä onkogeeninen

k-ras

johti morfologisia muutoksia ominaisia ​​vanhempien (normaali) soluihin, ilman merkittävää vaikutusta solujen kasvuun normaaleissa kasvuolosuhteissa. Kun kasvanut seerumin puutteesta välineellä TR1 puutteellinen syöpäsolut menettävät omavaraisuuden kasvun, ilmeisen viallinen etenemistä niiden S-vaiheeseen ja vähentynyttä ilmentymistä DNA-polymeraasi α, tärkeä entsyymi DNA lisääntymään. Nämä havainnot tarjoavat todisteita siitä, että TR1 on kriittinen omavaraisuus kasvun signaaleja pahanlaatuisten solujen, että TR1 toimii pitkälti pro-syöpä proteiinia ja se on todellakin ensisijainen tavoite syövän hoidossa.

Citation: Yoo MH , Xu XM, Carlson BA, Patterson AD, Gladyshev VN, Hatfield DL (2007) Targeting tioredoksiinista reduktaasin 1 vähentäminen Syöpäsolut Estää omavarainen kasvu ja DNA Replication. PLoS ONE 2 (10): E1112. doi: 10,1371 /journal.pone.0001112

Academic Editor: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 syyskuu 2007; Hyväksytty: 12 lokakuu 2007; Julkaistu: 31 lokakuu 2007

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, ja NIH avustuksia CA080946 ja GM065204 VNG: n kohdalla. ADP sponsoroi PRAT Fellowship, NIGMS, NIH.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokavalion seleeni on voimakas syövän ehkäisyyn aktiivisuus [1], ja molemmat seleeniä sisältävien proteiinien (selenoproteins) [2,3, ja siinä olevat viitteet], ja alhaisen molekyylipainon seleeniä sisältävien yhdisteiden (selenocompounds) [2 ja siinä olevat viitteet] ovat sekaantuneet tähän toimintaan. Suurta merkitystä seleenin tarjota terveyshyötyjä todennäköisesti toiminnan kautta selenoproteins [1]. Tioredoksiinin reduktaasin 1 (TR1) on yksi 24 tiedossa selenoproteins jyrsijöillä [4], on merkittävä antioksidantti ja redox säädin nisäkässoluissa [5,6 ja sen viitteet] ja on keskeinen rooli nisäkkäiden kehitys [7]. Kuitenkin, tämän entsyymin näyttää olevan vastakkaisia ​​vaikutuksia syövän kehittymisessä, koska se on liitetty sekä syövän ehkäisyyn [8] ja syövän edistämiseen [9] – [12]. Esimerkiksi TR1 tukee p53-toiminto ja on muita kasvaimia estävä toiminta, ja sen kohdistamista karsinogeenisia, elektrofiilisen yhdisteitä väittävät sen roolista syövän ehkäisyä [13]. Vaihtoehtoisesti, TR1 on yli-ilmentynyt useissa syöpäsolujen [9] – [12], ja sen inhibitio useilla erilaisilla voimakas syöpälääkkeiden muuttaa syöpään liittyvien ominaisuuksien lukuisia kasvaimia ja pahanlaatuisten solujen viittaa siihen, että tämä entsyymi on kohteena syövän hoidossa [9] – [12], [14], [15].

on epäselvää, onko TR1 syövän ehkäisyyn tai syövän edistäviä ominaisuuksia vaikuttaa voimakkaammin syövän, ovatko nämä keskenään ristiriitaiset vaikutukset toimivat samanaikaisesti tai ovat ominaisia ​​erilaiset vaiheissa syövän kehitystä, ja kuinka nämä ominaisuudet voitaisiin käyttää syövän ehkäisyyn ja /tai hoitoon. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi, me aluksi tarkasteltiin roolin TR1 hiiren keuhkosyövän solulinjaa ja hiiren eläinmalli ja totesi, että väheneminen TR1 tasojen päinvastaiseksi lukuisia pahanlaatuisia ominaisuuksia kuten tumorigenecity [16]. Tässä tutkimme TR1 toiminto ja roolista syövässä kehityksen pahanlaatuinen hiirisolulinjaa joita vastaava vanhempien (normaali) solulinja oli saatavilla, ja tarkastettava havaintojen useissa ihmisen syövän solulinjoissa.

Tulokset

Generation pahanlaatuisen ja vanhempien solulinjojen ja analyysi niiden TR1 tasoilla sekä useita syöpä ihmisen solulinjoja

DT-solut, jotka koodaavat onkogeeninen

k-ras

[17] , [18], ja vanhempien NIH3T3 (kontrolli) solut leimattiin

75Se, ja tuloksena proteiinin uutteet elektroforeettisesti tutkia tasot TR1 ja muiden selenoproteins (Fig. 1A, ylempi vasen paneeli). 55 kDa: n TR1 on yksi tärkeimmistä selenoproteins, yhdessä muiden selenoproteins, merkitty tässä kuviossa. On selvää, DT solut ovat suurempia määriä TR1 kuin kontrolli-soluissa. TR1 tasot tutkittiin myös hallita ja DT solujen western blotting (Fig. 1A, alempi vasen paneeli), joka vahvisti kohonneeseen TR1 DT soluissa. Mielenkiintoista, kohonnut TR1 ilme oli kustannuksella muiden selenoproteins, jotka olivat alhaisempia DT soluissa verrattuna ohjata soluihin.

osoitti solulinjoja leimattiin metabolisesti

75Se, syntyvä valkuainen solu-uutteiden elektroforeesilla ja geelit altistetaan Phosphorlmager (katso menetelmät). Selenoproteins tunnistettu aiemmin soluekstrakteissa [25], [26] on merkitty nuolella ja nimi oikealla kunkin paneelin. TR1 tunnistettiin myös western-blottauksella uutteissa kunkin solulinjan, kuten on esitetty alemmassa paneelit. (A, vasen paneeli) valvonta (vanhempien, NIH3T3) ja DT soluja. (A, oikea paneeli) NIH3T3 (kontrolli, vanhempien käytettävät solut tuottavat DT soluissa), LLC1 (hiiren Lewis keuhko- karsinooma), ACHN (ihmisen munuainen munuaissolukarsinooma), A549 (ihmisen keuhkojen ei-pienisoluinen karsinooma), HCT116 ( ihmisen paksusuolen adenokarsinooma) ja SNB19 (ihmisen solu glioblastooma). NIH3T3 käytettiin indikaattorina solulinja vertailu TR1 tasoilla normaalissa solulinjassa, että pahanlaatuisten solulinjojen. (B) DT /pU6-m3 ja DT /siTR1. DT (joka on saatu yli-ilmentyminen mutantti

k-ras

NIH3T3-solut) transfektoitiin stabiilisti kanssa pU6-m3 (kontrolli) vektori tai siTR1 pudotus vektorin, vastaavasti (katso menetelmät).

lisäksi hiiren Lewisin keuhkokarsinooma (LLC1) soluihin [16] sekä neljä ihmissolulinjoilla yhdessä, leimattiin

75Se ja selenoprotein ilme analysoidaan (Fig. 1A, oikea yläpaneeli). Vaikka mitään vastaavaa valvontaa soluja saatavilla näiden pahanlaatuisten solulinjojen vertasimme niiden selenoprotein merkintöjä kuvioita kuin normaaleilla NIH3T3-solut. Ainoa merkitty selenoprotein, joka näytti olevan yli-ilmentynyt kaikissa syöpäsoluissa linjat oli TR1. Western blot-analyysi osoitti myös korkeita TR1 ihmisen ja hiiren pahanlaatuisten solulinjojen (Fig. 1A, alempi oikea paneeli).

stabiili transfektio DT ja ohjaus solut siRNA-TR1 Knockdown vektori ja niiden karakterisointi

DT-solut transfektoitiin stabiilisti siRNA-TR1 pudotus (nimetty DT /siRNA) tai kontrollivektori (nimetty DT /pU6-m3) (Fig. 1 B, ylempi paneeli). TR1 oli lähes poissa DT /siRNA transfektoitujen solujen osoituksena metabolinen

75Se merkintöjä ja western-blottauksella (kuvio. 1 B, alempi paneeli).

fenotyypit kahden transfektoitujen DT soluista tutkittiin ja verrattiin kuin transfektoimattomia DT ja kontrollisoluja (Fig. 2). Ohjaus solut kasvoivat yksikerroksisessa ja kiinnitetty tiiviisti viljelyastiasta, jotka ovat ominaisia ​​normaaleille soluille, kun taas DT /pU6-m3 ja DT solut kasvoivat in monikerroksinen ja löyhästi kiinnitetty viljelymaljaan, jotka ovat ominaisia ​​pahanlaatuisten solujen (Fig. 2A). Kuitenkin DT /siRNA soluja oli huomattavasti vähentynyt kyky kasvaa monikerroksisia ja oli tiukemmin kiinni kulttuuriin lautasen kuin joko DT /pU6-m3 tai DT soluja.

(A) Ohjaus (NIH3T3, vanhempien) , DT, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 soluja. Soluja kasvatettiin viljelymaljoille ja valokuvattiin eksponentiaalisen kasvun aikana (katso menetelmät). (B) ankkurointi riippumattoman kasvun hallinnan, DT, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 pudotus soluja. Tuhat solut suspendoitiin pehmeällä agarilla ja niitä kasvatettiin kahden viikon ajan. Sitten maljat värjättiin INT yön yli ja valokuvattiin. Yksityiskohtaiset tiedot annetaan Methods. (C) kasvuvauhdin ohjaus, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 solujen normaaleissa ja seerumi-puutostiloja. Ohjaus, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 soluja siirrostettiin (2 x 10

5 solua /60 mm malja) ja kasvatettiin normaaleissa kasvuolosuhteissa (vasen paneeli), ja DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 soluja kylvetään (5 x 10

5 solua /60 mm malja) ja kasvatettiin seerumin puutteesta väliaineessa (oikea paneeli). Kasvu seerumin puutteesta väliaineessa verrattiin niihin, jotka saatiin normaaleissa kasvuolosuhteissa.

Koska monet syöpäsolut voivat kasvaa niiltä puuttuisi kiinnekohta pehmeässä agarissa, mutta useimmat normaalit solut eivät voi, kyky ohjaus, DT, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 solut voivat kasvaa pehmeässä agarissa tutkittiin (Kuva. 2B). DT ja DT /pU6-m3 solut kasvoivat pehmeässä agarissa, samalla kun ohjaus ja DT /siTR1 solut kasvoivat heikosti näissä olosuhteissa. Kasvu ominaisuudet pehmeässä agarissa kahden ihmisen solulinjoista, A549 ja HCT116, transfektion jälkeen vastaaviin ihmisen TR1 Knockdown vektori ja ohjaus vektori puuttuu siTR1 tutkittiin myös (ks. S1 ja kuvio legenda). Mielenkiintoista, molemmat solulinjat, jotka koodaavat siTR1 menettäneet kyvyn kasvaa pehmeässä agarissa.

Omavaraisuus kasvun signaaleja

Omavaraisuus kasvu signaaleja on ehdotettu yhtenä kuudesta hankittu valmiuksia syöpä fenotyyppejä ja Ras-Raf-MAPK signalointiryöpyn tiedetään olevan mukana tässä hankittu ominaisuus matkimalla kasvun signaaleja [19]. Olemme tutkineet vaikutusta TR1 vähennys tässä fenotyypin kasvattamalla ohjaus, DT /pU6-m3 ja TR1 knockdown solujen säännöllisesti ja seerumin elatusalustoissa (Fig. 2C). Tavanomaisissa kasvuoloissa, sekä DT ja DT /siTR1 solut kasvoivat yli kaksinkertainen määrä NIH3T3-solujen, kun taas DT /siTR1 solut kasvoivat vain noin 10% vähemmän tehokkaasti kuin DT /pU6-m3 soluissa (vasen paneeli, Fig. 2C). Siten TR1 knockdown ei laskenut kasvua DT solujen ilman liittyviä vaikutuksia TR1 olennaisuuden solujen kasvulle. Koska monet pahanlaatuiset solut kasvaa tehokkaammin kuin normaalit solut, kun viljellään seerumin puutteesta väliaineessa, tutkimme kyvyt kahden transfektoituja solulinjoja kasvaa seerumin puutteesta olosuhteissa (oikea paneeli). DT /siTR1 solut kasvoivat noin puoli määrä kuin DT /pU6-m3 solut, lisäksi viittaa siihen, että syöpään liittyvä ominaisuuksia soluja nimenomaan vaikutti TR1 knockdown.

Cell cycle analsis

Solusyklianalyysiä ohjaus, DT /siTR1 ja DT /pU6-m3 soluja, kun kasvatettu seerumia puutteesta välineellä suoritettiin selvittämään vaiheessa vaikuttaa väheneminen TR1 ilmaisun hidastaa kasvua (Fig. 3). Kolme solulinjoja kasvatettiin täydellisessä väliaineessa yön yli ja sitten laitetaan seerumin puutteesta alustassa 0, 24 ja 48 tuntia. Soluja inkuboitiin 5-bromi-2-deoksiuridiini (BrdU), ja värjättiin BrdU-vasta-aineiden arvioimiseksi DNA: n replikaatio ja inkuboitiin 7-amino-aktinomysiini (7-AAD) arvioida genomista DNA: ta. Nämä solut analysoitiin sitten FACS: lla (Fig. 3A) ja tarkoituksenmukaiset alueet kvantitoitiin (kuvio. 3B). Kolme solulinjat oli suuri määrä soluja sekä G0-G1 ja S vaiheissa analysoitaessa välittömästi seuraava aktiivinen kasvun täydelliseen alustaan, vaikka DT /siTR1 oli enemmän soluja S-vaiheeseen, kun taas kaksi muuta solulinjat oli enemmän soluja G0-G1 vaiheeseen (katso Time 0 kuvioissa. 3A ja B). Ohjaus solulinja oli noin 90% sen soluista säilytetään G0-G1 vaihe koko kasvua seerumissa puutosta väliaineessa. Tämä havainto varmasti osoittaa, että suurin osa valvonnan solut säilyvät lepotilassa (G0) tila, joka on sopusoinnussa niiden kyvyttömyys kasvaa näissä kasvuolosuhteissa. Merkittävä ero tapahtui määriä solujen DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 solulinjoja 24 tunnin kasvun G0-G1 ja S vaiheet että DT /pU6-m3 soluilla oli paljon suurempi osuus sen solujen S vaiheessa ja alempi prosenttiosuus G0-G1 vaiheessa kuin teki DT /siTR1. Sisällä S-vaiheeseen, DT /pU6-m3 oli noin 1,5 kertaa enemmän soluja alussa kuin myöhään S, kun taas DT /siTR1 oli noin 3 kertaa enemmän soluja alussa kuin myöhään S. Vaikka solumäärien molemmissa transfektoituja solulinjoja vuonna G0-G1 ja S vaiheita tarkemmin lähentää toisiinsa 48 tunnin kasvatuksen jälkeen suuria eroja oli edelleen läsnä välillä aikaisin ja myöhään S vaiheita näissä kahdessa solulinjassa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että DNA-replikaation pidätettiin alussa S-vaiheen DT /siTR1 soluja. On myös huomattava, että DT /siTR1 solut ovat suurempia määriä niiden solupopulaation säilytetään G2-M-vaiheessa kuin joko ohjaus- tai DT /pU6-m3 solujen kasvun aikana analyysi viittaa siihen, että enemmän soluja sisällä DT /siTR1 väestöstä on ongelmia vaihtamassa mitoosiin. Mahdollinen vika aiheuttaa suuremman hidastumista DTsiTR1 solujen G2-M-vaiheessa optio lisätutkimuksia, mutta jota ei tässä tutkimuksessa, koska se ei näytä vaikuttavan vähentämiseen DT /siTR1 kasvu verrattuna DT /pU6-m3 seerumin puutteesta väliaineessa (ks. 2C).

Control DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 soluja kasvatettiin seerumia puutosta väliaineessa 0, 24 ja 48 tuntia ja inkuboitiin BrdU 6 tuntia. Kerätyt solut värjättiin anti-BrdU-vasta-ainetta voidaan seurata äskettäin repii genomi-DNA: n ja 7-AAD seurata koko genomista DNA: ta. (A) värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä ja (B) kvantitoitiin kunkin vaiheen kasvun aikana, jonka FlowJO. Vaiheissa kasvukauden, G0-G1, S-vaiheessa (varhainen S ja Late S) ja G2-M näytettiin ja arvot edustavat prosenttia koko solupopulaation. Tiedot kokeista kuvassa esitetään Methods.

analyysi DNA-polymeraasin tekijöiden

Valaistaan ​​mikä komponentti (t) saattaa olla mukana DNA: n replikaatioon aiheuttaa väheneminen kokonaiskasvusta seerumin puutteesta väliaineen DT /siTR1 soluja verrattuna DT /pU6-m3 soluissa, tutkimme tasoja DNA Pol α, β, γ ja ε, Cdc45 ja PCNA jossa kaikki osansa tässä prosessissa [20 ]. Western analyysit näiden komponenttien tehtiin kolme solulinjojen kunakin ajankohtana (Fig. 4). DNA Pol α ja Cdc45 olivat erittäin rikastettu sekä transfektoituja solulinjoja kontrollisoluihin verrattuna kussakin aikapisteessä. Mielenkiintoista on, että DNA-Pol α näytti vähennetään DT /siTR1 soluja verrattuna DT /pU6-m3 solujen 24 tuntia ja suurin osa merkittävästi 48 tuntia. Lisäksi tasot DNA Pol ε näytti vähennetään ohjaus ja DT /siTR1 soluja verrattuna DT /pU6-m3-soluja 48 tunnin ajan, kun taas DNA-Pol β näytti pienennetään kaikki kolme ajankohtina DT /siTR1 verrattuna joko ohjaus- tai DT /pU6-m3 soluissa. Näyttäisi siltä, ​​että selvin vaikutus TR1 väheneminen DT /siTR1 solujen DNA Pol α mikä vähentää näiden solujen kasvua seerumissa puutosta väliaineessa. Kuitenkin TR1 vähentäminen voi myös johtaa pitoisuuksien vähentämistä DNA Pol β, kun taas alenemisesta DNA Pol ε 48 tunnin valvonta ja DT /siTR1 solut voivat johtua seerumin puutosta kasvualustaa.

ekspressiotasot DNA-polymeraasin komponentteja, DNA Pol α, β, δ ja ε, Cdc45 ja PCNA, valvonta, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 solut analysoitiin western-blottauksella. Soluja kasvatettiin seerumin puutteesta alustassa 0, 24 ja 48 tunnin ajan, kerättiin, proteiini solu-uutteet valmistettiin ja elektroforeesi Menetelmät kuvatulla tavalla.

Keskustelu

TR1 on monia solun toimintoja ja on laajasti mukana solun prosesseja, jotka säätelevät redox [9] – [12]. Esimerkiksi TR1 on rooleja solujen lisääntymisen, angiogeneesin, transkriptio, DNA: n korjaukseen palvelee antioksidanttipuolustuksen ja redox säätely solusignalointia (ks arviot [9] – [12]). Sen tärkeä tehtävä on ajateltu säilyttää sytosolin tioredoksiinista (TRX1) pelkistetyssä tilassa käyttämällä NADPH elektronidonorina [21]. Puolestaan ​​TRX1 lahjoittaa vähentää vastineet disulfideiksi ydin- ja soluliman proteiinit ylläpidosta vähensi kysteiinitähdettä näissä proteiineissa. Tässä me selvitetty roolia TR1 omavaraisuuden kasvua osoittamalla, että estämällä DNA replikaation pahanlaatuinen TR1 knockdown solulinja liittyy väheneminen DNA Pol α ilme. Lisäksi muut tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA: n replikaatio voidaan hidastaa rajoittamalla DNA-synteesi koska tioredoksiinista on rooli ylläpitää solunsisäiseen deoksinukleotidi altaan [11], [22], [23]. Olemme kuitenkin sulkea pois tätä mahdollisuutta tutkimalla deoksinukleotidi altaat ohjaus, DT, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 soluja ja osoittaa, että ne eivät vaihtelevat kasvun aikana seerumin puutosta väliaineessa (kts. S2).

Lukuisat TR1 toiminnot ja ominaisuudet viittaavat siihen, että tämä selenoprotein on syöpälääkkeen toiminnot: 1) oksidatiivisen stressin on yksi suurta ominaisuudet syöpäsolujen ja TR1 on keskeinen toimija antioksidanttipuolustuksen vähentämällä TRX1 ja muut redox sääntelyviranomaisten soluissa [ ,,,0],9] – [12]; 2) TR1 on välttämätöntä asianmukaisen toiminta tuumorisuppressorin p53 [13]; 3) TR1 inhibitiota karsinogeenisia, elektrofiilisen yhdisteet sekaantunut sen syövän ehkäisyyn [1]; ja 4) seleeniä sisältävä aminohappo, Sec, sijaitsee aktiivisen katalyyttisen TR1 [4] ja seleenin tiedetään olevan voimakas syövän ehkäisyyn ominaisuudet [1]. Kuitenkin, TR1 on myös liitetty kasvainten kehittymiseen ja ylläpitoon: 1) se on yli-ilmennetään monissa kasvaimissa ja solulinjat [9] – [12]; 2) useat syöpälääkkeiden ovat voimakkaita estäjiä TR1 viittaa siihen, että tämä entsyymi on kohteena syövän hoidossa [9] – [14]; 3) kohteena poistaminen TR1 kääntää morfologia ja muut syövän ominaisuuksia pahanlaatuisten solujen [16] (katso myös kuviot. 2 ja 3, ja teksti S1); ja 4) seleenin puute on raportoitu vähentävän kasvainten muodostumista joissakin syövän eläinmalleissa [24].

Miten roolia TR1 syövän kehittymisessä voidaan sovittaa yhteen sen osassa kasvaimen tukahduttaminen sekä tiedossa syövän ominaisuuksia seleeniä, joka on katalyyttinen komponentti TR1? On houkuttelevaa spekuloida, että riittävä määrä ravinnon seleeniä yleensä ja riittävän ekspressiotaso TR1 erityisesti ylläpitää solujen redox homeostaasin normaaleissa soluissa, suojaamalla niitä oksidatiivista stressiä, mutaatiot DNA ja vahinkoa muille solukomponenttien. Siten TR1, yhdessä muiden selenoproteins, voivat toimia syövän ehkäisyyn estämällä pahanlaatuisiksi. Kuitenkin vasta alkamassa kasvaimissa, vaatii varten TR1 moninkertaistaa koska tämä proteiini näyttäisi tarvitaan tukemaan kasvaimen kasvua, todennäköisesti siksi, että kysyntä on kasvanut sen vähentämiseksi vastineet kautta TRX1 reitin ja, kuten tässä työssä, DNA: n replikaatiota. Tämä ehdotus selittää niin voimakas syövän ehkäisyä aktiivisuutta ruokavalion seleeniä ja vastakkaisia ​​rooleja TR1 sekä ehkäistä ja edistää syövän. Lisäksi tämä tutkimus tarjoaa perustan selittämään erilaisia ​​kirjallisuustietoja roolista tämän arvoituksellinen proteiinin syöpä ja nostaa TR1 entisestään kuin [8] – [12], [14] – [16] on epäilemättä suuri vaikutus miten me visio saanti seleenin ruokavaliossa ihmisille ja muille nisäkkäille. On tiedetty jonkin aikaa, että ruokavalion, joka sisältää riittävästi tai täydentävän seleeniä on edullisia vaikutuksia estämällä tiettyjen syövän muotoja mahdollisesti toiminnan kautta rikastuttaa selenoprotein väestöstä [1]. Kuitenkin varovaisuutta on ilmaistava, että kun maligniteetti aloitetaan, sitten riittäviä tai rikastettu seleeniä ruokavalio voi palvella ajaa kasvaimien syntyyn. Tutkimuksemme tuo tärkeän kerros kohti ymmärrystä roolit redox prosessien syövän kehitystä ja käyttöä ruokavalion syövän ehkäisyssä ja hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

75Se (spesifinen aktiivisuus 1000 Ci /mmol) saatiin Research Reactor Facility, University of Missouri, Columbia, MO. PVDF-kalvo, NuPage 4-12% Bis-Tris geeleillä, hygromysiini B, lipofektamiini 2000, Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), antibiootti-antimykoottista liuosta ja naudan sikiön seerumia olivat yhtiöltä Invitrogen Life Technologies. siRNA vektori pSilencer 2,1-U6 Hygro ostettiin Ambion, Inc. ja ρ-iodonitrotetrazolium violetti (INT) Sigma. Vasta-aineita DNA-polymeraasia α, β, δ ja ε ostettiin Abcam, Inc: n ja vasta-aineita vastaan, PCNA ja Cdc45 olivat Santa Cruz Biotechnology, Inc .. BCA-proteiinimääritysreagenssilla, SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen olivat Thermo Fisher Scientific Inc. FITC BrdU virtaus pakki hankittiin BD Pharmingen ™. Tasyöpäsolulinja DT joka koodaa kasvaimia synnyttävän

k-ras

ja peräisin NIH3T3 (vanhempien) solujen jalomielinen lahjoitus tohtori Yoon Sang Cho-Chung ja NIH3T3-solut saatiin American Type Culture Collection. LLC1 (hiiren Lewisin keuhkokarsinooma) solut saatiin annettuna [16] ja ihmisen solulinjoja ACHN (ihmisen munuainen munuaissolukarsinooma), A549 (ihmisen keuhko ei-pienisoluinen karsinooma), HCT116 (ihmisen paksusuolen adenokarsinooma) ja SNB19 (ihmisen solu glioblastooma) saatiin NCI DTP, DCTD kasvain Repository at NIH, Bethesda, MD.

Culture nisäkässolujen ja solujen kasvua määritykset

NIH3T3 ja DT-soluja kasvatettiin DMEM jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja antibioottia antimykoottiliuoksella 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Transfektoitu stabiilisti siTR1 (TR1 pudotus) DT-soluja ja stabiilisti transfektoitu pU6-m3 ohjaus DT solut valmistettiin transfektoimalla vastaavat konstruktit lipofektamiinin 2000 ja valitsemalla solut, kun läsnä on 500 ug /ml hygromysiini B täsmälleen, kuten on kuvattu [16] .

morfologia NIH3T3, DT, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 solut arvioitiin eksponentiaalisen kasvun aikana istuttamalla soluja päälle 60 mm viljelymaljoihin, solut kasvanut räjähdysmäisesti ja valokuvattiin käänteisen faasikontrastimikroskoopissa . Kasvuvauhti NIH3T3, DT /pU6-m3 ja DT /siTR1 solut arvioitiin kylvämällä 2 x 10

5 solua /60 mm viljelymaljalla ja sen jälkeen 48 tunnin kasvun jälkeen solut kerättiin trypsiini-EDTA, ja solut laskettiin jonka trypansininen puristamiseen menetelmällä [16]. Arvioimiseksi kasvuvauhti solujen seerumin puutteesta kunnossa, soluja (5 x 10

5 solua /60 mm viljelyastia) ympättiin ja talteen 24 ja 48 tunnin inkubaatio väliaineessa, joka sisältää kaikki komponentit täydellistä kasvualustaa paitsi 0,5% FBS sijasta 10% FBS, ja solut laskettiin kuten edellä.

Western blot-analyysi ja

75Se merkintöjä solujen

tekniikat western blot analyysi ja merkitseminen solujen

75Se on yksityiskohtaisesti muualla [16]. Lyhyesti, Western blot -analyysiä varten, solut pestiin kylmällä PBS: llä ja kokosolulysaateista valmistettiin käyttäen lyysipuskuria (20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 10 mM NaF, 5 mM EDTA, ja proteinaasinestäjä cocktail). Proteiinin solu-uutteissa mitattiin käyttäen BCA-proteiinimääritysreagenssilla, 30 ug proteiinia näytteiden elektroforeesi NuPAGE 4-12% Bis-Tris geeleillä, erotetut proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle ja inkuboitiin sitten aluksi primaarista vasta-ainetta ( polyklonaalinen anti-TR1, anti-DNA-Pol α, β, δ, ε, anti-PCNA ja anti-Cdc45) ja lopuksi HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Kalvot reagoimaan SuperSignal West Dura Extended Duration Alustan ja altistettiin röntgenfilmille.

75Se-merkintöjä, solut ympättiin 6-kuoppalevylle (3 x 10

5 solua /kaivo), inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten leimattu 40 uCi

75Se 24 tunnin ajan, kerättiin ja lyysattiin, kuten edellä on kuvattu. 40 ug kutakin näytettä levitettiin NuPAGE 4-12% Bis-Tris geeli, elektroforeesi, proteiinit värjättiin Coomassie Blue-värjäyksellä liuos, geeli kuivattiin ja altistettiin Phosphorlmager (Molecular Dynamics).

75Se-leimatun selenoproteins altistuneista geelit tunnistettiin autoradiografialla [16].

Soft agar määritys

solujen kasvua pehmeässä agarissa arvioida niiden kyky ylläpitää ankkurointi riippumaton kasvu on ollut yksityiskohtainen muualla [16]. Lyhyesti, yhteensä 1000 ohjaus, DT, DT /pU6-m3 tai DT /siTR1 solut suspendoitiin 3 ml: ssa 0,35% jalo agar kasvatusliuoksessa, jossa oli 10% FBS: ää, ja levitetään tasaisesti 60 mm maljoille peitetty 4 ml pohjapinta kerros 0,7% jalo agaria DMEM. Levyjä inkuboitiin kostutetussa CO

2-inkubaattorissa 14 päivää, 0,5 ml tuoretta elatusainetta lisätään agarmaljalle välein 5 päivää. Pesäkkeet, jotka on kehitetty visualisoitiin värjäämällä ρ-iodonitrotetrazolium violetti (INT) yön yli ja levyt valokuvataan.

Solusyklianalyysiä

Solut ympättiin Soluviljelymaljassa (5 x 10

5 solua /60 mm malja) ja inkuboitiin yön yli ennen siirtämistä seerumin puutteesta median (0,5% FBS: DMEM). Soluja inkuboitiin 5-bromi-2-deoksiuridiinia (BrdU) 6 tuntia ennen sadonkorjuuta, BrdU leimattujen solujen korjattua määrätyin ajankohtina (0 h, 24 h ja 48 tuntia) ja värjättiin vasta-aineilla seurata monistaa DNA. Kerätyt solut kiinteän ja läpäiseviksi BD Cytofix /CytopermTM Fixation /läpäiseväksi ratkaisu solunsisäisen värjäystä. Sillä monistaa DNA-värjäys, joka sisällytetään BrdU koettimena anti-BrdU-vasta-ainetta ja koko genomi-DNA värjättiin 7-amino-aktinomysiini D (7-AAD) valmistajan menettelyjä. Solut, jotka sisältävät vastaavat DNA todetaan analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen FACS Calibur 2 lajittelija (Beckton Dickinson) ja solujen lukumäärä kussakin vaiheessa solusyklin kvantitoitiin FlowJo (Tree Star, Inc.).

tukeminen Information

teksti S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s001

(0,03 MB DOC) B Kuva S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s002

(3,54 MB TIF) B Kuva S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s003

(0,82 MB TIF) B