Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä kantasolut (CSCS) edustavat pientä alapopulaatio haimasyöpäsoluissa joilla on kyky aloittaa ja levittää kasvainten muodostumiseen. Kuitenkin mekanismit, joilla haiman CSCS säilyvät ei ymmärretä tai ominaista.

Methods

Expression of Notch reseptorien, ligandien, ja Notch signalointi kohdegeenien kvantitatiivisesti CSC ja ei- CSC väestöä 8 ensisijainen ihmisen haiman ksenografteja. Gamma sekretaasin estäjä (GSI), joka estää Notch polku ja shRNA kohdistettu Notch kohdegeenin Hes1 arviointiin käytettiin roolia Notch väylän CSC väestön huollon ja haiman kasvainten kasvua.

Tulokset

Notch polku komponenttien havaittiin voimistuvan haiman CSCS. Inhibitio Notch reitin käyttäen joko gammasekretaasin estäjän tai Hes1 shRNA haiman syöpäsoluissa alennetaan prosenttiosuus CSCS ja tumorsphere muodostumista. Toisaalta, aktivointi Notch reitin eksogeenisellä Notch peptidi ligandi lisäsi prosenttiosuus CSCS sekä tumorsphere muodostumista. Hoitoon in vivo potilaalle tehdä haiman kasvainten NOD /SCID-hiirissä, joilla GSI estetty kasvaimen kasvua ja vähentää CSC väestöstä.

Johtopäätös

Notch signalointireitin on tärkeää säilyttää haiman CSC väestöstä ja on potentiaalinen terapeuttinen kohde haimasyövän.

Citation: Abel EV, Kim EJ, Wu J, Hynes M, Bednar F, Proctor E, et al. (2014) Notch Pathway on tärkeä ylläpitäminen Cancer Stem Cell väestö Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (3): e91983. doi: 10,1371 /journal.pone.0091983

Editor: Martin Fernandez-Zapico, Schulze Center for Novel Therapeutics, Mayo Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 tammikuu 2014; Hyväksytty: 15 helmikuu 2014; Julkaistu: 19 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Abel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Randy Pausch perheelle AACR-PANCAN Innovation Award (DMS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa huolimatta 10

th yleisin syöpä diagnoosi [1]. Korkea kuolleisuus johtuu osittain siitä, että valtaosa haimasyövistä diagnosoidaan edennyt pitkälle. Mutta ainakin yhtä tärkeää on, että haimasyöpä ovat yleensä vain minimaalisesti reagoi kemoterapiaa ja sädehoitoa. On yhä enemmän todisteita siitä, että tämä vastustuskyky hoito on ainakin osittain johtuen luontaisesta vastus alapopulaation syöpäsolut ovat tuumorigeenisemmiksi ja jakaa monia ominaisuuksia kantasoluja ja siten on merkitty syövän kantasolut (CSC). Syöpä kantasolut eristettiin ensin vuonna myelooista leukemiaa [2] ja osoitettiin jakaa kantasolujen ominaisuuksia, kuten mahdollisista sisäisistä uudistamista ja kyky erilaistua ja lisääntyä. Sen jälkeen, CSCS on tunnistettu myös monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta-, aivo-, maksa-, paksusuoli-, eturauhas-, melanooma, ja haiman kasvaimet [3] – [10] _ENREF_3. Haimasyöpä kantasolut (CSC) on ensimmäinen eristettiin ihmisen haiman syöpään merkitsin profiilin ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ [10]. Nämä merkki positiivinen CSCS pystyivät muodostamaan kasvaimia NOD /SCID-hiirissä, jotka näyttivät histologisesti samanlaisia ​​primaarikasvaimen, mikä viittaa siihen, multi-teho palautetaan ennalleen eri kasvainsolutyypit. In vitro näyttöä kantasolujen fenotyyppiä kuten itseuudistumisen osoitettiin kyky muodostaa kasvaimen palloja

in vitro

toisin ESA

– /CD44

– /CD24

– solut, jotka eivät voineet.

on edelleen puutteellisesti miten haimasyöpä kantasoluja pidetään heterogeeninen kasvain. Yksi mahdollinen tekijä CSC huolto on Notch signalointireitille. Normaalissa kehittää haima, Notch signalointireitin on osoitettu olevan tärkeä säätelijä tasapaino itseuudistumisen ja erilaistumista [11] – [13]. On 4 jäsentä nisäkkään Notch-reseptorin perhe (KAATOLOVEN 1-4), jotka ovat samalla tavoin käsitellään ja aktivoidaan sarjan pilkkominen tapahtumia. Kypsä Notch-reseptori koostuu kahdesta alayksiköstä, jotka syntyvät tuloksena ensimmäisen katkaisun tapahtuman furiinin kaltaista konvertaasi [14]. Notch signalointireitin aktivaatio tapahtuu, kun lovi reseptori sitoutuu yksi viidestä tunnettu loven ligandeja [jagged1 (JAG1), jagged2 (JAG2), delta-like 1 (DLL1), delta-, kuten 3 (DLL3), ja delta-like 4 (DLL4)]. Ligandin sitoutuminen aiheuttaa konformaatiomuutoksen Notch-reseptorin, jonka avulla toinen pilkkominen tuumorinekroositekijä-alfa konvertoivan entsyymin (TACE) [15]. Kolmas lohkaisu tapahtuma suorittaa gammasekretaasin (preseniliini), joka vapauttaa solunsisäisen domeenin Notch jotta se voi tumaan aktivoida ilmentymistä kohdegeenien [16].

Inhibition of Notch signaloinnin polku johtaa ehtyminen monen voimakas haiman esisolut [11], [13]. Toisaalta aiheuttama Notch aktivointi estää haiman epiteelisolujen erilaistumista ja johtaa lisääntyneeseen ylläpitoon erilaistumattomien haiman progenitorisolujen [12]. Perustuen samanlainen ilmiasun näytteille CSCS, Notch signalointireitille on arvioitu sen roolista CSC itseuudistumisen. Sekä rinta- ja aivojen CSCS on osoitettu kasvaneen Notch-reitin aktivaatio [17], [18]. In vitro inhibitio Notch signalointireitin näiden kahden kasvaintyypeissä tuloksia laski itseuudistumisen, joka on esitetty pelkistämällä tumorsphere muodostumiseen. Oletimme, että Notch signalointireitille on edelleen yläreguloituja haiman CSC ja edistää haiman CSC toiminta ja haimasyövän kasvaimen kehittymisen.

Tässä tutkimuksessa arvioimme rooli Notch reitin ylläpitämisessä CSC väestö ja sen vaikutukset estämisen haiman kasvaimen kasvua. Havaitsemme säätelyä useita Notch koulutusjakson komponenttien haiman CSCS ja osoittavat, että esto jonka gammasekretaasin estäjän tai shRNA sen Hes1, keskeinen Notch kohdegeenin vähentää haiman CSC itseuudistumisen ja kasvainten muodostumiseen. In vivo hoito vakiintuneiden potilaalle tehdä haimatuumorien kanssa gammasekretaasia estäjä vähentää kasvaimen kasvua ja yhdessä sytotoksisen kemoterapian lisäksi täydentää anti-tuumorivaste. Tuloksemme viittaavat siihen, että Notch signalointi on kriittinen haiman CSC huolto- ja että kohdistaminen Notch signalointireitille haimasyövän on lupaava terapeuttinen potentiaali.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

haiman adenokarsinooma kudosnäytteitä saatiin potilailta, jotka tehtiin kirurgisten sisällä Michiganin yliopistossa Health System. Kirjallinen suostumus kaikilta tutkittavilla saatiin ennen keräämistä kudosta, ja kaikki protokollat, joihin liittyy potilaan näytteet tarkistetaan ja hyväksynyt Institutional Review Boards of Michiganin yliopiston Medical School (IRBMED). Alkuperäinen, Painetun kaikki kirjallinen lupa muodot pysyvät turvallisessa tiedoston Michiganin yliopistossa. Institutionaalinen Review hallitukset Michiganin yliopiston Medical School (IRBMED) todennut, että tämä tutkimus mukainen sovellettavien suuntaviivojen ja kansallisten määräysten, ja University of Michiganin Federalwide Assurance (FWA) kanssa Department of Health and Human Services (HHS). IRBMED hyväksyi myös kaikki kirjallinen suostumus asiakirjat, sekä lupamenettelyissä, tätä tutkimusta varten. The University of Michigan Federalwide Assurance numero Tämän tutkimuksen FWA00004969, ja tutkimus Michiganin yliopiston tutkimus tunnistenumero on HUM00025339.

Vasta-aineet ja reagenssit

Merck gammasekretaasia estäjä (MK-0752) oli Dr. Max Wicha (University of Michigan) ja käytettiin

in vitro

ja

ex vivo

tutkimuksia. Gammasekretaasia estäjä RO4929097 oli ystävällisesti Roche (Indianapolis, IN) ja käytettiin

in vivo

tutkimuksissa. PE-konjugoidulla hiiren anti-humaani-CD44 ja FITC-konjugoitua hiiren anti-ihmis-CD24-vasta-aineet hankittiin B.D. (Franklin Lakes, NJ). APC konjugoitua hiiren anti-ihmisen ESA hankittiin Miltenyi Biotech ja biotinyloidun hiiren anti-hiiri H2K ostettiin Southern Biotech. Hes1 käytetty vasta-aine Western Blot saatiin tri Xing Fan (University of Michigan) tai ostaa MBL International (Woburn, MA). Notch1 ja pilkotaan Notch1 vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA) ja β-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma (St. Louis, MO). Matrigel hankittiin B.D. (Franklin Lakes, NJ). Hes1 shRNA klooni V2LHS 249784 hankittiin Open Biosystems (Huntsville, AL). Delta /Serrate /Lag-2 (DSL) peptidi (sekvenssi CDDYYYGFGCNKFCRPR) syntetisoitiin Michiganin yliopistossa Protein Structure Facility.

pöytäkirjan hyväksymistä

Eläinten protokollia hyväksyttiin yliopiston komitea Käytä ja eläinten hoito (UCUCA) at University of Michigan ja lentivirus pöytäkirjat hyväksyttiin institutionaalisten Biosafety komitea (IBC) University of Michigan.

valmistaminen yksisolususpensioita syöpäsolujen

Single solususpensiota kasvainsolujen valmistettiin, kuten on kuvattu [10], seuraavin muutoksin. Ensisijainen ihmisen haiman adenokarsinooma ksenograftikudoksesta pilkottiin täydellisesti ja suspendoitiin sitten 200 yksikköä /ml ultrapuhdasta kollagenaasia IV (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) Media 199 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sen jälkeen kun entsyymiä digestion 37 ° C: ssa 45-60 minuuttia ja mekaaniset dissosiaatio pipetoimalla 15 minuutin välein 10 ml: n pipetillä, pilkottu ja hajotettiin solut suodatettiin 40 um: nylon mesh solun rajoittimen (BD Franklin Lakes, NJ) ja pestiin HBSS: llä (Invitrogen, Carlsbad, CA) kaksi kertaa. Sitten solut suspensoitiin uudelleen 2% FBS: ää HBSS: ssä kokeita varten.

Virtaussytometria

Virtaussytometria suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Dissosioituneet solut laskettiin ja siirrettiin 5 ml: n putkille, pestiin HBSS: llä /2% FBS: ää kahdesti ja suspendoitiin uudelleen HBSS /2% FBS: ää pitoisuutena 1000000 solua per 100 ui. Sandoglobin (1 mg /ml) lisättiin näytteeseen laimennoksena 1:50 ja näytettä inkuboitiin jäiden päällä 20 minuutin ajan, pestiin sitten kahdesti HBSS: llä /2% FBS: ää. Vasta-aineita, PE-konjugoitu hiiren anti-ihmis-CD44, FITC-konjugoitua hiiren anti-ihmis-CD24, APC konjugoidut hiiren anti-ihmisen ESA ja biotinyloidun hiiren anti-hiiri-H2K lisättiin laimennus ohjeiden, ja näytettä inkuboitiin 45 min jäätä ja sitten pestiin kahdesti HBSS /2% FBS. Konjugoidun streptavidiinin kanssa APC-Cy7 lisättiin laimennus 1:200 ja näytettä inkuboitiin jäiden päällä 15 minuuttia. Kun oli pesty kaksi kertaa HBSS: llä /2% FBS: ää, solut suspensoitiin uudelleen HBSS /2% FBS: ää, joka sisälsi 3 uM 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Virtaussytometria tehtiin käyttäen FACSAria (B.D., Franklin Lakes, NJ). Sivusironnan ja sirontamittari profiileja käytettiin poistamaan soluun dupleteiksi.

kvantitatiivinen PCR

pohjustajat Notch polku komponenttien valittiin pohjamaali pankin (Wang Seed, 2003) ja syntetisoitiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Kokonais-RNA uutettiin lajitellusta syövän kantasoluja ja ei-syöpä kantasoluja käyttämällä RNeasy Micro-kittiä (Qiagen, Valencia, CA) ohjeiden mukaisesti. Käänteinen transkriptio cDNA suoritettiin käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ohjeiden mukaisesti. qPCR suoritettiin Rotorgene 6000 (Qiagen, Valencia, CA) käyttäen Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden, kaikki reaktiot normalisoitu GAPDH. Käytetyt olosuhteet qPCR oli 95 ° C: ssa pidon 10 minuuttia, 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 sekuntia, 60 ° C: ssa 15 sekuntia ja 72 ° C: ssa 20 sekuntia.

Tumorsphere viljelmiä

perustettu haimasyöpä tumorspheres [10] pidettiin alalla media kuten aiemmin on kuvattu [19], [20] muutoksin [50% NeuralBasal (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% N2 Supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2% B27 täydentää (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% antibiootti-Anti-sieni (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ng /ml BMP4 (Sigma), 10 ng /ml LIF (Sigma), 20 ng /ml ihmisen bFGF- 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kaikki 01:01 DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)]. Tumorspheres siirrostettiin välein 6 päivää. Siirtämistä varten, tumorspheres hajotettiin 0,05% trypsiiniä 2-5 minuuttia ja sitten välittömästi pestiin kahdesti 40 ml: lla PBS: ää. Sitten solut läpi 40 um nailonverkkoa solusiivilän, laskettiin ja levitettiin tuoretta alalla väliaineessa Costar ultra low-kiinnitys 6 kuoppaisille levyille (Corning, Lowell, MA).

GSI hoitoon tumorsphere solujen

Tumorspheres hajotettiin yksittäisiksi soluiksi ja suspendoitiin uudelleen alalla väliaineessa, joka sisältää GSI ilmoitettuina pitoisuuksina, että huomattava ajanjaksoja. Sitten solut mikroskoopilla tai kerätään analyysiä varten.

Western blotting

Solut, jotka käsitelty tai ilman GSI eri annoksilla lysoitiin hajotuspuskuria (20 mM Tris, pH 7,5 /150 mM NaCl: a /12 mM EDTA /10% glyserolia /1% Triton X-100), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ja PhosphoStop (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Viisikymmentä ug proteiinia sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen 2x SDS-latauspuskuria (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja keitettiin 5 minuutin ajan ennen kuin näytteen SDS-PAGE. SDS-PAGE, proteiini geeli blotattiin nitroselluloosamembraanille Hybond C extra (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA) käyttäen Bio-Rad-blottauksella laite (BioRad, Hercules, CA) yhden tunnin ajan. Blottia estettiin 5% kuivamaitoa TBST yhden tunnin ajan, pestiin kahdesti TBST: ssä, ja sitten inkuboitiin vasta-aineiden kanssa (1:1000) 5% BSA: ta 4 ° C: ssa yön yli. Blotti pestiin kolme kertaa TBST: llä ja inkuboitiin sitten peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), 5% kuivamaitoa huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa TBST: ssä, blottia inkuboitiin 5 minuuttia SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraatti (Pierce, Rockford, IL) ja röntgenfilmin (Denville Scientific, Metuchen, NJ), kehitettiin sitten.

shRNA transductioin

lentivirustartunnat rakentaa pGIPZ sisältävä vektori Hes1 shRNA tai ohjaus shRNA tehtiin Vector ydin University of Michigan. Transduktio suoritettiin käyttäen ViraDuctin Lentivirus transduktio Kit (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA) ohjeiden mukaisesti.

apoptoosimäärityksessä

Tumorsphere transdusoitujen solujen kontrolli tai Hes1 shRNA viljeltiin alalla media joka sisälsi 4 ug /ml puromysiiniä 4 päivän seurasi trypsinaatiolla ja PBS pesua. Solut suodatettiin 40 um: n nailonverkon saada yhden solun suspensiot. Saatu yksi solut kiinnitettiin jääkylmällä 50% etanolia PBS: ssä yön yli. Sitten solut värjättiin PI ja FITC-anneksiini V käyttämällä anneksiini V: FITC Apoptosis Detection Kit II hankittiin BD Biosciences (San Jose, Kalifornia).

DSL hoitoon tumorspheres

Kuulat olivat hajotetaan yksittäisiksi soluiksi ja suspendoitiin uudelleen alalla väliaineessa, joka sisältää DSL-peptidin ilmoitetuilla pitoisuuksilla osoitetut ajat. Käsitellyt solut havaittiin mikroskoopilla tai kerätään analyysia.

Ex vivo GSI hoitoon tumorspheres ja istutettaviksi NOD /SCID

Single solujen erottaa tumorspheres viljeltiin alalla väliaineessa, joka sisälsi DMSO tai 8 uM GSI 48 tuntia ennen kuin se hajotetaan trypsiinillä ja värjättiin DAPI ja vasta-aineen H2K. Solut lajiteltiin FACS ja DAPI negatiivinen ja H2K negatiiviset solut kerättiin saamiseksi puhdas live, ihmisen haimasyövän solupopulaation. Pestiin HBSS, lajiteltu solut suspensoitiin uudelleen alalla väliaineessa. Solujen elinkelpoisuus validoitu käyttäen trypaanisini (Invitrogen, Carlsbad, CA). Neljäkymmentä tuhatta solua 50 ui väliaineessa sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen Matrigel ja injektoidaan subkutaanisesti midflank alueelle NOD /SCID-hiirissä käyttäen 23 gaugen neulaa. Viisi hiiriin ruiskutettiin kussakin testiryhmässä. Tuumorin koko mitattiin viikoittain. Kasvaimet eivät saa ylittää 2 cm ennen eutanasiaa. Lisäksi eläimet seurattiin päivittäin Michiganin yliopistossa eläinlääkintähenkilöstöä ja tapettiin mitään merkkejä kärsimystä tai laihtuminen. Lopussa tutkimuksen eläimet lopetettiin hiilidioksidilla tukehduttamalla seuraa niskanmurrolla varmistaa syöttämällä.

Orthotopic implantaatio Haiman kasvainsoluja NOD /SCID-hiiret ja GSI hoito

Haiman kasvainsoluja inkuboitiin lusiferaasi-ilmentävien lentivirus yli yön pestiin seerumittomalla HBSS ja suspendoitiin PBS /Matrigel-seokseen (01:01 tilavuuden mukaan) pitoisuudella 10000000 solua /ml istutettavien. Hiiret nukutetaan injektoimalla vatsaonteloon 100 mg /kg ketamiinia ja 5 mg /kg ksylatsiinia ja pieni vasemman subcostal viilto tehtiin. 500000 bulk kasvainsolujen tilavuudessa 50 ui injektoitiin hännän haiman käyttäen 30 gaugen neulaa. Buprenorfiini oli 6 tunnin välein ensimmäisten 24 tunnin aikana leikkauksen jälkeisen kivun lievittämiseksi. Hoidon kemoterapiaa aloitettiin 2 viikon kuluttua kasvaimet olivat havaittavissa. Kolme yksittäiset varhainen ihmisen haiman ksenograftikasvaimissa otettiin mukaan analyysiin. Oli 4 ryhmään hiiriä: ohjaus, RO4929097 (GSI), gemsitabiini, ja GSI plus gemsitabiinin, 5 hiirtä ryhmää kohti. Eläimet arvioitiin bioluminescent kuvantaminen ja kasvaimen kasvua arvioitiin viikoittain. GSI (30 mg /kg) annettiin suun kautta letkulla taajuudella 5 päivän 2 vapaapäivää. Tätä aikataulua käytettiin minimoimaan GSI aiheuttama ripuli toissijainen pikarisoluliikakasvua [21]. Gemsitabiini (50 mg /kg) annettiin viikoittain vatsaonteloon kuten aiemmin on kuvattu [22]. Hoitoa annettiin 4 viikon jossa vaiheessa eläimet lopetettiin hiilidioksidilla tukehduttamalla seurasi niskanmurrolla varmistaa kuolema. Ennen lopettamista eläimille seurattiin päivittäin Michiganin yliopistossa eläinlääkintähenkilöstöä ja tapettiin mitään merkkejä kärsimystä tai laihtuminen. Ruumiinavaus tehtiin ja tuumorit leikattiin analyysiä varten.

Bioluminescent Imaging

Bioluminescent kuvantaminen istutettujen ortotooppisten hiirissä suoritettiin käyttäen Xenogen IVIS 200 Imaging System (Xenogen Biosciences, Cranbury, NJ), kuten aiemmin kuvattu [23].

immunohistokemia

kudosnäytteitä fiksoitiin 10% fosfaattipuskuroidussa formaliinilla ja upotettiin parafiiniin. Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut leikkeet leikattiin 4 pm paksu, on asennettu poly-l-lysiinillä päällystettyihin kalvot (Sigma), ja kuivattiin yön yli 37 ° C: ssa. Sitten leikkeitä vaha ksyleenillä, vedettömät standardin histopatologisten menettelyjä, ja värjättiin H 0.05.

tulokset

Notch signalointireitille ylössäädellään haimasyövän kantasoluja

Notch signalointireitin on osoitettu aktivoida haiman syöpäsoluissa [24]. Oletimme, että Notch signalointireitin osat voidaan edelleen voimistuvan vuonna haimasyövän kantasolujen alaryhmästä. Käyttämällä ensisijainen ihmisen haimasyövän ksenograftien 8 eri potilaan kasvaimissa arvioimme ekspressiotasot Notch signalointireitin komponenttien syövän kantasoluja verrattuna irtotavarana syöpäsoluja. Kasvaimet alkaen ksenograftit eristettiin ja jalostetaan yksisolususpensioi- jotka sitten lajitellun perustuu triple-merkki profiilin CD44 + /CD24 + /ESA + saada CSCS ja erikseen ei-CSCS (kuvio 1A). Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi RNA: n joka on saatu CSCS ja ei-CSCS ilmentämiseen komponenttien Notch signalointireitin suoritettiin. Tulokset viittaavat siihen, säätelyä Notch koulutusjakson komponenttien CSCS edellä, että ei-CSCS (kuvio 1 B). CSCS 6 8 kasvainten ilmaistu ainakin yksi Notch-reseptori tasolle 1,5 -kertaisesti kuin CSC. Samoin ainakin yksi Notch ligandi voimistunut 1,5 kertaiseksi CSC yli kuin CSC 6 8 kasvaimia. Huomattavaa on, että meidän ei havaittu ilmentymistä joko Notch4 reseptorin DLL3 ligandin joko CSC tai ei-CSC osastojen tahansa ensisijaisen ksenograftien testattu (tuloksia ei ole esitetty). Oli keskimääräinen 1,75 kertaa suurempi ilmentymisen Notch reitin kohdegeenin Hes1 on CSCS verrattuna ei-CSCS. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CSCS differentiaalisesti näihin kohonneeseen Notch reaktiotien komponenttien ja että reitti on vastaavasti aktivoidaan, kuten on esitetty parannettu ekspressio Hes1.

. Virtaussytometria-analyysi. Dissosioituneissa matalan passage ihmisen haimasyövän ksenografti solut värjättiin DAPI ja vasta H2K, ESA, CD44 ja CD24. DAPI positiiviset kuolleita soluja ja H2K positiivisia hiiren soluja sekä eliminoitu analyysiin. CSC väestöstä (pinta merkki ESA

+ /CD44

+ /CD24

+) sen porteilla sekä P5 ja P7, ja ei-CSC väestön P6. B. Transcript tasot Notch koulutusjakson komponenttien CSC verrattuna ei-CSC saatu qPCR normalisoituivat GAPDH. Keskimääräinen kertaluokkamuutos välillä kasvainten edustaa rekki.

Notch polku esto

Perustuen havaintoon, että Notch signalointireitin komponenttien yläreguloituja haimasyövän ja erityisesti haiman CSC olemme edelleen tutkineet osuus Notch reitin aktivointi haiman CSC toiminto. Gammasekretaasia katalysoi kolmas lohkeamisvaihe Notch-reseptorin joka vapauttaa Notch solunsisäinen alue. Tämä vaihe mahdollistaa Notch-reseptorin sitten tumaan ja aktivoimaan Notch signalointia, jolloin säätelyä kohdegeenin ilmentymisen. Inhibitio gamma-sekretaasin kanssa gamma-sekretaasi-inhibiittori voi siten estää aktivoinnin Notch signalointireitin. Inkuboinnin haimasyövän tumorspheres kasvavia annoksia GSI vähentää ekspressiotasoja Notch kohdegeenin Hes1 annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 2A, B) (p 0,001 vs. kontrolli). On vahvistettu, että GSI voi estää Notch signalointi haiman syöpäsoluissa, me seuraavaksi arvioitiin vaikutusta Notch-reitin estäminen nimenomaan CSC lokero. Haimasyöpäsoluissa käsitelty GSI osoittivat merkittävää vähenemistä CSCS ESA: n kanssa

+ /CD44

+ /CD24

+ merkki profiilin käsittelemättömiin soluihin verrattuna (2,76 ± 0,16% ohjaus vs. 1,43 ± 0,15% kanssa GSI p = 0,013) (kuvio 2C, D). Tämä tulos viittaa rooli Notch reitin aktivoinnin CSC ylläpitoon.

. Ensisijainen haimasyöpä solun tumorspheres (peräisin potilaan 5) viljeltiin alalla väliaineessa, joka sisältää eri konsentraation GSI kuten 48 tuntia ennen Western blot-analyysi vasta-aineella Hes1 tai β-aktiini. B. kvantitointi Hes1 mRNA seuraavat GSI hoitoa 48 tuntia (* p 0,001 vs. kontrolli). C. haimasyöpä solujen alalla väliaineessa käsiteltiin ohjattu ajoneuvo (DMSO) tai 8 uM GSI: ssa 48 tuntia. FACS-analyysi ohjaus DMSO käsiteltyjen solujen (

yläpaneeli

) ja GSI käsiteltyjä soluja (

alempi paneeli

). CSC väestöstä pintamerkkiaine ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ tunnistettiin näiden solujen sekä portit P5 ja P7. D. kvantitointi ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ CSC väestössä DMSO ja GSI hoito (* p = 0,013 vs. DMSO).

Yksi piirteistä CSCS on itseuudistumisen joka voidaan määrittää in vitro mittaamalla tumorsphere muodostuminen läpi useita kohtia. Haiman CSCS tunnistetaan markkerin profiilin ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ on kyky muodostaa palloja sisään tarttumaton olosuhteissa, joka erottaa ne muista kuin syövän kantasoluja, joista puuttuu tämä kyky [10]. Ottaa havaittu annoksesta riippuva esto Notch koulutusjakson kasvavia annoksia GSI ja pienenemisestä prosenttiosuus haiman CSC, arvioimme toiminnallinen vaikutus CSC toiminto testaamalla vaikutuksia GSI tumorsphere määrityksissä. Yhdenmukainen annoksesta riippuva vaikutus Notch koulutusjakson esto, hoitoon haimasyövän soluja GSI aiheutti annoksesta riippuvainen väheneminen ensisijaisen tumorsphere muodostumiseen taajuus (kuvio 3A, p 0,01 vs. kontrolli).

. Haimasyöpä solujen tumorspheres viljeltiin 5 päivää-alalla väliaineessa, joka sisältää osoitetut pitoisuudet GSI. Edustavat kuvat ensisijainen tumorspheres, joka kehittyi 1000 solua kuoppaa kohti viljeltiin kasvavien pitoisuuksien kanssa GSI. Kvantitointi määrä ensisijaisen tumorspheres (mustat palkit) muodostetaan kussakin pitoisuudessa 1000 solua ympätään kuoppaa kohti (* p 0,01 vs. kontrolli). Toissijainen tumorsphere muodostuminen (harmaat palkit) alkaen tumorspheres käsitelty GSI hajotettiin yksittäisiksi soluiksi, pestiin ja viljeltiin 5 päivää normaalissa alalla väliaineessa ilman GSI (** p 0,01 vs. kontrolli). B. Tumorspheres käsiteltiin GSI lisäämiseen konsentraatioissa värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja FITC-anneksiini V (Anv) ja analysoitiin virtaussytometrialla arvioida, missä määrin apoptoosin. (* P 0,05 8 uM vs. kontrolli, ** p 0,01 16 uM vs. kontrolli). C. Solusyklianalyysiä haiman tumorspheres käsiteltiin DMSO-kontrollin tai GSI 0, 24, 48, ja 72 tuntia. (* P 0,01 vs. kontrolli). D. haimasyöpä soluja viljeltiin joko 8 uM GSI tai ajoneuvon ohjaus (DMSO) ja 48 tunnin injektoitiin subkutaanisesti NOD /SCID-hiiriin. Edustavat kuvat hiirten istutettiin soluja osoitetun hoitoryhmässä otettu 21 päivän kuluttua injektion. Nuolet osoittavat sijainti kasvaimia. Serial kasvain koot mittaukset hiirille on DMSO-kontrollin tai GSI at ilmoitettuina ajankohtina. N = 5 (* p 0,01 vs. kontrolli).

Voit selvittää havaitun esto tumorsphere muodostumisen säilyi seuraavat ohimenevä altistuksen Notchiin esto, käsiteltiin tumorspheres hajotettiin yksittäisiksi soluiksi ja re -cultured normaalissa alalla mediassa ilman GSI. On huomattava, että vaikutus tumorsphere muodostuminen säilyi jopa poistamisen jälkeen gamma-sekretaasin estäjä, mistä on osoituksena vähentynyt sukupolven toissijaisen tumorspheres (kuvio 3A, p 0,01 vs. kontrolli).

Vaikutus GSI on apoptoosin voisi selittää tämän vähennys tumorsphere muodostumiseen. Todellakin, havaitsimme korotettuun apoptoosin perustuu PI ja anneksiiniV värjäytymistä solujen in tumorspheres käsitelty GSI verrattuna vehikkelillä hoidettuihin tumorspheres (kuvio 3B, p 0,05 8 uM vs. kontrolli, p 0,01 16 uM vs. kontrolli). Tämä tulos viittaa siihen, että apoptoosin myötävaikuttaa vähentyneeseen tumorsphere pystyy muodostamaan soluja käsiteltiin GSI. Olemme myös suorittaa solusyklin analyysi puuttuessa ja läsnä GSI joka paljasti lisääntynyt kerääntyminen solujen G1 kanssa GSI kontrolliin verrattuna (p 0,01). Heikentynyt solusyklin etenemistä voi siis myös edistää vähentämistä tumorsphere muodostumisen inhibitioon Notch signalointireitin kanssa GSI (kuvio 3C).

Jotta edelleen vahvistaa tätä noudatetaan toiminnallista vaikutusta in vitro Notch koulutusjakson esto, olemme tutkineet onko esikäsittely kanssa GSI voisi estää kasvaimen muodostumista in vivo. Tässä kokeessa olemme esikäsitelty haimasyöpäsoluissa perustettu tumorspheres kanssa GSI: ssa 48 tuntia ja sitten istutetaan elinkelpoisia, käsitellyt solut subkutaanisesti NOD /SCID-hiirten (5 hiirtä per ryhmä). Solut, jotka olivat käsittelemättömiä muodostunut kasvaimia 5 päivää aikaisemmin kuin esikäsitelty GSI ja kasvoivat merkittävästi suurempi (p 0,01) kuin peräisin soluista esikäsitelty GSI (kuvio 3D).

Notch polku esto käyttämällä Hes1 shRNA

Kuten havaitaan kuviossa 1B, mRNA taso Hes1, suora tavoite /efektori Notch-signaloinnin, oli yläreguloituja CSCS verrattuna ei-CSCS useissa ensisijainen ksenografteissa. Säätelyä Hes1 havaittiin yhdenmukaisesti koko ksenografteja, toisin kuin muut Notch tavoitteita, kuten Hey1 ja Heyl (tietoja ei ole esitetty). Sen arvioimiseksi, onko havaitut vaikutukset GSI olivat nimenomaan seurausta estämällä Notch signalointireitin eikä off-tavoite vaikutuksia, käytimme lentivirus- jotka ilmentävät ohjaus ja Hes1 shRNA nimenomaan kohdistaa Hes1. Knockdovvn Hes1 mukaan shRNA vahvistettiin sekä mRNA: ta (p 0,001 vs. kontrolli) ja proteiinin tasot (kuvio 4A, B) ja eivät vaikuta vastavirtaan Notch1 pilkkominen (kuvio 4B). Downregulation Hes1 johti heikentynyt tumorsphere muodostumiseen (kuvio 4C, D, p 0,001 vs. kontrolli) tarjoaa lisätodiste siitä, että Notch polku aktivaatio edistää haiman CSC toiminto.

. Haimasyövän soluja transdusoitu joko ohjaus- tai Hes1 shRNA korjattu viljelyn jälkeen 4 päivää. Hes1 transkriptipitoisuuksissa kvantitoitiin qRT-PCR, normalisoitu GAPDH (* p 0,001 vs. kontrolli). B. Solulysaatit Western blotattiin varten Hes1, Notch1, halkaistut Notch1 tai β-aktiini.