Krooninen sairaus

tiivistelmä

vaikutus ehkäisevän ihmisen papilloomaviruksen (HPV) rokotuksen vähentämiseen kohdunkaulan syövän (CC) taakka ei tiedetä 30 vuotta. Siksi on edelleen tarpeen parantaa menettelyjä CC seulontaa ja hoitoa. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja kuvata solukohteita että voitaisiin harkita mahdollisia merkkiaineita seulonnassa tai terapeuttisina kohteina. Pyramidin strategiaa käytettiin. Aluksi ilmentyminen 8638 geenien verrattiin välillä 43 HPV16-positiivisia sertiä ja 12 tervettä kohdunkaulan epitheliums käyttäen mikrosiruja. Kaikkiaan 997 geenien vapautui, ja 21 geenit, jotka osoittivat suurinta sääntelyn validoitiin käyttäen qRT-PCR. 6 eniten voimistunut geenit (

CCNB2, CDC20, PRC1, SYCP2, NUSAP1

,

CDKN3

) kuuluvat mitoosin kautta. Ne tutkitaan edelleen 29 heikompilaatuisen kohdunkaulan intraepiteliaalisia neoplasioihin (CIN1) ja 21 vahva CIN (CIN2 /3) selvittää, voisivatko ne erottavat CC ja CIN2 /3 (CIN 2+) välille CIN1 ja valvontaa.

CCNB2

,

PRC1

, ja

SYCP2

käytti enimmäkseen liittyy CC ja

CDC20

,

NUSAP1

, ja

CDKN3

myös liittynyt CIN2 /3. Herkkyys ja spesifisyys

CDKN3

ja

NUSAP1

havaita CIN2 + oli noin 90%. Proteiinit koodaama kaikki 6 geenit näytettiin yläreguloituja CC immunohistokemiallisesti. Yhdistyksen Näiden merkkiaineiden pelastautumiskoulutukseen tutkittiin 42 CC potilaita seurattiin vähintään 42 kuukautta. Vain

CDKN3

oli yhteydessä huonoon säilymiseen ja se oli riippumaton kliinisessä vaiheessa (HR = 5,9, 95% CI = 1,4-23,8, p = 0,01).

CDKN3

ja

NUSAP1

voivat olla potentiaalisia kehittämiseen seulontamenetelmiä. Kuitenkin lisätutkimuksia suurempia näytteitä, jotta voidaan määrittää optimaalinen herkkyys ja spesifisyys. Esto mitoosin on tunnettu strategia torjumiseksi syöpiä. Siksi

CDKN3

voi olla paitsi seulonta ja selviytymisen merkki mutta potentiaalinen terapeuttinen tavoite CC. Kuitenkin onko se välttämätöntä kasvaimen kasvua vielä osoitettava.

Citation: Espinosa AM, Alfaro A, Roman-Basaure E, Guardadon-Estrada M, Palma Í, Serralde C, et al. (2013) Mitosis on lähde Mahdolliset tussit seulonta ja Survival ja terapeuttisia kohteita Kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 8 (2): e55975. doi: 10,1371 /journal.pone.0055975

Editor: Michael Scheurer, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2012; Hyväksytty: 04 tammikuu 2013; Julkaistu: 06 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Espinosa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Council of Science and Technology (CONACYT, www.conacyt.mx), myöntävät numerot 8135 /A1, 24341 (JB) ja 80680 (SK), ja National University of Mexico (www.unam.mx ), myöntää numero SDI.PTID.05.2 (JB). AME, AA ja IMM olivat vastaanottajien stipendiaattina CONACYT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on pääasiallisena syynä kehittämiseen invasiivisen kohdunkaulan syövän (CC), ja HPV löytyy lähes 100% näistä kasvaimista [1], [2]. CC tulokset etenemistä preinvasive kohdunkaulan intraepiteliaalinen neoplasia (CIN), joka on histologisesti luokitella lieväksi (CIN 1), kohtalaista (CIN 2), tai vaikea (CIN 3) dysplasia. CC tapahtuu pääasiassa CIN3 ja CIN2, mutta harvoin alkaen CIN1; arvioitu edennyt, näiden vaurioiden CC ovat 12%, 5% ja 1%: lla [3]. Tällä hetkellä rokotteiden markkinoilla, jotka estävät infektion onkogeenisten HPV-tyyppien 16 ja 18, jotka liittyvät 65-70% CCS maailmanlaajuisesti [4]. Nämä rokotteet ovat erittäin korkea hyötysuhde tartuntavaaran ja kehittäminen korkean asteen kohdunkaulan intraepiteliaalisia neoplasioihin (CIN2 /CIN3) [5], [6]. Kuitenkin rokotettu naisten on edelleen osallistua ohjelmien varhaista havaitsemista CC sillä nämä rokotteet suojaa ainoastaan ​​tiettyjen virustyyppien, ja se ei vielä tiedetä, kuinka kauan immuunijärjestelmän suojaa tavoite virus jää [7], [8]. Monissa maissa rokotteita HPV 16 ja 18 on sisällytetty kansalliseen rokotusohjelmaan, tytöille 9-12 vuotta iässä [9], [10]. Koska huippu esiintyvyys CC esiintyy naisilla 45-50 vuotta vanha, vaikutus näiden ennaltaehkäisevien rokotusohjelmien yleisyyden vähentämiseen CC ei tiedetä 30 vuotta. Siksi on tarpeen parantaa menettelyjä CC seulontaa ja hoitoa. Koska joka vuosi 530 000 uutta tapausta CC ja 275 000 CC kuolemat ilmoitetaan maailmanlaajuisesti ilmaantuvuus ja kuolleisuus suhde on noin 50% [11], [12].

Useiden vuosien Papanicolaou (PAP) testi on ollut tärkein seulontamenettelyssä varhaiseen diagnosointiin CC, ja sen massiivinen sovellus kehittyneissä maissa on vähentynyt esiintyvyys CC yli 50% viimeisten 40 vuoden aikana [13]. Naiset, joilla on epänormaali Puurot viitataan varten colposcopy vahvistaa, hävittää tai selventää diagnoosi histopatologinen tutkimus. Kuitenkin keskimääräinen herkkyys sytologia havaitsemiseksi CIN vaurioiden on 50-60%; vaikka spesifisyys on erittäin korkea, noin 90% [14]. Koska HPV on välttämätöntä kehittämiseen CC, useita menettelyjä havaita HPV-genomin on sisällytetty CC seulontaan. Verrattuna perinteisiin sytologia, HPV-DNA-testaus on suurempi herkkyys mutta pienempi spesifisyys havaitsemiseksi CIN2 vaurioita tai korkeampi (CIN2 +). Suuri herkkyys ja korkea negatiivinen ennustearvo (NPV) HPV-DNA testit havaitsemiseksi CIN 2+ muutokset viittaavat siihen, että sitä voitaisiin käyttää lisäämään seulontaan välein. Kuitenkin alhainen spesifisyys HPV DNA-testien lisäisi määrää seurannan testejä ja kolposkopia lähetteitä, mikä lisäisi kustannuksia seulonnan [15]. Siksi on tarpeen kehittää uusia menetelmiä varhaisen havaitsemisen CC korkea herkkyys ja spesifisyys on selvä. Useita kasvainmerkkiaineet liittyy CIN2 + on tunnistettu, etenkin

CDKN2A

,

TOP2A

, ja

MCM2

. Kuitenkin nämä merkit on ehdotettu ei seulontaan, mutta diagnoosin, ennuste, tai kliinisen hoidon [11], [16].

Invasiivisen kohdunkaulan syöpä on jo hoidetaan kirurgian, kemoterapia, sädehoito, tai yhdistelmä näiden hoitojen, riippuen kliinisestä sairauden vaiheesta. Onnistuminen on perinteisiin hoitoihin ja potilaiden eloonjäämisen pienenee sairauden edetessä enemmän edennyt pitkälle [17]. Itse asiassa naisten osuus, jotka hengissä 5 vuotta laskee 93% vaiheessa IA 15% vaiheessa IVB (www.cancer.org). Toisin kuin muiden syöpien, joille useita erityisiä molekyyli lääkkeitä on kehitetty [18], ei ole erityisiä molekyyli kohdistettuja hoitomuotoja CC. Suurin osa huumeiden vastaan ​​erityisiä tavoitteita syövän suuntautuvat muuntunut proteiineja, erityisesti proteiinikinaaseiksi [19]; mutta jotkut lääkkeet kohdistaa normaali proteiineja, joita yli-ilmennetään, kuten HER2 /neu rintasyövässä [20], [21]. Ensimmäinen askel kehittää erityinen molekyyli lääke tunnistaa yleinen molekyylikohteista jotka ovat läsnä potilailla sertin ja poissa terveillä naisilla.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa ja kuvata solukohteita läsnä useimmissa sertiä ja poissa normaalista kohdunkaulan kudos, joka eroavat riittävästi 2 ryhmän välillä voidaan pitää joko mahdollisina markkereita seulontaan, joiden herkkyys ja spesifisyys lähes 100%, tai mahdollisina terapeuttisina.

Methods

etiikka lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi tiede- ja eettisten komiteoiden Hospital General de Mexico (hyväksymisnumero DIC /03/311/04/051) ja suoritettiin mukaisesti eettisten periaatteiden kuvattuja 1964 Helsingin julistuksen. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikille osanottajille ennen niiden sisällyttämistä tutkimukseen.

Oppiaineet, näytteet, ja kokeelliset

Tutkimushenkilöt mukana 69 potilasta, joilla invasiivisen kohdunkaulan syövän (CC) diagnosoitu Department of Oncology, 29 potilailla, joilla on matala-asteinen CIN (CIN1), 21 potilasta, joilla vahva CIN (CIN2 ja CIN3), ja 25 naista, joilla oli normaali kohdunkaulan epiteelin arvioidaan laitoksella Naistenklinikka klo Hospital General de México Mexico Cityssä. CC näytteet olivat osajoukko valitaan kaikkiaan 462 potilasta, joilla CC jotka rekrytoitiin peräkkäin marraskuusta 2003 kautta heinäkuussa 2007 mikä oli noin 80% potilaista vasta diagnosoitu CC tänä aikana johtuen rajoittavien mukaanottokriteerinä (no edellinen hoito, tapaus tapauksessa syntynyt Meksikossa Meksikon syntyperä 2 sukupolvea). Valintakriteerit CC osajoukon perustuivat saatavuus tuoretta Tuumorinäytteiden RNA uuttamalla yli 70% kasvainsolujen morfologinen analyysi (katso jäljempänä), enimmäkseen FIGO vaiheet I /II, ja viruksen tyyppi. Tämä alaryhmä sisältyy 47 positiivisissa näytteissä HPV16 ja 22 näytteiden positiivisia muuta virusta tyypit, mukaan lukien HPV 18, 31, 33, 45, 51, 58, ja 59. Niistä 54 näytteet olivat okasolukarsinoomia, 14 näytteet olivat adenokarsinoomat, ja 1 näyte oli sellaisen adenosquamous syöpä. Keski-ikä syöpäpotilailla oli 48 vuotta (vaihteluväli, 23-78 vuotta, taulukko S1). Kaikki potilaat saivat täydellisen kliinisen arviointeja. Kasvaimet CC potilasta lavastettu mukaan viimeinen kansainvälinen tarkistettu protokolla gynekologiset syöpään [22]. Yksi tai kaksi koepaloja, harjoitettuun colposcopy tarkastelun, otettiin kasvaimia. Yksi biopsia jaettiin 2 yhtä suureen osaan, 1 osa kiinnitettiin puskuroidussa formol varten morfologinen analyysi ja toinen osa, yhdessä toisen koepala oli snap-jäädytetty kuivan jään päällä ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Kaikki CC potilaat ohjattiin leikkaukseen, säteily, kemoterapiaa, tai yhdistelmä näistä hoidoista ohjeiden mukaan American Cancer Society (katso alla). Ohjaus kohdunkaulanäytettä saatiin potilailta, joille suoritetaan kohdunpoisto johtuen myomatosis klo naistentautien yksikön Hospital General de Mexico. He olivat aiemmin todettu normaalia kohdunkaula jonka sytologia ja kolposkopia. Välittömästi sen jälkeen, kun vastaanotetaan kohdunkaula fragmentti toiminta huoneeseen, exocervical ja endocervical epitheliums leikeltiin alla stereoskooppisen mikroskoopin välttää stroomasoluissa. Sitten kudokset jäädytettiin nestetypessä ja varastoitiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. HPV havaitseminen ja kirjoittamalla, kaapia pois endocervix ja ectocervix kerättiin cytobrush päässä potilaiden ja verrokkien, solut suspendoitiin injektiopullon uuttopuskurin, ja sitten niitä säilytettiin -20 ° C: ssa analyysiin asti. Analyysi globaalin geeniekspression (8638 geenien) suoritettiin RNA: t uutetaan 43 tuoreista kasvainbiopsioissa positiivinen HPV16 ja 12 näytettä normaalista kohdunkaulan epiteelin käyttäen HG-Focus mikrosirun. Global geeniekspressio validoitu 24 näytettä, joista 19 sertiä ja 5 kohdunkaulan epiteelin valvontaa, toinen suurikapasiteettisten microarray (HG-ST1.0). 23 geenit, jotka osoittivat suurinta sääntelyn todensi reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) in 44 HPV16-positiivisia CC ja 25 kontrollinäytteitä. 6 eniten ilmentyvät eri geenit (

CCNB2

,

CDC20

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

, ja

CDKN3

) on vielä syvennettävä 29 heikompilaatuisen kohdunkaulan intraepiteliaalisia neoplasioihin (CIN1) ja 21 vahva CIN (CIN2 /3) tutkia ne voisivat erottaa CC ja CIN2 /3 (CIN 2+) välille CIN1 ja valvontaa. Immunohistokemiallinen (IH) suoritettiin 10 valittujen proteiinien 26 CC näytteissä ja 10 kontrollinäytteitä. Yhdistys 9 merkkiaineiden pelastautumiskoulutukseen tutkittiin eloonjääminen analyysi 42 potilaalla HPV16-positiivisia CC jotka seurattiin vähintään 42 kuukautta.

DNA ja RNA: n eristäminen

DNA puhdistettiin kohdunkaulan naarmuja ja jotkut kudosnäytteistä käyttämällä PureLink Genominen DNA Kit (Invitrogen, Grand Island NY) ja pidettiin -20 ° C: ssa analyysiin asti. Kokonais-RNA eristettiin puolet jaetaan koepala käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollaa. Laatu RNA varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla, kuten on osoitettu, kun läsnä on ehjä ribosomi-RNA, jossa 28s kaistan kaksi kertaa niin voimakas kuin 18s bändi.

havaitseminen ja HPV Typing

HPV tunnistus suoritettiin PCR: llä käyttämällä universaali alukkeita sijaitsee HPV

L1

geeni

MY09 Twitter /

MY11

,

GP5

+ /

6 +

, ja

L1C1

kuten aiemmin on kuvattu [23] – [25].

HBB

geeniä käytettiin sisäisenä kontrollina laadun arvioimiseksi DNA. HPV tyypit tunnistettiin sekvensoimalla monistettu bändejä positiiviset näytteet käyttäen fluoresoivaa sykli-sekvensointi menetelmä (BigDye Terminator Ready Reaction Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvenssin analyysi suoritettiin käyttäen ABI PRISM 3130xl geneettistä analysaattoria (Applied Biosystems). Jokainen sekvenssi HPV positiivista näytettä analysoitiin FASTA sekvenssin samankaltaisuus työkalu [26]. Keskimääräinen prosentuaalinen identiteetti näiden sekvenssien HPV-tyypeille oli 98,7% (vaihteluväli 91-100%).

geeniekspressioprofilointi ja data-analyysin

geeniekspressioprofiili 43 sertiä positiivisia HPV16 ja 12 terveillä verrokeilla kohdunkaulan epitheliums tutkittiin käyttäen Human Gene Focus (HG Focus) oligonukleotidi Microarray (MA) (Affymetrix, Santa Clara, CA). Tämä joukko sisältää 8794 koetinsarjojen vastaten 8638 tunnettu ihmisen geenien Gene Viitetietokanta. Total RNA: n valmistaminen (10 ug), leimattu cRNA synteesi, hybridisaatio, skannaus, ja kuva-analyysi suoritettiin mukaan valmistajan protokollia (Affymetrix GeneChip- Expression Assay manuaalinen). Laadun arvioimiseksi kokeiden seuraavia parametrejä käytettiin: lisääntynyt ilmentyminen eksogeenisen poly-A ohjaimet (Lys Phe Thr Dap), läsnäolo oligo B2 käytetään tekemään verkkoon linjauksia, tausta hyväksyttävällä välillä 20 100, yhtä suuri melu kaikissa näytteissä, prosenttiosuus esillä vaatii enemmän kuin 50%, 3 ’/5’ suhde konstitutiivisen geenin (GAPDH tai β-aktiini) on alle 3, ja lisääntyneen ekspression hybridisaation kontrolleihin (BioB BioC biod cRE). Vain ne MAs optimaalisen laadunvalvonnan analysoitiin. Lisäksi joitakin näytteitä suoritettiin kahtena arvioida toistettavuus kokeilun, mikä oli korkeampi kuin 99%.

MA intensiteetti arvot normalisoitiin käyttäen Robust Multichip keskiarvo (RMA) algoritmi FlexArray ohjelmistojen [27]. Normalisoitu voimakkuus arvot kutsutaan yksikköä intensiteetti (UI). Geenit ilmaistu toisella välillä kasvainten ja kontrolliraskauksiin algoritmilla merkitys analyysi mikrosirujen (SAM versio 3.0, https://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) käyttäen cut-off-arvot kertamuutos ( FC) of ≥1.5 yleinen väärä löytö määrä (FDR) on 1%, ja paikallinen FDR 10% [28]. Ohjaamaton hierarkkinen klusterointi ja pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritettiin käyttäen dChip ohjelmistoa (versio 1.6, www.dCHIP.org) ja R kielen Javan alustan, vastaavasti.

validointi Global Gene Expression toinen korkea suoritusteho microarray (HG-ST1.0) B

geeniekspressioprofiili 24 näytettä tutkitaan kanssa HG-Focus microarray, joista 19 sertiä ja 5 kohdunkaulan epiteelin valvontaa, tutkittiin myös käyttämällä Human Gene 1.0 ST oligonukleotidi microarray ( Affymetrix, Santa Clara, CA). Tämä joukko sisältää 33297 koetinsarjojen jotka vastaavat noin 20741 geenejä ihmisen geenin viitetietokannan mukaan UCSC Genome Browser Assembly maaliskuu 2006 NCBI 36 /hg18, saatavilla osoitteessa https://genome.ucsc.edu/. Total RNA: n valmistaminen (300 ng), leimattu DNA-synteesin, hybridisaatio, skannaus, ja kuva-analyysi suoritettiin mukaan valmistajan protokollia (Affymetrix GeneChip- Expression Assay manuaalinen). Laadun arvioimiseksi kokeiden seuraavia parametrejä käytettiin: Ulkosyntyisen poly-A valvontaa, läsnäolo oligo B2 käytetään tekemään verkkoon linjauksia, ja alue käyrän alla (AUC) arvoja yli 0,8. Vain ne mikrosirut optimaalisen laadunvalvonnan analysoitiin. Mikrosiruja normalisoitiin käyttäen RMA algoritmin Affymetrix ilmaisun konsoli. Normalisoitu voimakkuus arvot kutsutaan yksikköä intensiteetti (UI). Normalisoitu intensiteettiä (log

2-arvot) tutkittavissa 8370 geenejä, jotka tutkittiin molemmilla mikrosiruja (HG ST1 ja HG Focus) verrattiin, ja korrelaatio oli arvioitu Pearsonin korrelaatiokerroin.

Validation Global Gene Expression by Reaaliaikainen kvantitatiivinen retrotransskription PCR (qRT-PCR) B

Käänteiskopiointireaktioita totaali-RNA suoritettiin käyttäen High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems) kokonaistilavuudessa 20 ui. Yhdistelmä sisältyy 2 ug RNA: ta, 2 ui 10 x RT-puskuria, 0,8 pl 100 mM dNTP: itä, 2 ui 10 x RT Random Primers, 1 ui MultiScribe ™ käänteistranskriptaasin (5 U /ul), ja 1 ui RNaasi-inhibiittoria (2 U /ul). Reaktioita inkuboitiin 37 ° C: ssa 120 min, ja sitten niitä säilytettiin -20 ° C: ssa. Joukko 23 geenejä käytettiin vahvistamaan geeniekspression 44 HPV16-positiivisia CC ja 25 tervettä kohdunkaulan epiteelin kontrollinäytteistä qRT-PCR käyttäen Taqman. Geenit sisältyvät ovat

CCNB2, cdc2, CDC20, CDKN2A, CDKN3, CKS2, MCM2, MKI67, NUSAP1, PCNA, PRC1, RFC4, RRM2, SMC4, SYCP2, TOP2A, TYMS, ZWINT, CFD, EDN3, NDN, SLC18A2

ja

WISP2

.

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. TaqMan geenin ilmentymisen määrityksiä (taulukko S2; Applied Biosystems). Seitsemän geenit tutki myös 22 CC positiivisia muiden HPV (

CCNB2

,

CDC20

,

CDKN3

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

,

TYMS

), ja ensimmäinen 6 niitä yhdessä

CDKN2A

,

PCNA

,

MKI67

geenit olivat tutkitaan edelleen 29 huonolaatuisen CINs ja 21 korkealaatuista CINs. Kokeet ajettiin kahtena kappaleena: n lopullisessa tilavuudessa 20 ui, mukaan lukien 200 ng cDNA-templaattia, 10 ui 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 ui 20 x TaqMan Gene Expression Assay, ja 7 ui RNaasi-vapaata vettä. Sykliohjelma ajettiin on Roottorin Gene (Corbett Research, Sydney, Australia), joka oli asetettu seuraavasti: ensimmäinen PCR aktivointi vaiheessa 50 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä joka suli 95 ° C: ssa 15 s ja pariutumis /pidennys 60 ° C: ssa 1 min. Mediaani Ct keskihajonnat kaksoiskappaleet vaihteli 0,09-0,24 (keskiarvo = 0,16) joukossa 23 geenit, mikä viittaa siihen, että vaihtelut kaksoiskappaleet olivat hyvin pieniä [29]. Mittaus geenien ilmentyminen perustui suhteellisen standardikäyriin valmistettu 10-kertainen laimennossarja pooli CC tai normaali kohdunkaulan epitelium cDNA vaihtelee 500-,05 ng. Ensimmäinen käyrä käytettiin arvojen laskemiseen voimistunut geenien ja toisen kaarteen arvot vaimentua geenejä. Käyrät kunkin geenin testattiin kolmessa eri kokeissa juoksi kahtena ja keskiarvot korrelaation coeficients (r) olivat suuremmat kuin 0,98. Ilmentyminen kohdegeenien normalisoitiin kunkin kasvaimen ja ohjaus näytteen intensiteettiä sisäisenä vertailuna (

GADPH

) käyttäen aiemmin kuvatun menetelmän [30]. Normalisoitu voimakkuus mitattiin ng /ul. Normaalisuus testi (Shapiro-Wilk) suoritettiin testi normaalijakaumaa geeniekspression data. Kertamuutoksen ekspressio laskettiin jakamalla mediaani normalisoitu intensiteetti kasvaimen näytteiden mediaani normalisoitu intensiteetti kontrollinäytteistä. Välisen tilastollisen merkittävyyden mediaanit kasvaimia ja valvonnan laskettiin Mann-Whitney (MW) ei-parametrinen testi. Väliset korrelaatiot MA tulosten ja qRT-PCR data tehtiin käyttäen log

2-arvot ja mitataan käyttäen Pearsonin korrelaatiokerrointa.

immunohistokemia

proteiinin ilmentymistä 10 geenien määritettiin 26 CC ja 10 kontrollinäytteistä IH. Kaksi kotitekoinen kudossiruina (TMA) rakennettiin, joista toinen sisältää 14 HPV16-positiivisia sertiä ja 5 valvontaa ja toinen 12 CC positiivisia muille HPV ja 5 kontrollia. NUSAP1 tutkittiin vain näytteitä ensimmäisen TMA. Sylinterimäinen näytteitä edustaja alueiden parafiiniin kudosblokeista, aiemmin valitsemaa H p16 for CDKN2A (sc-71804); SCP-2 SYCP2 (sc-20048), PRC1 (sc-56345); sykliini B2 CCNB2 (sc-81241); CDKN3 (sc-475); ja Cdc2 varten p34 (sc-70822), saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet CDC20 (cat. 34-1900), Ki-67 MKI67 (cat. M7187) ja NUSAP1 (cat. H00051203-B01) saatiin Invitrogen, Dako (Glostrup, Tanska), ja Nova Biological (Littleton, CO ), vastaavasti. Laimennus käytetään kaikkien vasta-aineiden oli 1:100, paitsi cdc2, (01:50) ja NUSAP1 (1:250), ja vasta-aine laimennusaineen käytettiin Dako. Kokonaistilavuus 300 ui lisättiin kuhunkin osassa, ja laseja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Antigeeni-vasta-kompleksit on todettu avidiini-biotiini-peroksidaasi-menetelmällä käyttäen 3,3′-diaminobentsidiiniä-tetrahydrocloride kuin kromogeenisen substraatin (Cat. KO679 LSAB + Sys /HRP; Dako-Cytomation Carpinteria, CA), ja leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Vasta-aineet ja SYCP2, PRC1, CCNB2, CDKN3, cdc2, ja CDC20 testattiin kudoksissa tiedetään ilmaista näitä antigeenejä. SYCP2 testattiin vastasyntyneillä kives; PRC1, cdc2, ja CCNB2 testattiin paksusuolen syöpä; ja CDKN3 testattiin keuhkosyöpä koepaloja. Kaikki kudokset saatiin arkistoista patologian osaston. Prosenttiosuus värjättyjen solujen laskettiin analysoimalla 10 peräkkäisten suuritehoisia aloilla kasvainsolujen. Solun sijaintia immunoreaktion tunnistettiin, ja intensiteetti immunoreaktion pisteytettiin 0-4, jossa 0 osoitti värjäytymistä. Immuuni reaktio signaaleja havaittiin harvoin strooman kaikkien vasta-aineiden ja ei teki analyysiä varten. Immunovärjättiin dioja analysoitiin ja tekee 2 patologia, jotka olivat sokaissut tuloksia. Harvinaisissa tapauksissa ristiriitaisia ​​tulokset olivat uusia arvioita, pisteytetään perustuu konsensukseen lausuntoa.

Survival Analyysi syöpäpotilaiden

Mukaan FIGO lavastus potilailla, joilla on kohdunkaulan syövän sai yksilöllistä kohtelua sillä perusteella, hoitosuositukset kohdunkaulansyövän American Cancer Society (katso taulukko 1). Sen jälkeen, kun hoito on suoritettu, kunkin potilaan arvioitiin kliinisesti välein 3 tai 6 kuukautta kokenut onkologi. Kliiniset tiedot on seurantatutkimus saatiin potilaiden terveystiedot. Myös sosiaalityöntekijä suorittaa puheluita ja kotikäyntejä potilaille 6 kuukauden välein tutkimuksen aikana. Potilaat kirjataan elossa tutkimuksessa onnistuneesti seurattiin vähintään 42 kuukautta hoidon jälkeen. Sensuroitu ja kuolleen potilaita seurattiin kuukausien määrän taulukossa 1. tapaukset nimetty sensuroitu tarkoitettu potilaille, jotka olivat hävisi tutkimuksen seuranta-aikana tai kuolleen peräisin muista syistä kuin kohdunkaulan syöpä. Potilaiden katsottiin menetetään, kun ei hoitaa lääkärin vastaanotolle tautientorjuntakeskusten, ei löydetty käynteihin tai ei vastannut puheluihin. Tässä kohortin potilaista kirjattu kuolleen oli vain naisia, jotka kuolivat kohdunkaulansyöpä primaarikasvaimen pääasiallisena syynä. Kuolinsyy on kaikki paitsi yksi potilas, joka kuoli seurannan aikana varmistettiin terveystiedot ja kuolintodistus. Vain 42 44: llä HPV16-positiivisia CC pohditiin qRT-PCR sisällytettiin seurataan tutkimuksen. Neljä tapausta pidettiin oikeassa sensuroitiin ja kahdeksan kuolemantapausta oli rekisteröity. Keskimääräinen Seuraavat aika 42 potilaalla oli 50,5 kuukautta. Yhdistyksen Figo ja geenien ilmentymisen (

PRC1, CCNB2, CDC20, CDKN3, NUSAP1, SYCP-2, CDKN2A, PCNA, MKI67

) pelastautumiskoulutukseen tutkittiin eloonjääminen analyysi. Kun koko otoksen asetettu 500 koulutus sarjaa 21 näytteitä satunnaisesti luotu jokaiselle geenin tutkitaan. Luokitella geenien ilmentyminen tietojen kvantifioitiin qRT-PCR, ROC-analyysi suoritettiin kunkin koulutukseen asetettu. Tämä analyysi tehtiin asettaa raja-geenien ilmentymisen, joka edusti nämä arvot on korkein herkkyys ja spesifisyys erottamaan kuolleen ja elossa olevien potilaiden. Koko näyte setti analysoitiin sitten keskimääräiseen cut-off, laskettuna arvot 500 opetustiedostoiksi. Näytteet, joissa geenin ilmentyminen arvot ylittävät raja-asetettiin 1 ja ne, joiden arvot alle cut-off asetettiin 0. kumulatiivinen eloonjäämisaste aika laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja analysoidaan log-rank-testi. FIGO lavastus ja geenin ilmentyminen sisällytettiin kovariantteja vuonna Coxin suhteellisen riskin malliin.

Gene ontologia Classification Analysis

Tietokanta Annotation, visualisointi, ja Integrated Discovery (DAVID) toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [31], [32] ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) käytettiin luokitella vapautettu geenejä. Geenit luokiteltiin käyttäen funktionaalisia huomautusta klustereiden harkitsee geeni ontologian biologisia prosesseja. Luokittelu ankaruus asetettiin keski- ja enimmäismäärä.

Gene Huomautukset ja data-analyysin

fyysistä paikkaa geenien kartoitettiin mukaan UCSC Genome Browser Assembly maaliskuu 2006 NCBI 36 /hg18, käytettävissä klo https://genome.ucsc.edu/. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Access 2010 (Microsoft Inc.). Raaka MA data on MIAME mukainen ja se on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta (GEO, https://www.ncbi.nih.gov/geo/) tulonumerolla GSE39001. Vastaanotin operaattori (ROC) käyrä analyysi suoritettiin ja Youdenin indeksiä käytettiin [33] ja valitse paras katkaisupisteet erottaa kasvainten valvontaa ja CIN 2+ alkaen CIN1- käyttämällä ilmaisua arvot valittujen geenien saatu qRT-PCR. Kunkin merkki, herkkyys, spesifisyys, positiivinen ennustearvo (PPV), ja negatiivinen ennustearvo (NPV) laskettiin aiemmin kuvattu kaavojen [34]. Kaikki testit olivat 2-puolinen, ja p-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Sigma Stat ja SPSS ver. 17 ohjelmisto.

Tulokset

Expression analyysi 8638 geenien Kohdunkaulan syöpä

määrä mRNA transkriboidaan 8638 geeneistä verrattiin välillä 43 CC näytteiden positiivisia HPV16 ja 12 normaali kohdunkaulan epiteelin näytteitä käyttäen HG-Focus mikrosirun. Yhteensä 997 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä syövän ja kontrolliryhmiin; 600 oli voimistunut ja 397 olivat vaimentua (taulukko S3). Lähes puolet voimistunut ja vaimentua geenit oli FCt välillä 1,5-2,0, ja joukko geenejä molemmissa ryhmissä vähentynyt lineaarisesti (r = -0,8, p = 0,002) kuin FC-arvo kasvoi (kuvio 1). Pääkomponenttianalyysin (PCA; tuloksia ei ole esitetty) ja ei-valvottu hierarkkinen klusterointi (paneeli A kuviossa 2) suoritetaan kaikkien 997 geenin ilmentyminen arvot selvästi erotettu syöpä näytteet kontrolliryhmässä. Ilmaisulla monien geenien ei ollut täysin yhtenäiset eri syövän näytteiden, erityisesti ryhmä ilmen- tymisen lisääntymisen geenien (signaalit punaisella kuviossa 2A). Monet näistä geeneistä oli yläreguloituja joissakin kasvaimissa ja vaimentua muissa kasvaimissa. Tämä oli toisin kuin tasaisuus ilmaisu signaalien kontrolliryhmässä näytteitä. Geenit testattava merkkeinä seulontaan tai mahdollisina terapeuttisina valittiin mukaan Δ-pisteet rank (modifioitu t-testi, jota käytetään SAM), FC vai aikaisemmin käytettiin markkereita kohdunkaulan syövän. Alkaen 997 liittyvien geenien syöpä näytteitä, 163 on aikaisemmin raportoitu markkereita eri syöpien (IPA, kekseliäisyyttä Systems), kuten

MCM2

,

TOP2A

, ja

CDKN2A

, joita on käytetty merkkiaineina diagnosoinnissa kohdunkaulan syövän [35]. 997 geenit luetellaan alenevassa tilaaman Δ-pisteet (taulukko S3). Kaikkiaan 23 geenien (18 voimistunut ja 5 säädeltiin vähentävästi) valittiin tehtävän hyväksynnän qRT-PCR (lihavoitu taulukossa S3 ja Taulukko 2; piireissä värillinen sininen ja oranssi kuvassa 1). Kaikki vaimentua geenit (

CFD

,

NDN

,

WISP2

,

End3

, ja

SLC18A2

) ja 10 18 ilmen- tymisen lisääntymisen geenit (

PRC1

,

CKS2

,

TYMS

,

RFC4

,

RRM2

,

NUSAP1

MCM2

,

CCNB2

,

SMC4

, ja

cdc2

) valittiin mukaan Δ-pisteet listalla. Seitsemän jäljellä voimistunut geenit ovat listan 50 parhaan sijoittui geenejä, 2 heistä ovat geenejä, jotka on aiemmin ehdotettu merkkiaineiden CC (

CDKN2A

ja

TOP2A

), 4 (

CDC20

,

CDKN3

,

ZWINT

, ja

SYCP2

) valittiin perustuen FC arvosta, ja

PCNA

(taulukko S3) yhdessä

MKI67

, joka sijoittui 139. paikalleen, otettiin mukaan, koska nämä merkit ovat yleisesti käytetään mittaamaan solujen lisääntymistä. a. a. b. c. b.