Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä esittelee terapeuttinen haasteita johtuen sen tyypillisesti myöhään havaitseminen, aggressiivista etäpesäke, ja terapeuttinen vastus. Transkriptiotekijä Kruppel kaltainen tekijä 4 (Klf4) on ollut mukana ihmisen syöpien tuumorisuppressorina tai onkogeeni, vaikka sen rooli riippuu suuresti solujen yhteydessä. Rooli Klf4 munasarjasyövän ei ole selvitetty mekanistisiin yksityiskohtaisesti. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia Klf4 munasarjan syöpäsolujen transduktoimalla munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 ja OVCAR3 kanssa doksisykliinin-indusoituva Klf4 lentivirusvektorilla. Yliekspressio Klf4 vähensi solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Epiteelisolujen markkerigeeni E-kadheriinin merkittävästi voimistunut, kun taas mesenkyymisolun markkerigeenin vimentiinista, twist1and snail2 (etana) on vaimentua sekä Klf4 ilmentäviä SKOV3- ja OVCAR3 soluja. Klf4 esti transformoivan kasvutekijä β (TGFli) aiheuttaman epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) in munasarjasyöpäsoluja. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että Klf4 toimii tuumorisuppressorigeenin munasarjasyövän soluissa inhiboimalla TGF-indusoidun EMT.

Citation: Chen Z, Wang Y, Liu W, Zhao G, Lee S, Balogh , et ai. (2014) Doksisykliini Inducible Kruppel-Like Factor 4 Lentivirusvektori sovittelee mesenkyymikasvaimia on epiteelikasvaimet Transition in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 9 (8): e105331. doi: 10,1371 /journal.pone.0105331

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 20 heinäkuu 2014; Julkaistu: 19 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Hanke oli osittain tuettu National Institute of Health (HL095957, HD061420 on JY, ja CA092160 GT) ja UTHSC käynnistyksen rahoitus, Länsi klinikka Cancer Center (JY) ja Kiinan hallituksen (2010CB530204 CL, 112102310110 ja YG, 2011DFA33290 ja WG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Junming Yue on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit. Kaikki kirjoittajat eivät ole kilpailevia kiinnostusta julistaa.

Johdanto

Munasarjasyöpä on korkea kuolleisuus, kuulemma aiheuttaa 15000 kuolemantapausta vuosittain Yhdysvalloissa [1]. Vaikka merkittäviä parannuksia on tehty havaitsemiseksi munasarjojen syöpien viime vuosikymmenellä, yli 20000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain [1], [2]. Terapeuttinen vaihtoehdot munasarjasyövän on rajallinen, koska se kestää kemo- ja sädehoidon johtavat usein uusiutumista [3], [4].

Klf4 on osoitettu säätelevän solujen lisääntymistä ja erilaistumista, sen rooli on tutkittu laajalti useissa ihmisen syövissä käyttämällä vahvistus- ja menettämisestä toiminnon lähestymistapoja. Paksusuolen ja eturauhasen syöpä, Klf4 toimii onkogeenin [5], [6]. Sen sijaan sillä on tuumorisuppressori rooli neuroblastooma, keuhkosyöpä, mahasyöpä, lymfooma, kohdunkaulan syöpä, haimatiehyen syöpä ja hepatosellulaarinen karsinooma [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Rintasyövän, Klf4 voi toimia sekä onkogeenin [14], [15], ja kasvaimia estävä [16], [17], [18]. Rooli Klf4 munasarjasyövän ei ole riittävästi ja mekaanisesti käsitelty. Aikaisempi tutkimus osoittaa, että ilmaus taso Klf4 väheni merkittävästi munasarjasyövän verrattuna normaaliin munasarjan epiteelin, mikä viittaa siihen, että Klf4 voisi mahdollisesti toimia tuumorisuppressori munasarjasyöpä [19].

Klf4 on ainutlaatuinen rooli kantasolujen uudelleenohjelmointi helpottamalla mesenkymaalisten ja epiteelin siirtymistä (MET) [20]. Solu fenotyyppiset Siirtyminen epiteelin ja mesenkyymisolun siirtyminen (EMT) on perustavanlaatuinen prosessi tuumorimetastaasissa joka on näkyvä piirre munasarjakarsinoomissa. MET tai EMT johtaa muutoksiin epiteelin ja mesenkymaalisten markkerigeeni lauseke, joka sisältää snail1 2, Zeb 1 2, Twist, vimentiinistä, E-kadheriinin [18], [21], [22]. EMT säätelee useiden signalointireittien, jotka sisältävät WNT, TGF, ja Notch. [23], [24], [25]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että miRNA säätelevät EMT tai MET reittejä kohdistamalla epiteelin tai mesenkyymisolun markkerigeenit jotka sisältävät miR-194, miR-203, ja miR-200C [22], [26]. Klf4 on osoitettu säätelevän EMT useita eri syöpäsoluissa. Maksasolukarsinoomassa, rinta- ja eturauhassyövän soluissa, Klf4 aktivoi transkription epiteelisolujen markkerigeeni E-kadheriinin ja tukahduttaa mesenkymaalisten solujen markkerigeeni etanat 2 (kuonan) sitoutumalla niiden promoottoreita. Klf4 näissä syövissä edistää MET ja estää kasvainsolujen kasvua [10], [24], [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet rooli Klf4 munasarjan syöpäsolujen käyttäen doksisykliini (Dox) -riippuvainen Klf4 indusoitavissa lentivirusvektori (Tet-on) ja totesi, että indusoituvia yliekspressio Klf4 vähensi solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion edistämällä MET in munasarjasyöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3, OVCAR3 ja rintasyöpä MCF7 saatiin ATCC ja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Hyclone, Logan, UT), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). HEK293 FT-soluja viljeltiin DMEM, jossa oli 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 1% glutamiinia, 1% ei-välttämätön aminohappo, ja genetisiiniresistenssit kanssa lopulliseen pitoisuuteen 1 ug /ml.

Lentivirusvektori tuotanto

Dox-indusoituva Klf4 kääntää transaktivoijaproteiinia (rtTA-M3), ja EGFP lentivirusvektorit pakattiin HEK293FT soluissa ja valmistettu kuten aiemmin on kuvattu [28]. Stabiilit solulinjat yliekspressioon KLF4- tai EGFP- saatiin aikaan co-transdusoimaan SKOV3, OVCAR3, ja MCF7-solut lentivirusvektoreita Klf4, EGFP kanssa rtTA-M3 ja valitaan 5 ug /ml puromysiiniä. Aiheuttavan Klf4 ja EGFP ilmaisun Dox lisättiin normaaliin kasvualustaan ​​kuten.

Solun pesäkemuodostusta

SKOV3, MCF7 ja OVCAR3 solut transdusoitiin Klf4 tai EGFP yliekspressio viruksia (200 solua /hyvin kukin) maljattiin kolmena kappaleena osaksi 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin 2 viikkoa. Sitten ne värjättiin 0,1% kristallivioletilla, ja solujen pesäkkeet laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [29].

MTT-määritystä

Solut maljattiin 8000 kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille ja viljeltiin 24 h. Sen jälkeen 10 ui MTT-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin ~ 4 h. Reaktio lopetettiin lisäämällä 100 ui pesuainetta reagenssia; levyjä inkuboitiin 22 ° C: ssa pimeässä 2 tuntia; ja sitten absorbanssi mitattiin 570 nm: n aallonpituudella.

Cell migraatiokokeessa

transdusoidut solut (3 x 10

5 solua per kuoppa) ympättiin kolmena rinnakkaisena osaksi 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin 24 tunnin ajan. Solun pinta raaputettiin pipetin kärjen ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Tuoretta elatusainetta lisättiin vielä 24 tuntia. Siirtyminen laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: (alue haava-alueen 0 h – haava-alueen 24 h) /haava-alueen 0 h. Transvvell- migraatiomääritys suoritettiin käyttämällä modifioitua kammion (BD Falcon, San Jose, CA). Nämä kammiot insertoitiin 24-kuoppalevylle. -Soluja (3 x 10

4) 300 ui: aan seerumivapaata DMEM: ää lisättiin ylempään kammioon. Kemoatrak- DMEM lisättiin alempaan kammioon kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 24 tuntia. Keskipitkän ja ei-siirretyn solut ylemmässä kammiossa poistettiin taas, siirrettyjä soluja alapuolen kalvot kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Kuvat otettiin 10X suurennus. Solut vähintään kolmessa eri alojen laskettiin.

Cell invaasiomääritys

SKOV3- ja OVCAR3 soluja (5 x 10

5) transdusoidaan EGFP ja Klf4 yliekspressio virukset ympättiin serum- DMEM päälle insertit esipäällystetty matrigeelin (BD BioCoat, 24-kuoppaiset Kasvain Invasion System (BD Biosciences, San Jose, CA). DMEM, joka sisälsi 10% FBS lisättiin alaosaan hyökkäyksen järjestelmän kemoatrak-. 24 tunnin kuluttua, Transvvell- insertit värjättiin käyttäen 4 ug /ml calcein AM: n (Life Technologies, Grand Island, NY) 37 ° C: ssa 1 h. fluoresenssin voimakkuus mitattiin käyttäen BioTek Synergy (Winooski, VT) levynlukijalla viritys ja emissio aallonpituuksilla 485 nm ja 528 nm, vastaavasti.

Soft agar määrityksessä

pohjaan agar, 0,6% Noble-agaria DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, lisättiin 6-kuoppaisille levyille. Kaksi miljoonaa solut DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 0,35% Noble-agaria lisättiin pohjaan agar. Kasvatusalusta lisättiin sitten alkuun agar, kun se oli kiinteytynyt, ja soluille annettiin tuoretta elatusainetta joka 5 d, ja pesäkkeet laskettiin valomikroskoopilla 2 viikon kuluttua.

immunofluoresenssivärjäyksellä

ekspression havaitsemiseksi EMT liittyvien markkerigeeni, Klf4 ilmentäviä ja hallita SKOV3- solut kiinnitettiin 10 minuuttia käyttäen 4% PFA, pesty kolme kertaa 0,1% Tween 20: tä PBS: ssä (PBST), ja inkuboitiin estopuskurilla (5% normaalia vuohen seerumia, 3% naudan seerumin albumiinia, ja 0,1% Triton-X-100 PBS: ssä) 1 tunnin ajan. Ensisijainen vasta E-kadheriinin, snail2, ja vimentiinistä (1:200 laimennus, Cell Signaling, Danvers, MA), inkuboitiin kiinnitettyjen solujen kanssa yhdessä yössä. Huuhtelun jälkeen kolme kertaa 5 minuutin ajan PBST: llä, Alexa 488 tai 594 konjugoitua vuohen anti-kani (1:200 laimennus, Life Technologies), vasta-aineita lisättiin 1 h ajan huoneenlämpötilassa. Solutumat vastavärjättiin DAPI (Vector Laboratories, Inc .; Burlingame, CA). Kuvat otettiin käyttäen Nikon inverted fluoresenssimikroskoopilla.

Kromatiini immunosaostuksella (chip)

ChIP suoritettiin käyttäen siru-IT Express Entsymaattinen Kit (Active motiivi, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeet. Lyhyesti, Klf4-ilmentävät ja hallita SKOV3- soluja silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut kerättiin ja sonikoitiin leikkausvoimien kromosomi-DNA. Immunosaostus suoritettiin sitomalla 10 ug kanin anti-Klf4-vasta-ainetta tai IgG: tä (Santa Cruz Inc., Dallas, Texas) ja lysaatit ja inkuboitiin 4 ° C: ssa rotaatiossa yön yli. Chromatin kompleksit eluoitiin magneettiset helmet käänteisellä-ristikytkentäsidosten. Kromatiinin DNA puhdistettiin käyttämällä QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) ja eluoitiin 40 ul: aan vettä. DNA (4 ui) käytettiin kvantitatiivista PCR-reaktiossa havaitsemiseksi E-kadheriinin promoottori. Alukkeita käytetään havaitsemaan promoottorin E-kadheriinin olivat 5′-TAG AGG GTC ACC GCG TCT AT-3 ’(eteenpäin) ja 5’-TCA CAG GTG CTT TGC AGT TC-3 (taaksepäin), kuten aiemmin on kuvattu [16].

Western blot

munasarjojen ja rintasyövän solut kerättiin RIPA puskuriin (Thermo Scientific, Rockford, IL), joka sisälsi 1% Halt proteinaasinestäjä Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL). Sama määrä proteiinia (40 ug /kaista) ladattiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot blokattiin 5% rasvatonta maitoa 1 h ja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita Klf4 (Cell Signaling), GAPDH (Sigma, St. Louis, MO), vimentiinistä, E-kadheriinin tai snail2 (Cell Signaling).

tilastollinen analyysi

merkittäviä eroja määritettiin kahden tai kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja esitetään keskiarvoina ± SD Studentin

t

-testi.

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

yli-ilmentyminen Klf4 munasarjan syöpäsolujen käyttämällä Tet-järjestelmän

määrittämiseksi roolin Klf4 munasarjan syöpäsolujen rakensimme indusoitavissa lentivirusvektori, jossa Klf4 geeni ohjaa tetrasykliiniresistenssigeenit (Tet) tai Dox-reagoiva promoottori (TRE-tiukka). Käänteistranskriptioprosessi aktivaattori rtTA-M3 johtui konstitutiivinen ihmisen arjen C promoottori kloonattiin erilliseen lentivirusvektorilla (kuvio S1A). Klf4 ilmentyminen voidaan aktivoida rtTA-M3 läsnä ollessa Dox annoksesta riippuvalla tavalla. EGFP-indusoituva lentivirusvektorilla rakennettiin ja toimi kontrollina. Tutkia indusoima Klf4 ja EGFP että munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 ja OVCAR3, Dox lisättiin lopulliseen konsentraatioon 1 ug /ml, ja ilmaus Klf4 ja EGFP eri ajankohtina havaittiin Western blot. Expression of EGFP ja Klf4 nostetaan asteittain 24 tunnin aikana (kuva S1B). EGFP ilmentyminen SKOV3 ja OVCAR3 munasarjasyöpäsoluja visualisoitiin käyttäen fluoresoivaa microcopy 48 h lisäämisen jälkeen Dox (Fig. S2A, B). Dox hoito aiheutti muutoksia solujen morfologian SKOV3- soluja. Pyöristetty epiteelisolujen kaltainen morfologia havaittiin Klf4-transdusoitujen SKOV3- soluja verrattuna litistetty moninapaista epiteelisolujen kaltainen muoto EGFP tai Klf4 ohjaus solujen 48 ja 72 h (Fig. S1C ja Fig. S2C). Kuitenkin morfologian Klf4-transdusoitujen OVCAR3 soluja ei ole muutettu seuraavan Dox hoitoon verrattuna kontrollisolujen (tuloksia ei ole esitetty).

Klf4 estää solujen proliferaation ja pesäkkeiden muodostuminen

roolin tutkimiseksi Klf4 munasarjan syöpäsolujen proliferaatiota, MTT-määritystä suoritettiin Klf4-transdusoitu SKOV3- ja kontrollisoluja. Seuraavat Dox hoito, proliferaation Klf4 yli-ilmentäviä soluja oli esti merkittävästi verrattuna EGFP tai Klf4 (ei-Dox) kontrollisoluja (kuvio 1A). Olemme myös suorittaa pesäkkeiden muodostumisen määritykset SKOV3- ja OVCAR3 solut transdusoitiin Klf4 ja EGFP kontrollivektoreihin. Pesäkkeiden lukumäärä on Klf4 yli-ilmentäviä soluja oli merkittävästi vähentynyt verrattuna EGFP ja Klf4 kontrollisolut (kuvio 1 B, C). Lisäksi, pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritykset suoritettiin myös sen määrittämiseksi, onko Klf4 vaikuttaa kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun. Vastaavasti, tuloksemme osoittivat, että Klf4 inhiboi soluproliferaatiota puolikiinteän elatusaineet kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 1 D).

. Soluproliferaatiota SKOV3- solujen transdusoitu joko EGFP tai Klf4 tutkittiin MTT: llä eri ajankohtina seuraavan Dox hoitoa. Yliekspressio Klf4 vähensi merkittävästi solujen lisääntymistä verrattuna, että Dox-käsiteltyjen kontrollisolujen (*

p

0,05). B. 200 SKOV3- transdusoitujen solujen lentivi- Klf4 tai EGFP kontrollivektoreihin ympättiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin 14 d. Cell pesäkkeet laskettiin seuraavan kristalliviolettia värjäystä. Pesäkkeiden lukumäärä in Klf4 yli-ilmentäviä soluja oli merkittävästi vähäisempää kuin että Dox hoidettuun kontrolliryhmään soluja (***

p

0,001). C. määrä siirtomaiden Klf4 yliekspressoivia OVCAR3 solujen väheni merkittävästi verrattuna että Dox hoidettuun kontrolliryhmään soluja (**

p

0,01). D. Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen SKOV3- soluja. Pesäkkeet kuvattiin ja laskettiin 3 viikon kuluttua. Pesäkkeiden lukumäärä in Klf4 yli-ilmentäviä soluja oli merkittävästi vähäisempää kuin että Dox hoidettuun kontrolliryhmään soluja (***

p

0,001).

Klf4 vähentää solujen vaeltamiseen ja invaasio

Yksi keskeinen ominaisuus invasiivisen syöpäsolujen niiden lisääntynyt liikkuvuus. Sen tutkimiseksi, Klf4 vaikuttaa soluvaelluksen munasarjasyöpäsolulinjassa linja SKOV3, haavan paranemista analyysi suoritettiin käyttäen Klf4 transduktoitu- SKOV3- ja ohjaus soluja. Kuten kuviossa 2A, solujen muuttoliike väheni merkittävästi Klf4 yli-ilmentäviä soluja verrattuna hinnat EGFP- ja Klf4 transdusoimattomien ohjaus soluissa. Cell kemotaksista tutkittiin käyttäen transwell migraatiokokeessa. Kuten on esitetty kuviossa 2B, ja C, siirtyneet solut olivat vähentyneet huomattavasti Klf4 yli-ilmentäviä SKOV3- ja OVCAR3 soluja verrattuna soluihin EGFP ja Klf4 valvontaa. Sen tutkimiseksi, Klf4 vaikuttaa soluinvaasiota, solu invaasiomääritys suoritettiin Klf4 transduktoitu- SKOV3- ja OVCAR3 soluista käyttäen Matrigel päällystettyjä transwell levyille. Yliekspressio Klf4 vähensi soluinvaasiota verrattuna kontrolleissa molemmissa solulinjoissa (kuvio 3A, B).

. Haavan paranemista määritys suoritettiin tutkimaan maahanmuuttoluku SKOV3- solujen transdusoitu Klf4 ja EGFP lentivirusvektoreita. Valokuvat otettiin 0 ja 24 tunnin jälkeen alkuperäisen tyhjästä. Siirtymänopeuksien kvantitoitiin mittaamalla kolmella eri haava alueilla. Kolme erillistä koetta suoritettiin. Maahanmuuttoluku väheni merkittävästi Klf4 yli-ilmentäviä soluja verrattuna että Dox-käsiteltyihin kontrolleihin (**

p

0,01). B, C. TranswellTM migraatiokokeessa suoritettiin SKOV3- ja OVCAR3 soluja. Yliekspressio Klf4 vähensi soluvaelluksen SKOV3 (B) ja OVCAR3 (C) solut verrattuna in Dox-käsiteltyihin kontrolleihin (***

p

0,001).

A, B. solujen invaasiota määritys suoritettiin käyttäen Matrigel-päällystettyjä transwell levyjä SKOV3- (A) ja OVCAR3 soluja (B). Invaasio nopeus väheni merkittävästi Klf4 yli-ilmentäviä soluja verrattuna että Dox hoidettuun kontrolliryhmään solut molemmista SKOV3- ja OVCAR3 soluja (**

p

0,01). Tiedot kerättiin kolmesta eri kokeita ja analysoidaan käyttäen Student

t

-testaukset.

Klf4 edistää MET in munasarjasyöpäsoluja

Sen tutkimiseksi, Klf4 säätelee EMT vuonna munasarjasyöpäsoluja, epiteelisolujen markkerigeeni E-kadheriinin ja mesenkymaalisten markkerigeeni snail2 ja vimentiinin tutkittiin Klf4-transdusoitu SKOV3- ja OVCAR3 soluihin käyttäen Western blot. Epiteelin merkki E-kadheriinin merkittävästi voimistunut, kun taas mesenkymaaliset markkereita vimentiinista ja snail2 vähensi merkittävästi Klf4 yli-ilmentäviä soluja verrattuna EGFP ja Klf4 valvonta (kuvio 4A, B). Olemme myös suorittaa immunovärjäyty- on Klf4-yliekspressoivassa ja ohjaus soluja tutkia MET markkereita. Sekä E-kadheriinin ja vimentiinista värjäytyminen oli ulkoneva solukalvoissa, kun taas snail2 värjätään solutumien. Samoin kuin Western blotit, immunovärjäys osoitti, että E-kadheriinin ilmentyminen säädeltiin, kun taas vimentiinistä ja snail2 olivat vaimentua (kuvio 4C, D, ja E). Tutkimme myös ilmaus twist1 käyttäen reaaliaikaisen RT-PCR Klf4 transdusoiduissa SKOV3- soluja ja totesi, että twist1 oli merkittävästi vaimentua vuonna Klf4 ilmentävät SKOV3- soluja verrattuna kontrolli (Fig. S4). Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että Klf4 edistää markkinatalouskohtelu munasarjasyöpäsoluja. Edelleen tutkia E-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen johtui transkription aktivaation, suoritimme kromatiinin immunosaostus in Klf4 ilmentävien ja hallita SKOV3- soluja, ja promoottori alueen E-kadheriinin monistettiin rikastettua kromaattinen DNA reaaliaikaisella PCR kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],16]. Klf4 ilmentyminen SKOV3- soluissa johti noin 15-kertainen rikastuminen E-kadheriinin verrattuna kontrolleihin (kuvio 4F), mikä osoittaa, että Klf4 sitoutuu promoottori E-kadheriinin ja aktivoi E-kadheriinin ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja.

. B. Western blotit suoritettiin KLF4- ja EGFP-transdusoitujen SKOV3 (A) ja OVCAR3 soluja (B) kanssa tai ilman Dox induktio. E-kadheriinin ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut (***

p

0,001), kun taas vimentiinistä (**

p

0,01) ja snail2 (***

p

0,001) on vaimentua vuonna KLF4- yliekspressoivat SKOV3- soluja verrattuna ohjata soluja (A). E-kadheriinin (**

p

0,01) oli voimistunut, kun taas vimentiinistä (*

p

0,05) ja snail2 (***

p

0,001) on vaimentua in Klf4 yli-ilmentäviä OVCAR3 soluja verrattuna Dox-käsiteltyjen kontrollisolujen (B). E-kadheriinin (C) ja vimentiinista (D) immunovärjättiin solujen kalvot Klf4 ilmentävien ja hallita SKOV3- soluja. E. Snail2 värjättiin solutumissa in Klf4 ilmentävien ja hallita SKOV3- soluja. F. Klf4 sitoutuminen promoottori E-kadheriinin in SKOV3- soluissa tutkittiin kromatiinin immunosaostuksella käyttämällä Klf4 vasta-ainetta ja havaitsee reaaliaikainen PCR käyttäen E-kadheriinin alukkeita. Siru-rikastettu DNA tasot normalisoitiin syötettävä DNA, minkä jälkeen vähentämällä ei-spesifinen sitoutuminen määritettiin kontrolli-IgG (***

p

0,001).

Klf4 inhiboi TGF aiheuttaman EMT in munasarjasyöpäsoluja

tutkia mekanismi, onko Klf4 säätelee TGF aiheuttama EMT munasarjan syöpäsolujen SKOV3- ja OVCAR3 soluja käsiteltiin eri annoksilla TGFp. Expression of EMT markkeriproteiinien E-kadheriinin, vimentiinistä, ja snail2 tutkittiin käyttäen Western blot. Tuloksemme osoittavat, että TGF edistetään EMT munasarjasyövän solujen vähen- tämisessä E-kadheriinin ja upregulating snail2 ja vimentiinista (kuvio 5A, B). Lisäksi, kun käsitellään Klf4-ilmentävien ja valvoa SKOV3- ja OVCAR3 solujen kasvavia annoksia TGFp, Klf4 ilmentyminen merkitsevästi inhiboi TGF-indusoitua EMT molemmissa solulinjoissa (kuvio 6A, B).

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 (A) ja OVCAR3 (B) käsiteltiin eri annoksilla TGFp: ssa 48 tuntia. EMT-liittyvä markkerigeeni, kuten E-kadheriinin, snail2, ja vimentiinistä tutkittiin käyttäen Western blot. Merkitykset määritettiin vertaamalla TGFp käsitelty ei-hoitoon (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Munasarjasyöpä solulinjoissa SKOV3 (A) ja OVCAR3 (B) transdusoidaan lentiviraalinen Klf4 yli-ilmentymisen ja ohjaus vektori käsiteltiin TGFli 48 tuntia, ja proteiini ilmaisuja EMT liittyvien markkerigeeni E-kadheriinin, snail2 ja vimentiinistä tutkittiin käyttäen Western blot. Merkittäviä eroja verrattiin välillä Klf4 ilmentävät ja kontrolliryhmään (** p 0,05, *** p 0,001).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli Klf4 in munasarjasyöpäsoluja käyttäen lentivirusvektorilla välittämän indusoituvan ilmentymisen. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että Klf4 säädeltiin vähentävästi vuonna munasarjasyöpiä verrattuna kontrolleihin ja että Klf4 eivät vaikuttaneet soluproliferaatioon mutta lisäsi Bcl-2 /Bax suhteen ja esti apoptoosin [19]. Sen sijaan havaitsimme, että Klf4 inhiboi proliferaatiota SKOV3- solujen pesäkkeiden muodostumista ja MTT-määrityksissä (kuvio. 1A, B ja C). Ero voi johtua alhaisesta transfektion tehokkuus kyseisessä tutkimuksessa verrattuna meidän erittäin tehokas indusoituva lentivirus transduktio. Olemme myös havainneet, että Klf4 estää soluproliferaatiota OVCAR3 soluissa (Kuva. 1 C). Tuloksemme osoittavat, että Klf4 estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion, joten se toimii tuumorisuppressorina sekä SKOV3- ja OVCAR3 soluja.

Klf4 voi olla kahdenlaisia ​​vaikutuksia joko onkogeeni tai tuumorisuppressori rintojen syöpäsolut [14], [16], [18], [30]. Vertailla toimia Klf4 MCF7 rintasyövän että munasarjasyöpäsoluja, suoritimme samanlaisia ​​kokeita käyttäen samaa lentiviruksen Tet-on indusoituva vektori-transdusoidut MCF7-soluissa. Huomasimme, että Klf4 estää MCF7 soluproliferaatiota (Fig. S3A). Meidän havainto on samanlainen esitetyt tulokset MCF10A soluissa Yori et al. [16]. Yu et al., Osoitti kuitenkin, että Klf4 toimii onkogeenin MCF7-soluissa [14], joka on vastapäätä havaintoomme.

morfologia Klf4 ilmentävät SKOV3- solujen läsnä ollessa Dox oli selvästi muutettuja ohjaus soluja ilman Dox tällä eri ajankohtina (kuvio S2C); Emme kuitenkaan eivät havainneet ilmeisiä morfologisia muutos OVCAR3 soluissa induktion Klf4 ilmaisua. Yksi syistä, aiheuttaa tämä ilmiö on, että Klf4 myös indusoi solujen apoptoosia munasarjasyöpäsoluja perustuvat julkaisemattomia tietoja. Morfologiset erot voivat johtua erilaisista vastauksista Klf4 indusoi apoptoosia sekä solulinjoissa. Sekä SKOV3- ja OVCAR3 solujen epiteelisolujen markkerigeeni E-kadheriinin oli voimistunut, ja mesenkymaaliset markkerigeenit vimentiinista ja snail2 oli vaimentua seuraavan induktion Klf4 yli-ilmentymisen (Fig. 4A, B). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että Klf4 ensisijaisesti edistetään MET in munasarjasyöpäsoluja. Ilmentymistä EMT liittyvän markkerin geenejä munasarjasyöpä solut ovat samanlaisia ​​kuin mitä havaitaan MCF7 rintasyöpäsoluissa, vaikka endogeenisen ilmentymisen vimentiinista MCF7 ei ollut havaittavissa Klf4 yliekspressoiva tai kontrollisoluja. Tämä saattaa johtua alhaisen endogeenisen ilmentymisen taso vimentiinista MCF7-soluissa. Meidän tiedot tukevat hypoteesia, että Klf4 on keskeinen säädin edistää MET ja inhiboimaan EMT munasarjan ja rintasyövän soluissa.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että Klf4 sitoutuu promoottorialueet E-kadheriinin ja snail2, mikä voi aktivoida ilmentyminen E-kadheriinin tai tukahduttavat ilmentymisen snail2 fibroblasteissa ja useita syöpäsolulinjoissa [18], [24], [27], [31]. Ilmaisu epiteelisolujen merkki E-kadheriinin tarvitaan kantasolujen uudelleenohjelmointia. Klf4 helpottaa MET prosessi aktivoimalla E-kadheriinin ilmentymisen [31]. Munasarjan syöpäsolujen, havaitsimme Klf4 riippuvainen ylössäätely E-kadheriinin ja vaimennussäätely vimentiinista ja snail2. Tuloksemme osoittavat, että Klf4 transkriptionaalisesti sitoutuu promoottorien E-kadheriinin, mikä johtaa aktivoitumiseen E-kadheriinin ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja.

EMT tai MET on tarkoin säädeltyä useiden signalointireittien. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että useita signalointireittien, kuten WNT, Notch, NFKB ja TGFp, osallistuvat EMT tai MET siirtyminen syövissä [32], [33], [34], [35]. Aiemmat tutkimukset osoittivat myös, että TGFli edistää EMT in munasarjasyöpäsoluja [36], [37]. On kuitenkin olemassa mitään niihin liittyviä tutkimuksia kuvaavat mekanismia miten Klf4 osallistuu EMT ja vuorovaikutuksessa näitä reittejä munasarjasyöpäsoluja. Nykyinen tutkimukset osoittavat, että Klf4 estää TGFli aiheuttaman EMT sekä SKOV3- ja OVCAR3 soluja (Fig. 6A, B), mikä viittaa siihen, että Klf4 vaimentaa TGFp aiheuttama EMT munasarjojen syöpiä. Näin ollen, synergistisesti yliekspressio Klf4 ja inhibition TGFp koulutusjakson aikaan uudenlainen lähestymistapa uusien terapeuttisten lääkkeiden munasarjojen syöpien.

Yhteenvetona, tämä on ensimmäinen raportti, joka osoittaa, että Klf4 toimii kasvaimen vaimennin estämällä solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota in munasarjasyöpäsoluja kautta lieventäviä TGFli aiheuttama EMT.

tukeminen Information

Kuva S1.

induktio Klf4 ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja käyttäen lentiviraalinen Tet-vektorin. A. Lentivirusvektorikonstruktit Tet-vektorin järjestelmässä. Reverse transaktivaattori (rtTA-M3) ajoi ihmisen ubikitiinipromoottori C (UBC promoottori), ja EGFP tai Klf4 vauhdittivat Dox indusoituva promoottori TRE-tiukka. Indusoida ilmentymisen EGFP tai Klf4, Dox aktivointiin tarvitaan Tet-promoottorin seuraavat rtTA sitoutumisen Tet-reagoivan elementin promoottorialueen. B. EGFP ja Klf4 ilmaisuja indusoitiin Dox SKOV3 munasarjasyöpäsoluja ja havaittiin Western blot. C. SKOV3- solut yli-ilmentävät Klf4 näyttö pyöristetään epiteelisolujen kaltainen morfologia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s001

(PDF) B Kuva S2.

Dox aiheuttama EGFP ilmentymistä SKOV3- ja OVCAR3 soluja. EGFP ilmaisuja SKOV3 (A) ja OVCAR3 soluja (B) transdusoidaan EGFP lentivirusvektorilla visualisoitiin loisteputken mikroskopia tai ilman Dox induktio. Solujen morfologiaa tutkittiin valomikroskoopilla. C. Solujen morfologiaa oli kuvattu eri ajankohtina valomikroskoopilla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s002

(PDF) B Kuva S3.

Klf4 edistävää MET rintasyövän MCF7-soluissa. A. Pesäkkeenmuodostusta suoritettiin MCF7-soluissa transdusoitiin EGFP ja Klf4 yli-ilmentymisen lentivirusvektoreita. Pesäkkeiden lukumäärä in Klf4 yli-ilmentäviä soluja oli merkittävästi vähäisempää kuin että Dox-käsiteltyihin kontrolleihin (***

p

0,001). B. Western blot-analyysi Klf4 (**

p

0,01), E-kadheriinin (**

p

0,01), ja snail2 (*

p

0,05) MCF7-soluissa yli-ilmentävät Klf4 ja EGFP kanssa tai ilman Dox hoitoa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s003

(PDF) B Kuva S4.

Klf4 downregulates twist1 ilmentymistä munasarjasyövän SKOV3- soluja. Twist1 ilmentyminen Klf4 ilmentävät SKOV3- ja ohjaus solujen havaittiin reaaliaikainen RT-PCR seuraavat Klf4 induktion 24 tuntia käyttäen 1 ug /ml doksisykliiniä (*

p

0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s004

(PDF)

Text S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s005

(DOCX) B