Krooninen sairaus

tiivistelmä

keuhkosyövässä ilmaista kolinergisiin autokriinisen silmukka, joka helpottaa etenemistä syöpä solut. Antagonistien mAChRs on osoitettu alentaa kasvua pienisoluiset keuhkosyövät (SCLCs). Tässä tutkimuksessa tarkoitus tutkia kasvua estävää vaikutusta R2HBJJ, uusi muskariiniantagonisti, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin ja mahdollisia mekanismeja. Kompetitiivinen sitoutumismääritys paljasti, että R2HBJJ oli suuri affiniteetti M3 ja M1 AChRs. R2HBJJ esitteli voimakas antikolinerginen aktiivisuus karbakolikloridin aiheuttama supistuminen marsun henkitorvi. R2HBJJ merkittävästi tukahdutti kasvua NSCLC-solujen, kuten H1299, H460 ja H157. Vuonna H1299-soluissa, sekä R2HBJJ ja johtavaa yhdistettä R2-PHC näkyvissä merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta M3 reseptoriantagonisti darifenasiinia. Eksogeeninen Replenish ACh voisi lieventää R2HBJJ aiheuttama kasvun esto. Hiljentäminen M3-reseptori tai chat erityisillä-siRNA johti kasvun eston 55,5% ja 37,9% vähemmän H1299 soluista 96 tunnin kuluttua transfektion, vastaavasti. Lisätutkimukset paljastivat, että hoito R2HBJJ pidätettiin solusyklin G0 /G1 alas-säätely sykliini D1-CDK4 /6-Rb. Siksi nykyinen tutkimus osoittaa, että NSCLC-solut ilmentävät autokriini ja paracrine kolinerginen järjestelmä, joka stimuloi NSCLC-solujen. R2HBJJ, uutena mAChRs antagonisti, voi estää paikallista kolinergisen silmukka vastavaikuttamalla pääasiassa M3-reseptoreihin ja estää NSCLC solujen kasvua, jotka viittaavat siihen, että M3-reseptorin antagonisti saattaisi olla mahdollinen kemoterapiakäytäntöä varten NSCLC.

Citation: Hua N Wei X, Liu X, Ma X, hän X, Zhuo R, et al. (2012) romaani muskariiniantagonisti R2HBJJ Estää ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Growth ja Pidätykset solusyklin G0 /G1. PLoS ONE 7 (12): e53170. doi: 10,1371 /journal.pone.0053170

Editor: Michihiko Kuwano, Kyushu University, Japani

vastaanotettu: 14 elokuu 2012; Hyväksytty: 26 marraskuu 2012; Julkaistu: 28 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Hua et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuolleisuus kaikkialla maailmassa ja tapausten määrä ja kuolemantapauksia liittyvä keuhkosyöpä on kasvussa monissa osissa maailmaa. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on lähes 80% kaikista keuhkosyöpää. Huolimatta aggressiivinen ponnisteluja, hoidot eivät ole tyydyttäviä ja eloonjäämisluvut pysyvät synkkä ( 20%) [1]. Siksi edelleen ymmärrystä biologian NSCLC ja kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja keuhkosyövän hoitoon tarvitaan.

Asetyylikoliinia (ACh) on tärkeä välittäjäaine keskus- ja ääreishermoston ja pelaa keskeinen rooli oppimisen, muistin, autonomisen säätelyn, ja lihasten supistuminen aktivaation kautta asetyylikoliinin reseptorien (AChRs), mukaan lukien muskariini (mAChRs) ja nikotiinireseptoreihin (nAChr). Viime aikoina on havaittu, että ACh on myös laajalti syntetisoida erilaisia ​​ei-hermosolujen tyypit, mukaan lukien hengitysteiden epiteelisolujen [2], keuhkojen keuhkopussin [3], pienten ja paksusuoli, sappirakko, keratinosyytit [4], glia [5], verisuonten endoteelin [6] ja yleisin syöpäsolujen, kuten ei-pienisoluista keuhkosyöpää, pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC), paksusuolen syöpä, glial ja munasarjasyövät [7]. Laajalle levinnyt ilmentyminen kuin hermosolun asetyylikoliinin mukana arjen läsnäolo koliiniasetyylitransferaa- (chat), koliiniesteraasin ja reseptorit (nAChr, mAChRs). Vaikka ensisijainen tehtävä selvitetty puutteellisesti, ei-neuronaalinen asetyylikoliinin näyttää olevan osallisena säätelyssä tärkeitä solun toimintoja, kuten mitoosia, trofia toiminto, automaattisuus, liikkumiskyky, Värekarvatoiminnan aktiivisuutta, solu-solu yhteyttä, solun tukirangan sekä este ja immuunijärjestelmän toiminnot [7] – [9]. Siksi ei-hermosolujen kolinergisen järjestelmän ja asetyylikoliinin, joka toimii paikallisena autokriinisella ja paracrine hormoni, pitäisi syrjiä päässä hermosolujen kolinergisen järjestelmän ja hermosolujen asetyylikoliinin.

Samalla tavalla kuin neuronaalinen ACh stimuloi solujen kasvua joko muskariini kolinergisiin tai nikotiinikolinergisia reittejä. On raportoitu, että kasvainsolujen kasvua nopeutettiin aktivoimalla mAChRs paksusuolen [10], keuhkosyöpä [11] – [12], glia [13], ja eturauhasen [14]. Munasarjakarsinoomissa, ilmaus mAChR korreloi huonoon ennusteeseen [15]. Song

et ai

raportoitu, että keskeytys autokriinisiä muskariinikolinergiset signalointia M3-reseptorin antagonistin 1,1-dimetyyli-4-diphenylacetoxypiperidinium jodidia (4-DAMP) tai darifenasiinia on kyky estää SCLC solujen kasvua sekä

vuonna vitro

ja

in vivo

[16]. Lisäksi monet tutkijat ovat osoittaneet, että aktivaatio nAChr nikotiinin tai sen syöpää aiheuttavaksi johdannaisen 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanonia (NNK) stimuloivat kasvainsolujen kasvua rintojen [17], keuhko [18 ], keuhkopussin mesoteliooma [19], paksusuolen [20], virtsarakon [21] ja kohdunkaulan syöpä [22]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että a7 on tärkein nAChR alayksikköä joka välittää proliferatiiviset vaikutukset nikotiinin syöpäsoluja.

Penehyclidine hydrokloridi (PHC) on antikolinerginen lääke johdettu Hyoskyamiini ja kehittänyt itsenäisesti meidän instituutti. Koska mahdollisten antikolinergisten toimintaa, se on markkinoitu akuutin organofosfori- torjunta myrkytys ja keuhkoahtaumatauti (COPD) [23] – [24]. PHC on raseeminen yhdiste, jossa on kaksi kiraalista keskusta, jotka muodostavat neljä optista isomeeriä (Fig. 1). Meidän edellinen työ osoitti, että isomeeri R, R’-konfiguraatio (R 2-PHC) näyttää korkeimman antikolinerginen vaikutus. Vähentää sivuvaikutuksia painamalla pääsyn keskushermostoon, uusi antikolinerginen aine (R2HBJJ) on suunnitellut käyttöön kvaternaarista ammoniumsuolaa ryhmä R2-PHC molekyyli hoitoon perifeeristen sairauksien, kuten keuhkosyövässä ja keuhkoahtaumatauti. Esillä olevassa tutkimuksessa, valikoivuuden R2HBJJ M1-M5 reseptorien arvioidaan yksityiskohtaisesti ja antituumorivaikutuksen R2HBJJ on NSCLC solulinjoissa

in vitro

ja sen mahdollisia mekanismeja tutkitaan. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus vaikutuksen tutkimiseksi M3 antagonisti NSCLC soluissa.

Tulokset

R2HBJJ näkyy korkeampi selektiivinen affiniteetti M

3 ja M

1-reseptorin alatyyppejä

saturaatiositoutumisella analyysi tuotti affiniteettisitoutumista vakio (K

D) arvot [

3H] NMS ihmisen M1, M2, M3, M4 ja M5 0,29 ± 0,04, 0,81 ± 0,17, 0,53 ± 0,09, 0,19 ± 0,03, ja 0,48 ± 0,13 nM, vastaavasti. Suhteellinen selektiivisyys M1-M5 AChR alatyyppejä R2HBJJ ensin määritettiin tasolla reseptorin sitoutumisaffiniteetti ihmisen mAChRs proteiineja (Fig. 2). Arvot IC

50 ja K

i R2HBJJ estämällä [

3H] NMS sitoutumisen M1-M5-reseptorin alatyypit yhteenveto taulukossa 1. R2HBJJ osoitti suhteellisen korkea affiniteetti M3 ja M1-reseptori kuin M2 reseptoriin. Sijoitus affiniteetti R2HBJJ viidelle eri mAChRs oli M3 M1 M4 M5 M2.

mAChRs proteiineja inkuboitiin [

3H] -NMS 37 ° C: ssa 2 tuntia poissa ja n kasvavien konsentraatioiden läsnäollessa ja R2HBJJ. Data edustaa keskiarvoja ± SEM kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kahtena kappaleena.

R2HBJJ esti karbakolin aiheuttama henkitorven supistumista

määrittämiseksi estovaikutus R2HBJJ on mAChR, joka on ex vivo -mallissa marsun henkitorven supistuminen sovellettiin. Supistuminen henkitorven nauhan eristettiin marsun indusoitiin 1 uM karbakolia, ei-selektiivinen muskariini-agonisti. Ja sitten, kasvavien pitoisuuksien R2HBJJ (10

-10-10

-6,5 M) tai atropiinia verrokkina antagonisti, lisättiin kumulatiivisesti osaksi organbadet. Inhiboiva pitoisuus vastaan ​​karbakolikloridin aiheuttama supistuminen saatiin. Tulokset osoittivat, että R2HBJJ pitoisuudesta riippuvalla esti supistusvasteet marsun Henkitorviin on karbakolin (Fig. 3). 50%: n inhibition konsentraatio (IC

50) oli 7,58 ± 1,05 nM, joka oli tilastollinen merkittävästi vähemmän kuin atropiinilla (10,21 ± 1,04 nM,

P

0,05). Tiedot paljastivat, että R2HBJJ osoitti voimakasta antagonistista aktiivisuutta mAChRs ilmaistu marsun henkitorvi.

Karbakolikloridilla (1 uM) käytettiin indusoimaan supistuvien vastaus. Tämän jälkeen konsentraatiot R2HBJJ tai atropiinin lisättiin kumulatiivisesti suoraan elinhauteeseen ja estävä pitoisuus vasteita karbakolin aiheuttama supistuminen saatiin. Arvot ilmaistiin prosentteina suurimmasta supistuvien vasteen puuttuessa antagonisti. Jokainen piste edustaa keskiarvo ± SD viiden itsenäisen kokeen.

NSCLC solulinjat ilmensivät kolinergisiin reseptoreihin ja koliiniasetyylitransferaa-

Jos kolinerginen autokriinisen silmukka on toiminnallinen NSCLC, sitten solut on ilmaistava koliiniasetyylitransferaa- (chat), mAChRs ja /tai nAChr varten ACh tarjota autokriinisten kolinergisen stimulaation NSCLC solujen kasvua. Sen määrittämiseksi, ovatko NSCLC solulinjat ilmentävät AChRs ja Chat, mRNA: t viisi alatyyppiä mAChRs (M1-M5), kolme alatyyppiä nAChr (α7, α9 ja α10) ja chat tutkittiin RT-PCR: llä ihmisen NSCLC solulinjoissa H1299, H157, H460, A549 ja ihmisen kuolemattomaksi keuhkoputkien epiteelisolujen BEP2D. Kuten on esitetty kuviossa. 4, M1, M2, M5, α7, α9, α10 reseptorin alatyyppejä ja chat olivat lähes ilmaistu kaikissa NSCLC solujen testattu. M3 alatyyppiä ilmentyi H1299, H157and H460, ja oli poissa A549. M4-reseptorin alatyyppi ilmaistiin H1299 ja H157, mutta ei H460 ja A549. Sen sijaan ihmisen kuolemattomaksi keuhkoputkien epiteelisolujen BEP2D ilmaisi mRNA eri AChRs alatyyppien alemmilla tasoilla, paitsi α10 alatyypin ja chat. Tulokset merkitsevät asetyylikoliinin autokriinistä silmukkaa olemassa NSCLC-soluja.

RT-PCR suoritettiin kokonais-RNA: valmistettiin ilmoitetun solulinjat. Alukkeet esitetään taulukossa 3. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

R2HBJJ estivät NSCLC soluproliferaatiota in vitro

vaikutuksen arvioimiseksi R2HBJJ solujen kasvuun NSCLCs solut käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla R2HBJJ (1,6-100 uM) 72 h, ja solujen elinkyky määritettiin käyttämällä sulforodamiini B (SRB) määritys. Tulokset osoittivat, että hoito R2HBJJ merkittävästi tukahdutti solukasvun pitoisuudesta riippuvainen tavalla H1299, H460 ja H157-soluissa, joissa on 50% kasvua estävä pitoisuus (GI

50) 8,5, 8,8 ja 28,5 uM. Vertailun, A549 ja BEP2D solut olivat resistenttejä R2HBJJ, jossa GI

50 yli 100 uM, korkein testattu pitoisuus (kuvio. 5A). Data viittasi siihen, että anti-proliferatiivista vaikutusta R2HBJJ oli riippuvainen ominaisuuksista solulinjojen eikä ei-selektiivinen sytotoksisuus.

Effects of R2HBJJ ihmisen NSCLC solulinjoissa ja ihmisen kuolemattomaksi keuhkoputkien epiteelisolujen BEP2D (A ) ja vaikutukset mAChR ja nAChR antagonisteina H1299 solulinjoissa (B ja C, vastaavasti). Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla R2HBJJ tai kolinergisen reseptorin antagonistit 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin SRB-määrityksellä. Solut käsiteltiin liuottimella (DMSO) käytettiin kontrollina, jossa kannattavuus asetettu 100%. Kukin datapiste edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Lisäksi vaikutukset muiden mAChRs (Fig. 5B) ja nAChr (Fig. 5c) antagonisteina H1299 havaittu. Kuten on esitetty kuviossa. 5B ja 5C, tunnetut selektiiviset M3 mAChR antagonisteja darifenasiinille esti merkittävästi H1299 soluproliferaation pitoisuudesta riippuvalla tavalla, kun taas ei-selektiivinen mAChR antagonisti atropiini, ei-selektiivinen nAChR nisti mekamyyliamiinia, selektiivinen M1 mAChR antagonisti pirentsepiini, selektiivinen α4β2 /α4β4 antagonisti DhβE, ja selektiivinen α7 antagonisti α-bgt ei ollut ilmeisiä vaikutuksia soluproliferaatioon. M2 /M4-selektiivinen antagonisti AF-DX116 oli myös Solujen proliferaation estyminen korkeimmalla testatulla pitoisuudella. Vertailun vuoksi R2HBJJ ja sen lähtöaineena yhdistettä R2-PHC ehkäisi merkittävästi H1299 soluproliferaation pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, mikä inhibitiotehoa oli noin 3,7 kertaa suurempi kuin darifenasiinin, paras joukossa antagonistien testattu edellä. Koska ei ole eksogeeninen AChR agonisti on sovellettu, tiedot osoittivat, että endogeeninen ACh toimi autokriinikasvutekijänä signalointi ihmisen NSCLC-solujen, osittain aktivoimalla M3-reseptori.

Eksogeeninen AChR agonisti heikennettyjä R2HBJJ aiheuttama kasvun esto

Voit selvittää korrelaatio kolinergisiin signaalien kulkureiteillä ja R2HBJJ aiheuttama kasvun estäminen, eksogeeninen AChR agonistia ACh käytettiin. Vaikutukset ACh kasvuun H1299 ja R2HBJJ aiheuttama kasvun estämistä ei havaittu. Todettiin, että eksogeeninen ACh yksin 1, 10, ja 100 uM 72 tuntia ei ole ollut merkittävää vaikutusta H1299 solujen kasvuun (taulukko 2). R2HBJJ yksin 10 pM ja 20 pM vähensi solujen elinkelpoisuuden 100 ± 1,61%: sta 54,13 ± 3,89% ja 23,23 ± 2,14% (n = 3), vastaavasti. Kun ACh annettiin ennen R2HBJJ hoitoon, kasvun esto indusoi R2HBJJ (sekä 10 ja 20 uM) atttenuated läsnä eksogeenisen ACh pitoisuutena riippuvaisella tavalla. Kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) osoitti siginificant vaikutus R2HBJJ hoidon, ACh hoitoa, ja R2HBJJ hoito × ACh hoidon vuorovaikutusta (

P

0,0001, vastaavasti). Post-hoc testit vahvistivat, että esikäsittelyn jälkeen pitoisuudet ACh, 10 uM ja 100 uM, vaimensi merkittävästi kasvun esto indusoi 10 uM tai 20 uM R2HBJJ. Kun verrataan R2HBJJ hoito yksinään tasolla 10 uM, 10 uM ja 100 uM ACh esikäsittelyn kasvatti solujen elinkykyä alkaen 54.13 ± 3,89%: sta 82,29 ± 5,82% (

P

0,01) ja 91,1 ± 3,65% (

P

0,01), tässä järjestyksessä. Kun verrataan R2HBJJ hoito yksinään tasolla 20 uM, 10 uM ja 100 uM ACh esikäsittelyn kasvatti solujen elinkykyä alkaen 23.23 ± 2,14%: sta 35,57 ± 4,48% (

P

0,05) ja 58,55 ± 2,83% (

P

0,01), (taulukko 2).

M3- ja chat erityisiä siRNA vähentynyt syöpäsolujen lisääntymistä

osoittavat lisäksi, että endogeenisen ACh ja M3-reseptori signaali olivat mukana solujen lisääntymisen ihmisen NSCLC-solujen, H1299 solut transfektoitiin M3- tai chat-erityisiä siRNA: t ja niiden leviäminen havaittiin ajan. Ensinnäkin, western blot-analyysiä käytettiin tunnistamaan määriä näitä geenejä. Kuten on esitetty kuviossa. 6A ja 6B, M3 ja chat-proteiinin tasot olivat voimakkaasti vähentynyt 72 h kuluttua transfektion kohdistamista siRNA verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA. Käyttämällä SRB kokeessa 96-kuoppalevylle, teho kasvun aiheuttama esto hiljentäminen M3 tai chat testattiin 48, 72 ja 96 tunnin kuluttua transfektion. Tulos osoitti, että oli ajasta riippuva vähennys solujen kasvun elinkelpoisuuden M3- tai chat-siRNA H1299 soluissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA (Fig. 6C). Antiproliferatiivista vaikutusta hiljentäminen M3 tehtiin näkyväksi ilmeisesti alussa 48 h transfektion jälkeen (

P

0,01) ja inhibitio 55,5% saavutettiin 96 tunnin ajanjakson aikana (

P

0,001). Chat-siRNA, sen antiproliferatiivinen vaikutus esiteltiin 72 h transfektion jälkeen (

P

0,001), mikä oli hitaampi kuin M3 siRNA; ja esto 37,9% saavutettiin 96 tunnin kuluttua transfektion verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA (Fig. 6C,

P

0,001).

Down-regulation M3 ja chat-proteiini oli havaitaan western blot 72 tuntia transfektion jälkeen 200 nM siRNA: iden (A ja B). Soluja inkuboitiin kun läsnä oli 200 nM siRNA: ssa 48, 72 ja 96 h, jonka jälkeen solujen kasvua elinkyky määritettiin käyttämällä SRB-määritys ja sitä verrataan mock-ohjaus.

**

P

0,01,

***

P

0,001, verrattuna negatiivisen kontrollin siRNA transfektoiduissa soluissa samanaikaisesti piste (C). Seuraavat M3 tai negatiivinen siRNA transfektion jälkeen solut käsiteltiin tai ei R2HBJJ (8 uM ja 16 uM) 72 tuntia ja yhdistelmä vaikutus M3 siRNA pudotus ja R2HBJJ hoitoa solujen kasvuun tutkittiin käyttämällä SRB-määritystä.

#

P

0,05,

##

P

0,01 verrattuna negatiivinen siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin liuottimella. (D). Kukin datapiste edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

edelleen arvioida, onko anti-proliferatiivista vaikutusta R2HBJJ oli M3-reseptori erityisiä, H1299-soluja käsiteltiin R2HBJJ jälkeen M3 siRNA transfektion. Tulos osoitti, että negatiiviset siRNA käsitellyissä soluissa, R2HBJJ osoittivat merkittävää solujen kasvun esto, solujen elävyys oli 83,5% (

P

0,05) ja 57,4% (

P

0,01) jälkeen R2HBJJ 8 uM ja 16 uM käsittelyä. Kuitenkin, kun solut käsiteltiin M3 siRNA, solujen elävyys estyi 54,4%; R2HBJJ (8 uM ja 16 uM) ei vielä vaikuta solujen kasvua, mikä viittasi siihen, että hiljentäminen M3-reseptori vailla solujen herkkyys R2HBJJ ja korostetut roolia M3 vaikutuksesta R2HBJJ (Fig. 6D).

R2HBJJ pidätettiin solusyklin G0 /G1 vaihe

tutkia mahdollisuuksia mekanismeja R2HBJJ-indusoivat solukuoleman NSCLC soluissa, vaikutukset R2HBJJ solusyklin etenemisen havaittiin käyttämällä virtaussytometrianalyysin. Tulokset H1299 soluista osoitti, että osuus G0 /G1 faasi kasvoi 40,35%: sta 76,60%, ja että S-vaiheessa väheni 46,14% ja 15,93%, käsittelyn jälkeen 20 uM R2HBJJ 72 h (Fig. 7A). Lisäksi H1299 solut käsiteltiin erilaisia ​​R2HBJJ (2,5-20 uM) 48 tunnin ajan myös näytteillä merkittävä pidätys G0 /G1 vaiheeseen, jossa korotusprosenttiin välillä 39.60%: sta 70,01% (Fig. 7B). Lisäksi samankaltainen tulos saatiin H157 solulinjassa, jossa prosentuaalinen korotus G0 /G1 faasi 55.04%: sta 65,46% yli pitoisuus (Fig. 7C). Tulokset osoittivat, että R2HBJJ merkittävästi tukahdutti solun mitoosi etenemisen ajasta riippuvia ja pitoisuudesta riippuva tapojen kautta pidätti solut G0 /G1 vaiheeseen ja vähentää DNA-synteesiin.

Solut synkronoidaan 1% FBS: ssa 24 tuntia . Tämän jälkeen solut vapautetaan täydellisessä väliaineessa (10% FBS: ää), joka sisälsi 20 uM R2HBJJ 24, 48, 72 h (A, H1299-solut) tai eri pitoisuuksia R2HBJJ (2,5-20 uM) ja 48 h (B, H1299 solujen C, H157-solut). Solut, jotka käsitelty liuotinta (DMSO) käytettiin kontrollina. Solusyklin jakautuminen määritettiin käyttämällä virtaussytometria-analyysiä. Histogrammit näkyvät tässä edustivat kolme koetta.

R2HBJJ alassäädetty tasot solusykliä säätelevien proteiinien ja Rb fosforylaatio

Cell cycle siirtymistä G1: stä S pääasiassa aktivoidaan kaksi erilaista kinaasia komposiitit: sykliini D1 /CDK4: n, 6, ja sykliini E, A /CDK2. Rb on ensisijainen substraatti sykliini D-riippuvaisen kinaasin ja sillä on keskeinen rooli verkostossa solukierron säätelyssä. Tutkia taustalla molekyylitason mekanismeja G0 /G1 pidätyksen aiheuttama R2HBJJ, ajasta riippuvia muutoksia useita toisiinsa liittyviä solusyklin säätelymolekyyleja arvioitiin hoidon jälkeen 20 uM R2HBJJ in H1299-soluissa käyttäen western blot -analyysiä. Kuten on esitetty kuviossa. 8A, hoito R2HBJJ aiheuttama dramaattinen alas-säätely sykliini D1, CDK4 ja CDK6 proteiineja aikariippuvainen, kun taas taso sykliini E ja CDK2 pysyivät pohjimmiltaan muuttumattomina samana ajanjaksona. Lisäksi, fosforylaatio Rb (erityisesti Ser

807/811) pieneni aikariippuvainen. Lasku Rb fosforyloitiin asemaan Ser

807/811 tapahtui jo 3 tuntia käsittelyn jälkeen ennen ilmeinen solujen elinkelpoisuuden muutosta. Sitä vastoin ilmaus pohjapinta Rb osoitti merkittävää jatkuva kasvu ja sitten nopeasti laski alle havaittavan tason 48 h käsittelyn jälkeen, kun solun kasvua vaimentava on indusoitu (tuloksia ei ole esitetty), mikä saattaa viitata siihen mahdollisesti solujen sopeutuminen laskua fosforyloitua Rb jälkeen R2HBJJ hoidon. Edelleen arvioimme pitoisuus vaste Rb fosforylaation vähennetään hoidon jälkeen R2HBJJ 48 tuntia (Fig. 8B). Tulos osoitti, että lasku Rb fosforyloitiin Pa

807/811, jonka R2HBJJ oli pitoisuudesta riippuvainen, ja esiintyi alhaisin testattu konsentraatio (1,25 uM). Johdonmukaisesti, alas-säätely sykliini D1, CDK4 ja CDK6 proteiineihin havaittiin soluissa käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla R2HBJJ. Samoin ilmaus pohjapinta Rb osoitti merkittävää kasvua pitoisuuden ensin ja sitten nopeasti laski perustasolle. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että RB-proteiini ja kinaasi komposiitti sykliini D1 /CDK4: n, 6 olivat pääasiassa mukana solun G0 /G1 pidätyksen aiheuttama R2HBJJ.

H1299-soluja käsiteltiin 20 uM R2HBJJ varten osoitettu aikoina (3-60 h, A) tai eri pitoisuuksilla R2HBJJ (1,25-20 uM) 48 h (B). Solulysaatit alistetaan sitten western blot -analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ACh ja muut komponentit kolinergisen signalointi, kuten ChAT, koliiniesteraasin, M ja N kolinergisiin reseptoreihin, ovat läsnä erilaisia ​​ei-hermokudoksissa, mukaan lukien yleisimmät syöpäsolujen, kuten ei-pienisoluista keuhkosyöpää, SCLC, paksusuoli-, glial, rinta- ja munasarjasyövät. Paikallisessa ympäristössä kasvainten, pitoisuuksien ACh pinnalla reseptoreihin voi olla jopa suurempi johtuen korkeasta solutiheyksiin kiinteitä massoja, lisääntynyt eritys ACh läheisyys reseptoriin sijainti ja alentuneet koliiniesteraasin NSCLC [26], joka implicates että kolinerginen signalointi voidaan edelleen lisätä. Ei-neuronaalinen kolinergisen järjestelmän ja ACh, paikallisena solujen kasvua signalointi, on rooli kehittymistä ja etenemistä syövän ja edustaa mahdollinen uusi polku kohdistaa kasvaimen kasvua. Siksi, kolinergisiin antagonistit keskeyttävät sääteli autokriinisten signalointi voi tarjota suunnattu vastavirtaan lähestymistapa estää proliferatiivisten polku.

R2HBJJ, koska johdannainen antikolinergisen aineen R2-PHC, syntetisoitiin meidän instituutti. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme valikoivuuden R2HBJJ M1-M5 muskariinireseptoreihin ja sen antikolinerginen vaikutus. Olemme myös päättäneet, jos keskeytys endogeenisen kolinergisen signalointia R2HBJJ on kyky estää NSCLC kasvua

in vitro

.

Tuloksemme osoittivat, että R2HBJJ oli huomattavasti suurempi affiniteetti M3 ja M1-reseptorin alatyyppeihin kuin M2-alatyypin , jossa ehdotetaan vähemmän M2 reseptoriin liittyvän sydän- sivuvaikutuksia. Sijoitus affiniteetti R2HBJJ viidelle eri mAChRs oli M3 M1 M4 M5 M2. Tuloksena on yhdenmukainen, joka saatiin sen vanhempien yhdiste PHC ennen [27]. Vuonna toiminnalliset tutkimuksessa R2HBJJ esti supistuvien vasteita marsun Henkitorviin että karbakolille pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Estovaikutus oli vahvempi kuin mAChR antagonisti, atropiini.

Song

et al

raportoitu että SCLC syntetisoivat ja erittävät asetyylikoliinin, joka toimii autokriinikasvutekijänä kautta sekä nikotiini- ja muskariinikolinergiset mekanismit [16]. Tutkimuksemme selvitetty ihmisen NSCLC solulinjoissa, kuten SCLC, ilmaista sekä M ja N AChRs sekä ChAT, mikä tarkoittaa, että toiminnallinen perusta kolinergisen autokriinisen silmukan on läsnä NSCLC. Näin ollen kasvua inhiboiva aktiivisuus R2HBJJ useita NSCLC solulinjoissa, mukaan lukien H1299, H460 ja H157-soluja, voidaan välittää sekä M että N kolinerginen mekanismeja. Mutta kun H1299 solut käsiteltiin tunnetun selektiivinen tai ei-selektiivisiä päälle M- ja N- reseptorit

in vitro

, huomasimme, että vain M3-reseptorin antagonisti darifenasiinia esitti merkitsevän eston solun kasvuun. Sillä välin meidän yhdisteitä R2HBJJ ja R2-PHC myös merkittävästi esti solun elinkelpoisuuden H1299 soluja, joiden edullinen vaikutus kuin darifenasiinin. Tutkimuksessa Song

et al

, hoito SCLC-solujen M3-reseptoriantagonisteja 4-DAMP tai darifenasiinia esti solun kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme viittaavat siihen, että M3-reseptoriantagonisteja on estävää vaikutusta NSCLC samoin. Antiproliferatiivista vaikutusta R2HBJJ on NSCLC voi liittyä valikoivaan M3 antagonistisen aktiivisuuden. Russo P

et al

raportoitu, että esto α7-nAChR voimakas korkea affiniteetti antagonisti α-CBT aiheuttama antituumorivaikutus in NSCLC ja keuhkopussin mesoteliooma laukaisemalla apoptoosin [18] – [19]. Kuitenkin meidän tutkimus, toinen α7-nAChR antagonisti α-bgt käytettiin hoitoon H1299 solun ja vaikutus solujen elinkelpoisuuteen ei havaittu, mikä viittasi siihen, että α7-nAChR signalointi voi olla ensisijainen välittäjänä H1299 solujen kasvua.

Tässä tutkimuksessa olemme jättänyt noudattamatta proliferatiivinen Ulkoisten ACh on H1299-soluissa, mikä saattaa merkitä sitä, että endogeeninen ACh on tarjonnut riittävästi stimuloiva vaikutus solujen lisääntymistä. Kuitenkin eksogeenisen Replenish ACh tarvitaan antagonisoivat kompetitiivisesti inhibition R2HBJJ on H1299-soluissa. Tuloksena korosti, että vaikutus R2HBJJ on H1299 solujen kasvu saavutettiin kautta vaikuttavien endogeenisten ACh signalointi. Esillä olevassa tutkimuksessa, ChAT siRNA on osoittautunut estävän solun kasvua, mikä edelleen tukee tätä hypoteesia. Lisäksi on huomattava, että hoito M3-reseptori siRNA aiheutti huomattavan kasvun estoa H1299 soluihin verrattuna negatiivisen kontrollin siRNA käsiteltyihin soluihin. Teho inhibitio saavutti 50% tai enemmän sisällä 96 h ajan kuluessa. Kun M3-reseptorin tehokkaasti tippuu alas H1299, solut lossed niiden herkkyyttä R2HBJJ. Tulokset entisestään roolia M3 anti-proliferatiivista vaikutusta R2HBJJ.

solusyklin pysähtymisen on tärkeä mekanismi estää kasvaimen kasvua. Tuloksemme virtaussytometristen analyysi osoitti, että R2HBJJ merkittävästi tukahdutti solun mitoosi etenemisensä pidätti solut G0 /G1 vaiheeseen. Solusyklin siirtymistä G1: stä S ohjaa DNA-synteesiä ja vaatii hyperfosforylaatiota tuumorisuppressorigeenin, Rb [28]. Sykli prosessissa, katalyyttinen aktiivisuus sykliini D1 kanssaan CDK4 /6 ensin ilmenee puoliväliin G1, kasvaa maksimiin G1 /S siirtymistä ja edistää G1 poistua. Kun taas sykliini E ja sykliini A: liittämällä CDK2 aktivoituu G1 /S siirtymä tai varhaisessa S vaiheessa, vastaavasti. Fosforylaatiota Rb aluksi laukaisee aktiivinen sykliini D1-CDK4 /6-kompleksit ja myöhemmin kiihdyttää sykliini E-CDK2. Tämä fosforylaatio mahdollistaa dissosiaation transkriptiotekijöiden, kuten E2-promoottori-sitova tekijä (E2F) ja proto-onkogeenin c-Abl yli-ilmentynyt tai mutatoitunut lukuisissa pahanlaatuisia kasvaimia, jotka voidaan transaktivoimaan S-vaiheen geenejä, jotka koodaavat proteiineja, jotka vahvistavat G1-to-S-vaiheeseen kytkin ja vaaditaan DNA: n replikaatiota [29]. Solusyklin proteiineja tarkasteltiin tässä tutkimuksessa, ilmaisuja sykliini D1, CDK4 ja CDK6 proteiinit olivat alassäädetty aikariippuvainen, kun taas taso sykliini E ja CDK2 ei vaikuttanut merkittävästi. Lisäksi, fosforylaatio Rb aseman Ser

807/811 estyi R2HBJJ aikariippuvainen, joka voisi poistaa vuorovaikutusta c-Abl ja Rb ja hidastavat aktivoitumista c-Abl ja solusyklin etenemisen [ ,,,0],30]. Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että RB-proteiinin ja kinaasi komposiitti sykliini D1 /CDK4, 6 olivat pääasiassa mukana solu G0 /G1 pidätyksen aiheuttama R2HBJJ. Tulokset ehdotti myös, että R2HBJJ kohdistama sen hidastava vaikutus varhaisessa vaiheessa G0 /G1.

Itse säätelymolekyyleja koskevat varhain solusyklin etenemisen, kuten sykliini D1-CDK4 /6-Rb ovat usein tavoitteita geneettisiä muutoksia poikkeuksellisen suuri prosenttiosuus keuhkosyövässä [31]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että strategioita kohdistaa liittyvien proteiinien varhainen solusyklin etenemisen ja G1 rajoitus piste voivat olla käyttökelpoisia syövän hoitoon [32] – [33]. Sykliini D1 on myös osoitettu olevan alavirran kohde useiden signaalitransduktioreaktioteiden välittämän kuten onkogeenien kuten Neu, Ras, ja β-kateniinin. Tuoreessa tutkimuksessa tukee lupaus yhteistyössä kohdistaminen sykliini D1 ennakoiva ja henkilökohtaistaminen lähestymistavan keuhkosyövän ehkäisyä ja hoitoa [34]. Lisäksi ACh kautta toimivien mAChR on osoitettu johtavan soluproliferaatiota MAPK, ERK1 /2 ja sääntelyn solusyklin etenemisen [11], [16]. Meidän julkaisemattomat tiedot osoittivat myös, että varhainen apoptoosi oli mukana antiproliferatiivista vaikutusta R2HBJJ, mutta taustalla olevien mekanismien jäi vielä lisäselvitystä.

Yhteenvetona, nykyinen tutkimus osoittaa, että NSCLC-solut ilmentävät autokriini ja paracrine kolinergisen joka stimuloi NSCLC-solujen. R2HBJJ, uusi muskariiniantagonisti, voi estää paikallista kolinergisen silmukka vastavaikuttamalla pääasiassa M3-reseptoreihin ja estää NSCLC solujen kasvua. Mekanismi R2HBJJ aiheuttaman solukierron G0 /G1 pidätys liittyy alas-säätely sykliini D1-CDK4 /6-Rb. Tulokset viittaavat siihen, että M3-reseptoriantagonistit mahdollisesti tullut uusi voimakas kemoterapeuttinen varten NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Radioaktiivisesti yhdiste [

3H] N-methylscopolamine ([

3H] NMS), ihmisen muskariinireseptorien (M1, M2, M3, M4 ja M5) proteiineja ja BetaPlate Scint kalvo saatiin Perkin Elmer Life ja Analytical Sciences. R2-PHC ja R2HBJJ (kemialliset rakenteet on esitetty kuviossa. 1) syntetisoitiin meidän instituutti. Kemialliset rakenteet vahvistettiin ydinmagneettinen resonanssispektri analyysi. Atropiini, pirentsepiinin, mekamyyliamiinin, α-Bungarotoksiini (α-bgt), karbakolia, ja ACh hankittiin Sigmalta. Dihydro-β-erytroidiini hydrobromidi (DhβE) ja AF-DX116 ostettiin Tocris. Darifenasiinia ostettiin Beijing Huafeng United Technology. Vasta-aineita käytetään western blotting ostettiin Cell Signaling retinoblastoomaa tuumorisuppressoriproteiinia (Rb), fosfori-Rb (Ser

780 ja Ser

807/811), sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4, CDK6. M3-AChR saatiin Santa Cruz. Chat, β-aktiini, vuohen anti-kanin ja vuohen anti-hiiri immunoglobuliini leimattu piparjuuriperoksidaasilla ostettiin Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology.

Radioligandisitoutumiskokeet Pitoisuus

saturaatiositoutumisella suoritettiin käyttäen erilaisia