Krooninen sairaus

tiivistelmä

PRAME kuuluu ryhmään syöpä /kivesantigeenien (CTA: t), joille on tunnusomaista niiden rajoitettu ilmentyminen normaaleissa gametogenic kudoksissa ja erilaisia ​​kasvaimia.

PRAMEn

perhe on yksi monistetun geenin perheitä hiiren ja muiden nisäkkäiden genomien. Jäsenet

PRAMEn

geeniperheen koodata leusiinirikkaita repeat (LRR) proteiinien, jotka toimivat transkription sääntelyviranomaisten syöpäsoluissa. Kuitenkin rooli PRAMEn normaalissa sukuelimiin ei tunneta. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on luonnehtia ajallinen ja paikallinen ilmentyminen hiiren

Pramel1

geeni, ja määrittää solun lokalisoinnin PRAMEL1 proteiinin aikana hiiri spermatogeneesin. Tuloksemme osoittivat, että hiiren

Pramel1

ilmaistiin kiveksissä vain. MRNA ja ekspressiotaso oli alhainen vastasyntyneen kivekset, ja vähitellen kasvanut 1- 3 viikon ikäisiä kivekset, ja pysyi sitten vakiona kolmen viikon iässä. Immunofluoresenssivärjäyksellä on kiveksen kohdat hiirellä PRAMEL1 vasta-paljasti, että PRAMEL1 sijaitsi sytoplasmassa spermatosyyteiksi ja akrosomien alueen pyöreä, pitenevä ja pitkänomainen spermatids. Edelleen analysoidaan kiveksiin squash valmisteluun ja siittiöiden klo subsellulaarisista tasolla osoitti, että proteiini lokalisointi malleja PRAMEL1 koordinoitiin kanssa morfologisten muutosten aikana Akrosomi muodostumista spermatids, ja olivat merkittävästi erilaisia ​​liitoskappale, välikappale ja pääasiallinen palan flagellum välillä kivesten ja lisäkivesten siittiöiden. Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että PRAMEL1 voi olla rooli Akrosomi biogeneesissä ja siittiöiden liikkuvuutta.

Citation: Mistry BV, Zhao Y, Chang T-C, Yasue H, Chiba M, Oatley J, et al. (2013) Differential Expression of PRAMEL1, Syöpä /Kivesten antigeeni aikana Spermantuotanto Hiiri. PLoS ONE 8 (4): e60611. doi: 10,1371 /journal.pone.0060611

Editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 joulukuu 2012; Hyväksytty: 28 helmikuu 2013; Julkaistu: 02 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Mistry et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat USDA-NIFA (myönnä. 2010-65205-20362) ja käynnistysvaiheen varat Pennsylvania State University W-SL. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Spermantuotanto on monimutkainen biologinen prosessi mitoottiseen leviämisen spermatogonioiden, The meioottista jako spermatosyyteiksi ja morfogeeniseen erilaistumista spermatids kypsyä siittiöitä. Aikana spermiogenesis, pyöreä spermatids vuosina suuria morfologisia ja solumuutoksia, mukaan lukien muodostuminen Akrosomi, venymä ja tiivistyminen tuman muodostuminen flagellum, ja hävittäminen tarpeetonta solulimassa, tuottaa pitkälle erikoistuneita ja polarisoitunut siittiöt [1], [2 ]. Akrosomin on Golgin johdettu rakkula, joka sijaitsee etuosan alueen siittiön pään [3]. Se on keskeinen rooli hedelmöityksen sen osallistumista prosessiin siittiöiden muna sitovia ja tunkeutuu muna [4], [5]. Nisäkkään miehillä mutaatioita, jotka vaikuttavat akrosomin biogeneesin ovat hedelmättömiä tai subfertile [4] – [7]. Akrosomin biogeneesissä alkaa myöhään pakyteenispermatosyytti vaiheen meioosi ja jatkuu koko ensimmäisen puoliskon spermiogenesis [4], [5], [8]. Aluksi proacrosomal rakkulat muodostuvat Golgin laite ja koottu perinuclear alueella, lähellä yhtä napojen tuman pachytene spermatosyyteiksi. Päätyttyä meioottisen jako, nämä rakkulat fuusioituvat toisiinsa muodostaen yhden suuren akrosomien rakkula, joka kiinnittyy ydinvoiman kirjekuori pyöreiden spermatids ja laajentuminen jatkuu lisäämällä Golgi-ainekset [4], [8]. Aikana kypsymisen kasvavaan spermatids, Golgin lakkaa edistää glykoproteiinien että Akrosomi ja akrosomistaan ​​ydin monimutkainen läpi laajan morfologisten muutosten hankkia muoto ominainen tietyn lajin sperma [8].

Flagellassa nisäkkään siittiön on tärkeä ja hyvin järjestetty mikrotubulia pohjainen monimutkainen rakenne, joka tarjoaa liikkuvuutta tarvitaan siittiöitä päästä ja hedelmöittää munasolu [9]. Rakenteellisesti se on jaettu neljä pääosaa: liitoskappale, keskimmäinen pala, pääasiallinen pala, ja päätykappale [10]. Yleiskokouksen flagellum alkaa alussa spermiogenesis. Aikana flagellum biogenesis, pari keskusjyvänen siirtyy vastakkaiselle puolelle kehittää akrosomistaan ​​on perinuclear tilaan pyöreän spermatidien, jossa yksi kahdesta keskusjyvänen muodostaa flagellaarinen axoneme. Tämän jälkeen axoneme työntyy esiin spermatidien, jolloin saatiin siiman [8]. Yli 400-proteiineja on löydetty siiman, mutta vain murto-osa proteiineista on karakterisoitu molekyylitasolla ja osoitettu toimivan rakenteellisia, metabolisten tai signalointia proteiinien [11], [12].

syöpä /kivesantigeenien (CTA: t) ovat ryhmä proteiineja, joita ilmentyy runsaasti erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mutta niiden ekspressio normaaleissa kudoksissa kohdistuu pääasiassa kivesten ja munasarjojen sukusolujen [13] – [15]. Koska niiden ominaisuus ekspressiokuviota, CTA: t käytetään ennustetekijöitä markkereina erilaisia ​​kasvaimia ja pidetään myös lupaavia kohteita syövän immunoterapiassa [16] – [18]. Vähintään 70 CTA geeniperheistä osallistui yli 240 yksittäisiä geenejä (tai isoformit) on tunnistettu tähän mennessä [19]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CTA: t yleensä on rooli sekä kasvainten synnyssä ja gametogeneesiin [14], [15], [20]. Kuitenkin tietoa toiminto ja tarkka sijainti solun Toimintakehotukset sukusolujen ja syöpä kudoksiin on niukkaa verrattuna tietoja niiden ilmaisun ja immunogeenisyys [13], [15].

ilmentyy antigeenin melanooman (PRAMEn) on jäsen CTA: t, ja tunnistettiin alun perin kasvaimen antigeeni ilmaistaan ​​melanoomasoluissa, liipaisu autologisen sytotoksinen T-solu-välitteisen immuunivasteen [21].

PRAMEn

on monen kopion geenistä edustaa yksi monistetun geenin perheitä eutherian nisäkkäillä, jossa ~ 90 kappaletta hiiren, ~ 50 kopiota ihmisen ja ~ 30 kopiota naudan genomissa [19] , [22], [23]. Mielenkiintoista,

PRAMEn

on siirrettävissä ja monistettiin Y-kromosomi on nauta linjaa, viitaten rooliin mies lisääntymiseen [19]. Jäsenet

PRAMEn

geeniperheen koodata LRR (leusiinirikkaita uusinta) proteiineja, taita hevosenkengän muotoon niiden tertiäärirakenteessa. Ensisijainen tehtävä LRR proteiinien on tarjota monipuolinen rakenteellisen kehyksen muodostumista proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia erilaisten molekyyli- tunnustamista prosesseja, mukaan lukien signaalitransduktio, soluadheesio, transkription säätelyyn, RNA käsittely, apoptoosi, immuunivasteen, ja solujen polarisaatio [24 ] – [28]. Ilmentymistä ja toimintaa PRAME on tutkittu laajalti erilaisissa syöpäsoluissa, ja korkea PRAME ilmentyminen korreloi syövän etenemisessä [28] – [30]. Vuonna melanoomasoluja, PRAME toimii repressori retinoiinihapon (RA) signalointi kautta vuorovaikutuksen RA reseptorien (RAR) ja rekrytointi Polycomb proteiinien [27], [31]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että PRAMEn toimii transkription aktivaattori. Costessi

et al.

(2011, 2012) raportoi, että PRAMEn on osa Cullin2 perustuu E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla ja tarvitaan rekrytoida Cullin2 ubikitiinipromoottori ligaasilla EKC /KEOPS monimutkainen. Tämä kompleksi liittyy aktiivisten promoottorien säätelee

tumatranskriptiotekijä Y

(

NFY

) [29], [32]. Oletamme, että PRAMEn myös tärkeä rooli spermatogeneesin. Aloitusvaiheessa testata hypoteesia ja leikellä molekyyli rooli PRAMEn geeniperheen lisääntymisessä, päätimme työskennellä hiiren

PRAMEn kaltainen 1

(

Pramel1

) geeni, edustaja

PRAMEn

geeniperheen, joka on homologinen ihmisen

PRAME-,

ja sijaitsee hiiren kromosomissa (MMU) 4. tässä työssä olemme tunnettu

Pramel1

geeni suhteessa sen mRNA ja proteiini ekspressiokuviota ja solusijaintipaikan aikana kiveksissä kehittämisen ja spermatogeneesin.

tulokset

Emikukat ilmentymisen analyysi hiiren

Pramel1

kiveksissä

ekspressiokuvio hiiren

Pramel1

geenin (acc. nro. NM_031377) tutkittiin 11 aikuisen hiiren kudoksista RT-PCR: llä. Vertailun vuoksi, viisi muuta paralogit hiirestä

PRAMEn

perhe (X-linked

PRAME-

,

Pramel3

, ja

Pramel

, ja MMU4- liitetty

Pramef8

ja

Pramef12

) analysoitiin myös (taulukko 1). Tulokset osoittivat, että kaikki kuusi paralogeille olivat erittäin ilmaistaan ​​kiveksissä, vaihtelevalla ekspressiotasot muissa kudoksissa (Fig. 1).

Pramel1

ja

PRAMEn

mRNA: t nimenomaan ilmaistu kiveksissä, kun taas

Pramel

,

Pramel3

,

Pramef8

, ja

Pramef12

mRNA: ita ekspressoidaan pääasiallisesti kiveksen kanssa heikkoa ilmentymistä munasarjassa, maksassa, pernassa, munuaisissa, aivoissa, keuhkoissa, lihaksissa ja kateenkorva (Fig. 1a). Tutkimaan edelleen ajallinen ja paikallinen ilmauksia

Pramel1,

teimme aika kurssin tutkimuksen aikana kives kehitystä. Meidän RT-PCR-tulokset osoittavat, että vaikka alemman tason

Pramel1

mRNA ilmentyi vastasyntyneen kiveksissä, korkeamman tason vakiona ekspressiota havaittiin 1-week- kautta 8-viikon ikäisiä kivekset (kuvio . 1b).

a. Spatial ilmentymisen analyysi kuuden

PRAME

paralogeille kesken 11 eri aikuisen hiiren kudoksista.

PRAME-

ja

Pramel1

ilmaistiin erityisesti kiveksissä, kun taas

Pramel, Pramel3, Pramef8

ja

Pramef12

ilmaistiin pääasiassa gametogenic kudoksissa on alhainen ilmentymisen taso maksa-, munuais-, aivoissa, ohutsuolessa, keuhkoissa, lihaksissa ja kateenkorva. b. Ajallinen ilmentymisen analyysi

Pramel1

aikana kives kehitystä. Alhainen ilmentyminen havaittiin vastasyntyneen kiveksissä, kun taas jatkuva korkea ekspressio havaittiin kiveksissä 1- 8-viikon ikäisiä hiiriä.

Actb

käytettiin positiivisena kontrollina. M: markkeri; Ov: munasarja; Te: kives; Li: maksa; Sp: perna; Ki: munuainen; Br: aivot; Si: ohutsuoli; Ly: imusolmuke; Lu: keuhko; Mu: lihakset; Th: kateenkorva; -: Negatiivinen kontrolli.

Sen määrittämiseksi, onko PRAMEL1 proteiini ilmentyy kiveksissä, western blot-analyysi suoritettiin koko kiveksen lysaatti kypsä hiirillä käyttäen PRAMEL1-spesifistä vasta-ainetta. Kuten kuviossa 2a PRAMEL1 vasta-aine tunnistaa tietyllä taajuusalueella, jonka molekyylipaino on ~ 57 kDa: n, joka on ennustettu molekyylipaino hiiren PRAMEL1 proteiinin (acc. Nro. NP_113554). Lisäksi, hyvin pieni alue (~ 42 kDa) havaittiin (Fig. 2a). Testata spesifisyyden vasta-aineen, teimme pre-absorption ohjaus peptidin käytetään tuottamaan PRAMEL1 vasta-aine, jossa ei detektoitiin (Fig. 2a), mikä viittaa siihen, että vasta-aine on PRAMEL1-spesifinen ja vähäisempi rintama edellyttää lisätutkimuksia. Aika tietenkin analyysi PRAMEL1 proteiinin lisäksi ilmoittanut, että sen ilmentyminen kiveksissä oli ikäsidonnaisia ​​(Fig. 2b). Proteiini ekspressiotaso oli hyvin alhainen, vastasyntyneen vaiheessa (Fig. 2b), sopusoinnussa alhainen transkription havaittiin RT-PCR (Kuva. 1 b). Ilmaisua lisättiin vähitellen 1- 3 viikon ikäisiä kivekset, ja pysyi sitten vakiona, kun kolmen viikon iässä (Fig. 2b). Positiivisena kontrollina, monoklonaalinen β-aktiini (ACTB) vasta-ainetta käytettiin havaitsemaan ACTB, ja odotettu proteiinia 42 kDa: n havaittiin (Fig. 2a, 2b).

a. Western blot-analyysi PRAMEL1. Proteiiniekstraktit aikuisen hiiren kives tehtiin Western blot -analyysillä käyttämällä hiiren PRAMEL1 vasta-aine. Immuuni-reaktiivisen proteiinin, jossa on odotettu molekyylipaino on ~ 57 kDa: n havaittiin kiveksissä, ja hyvin pieni kaistan ~ 42 kDa: n havaittiin myös. Positiivisena ja latauskontrollina monoklonaalinen ACTB vasta-ainetta, ja odotetun immuuni-reaktiivisen proteiinin 42 kDa havaittiin. Negatiivisena kontrollina, teimme pre-absorption valvontaa peptidi käytetään tuottamaan PRAMEL1 vasta-aine, eikä detektoitiin. b. Aika tietenkin analyysi PRAMEL1 proteiinin ilmentymisen aikana kives kehitystä. Uutteissa vastasyntyneen (Nb), 1 viikon (1w), 2 viikkoa (2w), 3-viikkoa (3W), 4-viikkoa (4w) ja 8-viikkoa (8w) -old kivekset alistettiin western blotting hiirellä PRAMEL1 vasta-aine. Ilmaisu taso PRAMEL1 vähitellen kasvanut Nb 3W ja pysyi sitten vakiona jälkeen 3-viikon iässä. Numerot vasemmalla ilmaisevat molekyylipainojen standardiproteiineista.

paikallistaminen PRAMEL1 proteiinin spermatogeneesin aikana

tutkineet solujen, ajallisen ja ilmentyminen PRAMEL1 proteiinin aikana sukusolujen kehittäminen epäsuoralla immunofluoresenssimikroskoopilla. Aluksi tutkimme PRAMEL1 proteiini lokalisointi poikkileikkaukset kivesten nuorilla hiirillä, vastasyntyneestä 3-viikon iässä. Kuten on esitetty kuviossa. 3, ei ollut spesifistä värjäytymistä, joka havaittiin, että PRAMEL1 vasta-aineen koko osio 1-viikkoa vanhoja kives (Fig. 3a, c), mutta heikosti epäspesifinen tausta värjäytymistä havaittiin sekä PRAMEL1 vasta-aineella (Fig. 3a, c) ja pre-imeytyy peptidi ohjaus (Fig. 3d). Tämä voi olla seurausta suhteellisen alhainen ilmentymisen transkriptin ja proteiinia tässä vaiheessa (Fig. 1 b ja 2b). Verrattuna esiabsorboitiin peptidi valvonta, jossa joitakin ei-spesifistä värjäytymistä havaittiin (Fig. 3i), spesifistä värjäytymistä nähtiin, että PRAMEL1 vasta-aineen pääasiassa sytoplasmassa spermatosyyteiksi 2 viikon ikäisissä kives (Fig. 3f, h) . Kun hiiret saavutti 3 viikon iässä, hyvin ainutlaatuinen ja vahva värjäytyminen havaittiin, että PRAMEL1 vasta-aineen perinuclear alueella kierroksen spermatids (Fig. 3k, m), jossa cap-rakenne on ydinalan pinnalla havaittiin (kuvio . 3m).

poikkileikkaukset 1 viikon (a-e), 2 viikon (f-j) ja 3 viikkoa (k-o) -old hiiren kivekset värjättiin hiiren PRAMEL1 vasta-aine. Vaikka ei ole erityistä signaalia havaittu poikki siementiehyiksi in 1-viikon ikäiset kives, spesifistä värjäytymistä (vihreä) havaittiin solulimassa spermatosyyteiksi (f, h) 2 viikon ikäisissä kiveksissä ja perinuclear alue kierroksen spermatids ( k, m) 3 viikkoa vanhoja kiveksissä. Paneelit a, f, k ovat PRAMEL1 vasta-värjäystä. Paneelit b, g ja l vasta- värjätään DAPI visualisoida ytimiä. Paneelit c, h ja m ovat sulautuneen kuvia varten PRAMEL1 ja DAPI värjäystä. Nuolen päät osoittavat alueella on kuvattu signaaleja. Paneelit d, i ja n ovat peptidi-esiabsorboitiin vasta-värjäystä negatiivisena kontrollina. Paneelit e, j ja o ovat H Fig. 5 h).

poikkileikkaukset aikuisen (≥ 2 kuukautta vanha) hiiren kivesten oli double-värjättiin hiiren PRAMEL1 (vihreä) ja TUBA (punainen) vasta-aineita. PRAMEL1 värjäytyminen havaittiin kierroksella (a), pitenevä (e) ja pitkänomainen (i) spermatids aikana spermiogenesis. Tuuba värjäytyminen havaittiin pitenevä (f) ja pitkänomainen (j) spermatids, mutta ei kierroksella spermatids (b). Kaikki leikkeet vastavärjättiin DAPI (Paneelit c, g, k ja o) visualisoida ytimeksi. Paneelit d, h, l ja p sulautetaan kuvia PRAMEL1, TUBA ja DAPI värjäystä. Nuolen päät osoittavat alueella on kuvattu signaaleja. Sisäkkeet in d, h, ja l suurennetaan kuvan nuolenkärki-merkityillä alueilla (katso myös kuvio. 5a, c, e ja g). Paneelit m ja n ovat sekundäärinen vasta-aine säätimet FITC-leimattua aasin anti-vuohi lgG: llä ja TRITC-leimattu aasin anti-hiiri-IgG, vastaavasti. Suurennus on × 400. Asteikko bar = 20 pm.

Kivesten kohdissa (a, c, e ja g) ja squash valmisteita siementiehyiksi (b, d, f ja h) värjättiin anti-PRAMEL1 (vihreä) , anti-TUBB (punainen) ja DAPI (sininen). Sulautuneen kuvia triple-värjäys kierroksella spermatids (a ja b), pitenevä spermatids (c, d, e ja f) ja pitkänomainen spermatids (g) on ​​esitetty. PRAMEL1 värjäytyminen havaittiin akrosomien rakkulan alueen kaikkien kehittää spermatids ja TUBB värjäytyminen havaittiin Manchette on pitenevä ja pitkänomaisen spermatids. Koska sekundaarinen vasta-aine-ohjaus kives squash valmisteen (h) värjättiin FITC-leimatun aasin anti-vuohi lgG: llä ja TRITC-leimattu aasin anti-hiiri-IgG. Suurennus on × 1000. Asteikko bar = 10 pm.

lokalisaatio PRAMEL1 kivesten ja lisäkivesten siittiöiden

Tutkimme lisäksi solunsisäisen jakautuminen PRAMEL1 Kivesten /epididymal siittiöt suorittamalla epäsuora Immunofluoresenssivärjäystä käyttäen PRAMEL1- ja α-tubuliinin (TUBA) spesifisen vasta-aineita. Siittiöt kerättiin litistynyt siementiehyiksi kypsä kivekset, ja Caput, corpus ja cauda alueilla lisäkives. Tulokset paljastivat, että samanlainen värjäytymistä spermatids, PRAMEL1 pääasiassa lokalisoitu etuosan akrosomin alueelle siittiöiden (Fig. 6a, b, d, e, taulukko 2). Koska eri värjäyskuviot havaittiin välillä kivesten ja lisäkivesten siittiöiden, yli 200 siittiöt kustakin ryhmästä (taulukko 2) tutkittiin tutkia yksityiskohtaisesti lokalisoinnin PRAMEL1 proteiinin siittiösoluissa. Huomasimme, että kaikki kivesten siittiöiden (100%) osoitti akrosomien paikallistaminen PRAMEL1, kun taas vain 86,5% on epididymal siittiöiden oli positiivinen PRAMEL1 vuonna akrosomien alueella (taulukko 2). Lisäksi PRAMEL1 havaittiin pääasiallinen pala flagellum (41%) Kivesten siittiöiden (Fig. 6a, taulukko 2), kun se havaittiin liitoskappaleen (96%) ja välikappale (87,9%) vuonna epididymal siittiöt (caput, corpus, ja cauda) (Fig. 6a, b, d, e, taulukko 2). PRAMEL1 värjäytymistä nähtiin myös sytoplasmisen pisaroiden lisäkiveksen siittiöiden (Fig. 6d). Olemme havainneet, että 55% on lisäkiveksen siittiöiden oli sytoplasminen pisaroiden sijaitsee distaalipäässä keskikappaleen. Noin 73% näistä sytoplasminen pisaran-, joissa siittiöt osoitti PRAMEL1 signaalin sytoplasman pisaran (Fig. 6D, taulukko 2). Havaitsimme myös, että prosenttiosuus sytoplasman pisaran kantavien siittiöt vaihteli kolmesta hiiriä tutkittiin. Sekä kivesten ja lisäkiveksen siittiöt, ei PRAMEL1 värjäytymistä havaittiin renkaan alueella siiman. TUBA paikallistettiin etummaisessa akrosomien alueella sperman päätä, ja keskimmäinen pala ja pääasiallinen pala sperman flagellum of epididymal siittiöiden (Fig. 6a, b, d, ja e). Mitään signaalia ei havaittu, kun ensisijainen aineet jätettiin pois aikana värjäytymistä, mikä viittaa siihen, vähäinen ei-spesifinen sitoutuminen fluoresoivasti leimattuja sekundaarisia vasta-aineita (Fig. 6c, f).

Hiiri siittiöt kerätään squash valmisteet siementiehyissä (a , b ja c) ja lisäkiveksiin (d, e ja f) värjättiin PRAMEL1 (vihreä), TUBA (punainen) vasta-aineita ja DAPI (sininen). PRAMEL1 värjäytyminen havaittiin Akrosomi alueella kivesten ja lisäkivesten siittiöiden (a, b, d ja e). Kivesten siittiöiden (a) PRAMEL1 havaittiin myös pääasiallinen pala siittiöiden flagellum, kun taas lisäkivesten siittiöt (d ja e) PRAMEL1 värjäytyminen havaittiin etupäässä liitoskappale, välikappale ja sytoplasman pisaran. Koska sekundaarinen vasta-aine ohjaus kivesten (c) ja lisäkiveksen (f) siittiöt värjättiin FITC-leimatun aasin anti-vuohi lgG: llä ja TRITC-leimattu aasin anti-hiiri-IgG. Suurennus × 1000. Asteikko bar = 10 pm.

Keskustelu

Vaikka PRAMEn on tutkittu laajalti kasvainten synnyssä ja syövän biologian, ja sitä käytetään biomarkkerina syövän diagnosointiin ja antigeeniä tiettyjä syövän immunoterapiassa [28] – [32], [34], funktio PRAMEn geeniperheen gametogeneesiin ja lisääntymiseen ei ole selvitetty. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnettu mRNA ja proteiinin ilmentyminen hiiren

Pramel1

geeni, jäsen

PRAMEn

geeniperheen aikana kiveksissä kehittämisen ja spermatogeneesin. Tuloksemme osoittivat selvästi, että PRAMEL1 ilmentyy sytoplasmassa spermatosyyteiksi ja Akrosomi ja flagellum spermatids ja siittiöiden, jotka tarjoavat ensimmäistä käsityksen mahdollinen funktio

PRAMEn

geeniperheen spermatogeneesin. Jotta ymmärtää biologinen rooli (t) tämän koko geenin perhe ja suhde

Pramel1

ja muut perheenjäsenet, me haetaan ilmaisulliset tietoja yhteensä 10

PRAMEn

paralogeihin alkaen Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/geo) (taulukko 3) [35] – [40]. Yhdessä RT-PCR saadut tiedot tästä työstä, pystyimme klusterin nämä paralogeihin kolmeen suureen ryhmään niiden ajallisen ja ilmaisun profiileja: ryhmä I, ilmaista vain miehen sukurauhasten ja sukusolujen (

PRAMEn

ja

Pramel1

); ryhmä II, ilmaistaan ​​vain naisten sukurauhasten ja sukusolujen (

Oog1-3

); ja ryhmä III, pääasiassa ilmaistu sekä miesten että naisten sukuelimiin (

Pramel, Praeml3, Pramef8, Pramef12,

ja

Oog4

) (taulukko 3). Yhdessä eriävät ilmaus kuviot

PRAMEn

paralogeihin aikana gametogeneesiin sekä miesten ja naisten osoittavat, että eri jäsenten

PRAMEn

geeniperheen voi olla mukana eri kehitysvaiheissa gametogeneesiin ja alkionkehityksen.

on raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa, että eri Toimintakehotukset ovat mukana eri vaiheissa spermatogeneesin. Joista jotkin on ilmaistu ainoastaan ​​yhdessä vaiheessa, kuten SYCP1 (

synaptonemal monimutkainen proteiini 1

, joka tunnetaan myös HOM-TES-14), joka on rajoitettu meioottisissa prophase spermatosyyttien, ja SP17 (

sperma proteiini 17

), joka on ilmaistu kypsä siittiöitä ainoa [41], [42]. Muut CTA: t, kuten CTAG1 (

syöpä /kives-antigeeni 1

, joka tunnetaan myös nimellä NY-ESO-1) ja TRO (

trophinin

, joka tunnetaan myös nimellä

magphinin

tai MAGE -D3), ilmaistaan ​​useissa vaiheissa spermatogeneesin. CTAG1 ilmaistaan ​​spermatogonioista kautta pachytene spermatosyyteiksi [43], [44], kun taas TRO ilmentyy lähes kaikkien sukusolujen välillä spermatogonioiden kypsä siittiöitä [45]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että, kuten

Vian

geenin hiiren

Pramel1

ilmaistaan ​​laajasti eri sukusolujen spermatogeneesin aikana. PRAMEL1 proteiini havaittiin ensimmäisen kerran, joskin suhteellisen alhaisella tasolla, myös vastasyntyneiden kivekset Western-blottauksella, mikä viittaa ilmaus PRAMEL1 spermatogonioista. Asteittain tehostettuun PRAMEL1 havaittiin kivesten 1-, 2-, 3-viikon iässä ja ylläpidetään korkeammalla tasolla kypsillä kivekset. Tämä kasvu proteiinin ilmentymisen sama nousu RNA ilmentymisen vastasyntyneestä 1 viikon ikäisiä kivekset, ja voitiin selittää ylös-säätely geenin ilmentymisen, tai vaihtoehtoisesti, lisääntyminen määrä sukusolujen siellä on dramaattinen sukusolujen leviäminen ennen ensimmäisen aallon spermatogeneesin.

Toisin kuin syöpäsoluja, jossa PRAMEn proteiini tumassa, hiiri PRAMEL1 nähtiin ensimmäisen kerran sytoplasmassa spermatosyyteiksi 2 viikon ikäisissä kivekset tässä tutkimuksessa. Hallitseva ilmentyminen PRAMEL1 proteiinin sitten havaittiin etummaisessa alueella (pyöreä, pitenevä ja pitkänomainen) spermatids, koordinoida morfologisiin korjauksilla Akrosomi, mikä viittaa siihen, että

Pramel1

on rooli akrosomin kehittämisessä . Lisäksi havaitsimme, että PRAMEL1 oli differentiaalisesti jakautuneet eri puolilla siittiöiden flagellum välillä kivesten ja lisäkivesten siittiöiden. Koska siittiöiden vahvistuksen motiliteettia siirryttäessä kives on caudal alueelle lisäkiveksiin, tasauspyörästön lokalisaatio PRAMEL1 pitkin eri puolilla flagellum aikana siittiöiden siirtyminen voi olla osoitus siitä, että PRAMEL1 on mukana siittiöiden kypsymiseen ja liikkuvuuteen (ks keskustelua alla ).

Aikaisemmat tutkimukset syöpäsoluissa osoitti, että PRAMEn toimii joko transkription vaimennin RA signaloinnin [27], tai transkription aktivaattori on promoottorialueille sitovat NFY [29], [32]. Kuitenkin meidän tiedot viittaavat siihen, että

Pramel1

eivät voi osallistua transkription säätelyyn kautta radio- ja NFY-mekanismeilla, koska (1) PRAMEL1 on lokalisoitu sytoplasmaan sukusolujen spermatogeneesin aikana, ja (2) tärkeintä, transkriptio ajetaan alas puolivälissä spermiogenesis [27], [29], [31] ja siittiöt ovat terminaalisesti erilaistuneita soluja oleellisesti vailla transkription ja translaation toimintaa [46].

on syytä huomata, että kaksi LRR- sisältävät, kives-ekspressoidut proteiinit ovat sekaantuneet spermiogenesis, eli LRRC67 (

leusiinirikkaita toista, joka sisälsi 67

, joka tunnetaan myös kiveksissä LRR tai TLRR) ja PPP1R7 (

proteiinifosfataasi 1, sääntely (estäjä) alayksikön 7

, joka tunnetaan myös nimellä Sds22) [47], [48]. Molemmat proteiinit ovat vuorovaikutuksessa keskeinen fosfataasi,

proteiinifosfataasi 1

(PP1), joka toimii napa geeni useisiin sääntelyprosessit [46] – [48]. LRRC67 proteiini vuorovaikutuksessa PP1 jolloin muodostuu kompleksi osallistuu solun tukirangan uudelleenjärjestelyn miespuolisilla sukusoluilla [49]. LRRC67 proteiini myös vuorovaikutuksessa kinesiinin liittyvä molekyyli moottori, KIFC1 (

kinesiiniin perheenjäsen C1

), kuljettaa molekyylit pitkin mikrotubulusten että Manchette [33], [50]. Samoin vuorovaikutus PP1 ja PPP1R7 on myös liitetty siittiöiden kehitystä. Dimerointi PPP1R7 ja PP1γ2 johtaa laskua fosfataasiaktiivisuutta PP1γ2 ja myöhemmin indusoi liikkuvuusluokka pyrstöevän siittiöiden [51], [52]. Johtuen samanlaisia ​​rakenteellisia ja ilmaisun malleja, arvioimme PRAMEL1 voivat olla vuorovaikutuksessa PP1γ2 kuljettaa molekyylit pitkin mikrotubulusten siittiöitä flagellum. Vielä on selvitettävä, onko PRAMEL1 suorittaa samanlaisen tehtävän Akrosomi muodostumiseen ja siittiöiden liikkuvuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

C57BL /6J hiiriä kasvatettiin meidän pesäke Pennsylvania State University hiiri laitos, ja yhteensä kuusi paria kasvattajien perustettiin. Kivekset poistettiin hiiristä 0 päivää (vastasyntynyt), 1 viikko, 2 viikkoa, 3 viikkoa, 4 viikkoa ja 8 viikon iässä. Vähintään kolme eläintä (biologiset toistoa) käytettiin kussakin ikäryhmässä. Kivekset, lisäkivesten ja muiden kudosten aikuisen miehen kasvattajat ja munasarjat päässä naisen kasvattajat kerättiin jälkeen lisääntymisaikana. Kaikki eläin menettelyt hyväksyttiin Pennsylvania State University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC).

valmistaminen kivesten kudosten

kives histologia, koko kivekset irrotettiin aikuisten hiirten ja kiinteä inkuboimalla yön yli Bouin liuokseen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 4 ° C: ssa. Kudokset pestiin sitten 70% etanolissa, poistetaan vesi, ja upotettiin parafiiniin lohkoja. Parafiini-sulautettujen Kudokset leikattiin 4 um käyttämällä mikrotomia ja kiinnitettiin objektilaseille.

litistynyt kiveksen näytteet valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [53]. Lyhyesti, aikuisen kivekset irrotettiin ja siirretään lasi petrimaljaa jääkylmällä PBS: llä (140 mM NaCl, 2,6 mM KCI, 6,4 mM Na

2HPO

4, ja 1,4 mM KH

2PO

4, pH 7,4). Poistamisen jälkeen tunica albuginea, siementiehyiksi siirrettiin uuteen petrimaljaan, joka sisältää PBS. Käyttämällä hieno pihdit, tubulukset hellävaraisesti vetää erilleen ja pieni pala single kiemuratiehyessä leikattiin. Pala siementiehyiden tubule siirrettiin uuteen petrimaljaan ja 15-30 ui 0,1 M sakkaroosia, joka oli valmistettu PBS: ään. Solut vapautettiin tubulussolujen jonka tweezing erilleen tubulussolujen ja uudelleen suspendoimalla se sakkaroosiliuoksessa pipetoimalla ylös ja alas.