Krooninen sairaus

tiivistelmä

Potilaat, joilla ALK geenin uudelleenjärjestelyjä usein ilmeinen dramaattinen vastaukset crizotinib, ALK estäjä. Tarkka tunnistaminen potilailla, joilla ALK-positiivinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on välttämätön kliininen käyttö ALK-täsmähoitoihin. Kuitenkin arvioitaessa

EML4-ALK

uudelleenjärjestelystä NSCLC on edelleen haastava rutiini patologian käytännössä. Tutkimuksen tavoitteena oli vertailla diagnostista tarkkuutta FISH, immunohistokemia (IHC), ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (QPCR) menetelmiä havaitsemiseksi

EML4-ALK

uudelleenjärjestelystä NSCLC ja arvioida immunohistokemia kuten Esilajittelun työkalu. Tässä tutkimuksessa yhteensä 473 parafinoidut NSCLC näytteet kirurginen asemointia ja biopsiat analysoitiin IHC ALK vasta-aineella.

ALK

uudelleenjärjestely vahvistettiin lisäksi FISH ja QPCR. ALK-proteiinin ekspressiota havaittiin kaksikymmentä potilasta (20/473, 4,2%). 20 ALK-positiivisten tapausten IHC, 15 tapausta edelleen vahvistettiin

ALK

uudelleenjärjestely FISH, ja 5 tapauksessa eivät olleet tulkittavissa. Lisäksi arvioimme 13 ulos 20 IHC-positiivisten kudosten QPCR ylimääräisiä kalastaa, ja totesi, että 9 tapaukset olivat positiivisia ja 2 tapaukset olivat moniselitteisiä, kun taas 2 tapaukset olivat negatiivisia, vaikka ne olivat positiivisia sekä IHC ja FISH. ALK tila oli yhtäpitävät 5 ulos 8 tapausta, jotka olivat tulkittavissa kolmella tavalla. Lisäksi yksikään 110 IHC-negatiivisia tapauksia adenokarsinooma histologia osoitti

ALK

uudelleenjärjestelyjä FISH. Histologisesti, lähes kaikki

ALK

-rearranged tapaukset olivat adenokarsinooma, paitsi että yhdessä tapauksessa oli sarcomatoid syöpä. Kiinteä signet-rengas solukuvio tai mucinous seulamaisessa kuvio esiteltiin ainakin fokaalisesti kaikissa ALK-positiivisia kasvaimia. Johtopäätöksenä havaintomme ehdotti, että

ALK

uudelleenjärjestely liittyi ALK proteiinin ilmentymisen. Tavanomainen IHC määritys on arvokas väline Esilajittelun sairastavien potilaiden

ALK

uudelleenjärjestelyn kliinisessä käytännössä ja yhdistelmä FISH ja QPCR tarvitaan lisävahvistusta.

Citation: Zhang YG Jin ML, Li L, Zhao HY, Zeng X, Jiang L, et al. (2013) arviointi

ALK

uudelleenjärjestely Kiinan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä käytetään kalojen, immunohistokemia, ja reaaliaikaiset kvantitatiiviset RT PCR parafinoidut kudosten. PLoS ONE 8 (5): e64821. doi: 10,1371 /journal.pone.0064821

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu: 23 marraskuu 2012; Hyväksytty: 18 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 31, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (NO.81050015). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1], [2], huolimatta parannuksista havaitsemismenetelmiä ja hoitoja. Joukossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), mikä vastaa noin 85% kaikista keuhkosyövässä, adenokarsinooma on yleisin keuhkosyövän sekä miehillä että naisilla [2]. Nykyisin ponnistuksia omistettu kehittämiseen molekyylejä vastaan ​​erityisiä tavoitteita tietyn kasvaimen tyyppejä. Kanssa jatkuvaa parantamista ymmärrystämme molekyyliperustan keuhkosyöpään, kohdennettujen hoitojen NSCLC arvioidaan parhaillaan tai kehitetään. Näiden hoitojen ovat angiogeneesi-inhibiittorit ja merkinanto-estäjät, kuten epiteelin kasvutekijän reseptorin (EGFR) -targeted hoitojen [3]. Siksi avaimen tunnistus onkogeenien keuhkosyöpään on erittäin tärkeä askel kohti kehittää uusia molekyyli-kohdentamisaineita.

Äskettäin aktivointi anaplastinen lymfooma kinaasi (ALK) -geenin keuhkosyöpä fuusiolla piikkinahkaisten mikrotubuluksiin liittyvä proteiini-like4 (EML4) tai muu geeni kumppanien (kuten

TFG

ja

KIF5B

) on raportoitu [4], [5], [6]. ALK-geeni oli alun perin tunnusomaista fuusio- kumppanina NPM-ALK onkogeenin anaplastinen suuri solu lymfooma [7], ja on nyt tunnustettu aktiivinen komponentti useita fuusioproteiineja erilaisia ​​syöpiä [8]. ALK on transmembraaninen reseptori tyrosiinikinaasin toimintaa, joka kuuluu insuliinin kasvutekijän reseptorin superperheen, joka on koodattu kromosomissa 2 (2p23). Eri fuusio-osapuolet, ALK välittävät ligandista riippumaton dimerointi ALK, mikä konstitutiivista kinaasiaktiivisuutta, ja lähettää siten anti-apoptoottisen ja soluproliferaation signaaleja KRAS ja PI3K polkuja [8]. NSCLC, poikkeava aktivaatio ALK myötävaikuttaa keuhkojen karsinogeneesi jälkeen sulatettu useiden muiden geenin kanssa, useimmiten piikkinahkaiset mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 4 (

EML4

). EML4 geeni sijaitsee kromosomissa 2 (2p21) ja on käänteisesti suunnattu

ALK

.

EML4-ALK

fuusio voi tapahtua sen jälkeen, kun lohkaisu kromosomiin muuttujan päällä ja kromosomin inversio, mikä aiheuttaa eri fuusio isoformit [9].

EML4-ALK

fuusio tapahtuu toisiaan poissulkevia muodin

EGFR

tai

KRAS

mutaatioiden ja lähes yksinomaan adenokarsinooma. Läsnäolo

EML4-ALK

on todennäköisempää, jos potilaalla on tiettyjä demografisia ominaisuuksia, kuten ei tupakointi tila tai nuorempia [10]. Useimmat tutkimukset ovat löytäneet tämän geneettisen epänormaaliuden nopeudella 2-5% väestössä potilaiden NSCLC [11], [12], [13], [14].

Aiemmissa kliinisissä tutkimuksissa, Crizotinib, dual ALK /MET estäjä, osoitettiin olevan dramaattisesti tehokas potilailla, joilla NSCLC kätkeminen ALK-geenin uudelleenjärjestäytymistä [15]. Crizotinib äskettäin hyväksynyt Yhdysvaltain FDA hoitoon kehittynyt

ALK

positiivisten NSCLC tunnistaa fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) [16]. Tunnistamisen varmistamiseksi potilaiden todennäköisimmin hyötyvät Crizotinib, on tärkeää kehittää luotettavia ja helposti diagnostisia menetelmiä havaita ALK geeni uudelleenjärjestely kun seulonta potilaiden hoidon crizotinib. Vaikka ALK FISH on tullut kultakantaan havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestelystä NSCLC, se voi olla teknisesti haastavaa ja kallista. Näin ollen muita diagnostisia säännöt on vielä tutkittava, mukaan lukien immunohistokemia (IHC) ja käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR). RT-PCR on erittäin herkkä menetelmä havaitsemiseen ja kvantifiointiin RNA

EML4-ALK

. Se kykenee myös kirjoittamalla

EML4-ALK

variantti sekvensoimalla PCR-tuotteen. Kuitenkin, koska tämän menetelmän ei saa tunnistaa uusia uudelleenjärjestelyjä, joihin aiemmin tuntemattomia

EML4-ALK

variantteja tai tuntematon fuusiokumppanit ja sen prosessi voidaan helposti saastuneita, sen herkkyys ja spesifisyys on vielä vahvistettava. IHC on se etu, että laajalti saatavilla, suhteellisen helppo suorittaa ja säilyttää morfologinen tietoja, joiden ansiosta varma arviointi poikkeavien geenien kasvainsoluissa. Tästä syystä ALK IHC tuntuu soveltuu laajamittaisen seulonnan sairastavien potilaiden

ALK

-positiivinen NSCLC.

Suurin haaste käyttäen ALK IHC on usein matalan tason ilmentymistä ALK fuusioproteiinien

ALK

-rearranged NSCLC [16], mikä tekee tarpeelliseksi kehittää herkempiä IHC perustuvia menetelmiä. Useat ALK-vasta-aineiden on raportoitu viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että IHC on korkea yhteensopivuutta ALK FISH, mukaan lukien ALK1 monoklonaalinen vasta-aine DAKO [17], 5A4 monoklonaalinen vasta-aine Novocastra [18], ja D5F3 monoklonaalinen vasta-aine on kehittänyt Cell Signaling Technology [19] . Kuitenkin suuren mittakaavan tutkimuksia tarvitaan edelleen vahvistaa vastaavuutta välillä IHC ja FISH, kehittämistä ja arviointia uusien vasta-aineiden, joilla on korkea spesifisyys ja herkkyys ALK fuusioproteiinit olisivat erittäin tervetulleita.

Tässä tutkimuksessa olemme tutki ALK geeni uudelleenjärjestelyn avulla immunohistokemia NSCLC kliinisissä näytteissä, ja korreloi tulosten kanssa saatiin FISH ja QPCR. Lisäksi olemme tutkineet ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia NSCLC ALK geenin uudelleenjärjestelyjä. Tämä tutkimus tarkoituksena oli selvittää hyödyllistä tietoa ennustamaan ALK geeni uudelleenjärjestelyn ja määritetään diagnostinen menettely, joka voitaisiin suorittaa rutiinikäytännön.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Tämä tutkimus suoritettiin hyväksyntää Clinical eettisen komitean Pekingin Chao-Yang Hospital, Capital Medical University. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Archival formaliinikiinnitetyt parafinoidut kudokset saatiin 473 potilasta, joille oli tehty potilaiden primaarisesti keuhkosyövän vuosien 2006 ja 2011 Pekingin Chao-Yang sairaalan Capital Medical University Kiinassa. Tapaukset valittiin satunnaisesti potilailla diagnosoitu NSCLC histologisen otettujen näytteiden saatu kirurginen resektio ja koepala. Ei potilaat olivat saaneet kemoterapiaa ennen leikkausta ja koepala. Kaikissa tapauksissa, me tarkistetaan ikä diagnoosin, sukupuoli, tupakointi historia, ja sijainti primaarituumorin, jotka on saatu potilastietoja. Mukaan the7th painos TNM lavastus käsikirjasta keuhkosyöpä julkaisemassa AJCC vuonna 2010, kaikissa tapauksissa tarkistettiin ja lavastettu. Kaikki saatavissa histologia diat kussakin tapauksessa arvioitiin uudelleen, ja histologinen tyyppi ja laatu erilaistumisen vahvistettiin kriteerien mukaan Maailman terveysjärjestön luokitus keuhkotuumoreiden ja ERS /ATS /IASLC monitieteinen luokittelu keuhkoadenokarsinooma [20]. Kullekin tapauksessa edustaja kudosnäytekappaleessa sisältävä toimivin kasvainsoluja valittiin kaksi patologia. Vaiheessa tauti oli leikkauksen jälkeisen patologisen vaiheessa. Porras IV sairaudet sisältyvät tapaukset, jotka saivat koepaloja Avoimella keuhko- tai videoavusteinen thoracoscopic leikkaus diagnoosia. Kliinis tiedot on koottu taulukkoon 1.

ALK havaitsemistoiminto immunohistokemia

Jokaisesta edustaja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäytekappaleessa valittiin ja leikattiin 4 um paksuus immunovärjäämistä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun deparaffinization ja nesteytys, objektilasit kuumennettiin antigeenin hakuja painekeittimeen 3 minuuttia 100 ° C: ssa 0,01 mol /L Tris-EDTA-puskuriin (pH 9,0). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla liukuu 3% vetyperoksidilla absoluuttista metanolia 15 minuutin ajan, ja epäspesifinen sitoutuminen blokattiin 10% vuohen seerumia 15 minuuttia. Kanin monoklonaalista vasta-ainetta ALK (klooni SP8, Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA) käytettiin primäärisenä vasta-aineena laimennuksessa 1:100. Yön yli inkuboinnin jälkeen kanssa ALK-vasta-ainetta 4 ° C: ssa, levyt inkuboitiin anti-kani, piparjuuriperoksidaasileimattua polymeeri sekundääristä vasta-ainetta alkaen DAKO Envision + ™ System (Dako Corporation). Immunoreaktiivisuus visualisoitiin 3,3′-diaminobentsidiiniä (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ja kiinnitettiin. Positiivinen kontrolli kohdat tunnetuista ALK-positiivisten ALCL tapausta Jokaisessa värjäystä erän. Normaali imusolmuke kudosta käytettiin negatiivisena kontrollina. Sillä sokeakoekuoppaa, kaikki inkubaatiovaiheet olivat identtisiä, paitsi että kanin nonimmune IgG seerumia käytettiin mieluummin kuin ensisijaisen vasta-ainetta (ALK).

määritetty pisteytys kriteerit aikana alustava arviointi käyttämällä monen otsikkona mikroskoopilla, jotta päästä yksimielisyyteen. Värjäys tuloksia tulkitaan sitten kaksi kirjoittajien itsenäisesti, ilman aiempaa tietoa kliinis parametrit. Ristiriitainen tapausta tarkistettiin ja sovittu ennen tietojen analysoitiin tilastollisesti. Jokaisesta näytteestä, vähintään viisi kenttää (x 400) ja yli 500-solut analysoitiin. Sillä ALK tahroja, vain yksiselitteinen sytoplasminen värjäys pidettiin positiivisen reaktion. Lukumäärä immunopositiivista solujen semikvantitatiivisesti arvioitiin: ei positiiviset solut (-); 50% kasvainsoluista värjäämällä positiivinen (+); 50% -75% tuumorisolujen värjäämällä positiivinen (++); 75% tuumorisolujen värjäystä positiivinen (+++). Värjäytymisintensiteettiä luokiteltiin asteikolla 0 3+ (0, negatiivinen, 1+, heikko, 2+, kohtalainen, 3+, voimakas), samoin aiemmin kuvattu protokollien [17], [18].

Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) B

FISH suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kasvainkudoksissa käyttäen Vysis LSI ALK Dual Color, hajota uudelleenjärjestely Probe (Abbott Molecular, Abbott Park, Illinois, USA). ALK break-erilleen koetin sisältää kaksi DNA-koettimet leimataan Spectrum Orange ja Spectrum Green jotka vastaavasti hybridisoituvat bändi 2p23 vastakkaisilla puolilla reunustavien murtuessa ALK-geenin. Määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 4-pm paksu osastoja FFPE kudosblokeista poistettiin parafiini ja kuivattu, sitten leikkeet käsiteltiin Vysis esikäsittely reagenssilla (Abbott Molecular) ja saatettiin reagoimaan proteaasiliuoksesta (Abbott Molecular). ALK break-erilleen koetin seos levitetään koko kudokseen, ja ne olivat yhdessä denaturoitiin 73 ° C: ssa 3 minuutin ajan. Leikkeitä hybridisoitiin yön yli kostutetussa kammiossa 37 ° C: ssa. Pesun jälkeen tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Osiot analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla varustettu kolminkertainen ylipäästösuodattimen (DAPI /vihreä /oranssi). Toistuva analyysi joitakin näytteitä suoritettiin huonon hybridisaatiosignaaleista ja /tai huono kudosmorfologia. Positiivinen ja negatiivinen kontrolli objektilasit Jokaisessa ajossa FISH-testi.

FISH tulkinta

mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti, FISH objektilasit arvioitiin tietämättä IHC tulokset ALK. Kaksi teknikot analysoi kunkin FISH dia, skannaus koko kudoksen osassa ja pisteytys 50 edustaja ytimiä, jotka selkeästi ja sisälsi yksiselitteinen signaaleja. Ytimet, jotka sisältävät signaaleja vain yksi väri ei pitäisi luetella. Tulokset kunkin teknikon ei yhdistettiin vasta tutkimuksen loppuun minimoimaan puolueellisuutta pisteytys. Solu pidettiin positiivinen, kun ydin oli ainakin yhdet rikki toisistaan ​​signaalit, tai oli yksi punainen signaali (poistetaan vihreä signaali) lisäksi sulatettu ja /tai jaetaan kahtia signaaleja. Etäisyys kahden erotetun punaista ja vihreää signaalia arvioitiin käyttämällä kahta kertaa suurimman signaalin koon. Näytteet pidettiin positiivisena, jos yli 25 pois 50 kasvainsolujen olivat positiivisia, ja negatiivinen, jos alle 5 kasvainsolut olivat positiivisia. Näyte 5-25 positiivisia kasvainsoluja pidettiin moniselitteisiä, ja sitten arvioitiin toinen teknikko. Ensimmäinen ja toinen solumäärä lukemat laskettiin yhteen ja prosenttia laskettiin ulos 100-soluja. Jos keskimääräinen prosenttia positiivisia soluja oli 15% tai enemmän, näytettä pidettiin positiivisena. Muuten katsottiin negatiivisia

ALK

uudelleenjärjestely.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (QPCR) B

Yhteensä RNA eristettiin juuri leikattu FFPE kudosleikkeiden käyttämällä RNeasy-kittiä (Qiagen). Lyhyesti, kasvaimen alueella on tunnistettu värjäys hematoksyliini-eosiinilla, ja kudos tämän alueen värjäämätön osat on kaavitaan RNA. Jälkeen deparaffinization ja lyysi vaiheet, kokonais-RNA puhdistettiin RNeasy MinElute spin sarakkeessa. Genominen DNA poistettiin RNaasi-vapaa DNaasi I (Qiagen). Ennen RNA-monistus, eheyden ja puhtauden RNA arvioitiin denaturoivalla agaroosigeelielektroforeesilla ja A260 /A280-mittaus.

Reaaliaikainen PCR-monistus suoritettiin käyttäen AmoyDx ™ EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit (Amoy Diagnostics , Xiamen, Kiina) mukaan valmistajan suositusten. Lyhyesti, 0,1-5 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Kuusi mikrolitraa cDNA käytettiin sitten templaattina 25 ul: n reaktiossa reaaliaikainen PCR-havaitseminen EML4-ALK fuusio transkriptien käyttäen EML4-ALK Reaction Master seokset ja ABI 7500 cycler (Applied Biosystems). EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit työllistää uusi, oma alukkeita erityisesti monistaa kohdegeenin sekvenssin mukana yhdeksän tunnetun EML4-ALK fuusio transkriptivariantissa, kuten E13, A20, E6a /b, A20, E20, A20, E15, A20, E14 ; A20, E18, A20, E2, A20, E17, A20. Koh- cDNA mitattiin jokaisen syklin jälkeen datan keruuvaiheessa käyttämällä uutta fluoresoiva koetin. Laatu syntetisoitu cDNA varmistettiin samana ajon monistamalla viitteen geenin (β-aktiini,

ACTB

). EML4-ALK fuusio geenin ja

ACTB

määrityksissä leimattiin FAM. Positiivinen ja negatiivinen kontrolli oli mukana jokaisessa reaaliaikainen PCR aikavälillä. Määritelmän mukaan valmistajan ohjeiden, QPCR määritys EML4-ALK fuusio geeni pidettiin positiivisena, jos näyte Ct-arvo 30. Jotta näytteissä, reaaliaikaisen RT-PCR-määritys toistettiin kahdesti.

TILASTOANALYYSI

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS for Windows 13.0-ohjelman (SPSS Inc., Chicago , IL). Analysoida korrelaatiot

ALK

tilan ja kliinisen-patologisen muuttujia, käytimme χ2 testissä tai Fisherin testi, jos sovellettavissa. Todennäköisyys arvot 0,05 pidettiin merkittävinä analyyseissä.

Tulokset

Clinicopathogical ominaisuudet kasvaimia

Tässä tutkimuksessa kartoitettiin paneeli 473 NSCLC näytteitä, käsittäen 375 tapausta kirurgisesti toistoleikattiin kasvaimista, ja 98 tapauksia koepaloja. Ei potilasta sai kemoterapiaa aikaan diagnoosin. Kuten on esitetty yhteenvetona taulukossa 1, potilaiden koostuu 314 (66,4%) miehillä ja 159 (33,6%) naisia, joiden keski-ikä 59 vuotta (21-84 vuotta). Histologisesti, 341 (72,1%) oli adenokarsinooma, 112 (23,7%) okasolusyöpä, ja 20 (4,2%) muita tyyppejä. Patologisen vaihe oli I 166 (35,1%), II 104 (22%), III 105 (22,2%), ja IV 98 (20,7%) tapauksista.

ALK Protein Expression IHC

Kaikki ALK-positiivisia tapauksia esiintyi hajanaisena sytoplasman värjäyskuvio kasvainsoluissa, eikä immunovärjäys havaittu normaalin keuhkokudoksen keuhkoputkien epiteelin, keuhkorakkuloiden penumosyy-, keuhkorakkuloiden makrofageissa, mesenkymaalisten kudosten, solujen ja tulehdussolujen viereisen keuhkojen kudoksiin (Kuvio 1). Kaksikymmentä tapauksia ulos 473 oli ALK-positiivisia, mikä vastaa 4,2% kaikista tutkituista tapauksista IHC, johon kuului pistemäärä 3 nähdään 14 tapauksessa, jossa on rakeinen voimakas sytoplasmista värjäytymistä (kuva 1-A), pisteet 2 5 tapauksessa kanssa kohtalainen sytoplasminen värjäys (kuva 1-C), pistemäärä 1 1 tapauksessa, jolla on heikko sytoplasmista värjäytymistä (kuvio 1-E) ja pisteet 0 453 tapauksessa (kuva 1-G). Mitään merkittäviä kasvaimensisäistä värjäytymistä heterogeenisuus havaittiin, vaikka sinettisormus-rengas solujen taipumus näytteille heikompi värjäystä kuin muihin soluihin, ehkä siksi sytoplasminen ALK proteiinin väheni suuri määrä limaa materiaalia. Ei ollut mitään ilmeistä korrelaatiota ALK geeni uudelleenjärjestely FISH ja intensiteetti Immunovärjäyksen.

A, C, E, G: ALK immunovärjäyksin (alkuperäinen suurennos x 200). A ja C: voimakas ja kohtalainen sytoplasman värjäykset (pisteet = 3 ja 2 tässä järjestyksessä), E: heikko soluliman värjäykset (pistemäärä = 1) ja G: ei värjäytymistä (pisteet 0). B, D, F ja H. FISH-analyysi

ALK

käyttäen dual-väri ALK break-erilleen anturi. B, D ja F esittävät FISH sigals että ALK-jäsensi kasvaimia, ja osuus solujen ALK positiivisia signaaleja oli 49% (49/100), 38% (38/100), 56% (28/50), vastaavasti . Uudelleen järjestetyt

ALK

(B, D, ja F) on merkitty halkaisu punainen ja vihreä signaaleja tai yksi punainen signals.H esittää FISH sigals ei-järjestetty uudelleen kasvain. osuus solujen ALK positiivisia signaaleja oli 3% (3/100). Non-jäsensi

ALK

(H) esittää fuusio tai vierekkäin punainen ja vihreä signaaleja.

ALK uudelleenjärjestely arvioimana FISH

ALK uudelleenjärjestelyn arvioitiin käyttämällä FISH 110 IHC-negatiivisia tapauksia adenocacinoma histologia ja 20 IHC-positiivisia tapauksia. Niistä 20 IHC-positiivisia tapauksia, 15 tapausta vahvistettiin

ALK

uudelleenjärjestely ALK FISH, 5 tapauksessa ei tulkittavissa, koska tekniset esineitä kuten signaalin heikkenemistä, joka mahdollisesti johtui sopimattomasta kiinnittäminen tai menetys kasvaimen kudosta. Mikään 110 IHC-negatiivisia tapaukset osoittavat,

ALK

uudelleenjärjestely FISH. Edustavat kuvat ALK FISH on esitetty kuviossa 1-B, D, F, H oli kaksi positiivista

ALK

uudelleenjärjestelyn kuvioita. Yksi oli tauko erilleen (BA) kuvio yhdellä tai kahdella erottaa punaista ja vihreää signaalia, ja toinen eristettiin punainen signaalikuviosta ilman vastaavaa vihreää signaalia. ALK FISH-negatiivinen tapauksissa havaittiin kaksi fuusio signaalien tai lähellä punaisen ja vihreän signaaleja.

korrelaatio ALK IHC ja FISH

Tässä tutkimuksessa, 130 tapausta analysoitiin molemmat IHC ja FISH. Concordance välillä IHC ja FISH on esitetty taulukossa 2. harkitsee 5 tapauksissa FISH eivät olleet tulkittavissa, herkkyys ja spesifisyys IHC on 125 tapauksissa vertailu FISH, oli 100% ja 100%: lla. Näin ollen tämä tutkimus osoitti, että oli korkea yhteneväinen arvioinnissa

ALK

uudelleenjärjestelyn välillä IHC ja FISH.

EML4-ALK Fusion Gene by QPCR

sitten testattiin 13 IHC-positiivisten tapausten QPCR. EML4-ALK -fuusiogeenit havaittiin 9 ulos 13 tapauksessa. Ne sisältyvät

EML4-ALK

variantti 1, 2, 3 eksonin 13

EML4

, eksonin 20

EML4

, ja eksoni 6a /b

EML4

fuusioitu eksonia 20

ALK

, vastaavasti. Oli 2 tapausta, joissa EML4-ALK -fuusiogeenit ei havainnut QPCR, mutta

ALK

uudelleenjärjestelyjä havaittiin FISH. Lisäksi positiivinen tulos

EML4-ALK

2 tapauksissa ei toistu toistettujen mittausten. Huomattavaa on, että eräässä tapauksessa ALK FISH oli epäinformatiivinen

ALK

uudelleenjärjestely, mutta asia oli raportoitu positiivinen QPCR. Tämä voisi ehkä olla vähäisyys aiheuttaa tuumorisolujen. Tässä näytteessä, yhteensä 30 edustajan kasvainsolun tumat laskettiin, ja vain kaksi kasvainsolut olivat positiivisia.

ennusteeseen viittaavia Ominaisuudet ALK-positiivisten potilaiden

Yhteensä 473 toistoleikattiin ja koepala NSCLC näytteet tutkittiin. ALK proteiinin ilmentyminen arvioitiin kaikissa tapauksissa IHC.

EML4-ALK

translokaatiot ja /tai

ALK

uudelleenjärjestelyjä varmistettiin vielä kaikissa ALK-immunopositiivista tapauksissa FISH ja /tai QPCR. Välinen suhde

ALK

uudelleenjärjestelyn ja viittaavia tekijöitä on esitetty taulukossa 3.

ALK

uudelleenjärjestelyn havaittiin 20 473 NSCLC tapauksissa. 20 ALK-positiivisia tapauksia, 19 (95%) oli adenokarsinoomia, ja 1 oli sarcomatoid syöpä, joka oli merkittävä karan solu ja jättisolun komponentti. Histomorphologically, kuten taulukossa 4,

ALK

-rearranged keuhkojen adenokarsinooman usein osoitti kiinteä sinettisormus solukuvio. Kiinteä signet-rengas solukuvio tai mucinous seulamaisessa kuvio esiteltiin ainakin fokaalisesti kaikissa ALK-positiiviset kasvaimet (kuva 2). Kuten taulukosta 3, ALK-positiiviset potilaat osoittivat tilastollista eroa iän (p = 0,003) ja patologinen vaiheessa (p = 0,024), verrattuna ALK -negatiivisilla potilailla. Potilaat, joilla ALK-positiivinen keuhkon adenokarsinooma olivat nuorempia diagnoosin ja oli suurempi vaiheessa yleisimmin vaiheessa IV. Mitään merkittävää suhdetta osoitettiin välillä ALK uudelleenjärjestelyn ja joko potilaan sukupuolen tai tupakoinnin historiaa.

He osoittivat solid sinettisormus-rengas solukuvio (A), seulamaisessa rakenne (BD), ja runsas solunulkoisen liman (C).

keskustelu

Vaikka EML4-ALK fuusio geeni on vähäinen geneettinen poikkeavuus NSCLC [21], [22], esiintyvyys keuhkosyövän kasvaa monissa maissa, absoluuttinen määrä keuhkosyöpäpotilaita kätkeminen EML4-ALK fuusio geeni ei ole vähäpätöinen. Crizotinib, kaksi MET /ALK-tyrosiinikinaasi-inhibiittorin on osoitettu olevan tehokas hoidettaessa potilaita, joilla ALK-positiivisia NSCLC. Perustuu sen teho ja turvallisuus, crizotinib äskettäin hyväksynyt Yhdysvaltain FDA hoitoon potilailla, joilla on pitkälle edennyt ALK-positiivisia NSCLC. Kuitenkin ilmaantuvuus

ALK

uudelleenjärjestelyä on suhteellisen alhainen, aina 2-5%. Jopa silloin, kun rikastetun populaation NSCLC potilaiden valitaan perusteella niiden ennakoivaa kliinisiä piirteitä, kuten nuorempana, tupakoimattomuus ja adenokarsinooma histologia, on vaikea tunnistaa osajoukot ALK-positiivisia kasvaimia. Siksi tehokas seulonta potilaille, joilla on

ALK

-rearranged NSCLC on keskeinen kysymys kliinisessä käytössä.

ALK break-erilleen FISH-määritys on toiminut kumppani dignostic kriteeriä, jonka perusteella ALK positiivisuuden kliinisten kokeiden crizotinib [15]. Teoriassa ALK FISH pystyy havaitsemaan uudelleenjärjestelyn joissa

ALK

riippumatta fuusiokumppaneihin tai

EML4-ALK

variantteja, on FFPE kudos, joka edustaa yleisin tapa käsittelyä ja tallentamiseen kasvain yksilöitä. Kuitenkin teknologian ja kustannusten näkökulmasta FISH tavanomaisesta laajamittainen havaitseminen

ALK

uudelleenjärjestelystä NSCLC edelleen haasteellisena. On kiireesti kehittää ja validoida kustannustehokkaampia menetelmiä havaitsemiseksi tämän geneettisen poikkeamaa. Nykyiset diagnostiset lähestymistavat havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestely kuuluu immunohistokemia (IHC), FISH ja polymeraasiketjureaktio (PCR) -pohjaisen menetelmiä. Kuitenkin riittävän yksityiskohtaiset tiedot riittävän verrattuna FISH ei nykyisin ole.

IHC on nopea ja edullinen menetelmä parempana patologit rutiini diagnoosi. Se voidaan suorittaa menestyksekkäästi erilaisia ​​histologian ja sytologian näytteet. Vaikka immunohistokemiallista tekniikkaa ei suoraan tunnista ALK fuusio itse geenin, joka perustuu havaintoon, että ALK ei ole havaittavissa missään normaaleissa kudoksissa kuin aivoissa [23], ALK-immunoreaktiivisuus liittyy ilmen- tymisen lisääntymisen geenin ilmentymistä, mikä johtuu muuttunut promoottorin toimintaa, joka on erittäin tunnusmerkki

ALK

inversio. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut kaupallisesti saatavilla ALK vasta-aineilla on suhteellisesti pienempi herkkyys havaita ALK IHC, mahdollisesti heikon transkriptionaalisen promoottorin aktiivisuus-tehostaja alueella

EML4

joka ohjaa ilmentymistä EML4-ALK. D5F3 vasta-aine (Cell Signalling Technology) on yksi lupaavimmista vasta-aineiden havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestelystä NSCLC [19]. Kuitenkin lisätutkimuksia edelleen velvollinen vahvistamaan vastaavuutta välillä IHC ja FISH suuremmissa näytesarja.

Tässä tutkimuksessa, suoritimme immunohistokemia käytetään monoklonaalisia vasta-ainetta (klooni SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA), yksi yleisesti käytetty, hyvin testattu ALK-vasta samana laimennoksena, jota käytettiin ALCL, joten sen käyttö lisää käytännöllistä diagnoosilaboratoriossa näkökulmasta. Tämä vasta-aine tunnistaa ihmisen p80-proteiini, tunnistettiin hybridi ALK-geenin ja nucleophosmin (NPM) geeni johtuvat t (2; 5) (p23; q35) translokaatio löytyy 30-50% CD30 + suuri solu lymfoomat. Se tunnustaa myös täyspitkän ALK proteiinia. Meidän IHC menetelmä perustuu standardin IHC rutiinimenetelmänä patologian käytäntö. Olemme pitkäaikainen antigeeni haku aikaa ja inkuboitiin vasta-yön yli 4 ° C parantaa herkkyyttä ja spesifisyyttä. ALK-positiivisten määrä meidän NSCLC tapauksissa (20/473, 4,2%) oli verrattavissa määrä EML4-ALK fuusio transkripti raportoitu aiemmissa tutkimuksissa (2-5%). Kaikki ALK-positiivisten NSCLC tapauksissa IHC osoitti ALK geeni uudelleenjärjestely FISH ja /tai QPCR. Toisaalta, joukossa 473 NSCLC tapauksissa me satunnaisesti valittu 110 IHC-neagative tapauksia adenokarsinooma histologia arvioida

ALK

uudelleenjärjestely FISH, ja totesi, että ei ollut tapauksia, joissa

ALK

geeni uudelleenjärjestely havaittiin. Toisin kuin aiemmassa tutkimuksessa [6], IHC testi SP8 vasta-aineella osoitti suurempi spesifisyys ja herkkyys tutkimuksessamme. ALK värjäys tarjosi erittäin puhdas, helposti tulkittavia immunoreaktiivisuus häiritsemättä taustavärjäyksen positiiviseen tapauksissa. Tämä ristiriita luultavasti johtui eri IHC menettelyä kuten antigeeni haku ja vasta inkubaation tai johtui vaihteluista kudosten käsittely eri laboratorioissa. Tuloksemme jäi vahvistettava lager kohorttitutkimuksiin.

RT-PCR cDNA on ollut yleisesti käytössä seulonta strategiaa ALK geenin uudelleenjärjestelyjä. Sekvensoimalla PCR-tuotteen, erityisen EML4-ALK-variantteja ilmaistuna voidaan tunnistaa. Kuitenkin uusi ALK fuusiokumppaneihin ei havaita tällaisia ​​tekniikoita. Viimeaikaisissa tutkimuksissa, RT-PCR, joka perustuu havaitsemiseen

ALK

uudelleenjärjestelyä on suurelta osin rajoitettu tuoreita tai pakastettuja kudosta. Verrattuna multiplex RT-PCR, QPCR näyttää täysin sopiva menetelmä suoraa tunnistamista fuusio variantin ja havaitseminen sen ekspressiotason, koska sen edullinen ja nopea läpimenoaika. RT-PCR-tekniikkaan perustuva havaitseminen

ALK

uudelleenjärjestelyä FFPE kudoksia vaatii optimointia määrityksen suunnittelun ja jää arvioitavaksi suurissa kohorttitutkimuksiin. Tutkimuksessamme suoritimme QPCR on FFPE kudoksia 13 ALK-positiivisia tapauksia IHC. 2 tapausta olivat negatiivisia

EML4-ALK

by QPCR, mutta positiivisia

ALK

järjestely FISH. Oletettavasti oli uusi ALK fuusiokumppanit tai uusien

EML4-ALK

variantti, kun taas meidän määritys suunnittelu koskenut ainoastaan ​​yhdeksää tunnettu

EML4-ALK

variantteja. Tämä jäi validoi geenisekvensseihin. Ylimääräisiä, hajoaminen RNA FFPE kudosblokeista voi myös johtaa vääriin negatiivisiin tuloksiin. Tutkimuksessamme kaikki testatut FFPE kudosblokeista olivat 7-45 kuukautta vanha kun meidän tunnistus työ tehtiin. RNA laatu ja ilman saastumisen genomisen DNA varmistettiin formaldehydi-agaroosigeelielektroforeesilla. Olemme myös määrällisesti tason β-aktiini kuin endogeeninen RNA laadunvalvontaa. Tarvittava laadunvalvonta mukaan lukien ei-mallia ohjaus, tunnettu ALK-positiivisten ja negatiivisten kontrolli, tehtiin koko menettelyn. Tuloksemme osoittivat QPCR on FFPE kudoksia ei ole riittävän tehokas ainoana havaitsemismenetelmä, mutta se pysyi hyödyllistä tunnistaa mukana fuusio- variantti Pakastuskuukausi materiaalia ei ole saatavilla.

Suoritimme FISH, jota pidetään nykyisen