Krooninen sairaus

tiivistelmä

Rabdomyosarkooma on yleisin pehmytkudossarkooman lapsilla ja nuorilla, jolla on korkea uusiutumisen että dramaattisesti vaikuttaa kliiniseen tulokseen. Multiagent kemoterapiaa yhdessä leikkauksen ja /tai sädehoidon, on hoidon valinnan. Kuitenkin relapsimäärä on valitettavan korkea ja tunnistaakseen uusia hoitomenetelmien tarvitaan kiireellisesti. Tämän suhteen valikoiva lohko keskeisiä piirteitä syövän kantasoluja (CSC) erityisen lupaavia. Tässä tutkimuksessa olemme eristetty rhabdomyosarkooma CSC kara kaltaisia ​​piirteitä (korkea ilmentymä Nanog ja Oct3 /4, itseuudistumisen kyky, multipotenttisuus). Rabdomyosarkooma CSC osoitti suurempi invasiivisen kyvyn ja alennettua sytotoksisuutta doksorubisiinille verrattuna alkuperäiseen soluihin, mekanismilla liity klassisen monilääkeresistenttisyyden prosessi. Tämä oli riippuvainen korkeatasoisen lysosomifuusio happamuuden välittyy korkea ilmaus vakuolaarisen ATPaasi (V-ATPaasi). Koska se ei liittynyt muiden pediatristen syöpiin, kuten Ewingin sarkooma ja neuroblastooma, V-ATPaasi suurempi ekspressio CSC oli rhabdomyosarkooma erityisiä. Esto lysosomien happamoitumisen V-ATPaasi-estäjän omepratsolin tai erityisillä siRNA vaiennettu, merkittävästi parannettu doksorubisiini sytotoksisuusmekanismin. Yllättäen, lysosomien kohdistaminen esti myös solujen kasvua ja vähentää invasiivisia potentiaalia rhabdomyosarkooma CSC, jopa hyvin pieninä annoksina omepratsolin (10 ja 50 uM, vastaavasti). Näiden havaintojen perusteella ehdotamme lysosomifuusio happamuus arvokkaana kohteena parantaa kemosensitiivisyys of rhabdomyosarkooma CSC, ja ehdottaa käyttö anti-V-ATPaasi aineita yhdistettynä standardin hoito lupaavana välineenä hävittämiseksi minimaalinen jäljellä taudin tai ehkäisyyn metastaattisen taudin.

Citation: Salerno M, Avnet S, Bonuccelli G, Hosogi S, Granchi D, Baldini N (2014) alentuminen Lysosomaalinen Aktiivisuus hoitomuoto Targeting Cancer Kantasolut sikiön Rabdomyosarkooma Cell Line RD . PLoS ONE 9 (10): e110340. doi: 10,1371 /journal.pone.0110340

Editor: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italia

vastaanotettu: 02 toukokuu 2014; Hyväksytty: 21 syyskuu 2014; Julkaistu: 20 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Salerno et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat FIRB avustus (RBAP10447J ja N. B.) Italian opetusministeriön, korkeakoulujen ja tutkimuksen; Italian Association for Cancer Research (AIRC 11426 ja N.B.); ja Italian Ministry of Health, taloudellinen tukeminen Scientific Research ”5 promillea 2010”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rabdomyosarkooma (RMS) on yleisin kiinteän kasvaimen lapsuudessa, histologisesti jossa eri mallien poikkijuovaisten lihassolujen erilaistumista ja ominaista erittäin aggressiivinen kliininen käytös [1]. Vaikka tulos RMS potilaista on parantunut huomattavasti kahden viime vuosikymmenen ajan käyttöön perustuvat leikkauksen ja /tai sädehoidon yhdistettynä kemoterapia, pahenemisvaiheita esiintyy edelleen 30-40% nonmetastatic potilaista. Lisäksi noin 15% lapsista RMS merkkejä systeemisen sairauden aikaan diagnoosin. Nämä ”korkean riskin” aiheita ovat rajalliset hoitovaihtoehdot ja huono ennuste [2], joten kiireellistä tarvetta tunnistaa uusia hoitoja perustuu perusteellisesti RMS biologiasta.

Yhä useammat todisteet osoittavat, että riittämättömyys nykyisen syöpähoitojen hävittämiseksi minimaalinen jäljellä taudin ja uusiutumisen estämiseksi riippuu osittain niiden kyvyttömyys kohdistaa osajoukko lepotilassa tai matala-lisääntyvien kasvainsoluja, jotka tunnetaan syövän kantasoluja (CSC) [3]. CSC ensin tunnistettu leukemiat [4] ja sen jälkeen kuvattu useissa kiinteiden kasvainten [5], [6], [7], mukaan lukien sarkoomat [8], [9], [10], [11], [12]. On yleisesti hyväksytty, että CSC tehokkaasti aloittaa kasvaimia, näyttö varsi kaltaisia ​​piirteitä, ja vastaavat paikallisia ja systeemisiä uusiutumisen vuoksi välinpitämättömäksi syöpälääkkeiden [3]. Välinen suhde CSC ja minimaalinen jäljellä tauti on raportoitu [13], mikä viittaa vahvasti siihen, että kohdentaminen nämä solut saisivat merkittävän mahdollisuuden parantaa lopputulosta, jossa potilaita hoidettiin tavanomaisilla syöpälääkkeiden. Todellakin, CSC kaltainen solunsalpaajaresistentti elementit on jo todettu myös RMS [14], [15].

Microenvironmental olosuhteet voivat merkittävästi moduloimaan stemness fenotyyppi fysiologisissa olosuhteissa sekä syöpään. Erityisesti CSC kapealla, kasvainsolut reagoivat hypoksia muuntamalla aerobisen hengityksen glykolyysistä, mikä puolestaan ​​tuottaa maitohappoa ja aiheuttaa paikallista asidoosi. Tällaisten erikoinen microenvironmental piirteitä on liittynyt induktioon ja ylläpitoon multipotenttisuus ja stemness [16]. Solunulkoinen asidoosi on siis merkittävä toimija muodostumiseen ja ylläpitoon CSC, koska itsessään pystyy edistämään varsi kaltainen fenotyyppi. On jo tunnettua, että pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien sarkoomat, on tunnusomaista happaman solunulkoisen ympäristöön ja että syöpäsolut sisältävät yleensä huomattavan määrän happamia lysosomeihin. Nämä ominaisuudet ovat sopusoinnussa useita ominaisuuksia maligniteetin, mukaan lukien invasiivisuus ja kestävyys syöpähoitoihin [17]. Itse asiassa kertyminen peruslääkkeitä happamaksi rakkulat tai niiden neutralointi happamoitumisen solunulkoisen ympäristö on tehokas mekanismi chemoresistance ja voi helpottaa kasvaimen invaasio [18], [19]. Tästä syystä CSC käyttäytyminen vaikuttaa biokemiallisten ja biofysikaalisten muuttujien solunulkoisen osaston.

Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli lysosomin happamoitumista, ylläpiti vakuolaarisen (H +) – ATPaasi (V-ATPaasi ) protonipumpun kuin erikoinen mekanismi valikoivaa etua RMS CSC. Osoitimme, että V-ATPaasi on mukana invasiivisuus sekä kemosensitiivisyys näiden solujen, ja että tällaiset piirteet pahanlaatuisuuden voi olla täysin päinvastaiseksi tukos happamointimenetelmässä terapia- annoksia protonipumpun estäjät (PPI), mikä viittaa mahdollinen etu tämän luokan lääkkeitä yhdistelmänä tavanomaisten syöpälääkkeiden tehokkaasti kohdistaa RMS CSC.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

RD (RMS), MG-63 (osteosarcoma ), SK-ES-1, A-673 (Ewingin sarkooma, ES), SH-SY5Y, NB-100, ja CHP-212 (neuroblastooma, NB) solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä viljeltiin IMDM: ssä (Life Technologies), ja 20 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä ja 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (täydellinen alusta). Monilääkeresistenttiä MG-63-solut eristettiin vaiheittain altistuminen kasvavia annoksia doksorubisiinia (DXR). Saatu MG-63-solulinja, joka kasvoi eksponentiaalisesti, kun läsnä oli 100 ng /ml DXR nimettiin moniresistentti variantti MG-63-DXR100. MG-63-DXR100 oli jatkuvasti alttiina 100 ng /ml DXR säilyttää moniresistentti fenotyyppi [20].

Sphere viljelmät

Sphere-muodostavien solujen saatiin kuten aiemmin on kuvattu [12 ]. Lyhyesti, kaikki solut viljeltiin kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa DMEM: F12 -alustassa, jossa progesteronia (20 nM), putresceine (10 mg /ml), natriumseleniittiä (30 nM), apo-transferriini (100 ug /ml), ja insuliinin (25 ug /ml) (Sigma-Aldrich) alhaisen kiinnityksen pulloissa (Nunc). Tuore ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (20 ng /ml) ja emäksinen fibroblastikasvutekijä (10 ng /ml) (PeproTech), lisättiin kaksi kertaa viikossa kunnes solut alkoivat kasvaa muodostaen kelluvan aggregaatteja, nimeltään rhabdospheres. Viljelmät laajennettiin mekaanisella dissosiaatiota sfäärien, jonka jälkeen uudelleen pinnoitus solujen ja jäljellä soluaggregaatteja täydelliseen alustaan. Vain viljelmät pystyvät kasvuun alle spherogenic pesäkkeitä ja näyttämällä kantasolujen liittyviä ominaisuuksia pidettiin. Pallot analysoitiin alla seerumia keski alhaisen kiinnityksen alustoille (ei kiinnittynyt ehto) tai liittyvät ehdon läsnäollessa seerumin riippuen määrityksessä. Kaikki eristetyt palloset tunnettu siitä, että ilmentyminen kantasolujen liittyviä markkereita (Nanog ja Oct3 /4), ja vain RMS CSC, että pallo muodostavat tehokkuutta ja multipotenttisuus.

karakterisointi kantasolujen ominaisuuksia rhabdospheres

palloja muodostavan tehokkuuden aikana peräkkäistä kertaa tutkittiin pinnoite yksi soluja rhabdospheres tiheydellä 2000 solua /ml 48-kuoppalevyllä saada uusia palloja. Kokonaismäärä kasvaimen aloilla laskettiin, ja pallot erottaa saamiseksi toisen ja kolmannen sukupolven aloilla. Arvioida multipotenttisuus, rhabdospheres pidettiin Adherenttiviljelmissä 3 päivää ja sitten ympättiin eri olosuhteissa. Lyhyesti, osteogeenisen erilaistumista, 100000-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä kasvatettiin α-MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 10 mM β-glyserofosfaatti, 10

-8 M deksametasonia ja 50 mg /ml L-askorbiini- happo-2-fosfaattia (Sigma). 14 päivän jälkeen solut kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä, ja mineralisaatio arvioitiin värjäämällä 1% alitsariinipunaisella S (pH 4,2; Sigma-Aldrich). Sillä Adipogeeniset erilaistumista, 100000 solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja niitä kasvatettiin DMEM korkea glukoosi (Lonza), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 0,5 uM deksametasonia, 0,5 mM 3-isobutyyli-1-metyyliksantiini, ja 50 uM indomethacine (Sigma- Aldrich). 17 päivän jälkeen solut kiinnitettiin ja lipidien värjättiin 0,3% Öljy-Red-O. Sillä kondrogeenistä erilaistumista, 500000 soluja sentrifugoitiin 15 ml: n polypropeenia kartiomaiseen putkeen ja niitä inkuboitiin DMEM korkea glukoosi oli täydennetty 10% FBS: ää, 10 mg /ml TGFp 1 (PeproTech), 100 uM L-askorbiinihapon 2-fosfaattia, 6,25 ug /ml insuliinia, 40 ug /ml L-proliinia (Sigma-Aldrich). 3 viikon kuluttua, kohdat johdettu kondrogeenisten pelletit värjättiin Alcian Blue (pH 2,5).

Geenien ilmentyminen

Geenien ilmentyminen arvioitiin sen määrittämiseksi kantasolun liittyviä ominaisuuksia ja edelleen luonnehtia pallosta kulttuureissa . Kokonais-RNA eristettiin RMS, ES, ja NB kelluvia palloja tai natiivi solujen NucleoSpin RNA II (Macherey- Nagel), ja käänteiskopioitiin. MRNA: n ilmentämistä varten Oct3 /4 (NM_002701.4), Nanog (NM_024865.2), MDR1 (AF016535.1), ATPaasi V

0 ° C (NM_001101.2), matriksimetalloproteinaasi (MMP) 9 (NM_004994.2 ), ja CXC kemokiinireseptori-4 (CXCR4) (NM_001008540.1) arvioitiin käyttäen Light Cycler väline (Roche Diagnostics), monistetaan 1 ug cDNA, ja Universal Probe Kirjasto (Roche Applied Science). Koettimet ja alukkeet valittiin käyttämällä web-pohjainen määritys suunnitteluohjelmisto (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com): Oct3 /4-f 5′- CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3′; Oct3 /4-r 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3 ’; Nanog-f 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ’; Nanog-r 5’-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3 ’; MDR1-f 5’-GCCATCAGTCCTGTTCTTGG-3 ’; MDR1-r 5’-GCTTTTGCATACGCTAAGAGTTC-3 ’; ATPaasi V

0C-f 5′-TTCGTTTTTCGCCGTCAT-3 ’; ATPaseV

0c-r 5′-CCACTGGGATGATGGACTTC-3 ’; MMP-9-f 5’-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ’; MMP-9-r 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ’. Tulokset ilmaistiin suhde geeni ja Tata sitova proteiini (TBP, NM_003194.4, TBP-f 5’-TTGGGTTTTCCAGCTAAGTTCT-3 ’; TBP-r 5′-CCAGGAAATAACTCTGGCTCA-3’), kuten viite-geeni mukaan 2

-ΔΔCT menetelmä [21].

Western-blottaus

Western blottaus suoritettiin havaita kantasolujen liittyviä markkereita Oct3 /4 ja Nanog sekä MDR1, ATPaasi-V

0A1 alayksikköä, ja TBP. Kelluva pallo tai natiivin solut lysated kuumalla lyysipuskuria (1% SDS: ää, Tris, pH 7,4 20 mM, 5% β-merkaptoetanoli) analysointia varten Oct3 /4 ja Nanog, tai RIPA-puskuria (Tris, pH 7,6 50 mM, NaCl: a 150 mM, Triton-X-100 5%, natriumdeoksikolaatti 0,25%, EGTA pH 8 1 mM, NaF 1 mM, Sigma), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita (Roche), muiden proteiinien kanssa. Yhtä suuret määrät proteiinia lysaatit altistettiin pelkistävä SDS-PAGE-polyakryyliamidigeelillä, mitä seurasi immunoblottaukselle analyysi. -Blotit, joissa on lampaan anti-Oct3 /4 (Abcam), hiiren anti-Nanog (Abcam), hiiren anti-MDR1 (D-11, Santa Cruz), kanin anti-ATPaasi-V

0A1 (Abcam ) tai kanin anti-TBP (Santa Cruz) referenssinä. Inkubointi piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla ja sen jälkeen. Reaktio paljastui kemiluminesenssimittaus alustan (Pierce ECL Plus Western-blottaus Substrate, Thermo Scientific). Immunoblot-määritykset toistettiin kolme kertaa. Signaali kunkin kaistan kvantifioitiin oma ohjelmisto densitometristä arviointia (VisionWorksLS Analysis Software, Biospectrum, UVP).

Immunofluoresenssikoe

värjäytymisen V-ATPaasi, rhabdospheres annettiin tarttua 24 h täydellisessä väliaineessa ja kiinteän, inkuboitiin sitten anti-V-ATPaasin V

0A1 polyklonaalista vasta-ainetta (Sigma-Aldrich), jota seurasi sekundaarinen anti-kani-vasta-aine, Alexa vihreä 488 nm (Life Technologies). Tarkkailla vesicular lokalisaation V-ATPaasi, aktiinisytoskeletonin oli mukana värjättiin käyttäen 0,5 ug /ml falloidiinia-tetra- B isotiosyanaatti (TRITC) fluoresoiva väri (Sigma). Tumat vastavärjättiin Hoechst 33258 (Sigma), ja solut havaittiin konfokaalimikroskopiaa (Nikon TI-E).

migraatiokokeessa

migraatio kyky rhabdospheres arvioitiin Boyden kammio tekniikka verrattuna RD. Lyhyesti, yksittäisistä soluista, jotka ovat peräisin RD tai rhabdospheres jälkeen trypsinisaatiolla suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja ympättiin ylempään osastoon on Boyden-kammion (8 um huokosia, Euroclone). Alakammioissa sisälsi 10% FBS IMDM väliaineessa kuin chemo-houkutinta. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja sen annettiin kulkeutua 8 tuntia. Solut kiinnitetty yläpintaan suodatinta poistetaan mekaanisesti hankaamalla vanupuikkoja. Chambers värjättiin 0,5% kristalliviolettia laimennettuna 100% metanolia 30 minuutin ajan, huuhdeltiin vedessä ja tutkitaan kirkkaan kentän mikroskopia. Arvot siirtolaisuuden saatiin laskemalla 5 kenttää per kalvo (X20 tavoite) ja edustavat keskiarvoa neljästä itsenäisestä kokeesta.

invaasiomääritys

MMP-aktiivisuus kvantitoitiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, solut rhabdospheres ja RD ympättiin 6-kuoppaisille levyille (300000 solua /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä. 48 tunnin kuluttua solut pestiin ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 400 ul: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) 3 h. PBS otettiin sitten talteen, sentrifugoitiin ja supernatantti käytettiin määrityksessä. Yhtä suuret määrät supernatanttia lisättiin 100 ul: aan gelatiinin sammutusta (DQ liivate, Life Technologies) 96-kuoppalevylle. Tarttuvat solut irrotettiin ja laskettiin. Kun oli kulunut 24 h 37 ° C: ssa, fluoresenssiemissio mitattiin mikrolevylukijalla (Tecan). Tulokset ilmoitettiin prosentteina fluoresenssiemission suhteen soluton supernatantti ja normalisoitu kokonaismäärään soluja. Koe toistettiin kolme kertaa.

Virtaussytometria

Rhabdosphere soluja ja RD hajotettiin trypsiinillä, laskettiin ja värjättiin seuraavasti. Kvantifiointia varten CD133 ilmaisun, solususpensiota inkuboitiin monoklonaalisella CD133 /1 vasta-ainetta (AC133, Miltenyi Biotec) 10 minuutin ajan, jota seurasi 20 min inkubaatio anti-vuohi-vasta-aineen Alexa vihreä 488 nm (Life Technologies) 4 ° C: ssa. Arviointia varten CXCR4 sisällön, solususpensiot värjättiin monoklonaalisella CD184 (CXCR4) -PE (Miltenyi Biotec) 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Värjäyksen jälkeen solut suspendoitiin sitten uudelleen PBS: ään ja analysoitiin Coulter EPICS XL -virtaussytometrillä (Coulter Corporation, Beckman Coulter). Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Drug herkkyys määrityksessä

Rhabdosphere soluja ja RD maljattiin 6-kuoppaisille levyille (200000 /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä. 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin DXR (10, 50, ja 100 ng /ml; Sigma) tai sisplatiinin (5, 10, ja 100 uM, Sigma), ja sen jälkeen vielä 72 h, elinkykyisten solujen lukumäärä arvioitiin Trypan siniväriekskluusio määrityksessä. Prosenttiosuus kasvun inhibitio laskettiin suhteessa käsittelemättömiin soluihin. Lääke puoli vaikuttavan pitoisuuden enimmäismäärästä (EY

50) kunkin solulinjan laskettiin lineaarisen regression menetelmää. Koe toistettiin kahdesti.

DXR oton

Rhabdosphere soluja ja RD ympättiin 8-kuoppaisille lasi chamberslides ja annettiin kiinnittyä. Sitten solut altistettiin DXR (10 ug /ml) 15 minuutin ajan, pestiin, ja sitä havaitaan konfokaalimikroskopialla. Taso ydin- DXR kvantitoitiin vähintään 100 solua yli eri alojen käyttäen NIS-elementit mikroskooppi kuvankäsittelyohjelma (Nikon).

lysosomifuusio happamuus arviointi

Emissiospektri pH-herkän akridiinioranssia (AO) käytettiin mittaamaan pH vaihtelut happamissa soluelimiin [23], [24]. Rhabdosphere solut ja RD ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin tarttua 24 h täydellisessä elatusaineessa. Sitten solut altistettiin AO (1 ug /ml) 10 min, pestiin, ja sitä havaitaan spektrin konfokaalimikroskopialla. Luonnehtia profiilia AO emissiospektreissä, punainen band osuus (R%) sisällä koko emissiospektri laskettiin seuraavasti: R% = 100

I

655 /(

I

655 /

I

530) jossa

I

655 ja

I

530 ovat vihreitä (520-540 nm ) ja punainen (645-665 nm) integroitu päästöjen intensiteettiä, vastaavasti. Keskimääräinen R% laskettiin kaikille happaman soluelimiin 10 soluissa. Koe toistettiin kahdesti.

Sytosoliset pH: n mittausta

Sytosoliset pH (PHC) ja rhabdosphere solujen ja RD mitattiin käyttämällä karboksi-seminaphthorhodafluor-1 (karboksi-SNARF-1) (Molecular Probes ). Solut ympättiin kammioon dioja ja annettiin tarttua 24 h, ja sitten 10 uM karboksi-SNARF-1 lisättiin elatusaineeseen 30 minuuttia. Kammio levyt sijoitettiin lavalla konfokaalimikroskoopilla ja annettiin sopeutua ainakin 20 minuutin ajan ennen PHC mittauksia. Magnetointi lasersäde 514 nm (Arlaser) oli suunnattu näytteeseen kautta S Plan Fluor EL WD 40X objektiivia (Nikon). Tuloksena fluoresenssiemissio kerättiin 644 nm ja 594 nm. Useat kiinnostavat alueet (ROI), jonka halkaisija on 1 pm, sitten satunnaisesti valittu ilman ydin- alueilla. Päästöjen suhde oli kalibroitu käyttäen liuoksia (110 mM KCI, 25 mM KHCO

3, 11 mM glukoosia, 1 mM MgCI

2, 1 mM CaCl

2, 10 mM HEPES) vaihtelevalla pH-tasot ja jotka sisältävät 10pM nigerisiiniä (K + /H + ionofori). Fluoresenssiemissio- suhde (644 nm /594 nm) laskettiin ja käytettiin arvioitaessa PHC kalibrointikäyrästä. Koe toistettiin kolme kertaa.

Growth määrityksissä jälkeen lysosomiin kohdistaminen

heikentää lysosomiin toiminto, rhabdosphere solut ja RD käsiteltiin käyttäen kahta eri strategioita. Ensimmäisen yhden, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (200000 /kuoppa), annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan täydellisessä väliaineessa, ja sitten käsiteltiin AO (0,1, 0,5 ja 1 ug /ml; Sigma), joka selektiivisesti kasaantuu happamaksi lysosomeihin ja vaikuttaa syöpäsolujen kasvua [25]. 72 tunnin jälkeen, määrä elävien solujen arvioitiin eksluusio-määrityksellä. Koe toistettiin kaksi kertaa. Toinen strategia arvioitiin käyttäen PPI omepratsoli (OME), lääke, jonka tiedetään estävän V-ATPaasiaktiivisuutta [26]. Solujen elinkyky OME hoidon määritettiin käyttäen kahta eri määrityksiä. a) epäsuora määritys, rhabdospheres ja RD, tai solut edustaja ES tai NB histotype, ympättiin 96-kuoppalevyille (8000 solua /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä. 24 tunnin kuluttua väliaine vaihdettiin kanssa puskuroimattomalla RPMI, jossa on 10% FBS: ää, ja sitä käsiteltiin 10, 25, 50, ja 100 uM OME (Sigma-Aldrich). 24: n, ainoastaan ​​rabdomyosarkooma soluja, ja 72 h RMS, ES ja NB solujen elinkelpoisuus arvioitiin happaman fosfataasin (AP) määritys. Lyhyesti, solut pestiin ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 100 ul: lla puskuria, joka sisältää 0,1 M natriumasetaattia (pH 5,0), 0,1% Triton X-100, ja 5 mM p-nitrophenil fosfaatti. 3 tunnin kuluttua reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 ui 1 N NaOH: ta, ja värin kehittyminen määritettiin 405 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Tecan) [23]. b) suora määritys, rhabdospheres ja RD ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä. 24 tunnin kuluttua, 50 uM OME lisättiin elatusaineeseen. Kun on kulunut vielä 24 tuntia, elinkykyisten solujen lukumäärä määritettiin eksluusio-määrityksellä. Koe toistettiin kahdesti.

Apoptosis analyysi

Rhabdosphere solujen annettiin kiinnittyä 24 h täydellisessä väliaineessa, ja altistettiin 50 uM OME puskuroimattomassa RPMI, jossa on 10% FBS: ää. Sen jälkeen kun 24 ja 48 tuntia, solut leimattiin Hoechst 33258 ja läsnäolo apoptoottisten kappaleiden havaittiin alle fluoresenssimikroskopian.

Solusyklianalyysiä

Rhabdospheres altistettiin 100 uM OME non kiinnittynyt olosuhteissa pH: ssa 6,8 24 tuntia. DNA-sisällön ja bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen aikana S-vaiheen määritettiin samanaikaisesti analyysi propidiumjodidilla (PI) ja DNA: n kokonaismäärä, ja FITC-konjugoitua anti-BrdU fluoresenssi. Lyhyesti, soluja inkuboitiin 40 uM 5-BrdU (Sigma) 60 min 37 ° C: ssa, pestiin ja sitten 5 x 10

6 yhden solut kiinnitettiin 75% etanolissa 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Osittainen DNA: n denaturointi suoritettiin inkuboimalla soluja HCl: a, minkä jälkeen neutraloidaan Na tetraboraatti. Näytteet inkuboitiin sitten hiiren monoklonaalisella anti-BrdU-FITC-vasta-ainetta (BD Biosciences), pestiin, värjättiin 2,5 ug /ml PI (Sigma-Aldrich), ja analysoitiin. Monoparametric ja biparametric analyysit suoritettiin käyttäen WinMDI 2,7 ohjelmisto. Koe toistettiin kahdesti.

vaikutukset DXR solujen elinkyky OME hoidon

Rhabdosphere solujen anna kiinnittyä 24 h täydellisessä elatusaineessa. Sitten solut, jotka on esikäsitelty 10, 25, 50, ja 100 uM OME puskuroimattomassa RPMI, jossa on 10% FBS: ää. Kun on kulunut vielä 24 tuntia, solut altistettiin 50 ja 25 ng /ml DXR puskuroidussa väliaineessa. Kun on kulunut vielä 48 h, solujen elinkelpoisuus arvioitiin AP määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu. Tiedot ilmoitettiin solujen eloonjäämisen suhteen käsittelemättömiin soluihin (set = 100%). Koe suoritettiin neljänä kappaleena.

DXR otto jälkeen OME hoidon

Rhabdosphere solujen anna kiinnittyä 24 tunnin ajan täydellisessä väliaineessa. Sitten solut esikäsitelty 10 ja 20 uM OME puskuroimattomassa RPMI ja 0,1% FBS: ssa 1 h, ja sitten altistettiin 5 ug /ml DXR 15 min. Taso ydin- DXR kvantitoitiin vähintään 100 solua yli eri alojen, kuten aiemmin on kuvattu, ja verrattuna käsittelemättömien solujen. Koe toistettiin kahdesti.

siRNA transfektion

Erityiset geenien vaikutus saatiin siRNA liittyvän teknologian pipetillä-tyypin elektroporaatio. Lyhyesti, rhabdosphere solut trypsinoitiin ja 100 ui solususpensiota, joka sisälsi 2 miljoonaa solua ja 1,6 nmol spesifisten siRNA (ON-TARGETplus Human ATP6V0C siRNA Smart allas, Dharmacon, Thermo Scientific) tai ohjaamaan siRNA (siRNA ctr, ON-TARGETplus Ei- kohdistaminen Ohjaus Pool, Dharmacon) tai vesi (ei siRNA) siirrettiin 1 mm kyvettiin (Neon Transfektiosysteemi, Life Technologies). Elektroporaatiolla-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille (500000 solua /kuoppa) ja RNA: n eristys ja 96-kuoppaisen levyn kasvun määrityksessä (15000 solua /kuoppa). 24 tunnin kuluttua, vähentää mRNA-tasolla että V

0c ATPaasi varmistettiin Real Time PCR, kuten aiemmin on kuvattu. Kasvun määrityksessä, solut altistettiin 25 ng /ml DXR puskuroidussa väliaineessa ja inkuboitiin vielä 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin AP epäsuoraa määritystä, kuten aiemmin on kuvattu. Tulokset ilmoitetaan prosentteina solujen eloonjäämistä

vs.

kontrollisoluja (ei siRNA). Koe toistettiin kahdesti.

inhibitio rhabdosphere solumigraation OME

Rhabdospheres hajotettiin ja ympättiin 6-kuoppaisille levyille anna kiinnittyä 24 h täydellisessä elatusaineessa. Arvioida siirtymisen kyky, sitten solut esikäsitellään 50 uM OME puskuroimattomassa RPMI, jossa on 10% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua, elävät solut laskettiin ja sitten yhtä suuri määrä käsittelemätöntä tai OME-käsitellyt solut ympättiin ylempään osastoon Boyden kammion, kuten aiemmin on kuvattu. Koe toistettiin kahdesti.

inhibitio rhabdosphere solun invasiivisen mahdollisia OME

arvioimiseksi invasiivisia mahdollisia, rhabdosphere solut anna kiinnittyä 24 h täydellisessä väliaineessa, ja sitten esikäsitelty 50 uM OME puskuroimattomassa RPMI ja 0,1% FBS: ssa 3 tuntia. Vapauttamista MMP supernatantissa kvantitoitiin gelatiinia sammutusta määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu, ja normalisoitu kokonaismäärään elävien solujen. Arvioidaan vaikutus CXCR4 ilmentävä populaatio, rhabdospheres ympättiin palloja muodostavan kunnossa pH 6,8 ja esikäsitelty 100 uM OME. 48 tunnin kuluttua solut altistettiin elinkelpoisia laskenta ja CXCR4-positiivisten fraktio väestön elävien solujen (valittu eteenpäin ja sivulle sironnan parametrit) arvioitiin virtaussytometrillä, kuten aiemmin on kuvattu. Kokeet toistettiin kahdesti.

Tilastollinen

Koska pieni määrä havaintoja, tietojen ei katsottu normaalisti jakautunut. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SE. Tilastollinen analyysi suoritettiin StatView 5.0.1 ohjelmiston (SAS Institute Inc., Cary, NC). Paramerinen U-testi käytettiin ja p 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Rhabdosphere muodostumista ja rikastumista

2-3 viikon kulttuurin kasvutekijän suhteen väkevöityä seerumipuutteinen väliaineessa, RD-solut muodostivat viljelmät koostuvat kelluva soluaggregaatteja, ns rhabdospheres, että voitaisiin vahvistaa entisestään

vitro

(kuvio 1A). Arvioida kykyä rhabdosphere solujen aloittaa itseuudistumisen, pallojen lukumäärä on muodostettu kolmen peräkkäistä kertaa kullakin kanavan määritettiin. Pallojen lukumäärä saadaan kolmannen sukupolven oli huomattavasti suurempi, mikä osoittaa, että rhabdospheres voidaan sarjoittain rikastaa (kuvio 1 B; p = 0,0495

vs

passage 1).

(A) Faasikontrasti- kuvat of rhabdospheres johdettu RD kasvatettu kiinnittymisestä riippumaton ehto, seerumin puutteessa, jota oli täydennetty bFGF ja EGF. Edustavia kuva, asteikko bar 100 mikrometriä. (B) Sphere muodostavaa tehokkuutta rhabdospheres kolmen sarja kohtia. Kaavio osoittaa määrän perus-, keski- (syntyvät dissosioituneissa ensisijainen aloilla), ja kolmannen asteen (syntyvät dissosioituneissa toissijainen pallojen) aloilla vuodesta 2000 soluista. * P 0,05

vs

ensisijainen aloilla. (C) mRNA-tasot kantasolujen merkkiaineiden Oct3 /4 ja Nanog in rhabdospheres verrattuna natiivi RD Real Time PCR. * P 0,05. (D) Western blotting for Oct3 /4 ja Nanog in rhabdospheres verrattuna RD natiivi soluihin (vasen, edustavat kuvat) ja densitometrinen analyysi (oikealla; * p 0,05). (E) eriyttäminen määrityksissä rhabdospheres inkuboinnin jälkeen sopivilla erottaa ärsykkeitä. Vasen: osteogeeninen erilaistuminen arvioitiin Alizarin Red S värjäys, Mittakaavapalkki 100 mikrometriä; keskimmäinen: adipogeenisen erilaistumisen arvioitiin Oil-Red-O lipidejä värjäys, Mittakaavapalkki 10 mikrometriä; oikea: kondrogeenistä erilaistumista arvioitiin Alcian Blue värjäys, Mittakaavapalkki 50 pm. Kuvat ovat. (F) TranswellTM kemotaksiamäärityksessä of rhabdospheres

vs

native RD. Kaavio näyttää kuinka monen solujen viisi X20 aloilla kuluttua 8 h. * P 0,05. (G) mRNA-tasot MMP-9 vuonna rhabdospheres

vs

native RD Real Time PCR. * P 0,05. (H) MMP toimintaa supernatantissa rhabdospheres

vs

RD natiivi soluissa gelatiinia sammutusta määrityksessä. * P 0,05. (I) mRNA-tasot CXCR4 rhabdospheres verrattuna natiivi RD Real Time PCR. * P 0,05. (L) sy- tofluorimetrisillä analyysi CXCR4-positiivisten solujen fraktion rhabdospheres ja natiivi RD. Edustavia intensiteetti tontteja rhabdospheres ja natiivi RD (vasemmalla) ja prosenttiosuus CXCR4-positiivisten solujen (oikealla). ** P 0,001.

Stemness ominaisuuksia rhabdospheres

arvioimiseksi kantasolujen liittyvät ominaisuudet rhabdospheres, ilmentymisen taso kahden stemness markkereita, transkriptiofaktoreiden Oct3 /4 ja Nanog, arvioitiin ja verrattiin natiivin RD soluihin. Transkription sekä geenien yläreguloituja rhabdospheres (kuvio 1C). Erityisesti havaitsimme huomattava lisäys Nanog mRNA ja suuntaus kasvaa, vaikka ei merkittävää, sillä Oct3 /4 (kuvio 1 C; p = 0,0283). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin Nanog proteiinin Western blot-analyysi, jonka havaitsimme heikko mutta merkittävä lisäys palloja (kuvio 1D; p = 0,0495), kun taas emme löytäneet eroa Oct3 /4. Erityisesti olemme myös havainneet, että CD133 ei liittynyt varsi kaltainen fenotyyppi (45,9 ± 3,4% RMS CSC

vs

43,8 ± 1,8% ja RD, tässä järjestyksessä). Lopuksi osoitti kantasolujen plastisuus rhabdospheres niiden kyky erilaistua kolmeen mesenkymaaliset suvusta, kuten on osoitettu alitsariinipunaisella S (osteogenesis), öljy-Red-O (adipogeneesin), ja Alcian Blue (kondrogeneesin) värjäytymistä (kuvio 1 E) .

Tehostettu maahanmuutto- ja hyökkäys ominaisuudet rhabdospheres

määrä rhabdosphere soluja, jotka vaelsivat läpi Boyden jaosto oli huomattavasti suurempi kuin RD (kuvio 1 F; p = 0,0162). Rhabdosphere solut osoittivat myös merkitty

in vitro

soluväliaineen hajoamista potentiaali verrattuna natiivi RD, mikä näkyy säätelyä MMP-9 mRNA (kuva 1 G; p = 0,0495), ja jonka korkeamman liivate hajoamisen aktiivisuuden erittyy MMP-9 (kuvio 1 H; p = 0,0368). Lisäksi, rhabdospheres ilmaisi erittäin korkea solun pinnan reseptoriin CXCR4, kuten on osoitettu Real Time PCR: llä (kuvio 1 I; p = 0,0495) ja virtaussytometria (kuvio 1 litra; p = 0,0027). Tämä kemokiinireseptori välittää kasvainsolujen vaeltamista kohti ligandia ilmentävien kudosten [27].

Vähentynyt herkkyys DXR kautta MDR1-riippumaton mekanismi rhabdospheres

arvioimiseksi chemoresistance RMS CSC, rhabdospheres ja native RD altistettiin yhä sisplatiinin tai DXR. Mitä elinkelpoisuuden eston sekä solupopulaatioiden osoitti samaa kaavaa vastauksena sisplatiinin (kuvio 2A, EY

50-arvot: 18,7 uM palloja ja 14,6 pM RD). Toisaalta, toisin kuin natiivi RD, RMS CSC oli huomattavasti alemman kasvun estämistä vastauksena DXR (kuvio 2B; p = 0,018 10 ng /ml, p = 0,0209 50 ng /ml, ja p = 0,0202 100 ng /ml). EY

50-arvo oli 4,5-kertainen varten rhabdospheres kuin RD (79,5 ng /ml ja 17,6 ng /ml, tässä järjestyksessä). * P 0,05. * P 0,05. * P 0,05. * P 0,05. * P 0,05.