Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

sirutekniikalla sovellettu microRNA (miRNA) profilointi on lupaava työkalu monilla tutkimusaloilla; kuitenkin, riippumattomat tutkimukset kuvaavat samaa patologian usein raportoitu huonosti päällekkäisiä tuloksia. miRNA analyysimenetelmät ovat vasta hiljattain järjestelmällisesti verrattuna, mutta vain harvoissa tapauksissa käyttää kliinisissä näytteissä.

Menetelmät /Principal Havainnot

tutkineet välinen alustan toistettavuus neljän miRNA microarray alustoille (Agilent, Exiqon , Illumina, ja Miltenyi), verrataan yhdeksän pariksi kasvain /normaali paksusuoli kudoksissa. Kaikkein Lihavien ja valitut discordant miRNA tutkittiin edelleen kvantitatiivisella RT-PCR. Maailmanlaajuisesti huono päällekkäisyys ilmentyvät eri miRNA tunnistaa kunkin alustan todettiin. Kuitenkin kahdeksan miRNA korkea yksimielisyys erilaiseen ekspressioon joukossa neljä alustoja ja vertailukelpoisuuden qRT-PCR havaittiin. Lisäksi useimmat miRNA sarjaa tunnistaa kunkin alustan johdonmukaisen rikastettu tietoja muiden alustojen ja suurin osa paksusuolensyöpä liittyvän miRNA sarjaa peräisin kirjallisuudesta validoitu meidän tiedot, riippumatta alustan. Laskennallinen integrointi miRNA ja geeniekspressioprofiilien ehdotti, että anti-korreloivat ennustettu kohdegeenien differentiaalisesti ilmaisi miRNA yleisesti rikastettu syöpään liittyvien reittejä sekä geenien Glykolyysivaiheen ja ravinteiden kulkeutumista.

Johtopäätökset

Tekninen ja analyyttinen haasteita mitattaessa miRNA edelleen ja lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan lisätä johdonmukaisuutta eri microarray perustuvia menetelmiä. Kuitenkin parempi välinen alustan Sopimuksen havaittiin tarkastelemalla miRNA asetetaan sijasta yhden miRNA ja läpi miRNA – geenien ilmentyminen integroitu lähestymistapa.

Citation: Callari M, Dugo M, Musella V, Marchesi E, CHIORINO G, Grand MM, et ai. (2012) vertailu Microarray Platform mittaaminen Differential MicroRNA ilmentäminen Paired Normaali /Cancer Colon kudokset. PLoS ONE 7 (9): e45105. doi: 10,1371 /journal.pone.0045105

Editor: Yujin Hoshida, Mount Sinai School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 14 elokuu 2012; Julkaistu: 13 syyskuu 2012

Copyright: © Callari et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cariplo Foundation (2007.1215 /10,4890 MAP), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC IG-10302 2010 SC ja AIRC 5 × 1000 n. 12162 SC) ja terveysministeriön (ACC apuraha MGD), ja tuella Regione Lombardia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylien 18-24 nukleotidin pituisia, jotka ovat laajasti konservoitunut kaikissa eukaryoottiorganismeja ja toimivat säätelijöinä geenien ilmentyminen. miRNA ovat mukana kaikki suuret solujen prosessit ja ovat osallisina suuri määrä ihmisen sairauksia kuten syöpää [1] – [3].

Kuluneen vuosikymmenen aikana, DNA-siru teknologia on tullut yhä kustannustehokasta menetelmää joka pystyy nopeasti tuottamaan korkean suoritustehon data, valmistaa tietä genominlaajuisia (GW) analyysi geenien ilmentymisen, genomisen kopioluvun vaihtelut, SNP, ja epigeneettiset muutokset. Microarray-pohjainen tekniikoita on laajasti käytetty useissa tutkimuksen ja molekyylitason analyysit käyttäen malleja geenin ilmentymisen ja ennalta määrätty matemaattisia algoritmeja, kuten Mammaprint®) [4], parhaillaan validointi mahdollisille multisentrinen kliinisissä tutkimuksissa rintasyövässä.

äskettäin sirutekniikalla on sovellettu miRNA profiloinnin ja on tulossa lupaava tekniikka monilla tutkimusaloilla, kuten translaatiotutkimusta onkologian, ja voi antaa hyödyllistä tietoa roolista miRNA sekä kasvainten synnyssä ja etenemisessä syöpä [2]. Kuitenkin riippumattomat tutkimukset kuvaavat samaa patologia on usein huonosti päällekkäisiä tuloksia. Tämä voi johtua pieni otoskoko, korkea kasvain vaihtelevuus ja heterogeenisyys vaan myös teknisistä syistä. Merkittävä etu microarray lähestymistavassa korkean suoritustehon samanaikainen seulonta jopa tuhansia molekyylejä yhdessä määrityksessä, mutta tämä edellyttää hybridisaatio-olosuhteissa olla samat kaikille koettimista array. Tämä ei ole vähäpätöinen miRNA mikrosiruja koska GC-pitoisuus miRNA on erittäin vaihteleva ja vaihtoehtoja sondirakenne ovat rajoitetumpia kuin mRNA johtuu niiden lyhyt pituus. Täydellinen katsaus yleisiä käsitteitä ja erityisiä haasteita, jotka liittyvät miRNA profilointi viittaa Pritchard et ai [5]. Lukuisia alustoja miRNA profilointiin ovat kaupallisesti saatavilla, ja jokainen valmistaja on kehittänyt oman teknisiä menettelyjä maksimoimiseksi herkkyyden ja spesifisyyden mittaamalla miRNA ekspressiotasoja. Tämän seurauksena, koetin signaalien uskotaan laajalti erilaisia ​​eri alustoilla, ja suora vertailu ei ole mahdollista. Tästä huolimatta, yleisen kuviot differentiaalisesti ilmaistuna (DE) miRNA olisi johdonmukaisesti havaita kaikilla alustoilla. Vasta viime aikoina vertailua sekä yksilöiden välinen alustan toistettavuus miRNA mikrosiruja on analysoitu yli kolme erilaista alustoilla (katso taulukko S1 lisätietoja) [6] – [11]. Yhdessä nämä tutkimukset antavat todisteita siitä, että miRNA microarray alustoille osoittavat erinomaista sisäistä alustan toistettavuus, mutta rajoitettu välinen alustalla aloista. Todellakin, verrataan miRNA tunnistettu DE sisällä kunkin alustan, merkittävää vaihtelua kokonaismäärässä sekä taitettavan muutos miRNA on todettu. Kolme näistä tutkimuksista [6]; [8]; [9] ovat perustaneet johtopäätöksensä vertailua kudosten tai altaita kudosten täysin eri alkuperää. Sah et ai. analysoi ilmentyminen seitsemän synteettisen miRNA nousi jyrkästi tunnetun pitoisuuden osaksi RNA istukkakudos ja hybridisoitiin viidellä alustoilla [11]. Ollakseen lähempänä on miRNA microarray sovellus syöpätutkimuksessa, Git et al. analysoidaan allas normaalin rintakudoksen kudosten ja kaksi rintasyövän solulinjat [7] ja Dreher et al. verrattuna untrasfected ja HPV-transfektoitiin ihmisen keratinosyyttejä [10]. Vaikka entinen neljä vertailut ovat hyödyllinen järjestelmä käsitellä teknisiä ongelmia, ja myöhemmin kaksi tutkimusta ovat epäilemättä realistisempi, kysymys konkordanssin eri alustoilla, kun kliinisesti näytteitä käytetään, ei ole vielä käsitelty.

Tässä tutkimuksessa vertasimme miRNA ekspressioprofiilit yhdeksän peräsuolen syövän ja normaalin paksusuolen limakalvo näytteet samoilta potilaista käyttäen neljää eri kaupallista alustoilla (Agilent, Exiqon, Illumina ja Miltenyi). Ilmaisu kaikkein yhdenmukaisia ​​ja valittujen discordant miRNA joukosta alustoilla sitten arvioitiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR). Lopuksi, integroiva analyysejä miRNA yhteydessä geenien ilmentymisen ja kirjallisuuden tietojen suoritettiin todisteena periaatteen pätevyyden microarray miRNA analyysin saamaan käsityksen biologinen rooli näiden miRNA.

Tulokset

Kokeellinen asetus

Korosta vaikutuksen näytteen alkuperästä ja tutkimuksen suunnittelu saadut tulokset, teimme laskennallisen vertailun ekspressiotietojen neljästä microarray tutkimuksia. Valitsimme saadut yhteisestä miRNA alusta eli Agilent, kahdesta miRNA alustan vertailevia tutkimuksia (lisätietoja taulukossa S1), jonka ilmentyminen tietoja ihmisnäytteillä ovat julkisesti saatavilla (GSE13860 [6] ja E-MTAB-96 [7] ) ja kahdesta tutkimuksesta valittiin esimerkkeinä kokeellinen sovelluksia hoitopaikassa eli profiileja tuumorigeneesiin liittyvistä eturauhasen [12] ja mahalaukun [13] syöpä (GSE21036 ja GSE28700, vastaavasti; yksityiskohtia Fig.S1 legenda). Kuten kuviossa S1 määrä DE miRNA ja siihen liittyvä kansi muutokset ovat huomattavasti korkeammat cross-platform analyysi kuin profiileja tarkastelemalla kasvaimien syntyyn. Määrääminen yhtenäinen ja mielivaltainen kynnysarvo (| log

2 kertainen muutos | 1), 88,5% (GSE13860) ja 25,9% (E-MTAB-96) on miRNA läsnä paneelit olivat differentiaalisesti ilmaistut cross-platform aineistot; Toisaalta, vain 6,9% (GSE21036) ja 6,7% (GSE28700) on miRNA tunnistettiin DE samassa kynnys kliinisessä aineistoja.

Näiden tilojen, päätimme arvioida inter-alustat toistettavuus hoitopaikassa arvioimalla kasvain ja normaali vastine miRNA profiileja otetuista näytteistä yhdeksästä potilaasta, joille tehtiin kirurginen resektio paksusuolen syövän (katso taulukko S2 kliiniset ja patologiset ominaisuudet). RNA erät näistä näytteistä hybridisoitiin neljällä microarray alustoille: Agilent SurePrint G3 ihmisen miRNA Microarray, Exiqon miRCURY LNA microRNA Array, Illumina Human_v2 microRNA ilmaisun Beadchips, ja Miltenyi miRXplore Microarray. Pääpiirteet neljän alustat on kuvattu taulukossa 1.

On huomattava, että alustan Illumina vedettiin maaliskuusta 2010 alkaen; kuitenkin, päätimme sisällyttää se meidän verrattuna johtuen sen laajaan käyttöön laboratorioissa ympäri maailman, mukaan lukien meidän Institute. Siten käsiteltyjä kysymyksiä tässä tutkimuksessa voi kiinnostaa käyttäjille Illumina alustan paremmin tulkita niiden tuloksia ja mahdollistaa entistä perusteita kytkin eri alustalla.

Agilent, Exiqon, ja Illumina taulukot tehtiin yksivärinen. Miltenyi hybridisoitiin kahta väriä: kudosnäytteitä leimattiin Hy5, ja synteettinen viite ostettu Miltenyi kanssa Hy3. Koska synteettinen viittaus suunniteltiin miRBase 9.2 ja kattaa vain osan miRNA läsnä paneelit suunniteltu miRBase 14.0, vain Hy5 tiedot otettiin huomioon ja käytettiin normalisointia, jotta suorempi verrattuna muihin kolmella alustalla.

Agilent, Exiqon, ja Illumina alustat sisälsivät koettimia suunniteltu joko virus- miRNA sekvenssit tai otaksuttu miRNA ei vielä selityksin vuonna miRBase johdettu kirjallisuudesta ja Next-Generation Sequencing tutkimuksia. Koska nämä sekvenssit ovat läsnä vain yhdessä alustalla, ne jätettiin analyyseihin.

miRBase tietokanta on ensisijainen säilytyspaikka kaikille miRNA sekvenssit ja merkintöjä käyttävät kaikki valmistajat suunnittelussa anturit. Kuitenkin usein päivitys miRBase johtaa annotaatio ongelmia. Välttääksesi mahdollisen bias, valitsimme taulukot suunniteltu tiiviiseen miRBase versioita ja koettimien neljän testattujen alustat suunniteltiin joko v12.0 tai v14.0 miRBase. Olemme varmistaneet, että nimet ja sekvenssit miRNA läsnä v12.0 ei muuttunut uudemmissa miRBase versio, kun taas joukko uusia miRNA lisättiin. Ero kokonaismäärä miRBase selityksin miRNA neljän alustat oli suhteellisen pieni (6%).

arviointi Data Distribution ja Detection Hinta

Ei-normalisoitu signaali intensiteetit osoitti alusta riippuvainen jakelu mikä ainutlaatuinen kehitettyjä menetelmiä valmistajien merkintöjä, hybridisaation ankaruus ja tiedonkeruu (Fig. 1A). Kaikille alustoille, signaalit kattoi suurimman dynaamisen alueen käytettävissä 16-bittinen skannerit; Agilent, Exiqon, ja Miltenyi signaali jakaumat yleensä on positiivinen vinous (oikealta puolelta pitkän hännän) ja erosivat Illumina jakaumia jossa monet koettimet osoitti väli korkeille ekspressiotasot.

(A) Global normalisoimattoman intensiteetti jakeluun. (B) Graafinen esitys miRNA havaitseminen; sininen = havaittu, keltainen = havaitsematta, harmaa = ole läsnä. (C) Box-käyrä prosentteina GC sisällön kypsä miRNA sekvenssit; sininen = havaittu, keltainen = huomaamatta.

P

-arvot laskettiin Studentin t-testillä.

Agilent ja Illumina alustoja, me seurasimme havaitseminen puhelun kriteerien suosittelemia valmistajat. Illumina ohjelmisto tarjoaa havaitsemisen

P

-arvo, joka arvioi, missä määrin signaali on suurempi kuin melu edustaa negatiiviset kontrollit; Samoin Agilent ohjelmisto tarjoaa lippu (gIsPosAndSignif), joka arvioi jos toiminto signaali on positiivinen ja merkittävä verrattuna taustan. Sen sijaan, että Exiqon ja Miltenyi alustat havaitseminen puhelu kriteerejä ei ole määritetty; Näiden alustojen, loimme kynnys prosenttiosuus pikseliä jokaisesta paikalla jono, jonka voimakkuus oli pienempi kuin tausta. Ottaen huomioon nämä suodattamalla menettelyt, 675 (78% miRBase selityksin miRNA läsnä array), 775 (87%), 808 (94%), ja 376 (41%) ainutlaatuinen miRNA oli havaittavissa ainakin yhdessä näytteistä Agilent, Exiqon, Illumina, ja Miltenyi alustoja, vastaavasti (kuvio. 1 B). Oli 233 miRNA jotka yhteinen kaikille alustoille, on voimakkaasti rajoitettu alhainen rikkomusten määrä on Miltenyi alustalla.

Jotta voidaan arvioida, missä määrin GC-pitoisuus vaikutti havaitsemista kutsu kunkin alustan, laskimme GC prosenttiosuus miRNA analysoitiin ja verrattiin kunkin alustan, GC sisällön välillä havaitaan ja havaitsematta miRNA. Huolimatta jokainen valmistaja on säädetty sondirakenne ja hybridisaatio menettelyt voittaa ristiriitaisuuksia termodynaamisen vakauden koetin /kohde tunnistettu, GC-pitoisuus oli huomattavasti korkeampi havaitun kuin huomaamatta miRNA kaikissa alustoissa, ja tämä ero oli erityisen selkeästi Miltenyi platform (Fig. 1 C).

normalisointi ja luokan vertailu Tulokset

Useat normalisointi ja tietojenkäsittely on käytettävissä, useimmat käännetty geenien ilmentyminen tutkimukset ja vähän yksimielisyys laboratorioissa. Ottaen huomioon ainutlaatuiset ominaisuudet kunkin alustan, on epätodennäköistä, että sama normalisointi menettelyä voitaisiin suorittaa yhtä kaikilla alustoilla korjaamiseksi systemaattisia eroja.

Jotta valita paras normalisointi kunkin alustan, arvioimme kyky neljä eri menetelmiä (lössi, kvantiili, sijoitus muuttumaton, ja Tukeva Spline normalisointi) vähentää sisäistä luokan vaihtelua normaalin ja kasvaimen näytteiden avulla Suhteellinen Log Expression (RLE) (ks. S2). Lisäksi, odotimme, että paras normalisoinnin menetelmää pitäisi lisätä kertaiseksi muutoksia ja useissa eri tavalla ilmaistuna miRNA välillä kasvaimen ja normaalin kudoksen. Niiden mukaan, päätimme RSN varten Illumina ja Agilent, lössi varten Exiqon ja quantile varten Miltenyi.

Kuvassa S3 kasvain /normaali luokka vertailuja 4 alustoja ilmaistuna histogrammit log

P

-arvon ja FDR, raportoidaan. Vertailu tunnistettu kello kynnys

P

0,005, 29 miRNA jotka moduloidaan Agilent, 4 Exiqon, 42 Illumina, ja 3 on Miltenyi alustalla, mikä vastaa 4,3%, 0,5%, 5,2 %, ja 0,8% miRNA havaittu, vastaavasti.

Inter-alustan sopimuksen luokan vertailu Tulokset

Sen arvioimiseksi välistä alustan konkordanssin selvitimme miRNA jotka olivat DE osoitteessa

P

0,005 vähintään yhdessä alustan; yhdistämällä nämä miRNA, konsensus luettelo 68 miRNA syntyi. Jos haluat korostaa vastaavuutta yksi neljästä alustoja,

P

-arvot ja taita-muutoksia konsensus listan miRNA näkyvät kolorimetrisen mittakaavassa kuviossa 2A ja B vastaavasti. Muuttamisesta

P

0,005 kaikki neljä alustoilla, ei miRNA olivat yleisesti DE. At

P

0,05, HSA-miR-378, HSA-miR-375, HSA-miR21 *, HSA-miR 145 havaittiin kuten DE kaikki alustat ja vielä 4 miRNA (HSA-miR -96, HSA-miR21, HSA-miR147b, ja HSA-miR-143) olivat DE kaikissa mutta yhdellä alustalla; itse asiassa, on Miltenyi alustalla, HSA-miR-96 ja HSA-miR-147b ei havaittu, kun taas HSA-miR-21 ja HSA-miR-143 ei saavuttanut merkittävää kynnystä. Kaksitoista, 2, ja 25 miRNA todettiin olevan yksinomaan DE on Agilent, Exiqon, ja Illumina alustoja, vastaavasti. Loput 29 miRNA olivat DE ainakin kaksi tasoa. Taitteen muutokset ovat yhdenmukaisia ​​eri alustoilla, ainoana poikkeuksena kaksi miRNA (HSA-miR-218 ja HSA-miR-302a), jotka olivat DE osoitteessa

P

0,05 vuonna Illumina ja Exiqon, mutta ristiriitainen kertainen -muutokset (Fig. 2B).

(A)

P

-arvot kasvain /normaali luokan vertailun visualisoida sinivalkoinen lämpö kartta; katso asteikko kuvassa. (B) Log

2-kertaiseksi muutoksia kasvain /normaali luokan vertailun visualisoida punavihreän lämpö kartta; punainen = sääteli; vihreä = alassäädetty kasvaimissa.

Sen valvomiseksi, että rajoitettu määrä yhteisesti DE miRNA ei ollut seurausta normalisoinnin menetelmistä, laskimme määrä ilmentyvät eri miRNA kussakin alustan ja kunkin neljän normalisointi menetelmiä. Sillä 256 (= 4

4) mahdollisia yhdistelmiä, tunnistimme lista jaetuista DE miRNA. Unionin kaikki nämä luettelot ongelmitta neljä miRNA (HSA-miR-378, HSA-miR-375, HSA-miR-145, HSA-miR-21 *), mikä viittaa siihen, että eri normalisointi menetelmillä voi olla huonompi kuin tai, parhaimmillaan, sama valinta (Fig. S4A). Huomionarvoista joukossa 4 yhteistä miRNA HSA-miR-378 tunnistettiin kaikkia mahdollisia yhdistelmiä (Fig. S4b).

yleinen alusta vertailukelpoisuus tarkkuuden ja kyky tunnistaa DE miRNA arvioitiin keskittymällä vastaavasti taitteelta muutoksia ja t-arvoja kasvaimen /normaali vertailua varten 233 miRNA yleisesti havaita 4 alustoilla. Sen jälkeen kokosi analyysi, paras korrelaatio kesken log

2-kertaiseksi muutoksia ei havaittu Agilent ja Exiqon (Pearsonin korrelaatio = 0,63), kun taas Illumina osoitti eniten eri mallia ja laajempaa kertamuutoksia (Fig. 3A ja kuvio. S5a). Samalla tavalla, vain osittain samankaltaisia ​​t-arvot (Pearsonin korrelaatiota; korkeuden = +0,28-,48; keskiarvo = 0,40) on läsnä yksi 4 alustoja, mutta tällä kertaa Miltenyi osoitti eniten epäyhtenäinen toiminta (Fig. 3B ja kuvio. S5B).

Hierarkkinen klusterointi (etäisyys = Pearsonin korrelaatio; sidos = keskiarvo) on log2 kertamuutoksia (A) ja t-arvot (B) saatu kunkin alustan vertaamalla kasvaimen ja normaali näytteet alaryhmässä yhteisesti havaittu miRNA. t-arvot laskettiin käyttäen t-testiä satunnaisella varianssi mallin.

Inter-alustalla sopimuksen avulla miRNA Asettaa

Aikaisemmat tutkimukset verrataan suorituskykyä geenien ilmentymisen microarray alustoille ehdotti, että huolimatta suhteellisen alhainen päällekkäisyys luettelot DE geenien saatiin erilaisilla alustoilla, hyvä sopimus havaittiin tarkasteltaessa biologisesti sukua geenin sarjaa sijasta yksittäisten geenien [14]. Testata, onko samanlaisia ​​johtopäätöksiä voidaan vetää miRNA microarray alustoille, teimme miRNA asetettu rikastumista analyysi meidän datatestausta kaksi sarjaa miRNA asettaa: 1) DE miRNA tunnistaa jokaisen laiturin Tutkimuksessamme arvioimaan rikastusasteet joukossa ylös tai alassäädetty miRNA toisella alustoilla; 2) miRNA tunnistettu ylä- tai alaspäin säädeltyjä paksusuolensyöpä ja normaali limakalvo muissa microarray perustuu tutkimuksiin kirjallisuudesta (taulukko S3). Useimmat miRNA sarjaa tunnistaa kunkin alustan johdonmukaisen rikastettu tietoja muiden alustojen kanssa Miltenyi miRNA asettaa osoittaa alemman rikastusta (Fig. 4A). Lisäksi suurin osa paksusuolensyöpä liittyvän miRNA sarjaa perustuvat kirjallisuuteen myös validoitu tietomme ja ainakin osittain, riippumatta testattujen alustan (Fig. 4B).

Yhteenveto miRNA set rikastamiseen analyysi suoritettiin käyttäen GSEA. Ilmaisun saadut kanssa 4 eri alustoilla, testasimme rikastamisen miRNA DE (verrattaessa peräsuolen syövän ja normaali limakalvo) tutkimuksessamme (A) tai raportoitu kirjallisuudessa (B). miRNA ylä- tai alassäädetty testattiin erikseen. Sillä kirjallisuus johdettuja miRNA kappaletta, kuusien kirjailija ja siinä käytettyjä osoitettiin (katso myös taulukko S3). False Discovery hinnat alle 5% tai 10% pidettiin merkittävinä tai marginaalisesti merkitsevä vastaavasti.

Vertailu qRT-PCR Data

Microarray säännöllisesti tietoja vahvistanut qRT-PCR. Eri järjestelmät ovat kaupallisesti saatavissa ja on todettava, kuten varten microarray alustoille, qRT-PCR valmistajat myös käsitellä jatkuva päivitys miRBase merkintöjä. Koska validointimenetelmän riippuen saatavuudesta valitun miRNA määrityksiä aikaan kokeet tehtiin, SYBR Green LNA määritykset peräisin Exiqon tai Applied Biosystem Taqman käytettiin.

keskittäneet validointi analyysi 18 miRNA että Yhteenvetona eri tilanteissa löytyy alustan verrattuna (taulukko 2). 8 DE miRNA vähintään 3 4 array alustojen todensi kuin merkittävästi DE by qRT-PCR. Näistä 8 miRNA, korkea korrelaatioita qRT-PCR ja array ilmaisun arvoja ja pareittaisesta kontrastit joukko tietojen havaittiin (taulukko 3 ja tiedosto S1) kahta poikkeusta lukuun ottamatta; jos kyseessä on HSA-miR-21 *, vaikka qRT-PCR tiedot vahvistivat ero lauseke esiintyy kaikissa array alustoilla, sen korrelaatio array data rajoitettiin (R kerroin n alueella 0,27-0,44); HSA-miR-21, arvot, Illumina ei korreloi muiden arvojen saadaan paneelit tai qRT-PCR: llä. Tämä jälkimmäinen ero johtuu todennäköisesti MIR-21 ilme arvot Illumina jotka ovat lähellä kylläisyyttä kaikissa näytteissä, ja tästä syystä keskittynyt rajallinen.

paremmin ymmärtämään perusteella huono päällekkäisyys luokan vertailun tulokset neljän alustat, mittasimme ilmaus 10 edelleen miRNA (taulukko 3 ja File S1).

Kuusi heistä (HSA-miR-136, HSA-miR -139-5p, HSA-miR-182, HSA-miR-30a, HSA-miR-497, ja HSA-miR-93) valittiin joukosta 14 DE miRNA (

P

0,05) mukaan sekä Agilent ja Illumina. Me validoitu array tietojen qRT-PCR 5 näistä 6 miRNA, asiaa lukuunottamatta HSA-miR-93. Korrelaatiokertoimet välillä qRT-PCR ja joko Agilent tai Illumina tietoja vaihteli +0,65-,87 HSA-miR-136, HSA-miR-139-5p, HSA-miR-30a, ja HSA-miR-497; HSA-miR-182, jonka koetin intensiteetit on Illumina olivat välitasojen ja DE osoitteessa

P

0,005 ja Agilent olivat lähellä tausta ja DE osoitteessa

P

0,05 , olivat 0,86 ja 0,48, vastaavasti.

Kaksi muuta miRNA, HSA-miR-886-5p ja HSA-miR-886-3p, valitaan qRT-PCR validointi olivat yhtäpitävät 2 neljästä alustoja. Ero ilmentyminen HSA-miR-886-5p, DE on Illumina ja Miltenyi alustoja, vahvistettiin RT-qPCR, kun taas, että HSA-miR-886-3p, DE on Miltenyi ja Agilent alustoja, ei näytä olevan DE by qRT-PCR.

Lopulta valitsimme kaksi miRNA (HSA-miR-218 ja HSA-miR-302a), jotka olivat DE päälle Exiqon ja Illumina alustoja mutta vastakkaiset kertaiseksi muutoksia. HSA-miR-218 vähensi ilmentyminen kasvainten Illumina varmistettiin qRT-PCR, kun taas HSA-miR-302a ei validoitu käyttämällä qRT-PCR: ää.

Reaaliaikainen PCR tietoja käytetään yleisesti määrittämään herkkyyden ja spesifisyys saatujen tietojen kanssa mikrosiruja. Tätä varten me verrattuna meidän tuloksia, jotka saatiin itsenäisen julkaistu qRT-PCR tutkimuksessa, jossa 70 665 ainutlaatuinen miRNA testattu havaittiin differentiaalisesti ilmaistut 40 pariksi normaali-paksusuolensyöpä näytteitä [15]. Kunkin alustan valitsimme miRNA läsnä qPCR aineisto (527 Agilent, 596 varten Illumina, 545 Exiqon ja 278 Miltenyi) ja lasketaan ROC käyrät eri kynnysarvot

P

-arvo. (Fig. 5). Arvot Area Under the ROC Curve (AUC) osoitti, että Agilent ja Illumina ovat hyvin samankaltaisia ​​ja ovat tarkin alustojen Miltenyi on Heikompitehoiset.

Kun otetaan huomioon kuten kultakantaan miRNA tunnistettu differentiaalisesti ilmaistu qPCR tutkimus 40 pariksi kasvain-normaali näytteissä, arvioimme suorituskyky kunkin alustan laskettaessa herkkyys ja eri kynnysarvot

P

-arvon ja piirtämistä tuloksena arvoja ROC tilaan.

Biologiset Insight

Kun 68 miRNA DE osoitteessa

P

0,005 ainakin yksi neljästä alustojen verrattiin kirjallisuustiedoista, huomasimme, että 25% niistä oli yhtäpitävästi kuvattu kirjallisuudessa vapautettiin peräsuolen syövän verrattuna ei kasvain vastine (taulukko S4). Lisäksi olemme havainneet, että 12 miRNA kuuluvat tunnettu koekspressoi perheen klustereita. Tärkeimmät biologiset tiedot liittyvät neljään miRNA klusterit raportoidaan taulukossa 4. Tarkasteltaessa niiden ilmaisua havaitsimme, että: Mir 25-106b klusterin vain HSA-miR-25 ja HSA-miR-93 ovat läsnä luettelossa 68 miRNA at kynnysarvoja me sovellettu; MIR 182-96 klusteri on erityisen ilmeistä Illumina joissa HSA-miR-182, -182 *, -183 ja -96 ovat kaikkein säädelty miRNA tällä alustalla (kertamuutoksia kasvain vs normaali vaihtelee 4,42-2,65 ); Mirna klusterin 143-145 on johdonmukaisesti vapautettiin kaikki neljä alustat Tutkimuksemme, että HSA-miR-143 kaikkein alassäädetty miRNA kasvaimen kudosten Exiqon alustalla (fold muutos kasvain vs normaali kasvaimen = 0,30; p = 0,036) ja HSA-miR 145 eniten alassäädetty Agilent ja Miltenyi (taita muutos kasvain vs normaali = 0,30 ja 0,35; p = 0,0027 ja 0,018 vastaavasti).

geeniekspressioprofiilien saman näytteiden analysoitiin miRNA ilmaisu paneelit olivat saatavilla. Näin ollen meidän pitää integrointi lähestymistapa arvioida samanlaisia ​​biologiset tiedot voidaan saada takaisin neljästä alustoja, riippumatta päällekkäisyys DE miRNA. Tätä tarkoitusta käyttäen MAGIA työkalua, korreloi negatiivisesti otaksuttu kohdegeenien DE miRNA todettiin kunkin alustan (File S2) ja rikastus analyysi suoritettiin IPA ohjelmisto. Korosta yhtäpitävyyttä joukossa neljä alustoja, rikastus

P

-arvot kaikille syöpään liittyvien reittien merkittävästi rikastettu vähintään yhdellä alustalla on esitetty kolorimetrisen mittakaavassa kuvassa 6A. Keinot liittyvät solukierron säätelyssä ja PTEN signalointi oli yhtäpitävästi tunnistettu. Kun tarkastelimme vahvistanut tavoitteensa TarBase ohjelmisto määrä miRNA-mRNA vuorovaikutukset korreloi negatiivisesti p 0,05 oli hyvin rajallinen (Agilent = 35, Exiqon = 2, Illumina = 45 ja Miltenyi = 0) esteenä vertailu kaikkien neljän alustat .

(A) Pathway rikastaminen analyysi anti-korreloivat ennustettu kohdegeenien differentiaalisesti ilmaisi miRNA mukaan kunkin mikrosirujen alustalla. (B) Verkon ylä- 8 ilmentyvät eri miRNA ja niiden anti-korreloivat kohdegeenien. 250 alkuun vuorovaikutus käytettiin tuottamaan verkkoon MAGIA työkalu.

Lisäksi, ottaen huomioon qRT-PCR tiedot 8 eniten yhtäpitäviä miRNA ja geeni-ilmentymisen profiilit, samalla integroitu lähestymistapa tunnistettu yhteensä 803 miRNA-korreloi negatiivisesti geeni (ennustettu miRNA tavoitteet) yhteisvaikutuksia (File S2). Graafinen esitys alkuun 250 vuorovaikutukset korosti, että monet geenit, jotka säädellään ylöspäin kasvaimet ennustetaan tavoitteet kahden tai useamman alassäädetty miRNA (Fig. 6B). Yksityiskohtaisesti on 70 geenit yhdessä kohdistetun vähintään kaksi miRNA ja 84% heistä säätelevät miR 143-145 klusteri (taulukko S5). Näistä geeneistä jotka liittyvät glykolyysistä ja ravinteiden liikenneväylien kautta tuntui yliedustettuna.

Keskustelu

Huolimatta suhteellisen uusi löytö, on nopeasti kasvava kiinnostus tutkimuksessa roolin miRNA vuonna monet patologisia prosesseja kuten syöpää. Niinpä suurikapasiteettisten tekniikoiden alunperin kehitetty GW geenin ilmentymisen arviointi, olivat nopeasti mukauttaa GW mittaamiseen miRNA. Kuten korostetaan viime arviot [5]; [16]; [17], useat tekijät, mukaan lukien lyhyt miRNA pituus, korkea homologia miRNA perheitä, korkea määrä uusia miRNA tunnistetiedot (todellinen määrä miRNA vuonna miRBase 18, julkaistiin marraskuussa 2011 lähestyy kahta tuhansia) ja suhteellisen korkea prosenttia (noin 10%) sekä johtuva artefakti miRNA ei vahvistanut uudelleenjärjestely kokeissa merkittävästi mutkista niiden analysointi. Vaikutus näiden tekijöiden eri menetelmiä sovelletaan valmistajien eri käytettävissä alustoja on tarkasteltava inter-alustalla vertailevia tutkimuksia.

kysymykset sisäinen ja välinen mikrosirujen alustalla toistettavuus ovat etupäässä käyttäen koeasetelmia kun kudokset tai solulinjat eri alkuperää verrattuna, sillä oletuksella, että johtuen monenlaisia ​​odotettavissa ilmaisun modulaatiot tällainen vertailu, tekninen melu voi tulla merkityksetön. Tämän tyyppinen lähestymistapa peilattu noudatettua ensimmäisessä vaiheessa tutkimuksen mukaan Microarray Quality Control (MAQC) konsortio, jonka tarkoituksena on arvioida muun alustan ja laboratorionväliset toistettavuus geenien ilmentymisen microarray data käyttäen kahta erilaista RNA: iden (ihmisen aivojen ja Universal ihmisen viite) [18]. Tämä lähestymistapa on voimakkaasti kyseenalaistettu vuonna 2007 sen johdonmukaisuuden puute todellisia tutkimusasetelmissa [19]. Kuitenkin suurin osa miRNA välisten alustan vertailevia tutkimuksia, lainattu Aldridge Hadfield [16] ja esitetty taulukossa S1, kokeellinen suunnittelu oli painotettu käyttö näytteiden vahvojen ero alkuperää. Huomionarvoista, vain kaksi tutkimusta [7]; [10] vertasi miRNA Biologisten mielekkäitä näytteitä, ainakin kolme eri alustoilla, mutta näissäkin tapauksissa näytteet ovat solulinjat. Siten meidän tutkimus on ensimmäinen yritys verrata miRNA alustan suorituskykyä hoitopaikassa, jossa inter-näytteen vaihtelu saman luokan odotetaan olevan suurempi kuin vuonna solulinjoissa.

Suurin osa profilointi tutkimusten avulla kliiniset näytteet, joilla pyritään paljastamaan jopa hienoisia eroja ilmaisun mutta jotka liittyvät tiettyyn kliinisessä yhteydessä. Näissä asetuksia, tekninen rinnakkaisnäytteiden usein mahdotonta johtuen RNA määrä ja taloudelliset seikat. Siten esillä olevassa tutkimuksessa käsitellyt välisen alustan vertailtavaksi kuuluvien näytteiden kahteen luokkaan (pariksi kasvain ja normaali paksusuoli kudokset), joka voi teoriassa johtaa uusia oivalluksia kasvaindiagnostiikassa ja kliinisiä sovelluksia. [27].