PLoS ONE: Vaikutus 3’UTR vaihtoehdot erityis- Expression of Candidate Cancer altistavia geenejä
tiivistelmä
Vaihtoehdot säätelyalueissa ennustetaan olevan tärkeä rooli tautiherkkyyteen yleisten sairauksien. Polymorfismit kartoitus microRNA (miRNA) sitoutumiskohtia on osoitettu häiritä kykyä miRNA kohdistaa geenien mikä ero mRNA ja proteiinin ilmentymisen.
Skin kasvain alttius 5
(
Skts5
) tunnistettiin lokuksen annetaan alttius kemiallisesti aiheuttama ihosyöpä NIH /Ola mukaan SPRET /etäissiittoisilla F1 backcrosses. Sen määrittämiseksi, polymorfismien välillä kannasta, jotka kartoitettiin otaksuttu miRNA sitoutumiskohdat 3’alue (3’UTR) geenien osoitteessa
Skts5
vaikutti ilme, teimme järjestelmällinen arviointi 3’UTRs kandidaattigeenien koko tämän lokuksen. Yhdeksän geenit oli polymorfismien niiden 3’UTRs jotka sopivat nostolaite tietojen ja kahdeksan näistä sisälsivät polymorfismien epäillään häiritä tai ottaa käyttöön miRNA sitova. 3’UTRs kuuden geenin,
Bcap29
,
Dgkb, Hbp1, Pik3cg, Twistnb
, ja
Tspan13
differentiaalisesti vaikuttaa lusiferaasin ilmentymistä, mutta ei näytä olevan säädellään eri tavalla jonka arvioidaan miRNA ennustetaan sitoutuvan vain yksi kaksi isoformia. 3’UTRs neljästä lisägeenit valittu uran jotka sopivat väljempiä vaatimuksia arvioitiin.
Ifrd1
ja
ETV1
osoitti eroja ja sisälsi polymorfismien ennustetaan häiritä tai luo miRNA sitoutumiskohtien mutta ei osoittanut mitään eroa sääntelyä miRNA testattu. Yhteenvetona useita 3’UTRs jossa on mahdollinen toiminnallisia variantteja välillä herkkiä ja resistenttejä kantoja hiirten vaikuttanut differentiaalikaavojen riippumaton ennustetun miRNA sitova.
Citation: Skeeles LE, Fleming JL, Mahler KL, Toland AE (2013) vaikutus 3’UTR vaihtoehdot erityis- Expression of Candidate Cancer altistavia geenejä. PLoS ONE 8 (3): e58609. doi: 10,1371 /journal.pone.0058609
Editor: Akio Kanai, Keio University, Japani
vastaanotettu 16. lokakuuta 2012 Hyväksytty: 06 helmikuu 2013; Julkaistu 5 maaliskuuta 2013
Copyright: © 2013 Skeeles et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain MGO RSG-07-083 American Cancer Society, CA134461 National Cancer Institute ja OSU Kattava Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Dr. Tolandin on Academic Editor PLoS One. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.
Johdanto
Mus spretus
hiiret ovat vastustuskykyisiä ihosyöpä verrattuna
Mus musculus
hiirillä. Aikaisemmissa sidos tutkimuksissa dimetyylibents [a] antraseenia (DMBA) /12-O-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatti (TPA) – aiheuttama ihosyöpä useita ihosyöpä alttiuslokukset tunnistettiin SPRET /etäissiittoisilla NIH /Ola F1 takaisinristeytysanalyysillä hiiret [1] – [4]. Linkage suoritettiin myös käyttämällä SPRET /EiJ mukaan FVB /N, SPRET /EiJ NIH /Ola ja STF /Pas NIH /Ola F1 takaisinristeytysanalyysillä hiiriä, jotka antoivat lisätietoa alttiuslokukset. Yksi ihon alttiuslokukset,
Skin kasvain alttius 5
(
Skts5
), havaittiin SPRET /etäissiittoisilla NIH /Ola ylittää, mutta ei STF /Pas NIH /Ola F1 tai SPRET /EiJ mukaan FVB /N ylittää [3], [4]. Linkage tulokset SPRET /EiJ NIH /Ola olivat epäselviä tälle alueelle. Sekvenssianalyysit 54 geenien ja koodauselementit yli 14-Mb piikin sidoksen alueella osoitteessa
Skts5
yksilöitiin useita koodaus muutokset, jotka nostolaitteen analyysit (Mahler et al. 2008).
Differential geeniekspressiota oletetaan olevan yhtä tärkeää, ellei jopa tärkeämpää, sillä taudin alttius ei-synonyymejä koodaus muutokset [5]. Geenien ilmentyminen erot johtuvat perinyt tekijöistä voi johtua vaihteluista tehostajana tai promoottori sitoutumiskohtia, vaihtelut epigeneettiset sääntelyn vaikuttavat metylaatio tai kromatiinin muutoksia, vaihteluja ilmentyminen trans-toimivia tekijöitä tai eroista asetuksessa MikroRNA (miRNA) [6] – [9]. Yhden emäksen monimuotoisuus (SNP: t) kuuluvat, erityisesti 3’untranslated alue (3’UTR) geenien voivat häiritä mRNA: n vakautta ja kääntäminen läpi vaikutukset polyadenylaatio- ja sääntelyn proteiini-mRNA ja miRNA-mRNA vuorovaikutusta [10] – [12]. Alustavat tutkimukset ihmisillä on todettu vaihtelut 3’UTR geenien, jotka näyttävät vaikuttavan syövän riskiä häiritsemällä normaalia miRNA sitova [13], [14]. Yksi tällainen muunnelma
KRAS2
geeni lisää riskiä keuhko- ja munasarjasyöpään muuttamalla kykyä miRNA
let-7
sitoa [15], [16]. Toisessa tutkimuksessa hiirillä tarkasteltiin miRNA täydentävien alueiden kolmelle miRNA jotka otettiin käyttöön tai hajotettiin SNP alleelisen-epätasapaino sekvensointi [17]. Ilmentymis- eroja sopiva RNA-sekvenssin tietoja havaittiin suuren prosenttiosuuden oletetun kohdegeenien, viittaa siihen, että vaihtelut 3’UTRs on keskeinen rooli geeniekspression eroja yksilöiden välillä.
Sen määrittämiseksi, polymorfismit otaksuttu miRNA sitoutumiskohdat olivat vaikuttavia geenien ilmentyminen ja voisi olla toimiva ehdokkaita
Skts5
, suoritimme järjestelmällinen analyysi 3’UTR alueiden geenien poikki uran. Havaitsimme sekvenssivariantit yhdeksässä geenejä, jotka sopivat kytkentäanalyysi (olivat polymorfisia välillä SPRET /etäissiittoisilla ja NIH /Ola eikä eroa STF /PAS ja NIH /Ola tai SPRET /EiJ ja FVB /N). SNP kahdeksasta näiden 3’UTRs ennustettiin karttaa otaksuttu microRNA sitoutumiskohtiin. Ylimääräinen 18 geenit olivat polymorfisia välillä SPRET /etäissiittoisilla ja NIH /Ola ja SPRET /EiJ ja FVB /N muttei välillä STF /PAS ja NIH /Ola. Tässä me kuvaamme vaikutuksia variantteja näistä ehdokas alttiusgeenit ilmentymiseen.
Materiaalit ja menetelmät
Eläinten materiaali ja solulinjoissa
Eläviä eläimiä käytettiin tässä tutkimuksessa ; olemassa olevat DNA ja kudoksia toimitti yhteiskäyttäjiä tai kaupallisista lähteistä. UCSF ja University of Roswell Park Institutional Animal Care ja Käytä komiteat (IACUC) hyväksyi alkuperäisen eläimen työ, joka tuotti näytteet tässä tutkimuksessa käytetyt. Laboratorio alkuperä kunkin hiirikannoilla tutkimuksessa ovat seuraavat: STF /PAS (sisäsiitoslinjaan ylläpitämä Institute Pasteur), SPRET /EiJ (sisäsiitoslinjaan ylläpitämä Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), ulkosiittoinen
spretus
(SPRET /etäissiittoisilla, ulkosiittoinen rivi ylläpitämä Hiroki Nagase, Roswell Park Institute), FVB /N (Sisäsiitoslinja ylläpitämä Jackson laboratoriot) ja NIH /Ola (sisäsiitoslinjaan ylläpitämä Allan Balmain). NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla ovat homotsygoottisia poikki
Skts5
. Kudosten NIH /Ola-hiiret saatiin Dr. Allan Balmain ja kudosten SPRET /etäissiittoiset hiiret toimittanut Hiroki Nagase. DNA eristettiin hännät tai pernat SPRET /etäissiittoisilla ja NIH /Ola hiiriin käyttäen standardimenetelmiä [18]. SPRET /EiJ ja FVB /N-DNA ja kudokset ostettiin Jackson Laboratories. STF /PAS DNA oli lahja Xavier Montagutelli, DVM, PhD Institut Pasteur. C5N, joka on ei-immunogeeninen hiiren keratinosyyttisolulinjan saatu Allan Balmain, pidettiin 1 x Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä antibiootti.
Sequence analyysi
3’UTRs on 39 geenien kartoitus
Skts5
josta meillä ei ole järjestyksessä tiedot kaikista käytetyt kannat nostolaitteen analyysit tunnistettiin käyttäen Ensembl tietokannan, rakentaa 35-48 . Suunnittelimme PCR-alukkeita käyttämällä Integrated DNA Technologyn SciTools PrimerQuest web-pohjainen ohjelma [https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest; San Diego, CA]. PCR-tuotteet käsiteltiin Exo /SAP-IT (USB, Cleveland, OH) poistamiseksi yksijuosteinen DNA. Automatisoitu sekvensointi PCR-tuotteiden tehtiin ABI 3700 (Applied Biosystems /Life Technologies, Carlsbad, CA) standardimenetelmillä. Alukkeita käytettiin PCR: ään käytettiin myös sekvensointi. Eteenpäin ja päinvastaisessa järjestyksessä lukee analysoitiin ja verrattiin käyttäen Lasergene /DNAstar- 3.0 (DNASTAR, Madison, WI). Sekvenssi jäljet tarkastettiin silmämääräisesti aina nukleotidisubstituution osoitettiin.
Mahdollisten mikroRNA sitoutumiskohtien
3’UTR polymorfismien jotka havaittiin vain välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla arvosteltiin onko ne häiriintyy tai käyttöön
in silico
ennusti microRNA sitoutumiskohtia. Neljä ohjelmaa käytettiin: Miranda (www.microRNA.org) [19], MicroInspector (https://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/) [20], Patrocles löytäjä (www.patrocles.org) [21] ja MicroSNiPer (https://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper/getSeqByNM.php) [22]. Miranda antoi meille mahdollisuuden ennustaa jos meidän SNP kohteisiin häirinnyt miRNA sitoutumiskohdat hiiren viittaus kanta, joka oli hyvin samankaltainen NIH /Ola 3’UTRs. Kolme muuta ohjelmien avulla ainutlaatuista sekvenssiä analysoidaan microRNA sitoutumiskohdista. Sivustoille ennusti MicroInspector, me ensin huomioon ne, jotka oli ennustettu vähintään vapaa energia (MFE) on suurempi kuin -15 kcal /joule yhdessä muodossa ja MFE alle -20 kcal /joule toisessa muodossa. Kun reevaluated, vain ne, jotka arvioitiin olevan MFE yli -18 kcal /joule yhdessä muodossa ja MFE on -22 kcal /joule tai vähemmän toisessa muodossa, kuten on aiemmin käytetty
Mus musculus
[20], testattiin edelleen kokeellisesti. -22 Kcal /J tai vähemmän pidettiin vahva sitoutuminen ja -18 kcal /J tai enemmän pidettiin lainkaan tai vain heikosti sitovaa. Patrocles ja MicroSNiPer mahdollistaa vertailun kaksi ainutlaatuista sekvenssien erojen ennusti sitoutumiskohtia. MicroSNiPer vaatii SNP voidaan syöttää ennusteen ohjelmaan, joten tämä työkalu ei kyennyt ennustamaan sivustoja luonut tai häiritsevät lisäyksiä tai poistoja. Käyttämällä MicroInspector, Patrocles, ja MicroSNiPer, poimimme ehdokas miRNA jotka ennustettiin sitoutuvan vain hiiren kanta (NIH /Ola tai SPRET /etäissiittoisilla), joka osoitti pienempi ilmentyminen mitattuna meidän 3’UTR lusiferaasianalyysissä ilmaisun ja että sisälsi polymorfismi miRNA sitoutumiskohdassa jotka sopivat hiirellä sidoksen tuloksia.
kloonaus
osa kunkin ehdokkaan geenin 3’UTR jotka sisältyvät polymorfiset sivustoja, jotka sopivat hiirellä nostolaitteen ja ennustettiin häiritä miRNA sitovia kloonattiin Clontech pGL3 kontrollivektorille (Mountain View, CA) (taulukko S1). Vektori linearisoitiin käänteisellä PCR: llä (IPCR) käyttäen Advantage HD Polymerase Mix (Clontech), mukaan valmistajan protokollaa. IPCR alukkeet suunniteltiin käyttäen IDT PrimerQuest ohjelmistoa. Lineaarinen tuotteet erotettiin pyöreä vektoriin käyttäen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Frederick, MD). PCR-alukkeet kloonaukseen käyttämällä Clontech n In-fuusio HD -kloonaustarvikesarjaa protokolla suunniteltiin käyttäen IDT PrimerQuest ohjelmistoa (taulukko S2). PCR-tuotteet monistettiin NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla DNA, puhdistettiin ja kloonattiin vektoriin 3 ’lusiferaasigeenin rekombinaatiolla käyttämällä Clontechin In-Fusion HD -kloonaustarvikesarjaa, mukaan valmistajan protokollaa. Plasmidi-DNA analysoitiin restriktiodigestiolla ja kloonit sekvenssi varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla.
mutageneesillä
geenejä, joissa NIH /Ola tai SPRET /etäissiittoisilla 3’UTR oli vaikea klooni, polymorfiset alueet, jotka sopivat hiiren sidos muuttivat mutageneesillä (SDM) käyttäen plasmideja, jotka sisältävät 3’UTR muiden kannan templaattina. SDM alukkeet suunniteltiin käyttäen Stratagene-yhtiön QuikChange Primer muotoiluohjelman, ja SDM suoritettiin käyttäen Stratagene n QuikChange Lightning Multi mutageneesillä Kit kohden valmistajan suositteleman olosuhteet (Agilent, Santa Clara, CA). Mutatoitu plasmidit sekvenssi varmistettiin.
Transfektiot /Lusiferaasimäärityksiä
C5N solut kotransfektoitiin pGL3 In-Fusion tuotteita, PRL-TK Renilla tulikärpäsen lusiferaasi-vektoriin (Promega, Madison, WI) , ja pre-miRNA tai Mirvana matkivat miRNA esiasteiden (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) miRNA määrityksissä. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island NY) 3’UTR DNA transfektioita ja Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfektioihin käyttäen plasmideja (600 ng /kuoppa kutakin plasmidia) ja miRNA esiasteita tai salattu valvonta ( 13 pmol /kuoppa 12-kuoppaisella levyllä). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, proteiini eristettiin käyttämällä M-PER (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL), ja RNA eristettiin käyttäen Ribozol (ISC Bioexpress, Kaysville, UT). Lusiferaasin mittauksia, D-lusiferiini (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) sekoitetaan, joka sisälsi DTT: tä ja glysyyliglysiini lisättiin 30 ui eristetty proteiini Vertias Microplate Luminometer käyttäen Veritas Luciferase Assay-ohjelman (Promega, Madison, WI). Aktivoi reaktio ATP sekoitus, jossa DTT, glysyyliglysiini, EGTA, MgSO
4, ja K2PO
4, lisättiin. Kontrolli reportterianalyysi sisälly natiivi Coelenterizine (NanoLight Technologies, Pinetop, AZ) ATP, DTT, glysyyliglysiini, EGTA, MgSO
4, ja K2PO
4, lisätään 30 ui eristetty proteiini jälkeen Promega Renilla protokollaa. Luciferase suhteellinen valo yksikkö lukee normalisoituivat Renilla lusiferaasi. Lusiferaasi suhteet suhteessa mock-transfektoituja soluja on esitetty. Transfektiot ja lusiferaasin määritykset suoritettiin vähintään kaksi kertaa kunkin 3’UTR joukko rakentaa ja miRNA määrityksessä lukuun ottamatta
miR-3064-3p
(
Pik3cg
), joka testattiin ainoastaan kerran ja osoitti vakuuttavia tuloksia ole eroja. Student t-testejä käytettiin laskettaessa merkitystä ilmaisun eroja.
Muita koeolosuhteita testattiin transfektioiden kanssa
Twistnb
3’UTRs yhdessä
miR-3074-5p
ja /tai
miR-691
. Kokeet suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, paitsi että C5N solut otettiin talteen 24, 48 ja 72 tuntia käyttäen suurempaa miRNA (26 pmol) tai molemmat miRNA yhdessä (26 pmol kutakin). Pienempi annos transfektoitujen miRNA (7 pmol) tai molemmat miRNA yhdessä (7 pmol kutakin), arvioitiin myös vaikutuksena
Twistnb
3’UTRs 24 ja 48 tuntia. Muita kokeita vaikutusten arvioimiseksi
miR-3074-5p
on
Twistnb
isoformit sisältyvät transfektioissa in C5N soluissa anti-miRNA varten
miR-3074-5p
tai negatiivinen kontrolli estäjää 24 ja 48 tuntia transfektion jälkeen kahtena pitoisuutena (13 pmoolia ja 30 pmoolia).
Vahvistus miRNA transfektio kvantitatiivinen PCR (qPCR) B
vahvista miRNA transfektio, RNA oli edellä kuvatulla tavalla eristettyjen. Käänteistranskriptio (RT) suoritettiin käyttäen Applied Biosystem Multiscribe RT mukainen pakkaus valmistajan suositteleman protokollan (LifeTechnologies /Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Taqman qPCR koettimia miRNA hankittiin Applied Biosystems.
Sno202
avulla laskettiin suhteellinen ilme. qPCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle. Kokeet mukana ei-RT eikä templaattikontrollien. Cycle kynnys (CT) arvoista otettiin keskiarvo poikki kolmena verrokkina ja delta CT-arvot laskettiin jokaisen testin miRNA ja mock valvontaa.
tunnistaminen mikroRNA ehdokkaiden
tarkentaa lista ehdokas MikroRNA (miRNA) kartoitettiin sekä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla muodot näiden sitoutumiskohtien kahdessa pienin vapaa energia (MFE) ennakointivälineet, RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) [23] ja RNAcofold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAcofold.cgi) [24]. Olemme edelleen puhdistettu listalta ehdokas 3’UTRs niille, joiden SNP ennustettiin aiheuttamaan 5 kcal /J tai suurempi ero miRNAbinding MFE välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla sekä ennustelaitteet (taulukko S3).
arviointi mRNA ekspression qPCR
geenien tunnistamiseksi, joka esittää differentiaalisen ekspression, RNA eristettiin hännät NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla hiiriin käyttäen Trizol (Invitrogen) valmistajan suosittelemia olosuhteita. Yksi mikrogramma RNA: ta kustakin eläimestä oli päinvastainen transkriptoitiin käyttäen iScript cDNA-synteesi kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Arvioida mRNA ilmaus ehdokas
Skts5
geenejä, Taqman hankittiin Applied Biosystems (Life Sciences Technologies). Jokainen näyte mitattiin kolmena kappaleena. Kolme ohjaus geenit,
L19
,
Ppia
ja
HPRT
, käytettiin laskettaessa suhteellinen ekspressio ja keskimääräinen ero ilmentyminen laskettiin kaikkien kolmen valvontaa. Kokeet sisältyvät vesi aihioita ja no-RT valvontaa. Merkitys differentiaalikaavojen määritettiin Student T-testejä.
Tulokset
tunnistaminen ehdokas 3’UTRs opiskeluun
Skts5
on ihokasvaimesta alttius locus aiemmin tunnistettu F1 takaisinristeytysanalyysillä hiirillä välillä altis NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla kannat [4], [25]. Kytkentä tässä lokuksessa ei löytynyt F1 backcrosses välillä NIH /Ola ja STF /PAS tai välillä FVB /N ja SPRET /EiJ, muut ihon resistenttien Mus spretus viittaa siihen, että potentiaalisesti toiminnallinen kvenssivariantit joka oli läsnä SPRET /etäissiittoisilla, mutta ei STF /PAS tai SPRET /EiJ, voidaan pitää ehdokkaana variantteja. Aiemmissa tutkimuksissa sekvensoimme koodaavat eksonit 54 geenien minimaalinen
Skts5
sidos alueen hiirikannoissa alttiita ihosyöpä (NIH /Ola ja FVB /N) ja hiirillä resistenttejä ihosyöpä (SPRET /etäissiittoisilla , SPRET /EiJ, STF /PAS) [4]. Meidän alustava tutkimus, emme ole täydellinen genotyypin koko 3’UTRs kaikkien geenien kaikki kantojen hiiriä käytetään tutkimuksessa. Tuottaa puuttuvia järjestyksessä tiedot, sekvensoimme pisin 3’UTR version 39 geenien kannat josta meillä puuttuivat tiedot, pääasiassa STF /PAS. Geeneistä arvioitu, oli 24 3’UTR polymorfismien yhdeksästä geenejä, jotka sopivat kaikkein konservatiivinen sidos tietoja, että ne olivat vain polymorfisia välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla, mutta eivät olleet polymorfisia välillä STF /PAS ja NIH /Ola tai välillä FVB /N ja SPRET /EiJ (taulukko 1).
vaikutus 3′-UTR-varianttien ekspressiota,
odotettavissa, että vain osa 24 3’UTR polymorfismit olisi ennakoida muuttaa miRNA sitovia. Tunnistaa nämä SNP, olemme tulleet niin NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla sekvenssit kahteen miRNA sitovaa ennustus ohjelmia, MicroInspector [20] ja Miranda [19]. Viisitoista polymorfismien ennustettiin vaikuttavan miRNA sitovia.
Cbll1
oli ainoa geeni 3’UTR variantti sopiva nostolaite, joka ei ole vähintään yksi ehdokas SNP ennustetaan häiritä tai käyttöön miRNA sivuston (taulukko 2; Taulukko S3; Kuva S1).
Voit selvittää 3’UTRs polymorfismien vaikuttaa ilmaus, me kloonattujen fragmenttien 3’UTRs on 245 1652 emäsparin kokoisia joka sisälsi variantteja kiinnostusta kahdeksan geenien kanssa polymorfismien sovittamalla nostolaite tiedot ja ennusti häiritä miRNA sitovia (taulukko S1). 3’UTR varten
Cbll1
kloonattiin myös. Sen jälkeen kloonaus 3’UTR fragmenttien
Bcap29
,
Cbll1
,
Dgkb
,
Hbp1
,
Meox2
,
Pik3cg
,
Stxbp1
,
Tspan13
, ja
Twistnb
, pGL3-kontrolli sivektorissa, transfektoimme konstruktit osaksi C5N normaalit keratinosyyttisoluja ja mitataan lusiferaasin tasoja kaksi isoformia. Oletimme, että jos varianttia 3’UTR ennustettiin näyttämään miRNA sitovat vain yhden kannan, pitäisi olla pienempi lusiferaasiekspressio verrattuna muunnos ei ennusteta sitomaan miRNA. Transloimattomassa alueet
Bcap29
,
Dgkb
,
Hbp1, Pik3cg
,
Stxbp1
, ja
Twistnb
oli Monimuotoinen sivustoja, jotka ennustettiin sekä esitellä ja häiritä otaksuttu miRNA sitoutumiskohtia. Siten nämä kuusi geeniä, ei ollut selvää, miten polymorfismi voi vaikuttaa ilme. Yhdeksän 3’UTRs arvioitu, kuusi osoitti tilastollisesti merkitsevä ero lusiferaasin ilmentymistä kantojen välillä (kuvio 1 ja dataa ei näytetty). Voimakkain erot lusiferaasin ilmentyminen olivat 3’UTRs on
Hbp1
ja
Bcap29
(kuvio 1). Monille geenit, sekä 3’UTR isoformeja osoitti vähentynyt lusiferaasiekspressio verrattuna pGL3 vektori viittaa siihen, että miRNA tai muita sääntelymekanismeja on vaikutuksia niin 3’UTR muodoista.
edustaja suhteellinen lusiferaasiyksiköt normalisoitui pilkkaamaan varten pGL3 sivektorissa (tummanharmaa), NIH 3’UTR (musta) ja SPRET /etäissiittoisilla 3’UTRs (vaaleanharmaa) kuuden geenien näkyvät. P-arvot differentiaalikaavojen välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla on merkitty. A.
Bcap29
; B.
Dgkb
; C.
Hbp1
; D.
Pik3cg
; E.
Twistnb
; F.
Tspan13
.
tunnistaminen varianttien vaikuttavien otaksutun microRNA sitoutumiskohdista
Kuten variantit 3’UTR alueet on osoitettu vaikuttavan miRNA sitova ja myöhemmät geeni ja proteiinin ilmentyminen [15], [16], me arveltu, että 3’UTR variantit sovittamalla nostolaitteen tiedot voivat vaikuttaa geenin sääntelyä ja siksi vaikuttavat erot syövän alttiuden välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla hiirillä. Kuusi yhdeksästä 3’UTRs arvioitiin,
Bcap29
,
Dgkb
,
Hbp1
,
Pik3cg
,
Twistnb
ja
Tspan1
, osoitti ero lusiferaasiekspressio välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla, mutta koska monet näistä oli useita SNP jotka ennustetaan vaikuttavan sitovia, halusimme priorisoida johon SNP ja miRNA todennäköisimmin tähän. Lisäksi, kuten jotkut SNP aiemmin määritettiin sekä esitellä ja häiritä mahdollisia sitoutumiskohtia, halusimme käyttää lusiferaasia tietoja valita miRNA joka sopisi ilmaisua tiedot. Tarkentaa meidän ehdokas SNP lista ja valitse mahdollisten miRNA opiskelua, sekvenssi 3’UTRs geenien kanssa ehdokkaan variantteja arvioitiin käyttäen ylimääräisiä miRNA sitova ennustusohjelmia Patrocles, ja MicroSNiPer. Käytimme myös MicroInspector, tunnistamiseen sitoutumiskohtien kanssa MFE alle -22 kcal /J yhdessä muodossa (vahva sitoutuminen) ja suurempi kuin -18 kcal /J toisessa muodossa (heikko tai ei sitovaa), kuten suositellaan Mus musculus [20]. Kaikkien ennustettu miRNA sitoutumiskohtia, päätimme, missä määrin polymorfismi oli ennustettu lujuutta sitovia. Käyttämällä RNAhybrid ja RNAcofold, laskimme vapaan energian sitoutumisen oletetun miRNA. Testasimme ilmentyminen eroja kaikkien miRNA vuorovaikutusta, joka osoitti ennustettu erot on suurempi kuin 5 kcal /J näiden kahden variantin muotoja molemmissa ennustelaitteet. Kaikki kuusi geenien variantteja, jotka sopivat nostolaite tiedot ja osoittivat eroja lusiferaasiekspressio oli variantteja, joilla on merkittäviä eroja ennusti vapaa energia sitoutumisen miRNA, joista osa sisälsi SNP ennustettu siemenen alueen (taulukko 2, kuva S1).
vaikutus MikroRNA ilmentymiseen
Voit selvittää ennustetun miRNA voisi vaikuttaa lusiferaasiekspressio eroja
Bcap29
,
Dgkb
,
Hbp1
,
Pik3cg
,
Twistnb
ja
Tspan13
, me kotransfektoidaan C5N solujen NIH /Ola tai SPRET /etäissiittoisilla lusiferaasia rakentaa ja edeltäjä miRNA ennustetaan sitoa sen variantit sopusoinnussa sidoksen ja alunperin lusiferaasiekspressio (taulukko 2). Valitsimme 13 ehdokasta miRNA arvioitavaksi. Aloitimme tutkimukset ainoastaan arvioimalla isoformia ennustetaan sitovat miRNA ja arvioitiin molemmat isoformit kun näimme vaikutus odotettuun suuntaan miRNA lusiferaasiin tasoilla. miRNA varten
Pik3cg
(
miR-707
),
Hbp1
(
miR-127
,
miR-183
, ja
miR-873
),
Twistnb
(
miR-718
, ja
miR-691
), ja
Dgkb
(
miR-489
) ei ollut vaikutusta lusiferaasin ilmentymistä (kuvio 2A ja tietoja ei ole esitetty).
miR-1940
kanssa
Tspan13
3’UTR ja
miR-31
kanssa
Hbp1
3’UTR vähentynyt lusiferaasiekspressio molempien isoformeja samalla viittaa siihen, että nämä miRNA sitoivat 3’UTRs samassa määrin (kuvio 2B ja tietoja ei ole esitetty). Muut miRNA,
miR-128 (Bcap29), miR-3064-3p (Pik3cg) B,
miR-3074-5p
(
Twistnb
) ja
miR -485 (Dgkb) B vähensi lusiferaasin ilmentymistä pGL3 ohjaus tyhjän vektorin samassa määrin kuin vektori, joka sisältää kloonatun 3’UTR (kuvio 2C ja tietoja ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miRNA valitsimme analysoitavaksi eivät olleet vastuussa havaitut erot lusiferaasiekspressio välillä SPRET /etäissiittoisilla ja NIH /Ola.
edustaja kokeita näkyvissä mitään vaikutusta miRNA on lusiferaasiekspression ja vastaavien vaikutusten miRNA molemmilla isoformeja näkyvät. A.
Dgkb
3’UTR kanssa
miR-489
; B.
Tspan13
3’UTR kanssa
miR-1940; C. Dgkb kanssa miR-485
. pGL3, pGL3 sivektorissa ilman insertti; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /etäissiittoisilla 3’UTR; NC, munakokkelia ohjaus miRNA; Tummanharmaa baareja, pGL3 sivektorissa; Mustat palkit, pGL3-vektorin, johon NIH /Ola 3’UTR; Vaaleanharmaa baareja, pGL3 vektori, joka sisältää SPRET /etäissiittoisilla 3’UTR.
sulkea pois mahdollisuutta, että me puuttui ero vaikutuksia miRNA on lusiferaasiekspression koska käytetyissä koeolosuhteissa, arvioimme
Twistnb
3’UTR käyttäen lisäannos miRNA
miR-3074-5p
ja
miR-691
ja lisäksi ajankohtina transfektion. Tämä 3′-UTR valittiin tarkempi tutkimus, koska se sisälsi variantteja ennustetaan sitoutuvan siemenen alueen näiden molempien miRNA (kuvio S1). Olemme havainneet eroja vaikutus miRNA verrattuna alkuperäistä kokeissa (kuvio 3A, 3B ja tietoja ei ole esitetty). Kuten miRNA voivat toimia yhdessä, me arvioitiin myös
miR-3074-5p
ja
miR-691
yhdistelmässä on
Twistnb
3’UTR NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla isoformit ja totesi, että tulokset yhdistelmä
miR-691
ja
miR-3074-5p
olivat identtiset
miR-3074-5p
yksinään (kuvio 3A, 3B ja tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että meidän tiedot eivät todennäköisesti artefakti käytetyissä kokeellisissa olosuhteissa.
edustaja kokeet osoittavat epäspesifistä vaikutusta
miR-3074-5p
ja /tai
miR-691
molemmin isoformia
Twistnb
esitetään pienellä annoksella transfektiota miRNA esiasteita. A.
Twistnb
3’UTRs 24 tuntia transfektion kanssa
miR-3074-5p
,
miR-691
tai molempien miRNA. B.
Twistnb
3’UTRs 48 tuntia transfektion kanssa
miR-3074-5p
,
miR-691
tai molempien miRNA. pGL3, pGL3 sivektorissa ilman insertti; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /etäissiittoisilla 3’UTR; NC, munakokkelia ohjaus miRNA; Tummanharmaa baareja, pGL3 sivektorissa; Mustat palkit, pGL3-vektorin, johon NIH /Ola 3’UTR; Vaaleanharmaa baareja, pGL3 vektori, joka sisältää SPRET /etäissiittoisilla 3’UTR.
edelleen vaikutuksen arvioimiseksi
miR-3074-5p
pGL3 ja NIH /Ola ja SPRET /Eksogaamiset
Twistnb
3’UTRs, transfektoimme inhibiittoria
miR-3074-5p
ja verrattuna ekspression negatiiviseen kontrolliin estäjän ja
miR-3074-5p
. Jos miRNA olivat suoraan kohdistettu ennustettu SPRET /etäissiittoisilla
Twistnb
isoformia ja havaittua vaikutusta pGL3 vektorin ja NIH /Ola
Twistnb
olivat epäspesifisiä vaikutuksia (kuvio 3A ja B) , voisi olettaa, että inhibiittorin lisääminen olisi suurin vaikutus pGL3 vektorin kanssa SPRET /etäissiittoisilla 3’UTR. Lisäksi on anti-
miR-3074-5p
osoitti eniten kertainen nousu lusiferaasin ilmentymisen pGL3 vektorin ja osoitti ei-spesifisten kasvaa ilmentymisen SPRET /etäissiittoisilla ja NIH /Ola-isoformit viittaa siihen, että alennettu lusiferaasin ilmentyminen on ei-spesifinen (tuloksia ei ole esitetty).
on mahdollista, että endogeeninen miRNA voidaan kohdistaa maksimaalinen knock-down ja lisäämällä miRNA prekursorin meidän C5N solut eivät indusoi edelleen pienenee lusiferaasin ilmentymistä. Arvioida tämän mahdollisuuden mittasimme miRNA ilmaus RNA korjattu C5N soluista, jotka olivat valetransfektoidun. Huomattavaa on, että kaikki miRNA arvioitiin näkyi merkkejä ilmaisun ei-transfektoidaan qPCR, mutta suurin osa näistä oli ilmaistu suhteellinen taso 1% tai vähemmän valvontaa,
sno-202
. Näin ollen suurin osa miRNA tässä tutkimuksessa, endogeenisten tasojen ilmentymistä C5N solut ovat todennäköisesti aiheuttaa maksimaalisen pudotus ennustetun kohde 3’UTR. MikroRNA osoittaa korkeampaa endogeenisen ilmentymisen mukana
miR-31
(252% kontrollista),
miR-183
(12,5% kontrollista),
miR-675-3p
(2,2% kontrollista) ja
miR-3074-5p
(3,7% kontrollista).
mRNA ilmentymä ehdokas kohdegeenien
Yksi vaikutus miRNA sitoutumisen mRNA on mRNA: n hajotus tuotteen ja vähentynyttä ilmentymistä. Geenit kartoitus
Skts5
arvioitiin qPCR onko oli eroja hännän mRNA välillä NIH /Ola ja SPRET /etäissiittoisilla. Testatuista geenit sisältävä ehdokas 3’UTR variantteja löydettiin huomattavia eroja mRNA ilmaisun
Bcap29
,
Hbp1
,
Pik3cg
,
Twistnb ja Tspan13
, mutta ei ole merkittäviä eroja ilmentymisen
Dgkb
ja
Meox2
(kuvio 4 ja tietoja ei ole esitetty). Lauseke
Stxbp6
oli liian alhainen vertailun. Geenit, jotka olivat pysyvästi tulosten välillä lusiferaasiekspression määrityksissä ja qPCR ovat
Bcap29
(korkeampi ilmentyminen NIH /Ola),
Hbp1
(korkeampi ilmentyminen SPRET /etäissiittoisilla),
Meox2
(ei merkittävää eroa ilmaisun),
Twistnb
(korkeampi ilmentyminen NIH /Ola) ja
Tspan13
(korkeampi ilmentyminen SPRET /etäissiittoisilla).
Bcap29
osoitti mahdollisimman suurta eroa, noin 15-kertainen ilmaisun NIH /Ola kuin SPRET /etäissiittoisilla (kuva 4).
Dgkb
ei osoittanut mitään merkitsevää eroa mRNA: n ekspression, mutta korkeampi lusiferaasin ilmentyminen NIH 3’UTR.
Pik3cg
osoitti korkeampi ilmentyminen SPRET /etäissiittoisilla mRNA, mutta pienempi lusiferaasiekspressio. Siten viisi seitsemästä geenien arvioida qPCR osoittivat johdonmukaisesti ekspressiokuvioiden välillä mRNA ja vaikutus 3’UTR on lusiferaasiekspression. Kuten miRNA toimivat kahdella tavalla, yksi lisäämällä mRNA: n hajoamisen ja muut häiritsemällä käännös, on mahdollista, että mitään eroa mRNA ilmaisu olisi noudatettava, vaikka ero miRNA sitova tapahtuu [26], [27].
kvantitatiivinen PCR seitsemän geenien arvioitu ero lusiferaasiekspressio välillä SPRET /etäissiittoisilla ja NIH /Ola 3’UTR näkyvät.