Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntynyt CCL5- tasot ovat markkereita epäsuotuisa lopputulos potilaalla on melanooma, rinta-, kohdunkaulan, eturauhas-, maha- tai haimasyöpä. Täällä olemme arvioineet roolia CCL5- /CCR5 vuorovaikutukset kehityksessä paksusuolen syövän. Tätä varten olemme tutkineet useita ihmisen kolorektaalisyöpää kliinisissä näytteissä ja löysi CCL5- ja sen reseptorit yli-ilmentynyt perusterveydenhuollossa sekä maksan ja keuhkojen etäpesäkkeet potilaiden verrattuna terveisiin kudoksiin. In vitro, CCL5- lisäsi kasvua ja muuttavien vasteet koolonkarsinoomasoluissa sekä ihmisen ja hiiren alkuperää. Lisäksi systeeminen hiirten käsittely CCL5 suunnatulla vasta-aineita vähensi laajuus kehityksen ihonalainen paksusuolen kasvaimet, maksan etäpesäkkeiden ja peritoneaalikarsinoosi. Johdonmukaisesti, löysimme lisääntynyt määrä CD45-immunoreaktiivisten solujen stroomaan jäljellä leesioiden sekä rajapinnan kanssa tervettä kudosta. Sen sijaan, valikoiva kohdentaminen CCR5 kautta annon TAK-779, CCR5-antagonisti, vain osittain vaarantunut paksusuolen syövän etenemisessä. Lisäksi CCL5- neutralointi sulatettu kasvainten herkempi PDGFRβ suunnatun strategian hiirillä, tämä yhdistelmä hoito tarjoaa suurimman suojan maksametastaaseihin ja tukahduttamalla makroskooppisen peritoneaalikarsinoosi. Yhdessä meidän tiedot osoittavat osallistumista CCL5- patogeneesissä kolorektaalisyöpää ja kohta sen mahdollisesti arvoa terapeuttisena kohteena.

Citation: Cambien B, Richard-Fiardo P, Karimdjee BF, Martini V, Ferrua B , Pitard B, et ai. (2011) CCL5- neutralointi Rajoittaa Syöpä Kasvu ja Voimistaa kohdentaminen PDGFRβ vuonna peräsuolen syöpä. PLoS ONE 6 (12): e28842. doi: 10,1371 /journal.pone.0028842

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 16 marraskuu 2011; Julkaistu: 20 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Cambien et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Institut National de la Sante et de la Recherche médicale ja Association pour la Recherche sur le Cancer (Grant 3707). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Bruno Pitard omistaa varastosta In-Cell-Art Co, joka kehittää 704 rokotteen sovelluksiin. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kasvain-stroomavuorovaikutuksiin kirjataan kriittisiä komponentteja kasvaimen invaasion ja metastaattisen potentiaalin paksusuolen karsinooma [1]. Strooman, tulehdus- ja syöpäsolujen viestivät keskenään suoraan solukontaktissa mutta myös epäsuorasti paracrine signaaleja [2], [3]. Tällaiset signaalit suosivat kasvaimen kehitystä monin tavoin: ne toimivat kasvutekijöitä, stimuloivat angiogeneesiä, moduloivat soluväliaineen, indusoi lisähenkilöstön stroomasolujen ja osallistua immuunijärjestelmää veronkiertotapausten syövän. Tämän seurauksena tunnistaminen kasvaimen edistäviä tekijöitä syöpähoitojen on tullut erityisen tärkeiksi laatia kasvainten vastaisen strategioita sen joko yksi- aineella tai yhdistelmähoitoa tapauksessa, jossa kasvaimet eivät vastaa ainoana lääkkeenä. Eri tekijöitä on tunnistettu, koska promoottorit paksusuolen syövän etenemisen, joista tavallisimpia ovat VEGF (verisuonten endoteelin kasvutekijä) perhe, FGF (fibroblastikasvutekijä) perheen ja PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä) perhe, niiden tuotanto sisällä kasvain korreloi kasvaimen ja lyhyempi potilaan eloonjääminen [4] – [8]. Viime aikoina on ollut yhä enemmän todisteita useista tutkimuksista myös meidän että kemokiinien tuotettu kasvain microenvironment voi myös ratkaiseva rooli patogeneesissä CRC (kolorektaalisyöpää) [9] – [12].

Niistä kemokiinien uskotaan vahvasti edistää syövän synnyn ja stromagenesis on CCL5- /RANTES (CC kemokiini ligandi 5 /valvotuilla aktivoinnin, normaali T-solu-ilmaistuna ja erittämä), joka alun perin kuvattiin sen keskeinen rooli kroonisissa tulehdussairauksissa. Todellakin, kliiniset tulokset ovat osoittaneet, että kohonneet kudoksen tai plasman CCL5- ovat markkereita epäsuotuisa lopputulos potilaalla on joko melanooma, rinta-, kohdunkaulan, eturauhas-, maha- tai haimasyöpä [13] – [20]. Rintasyövän,

in vivo

CCL5 neutralointi tai CCR5 antagonismi osoitettiin kumota MSC aiheuttama etäpesäke syöpäsolujen siten syytetään CCL5 /CCR5 on keskeinen akseli tässä maligniteetti [21]. Valikoiva kohdentaminen CCR5 /CCL5- signaloinnin johti myös vähensi kasvainten kasvua koe haiman adenokarsinooma hajottamalla CCR5-riippuvaisen rekrytointi säätelijä-T-solujen kasvaimia [22]. Anibamine, uusi CCR5-antagonisti tukahdutti myös invasiivisen ja metastaattisen ominaisuudet eturauhassyöpäsolujen hiirissä [23]. Lopuksi CCL5- saarto merkittävästi heikentynyt mahalaukun syövän etenemisessä [20]. Mielenkiintoista, CCL5- on viime aikoina raportoitu ekspressoituvan kolorektaalikarsinoomasta, pääasiassa leviämisrintamassa primaarikasvainten [24]. Edellä mainitun kliiniset havainnot useissa syövissä, se on houkuttelevaa spekuloida, että CCL5- ja sen reseptorit voivat olla merkittävä rooli CRC etenemiseen ja voi siten edustaa mielenkiintoinen kohde hoitoon tämän maligniteetti. Tähän mennessä ei kuitenkaan mikään näistä seikoista on käsitelty

in vivo

.

Tutkimuksen tässä kuvatut suunnattu nimenomaan saada uusia oivalluksia roolia CCL5- /CCR5 vuorovaikutukset kehittämisessä peräsuolen syöpä. Tätä varten olemme tutkineet useita ihmisen paksusuolen syövän kliinisiä näytteitä ja löytänyt CCL5- ja sen reseptorit yli-ilmentynyt perusterveydenhuollossa sekä maksan ja keuhkojen etäpesäkkeet CRC potilaista verrattuna terveisiin kudoksiin. Arvioida merkitystä CCL5- /CCR5 neutralointi paksusuolen syöpä, olemme käyttäneet syngeneeisissä kokeellisissa malleissa ortotooppisten (maksa) ja kohdunulkoinen (ihonalaiskerros) paksusuolensyöpä immunokompetenteilla hiirillä. Olemme tutkineet vaikutus CCL5- tai CCR5-estäjät annettiin yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä hiiren PDGFRβ kohdistetuksi, tämä strategia on parhaillaan kliinisen arvioinnin hoitoon CRC syöpiä. Tässä raportissa esitetään ensimmäinen prekliinisissä näyttöä rooli CCL5- paksusuolen syöpä ja osoittaa, että CCL5- saarto on mahdollista vähentää paksusuolen syövän etenemistä ja parantaa terapeuttisen vasteen usealle lääkkeelle kuuri.

Materiaalit ja menetelmät

Reagent

seuraavat reagenssia (TAK-779) saatiin läpi NIH aIDS Research and Reference Reagent Program, Division of aIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH.

kasvainsolulinjoja and Experimental Animals

Ihmisen HT29 ja hiiren CT26 koolonkarsinoomasoluille hankittiin ATCC ja pidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Nainen SCID ja BALB /c-hiiriä, 6-8 viikkoa vanhoja, hankittiin Harlan (Gannat, Ranska).

Ethics

kymmenen erilaista ensisijaista paksusuolen syövän kasvaimet ja metastaattinen kudosten samasta potilaat sekä pariksi ”terve” paksusuolen koepalat kerättiin potilailta, joilla invasiivisia adenokarsinoomat, joka tehtiin kirurginen koepaloja tai alustava leikkaus Institut Paoli-Calmettes (IPC, Marseille, Ranska) vuosina 1987 ja 2007. Kukin potilas antoivat kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja tutkimuksen hyväksyi IPC ”Comité d’Suunta stratégique”. Kaikki toimenpiteet, joissa koe-eläimiä ja niiden hoito hyväksyttiin Institutional Review Board (lupa numero # A06-088-14).

TaqMan reaaliaikainen PCR kokeita

Yhteensä RNA paksu- syöpä ja terve paksusuolen, hiirestä terve ja kasvaimen kudokset sekä paksusuolen sinoomasolulinjoja uutettiin käyttäen RNeasy (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska) ja cDNArksi käyttäen Superscript III entsyymi (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska) kuten aiemmin on kuvattu [11]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI PRISM 7900HT ja suoritettiin käyttäen TaqMan® geeniekspression määrityksiä ihmisen näytteitä (hCCR1: Hs 00174298m1, hCCR3: Hs 00356601m1, hCCR5 Hs 00152917m1, hCCL5: Hs 00174575m1) (Applied Biosystem, Courtaboeuf, Ranska ), tai SYBR® geenin ilmentymisen määrityksissä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems). Alukesekvenssit hiiren CCL5 olivat: eteenpäin, 5’TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3 ’; ja kääntää, 5’AACCCACTTCTTCTCTGGGTTG-3 ’, hiiren CCR1: eteenpäin, 5’AGGCCCAGTGGGAGTTCAC-3’; ja kääntää, 5’TCTTCCACTGCTTCAGGCTCTT-3 ’, hiiren CCR3: eteenpäin, 5’AAGCTTTGAGACCACACCCTATG-3’; ja kääntää, 5’GACCCCAGCTCTTTGATTCTGA-3 ’; hiiren CCR5, eteenpäin 5’TTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAAC-3 ’ja kääntää, 5’TTCTCCTGTGGATCGGGTATAGA-3’. Suhteellinen tasot mRNA ilmaisun määritettiin käyttämällä ACk

T-arvot saadaan vähentämällä C

T ohjaus (ihmisen tai hiiren aktiini) välillä C

T kohdegeenin mitattiin samalla RNA: n valmistaminen. Vertaileva mRNA-ilmentymisen tasoa terveillä (

X

) ja metastaattinen kudoksiin (

Y

) laskettiin käyttämällä kaavaa Δ

C

T

Y

–

ACk

T

X

ja ilmaistiin taita terve (2ΔΔ

C

T). Hiiren terve paksusuolen kudokset käytettiin analysoitaessa hiiren kasvaimia ja ihmisen terveen paksusuolen näytteitä käytettiin analysoimaan ihmisen kasvaimia ja HT-29 näytettä.

In vitro

runsaudenmäärityksessä

Lyhyesti koolonsyöpäsoluja esikäsitelty tai ei ole TAK-779 tai anti-CCL5 vasta-aineita (ilmoitettuina pitoisuuksina) ympättiin tiheydellä 10

4 solua /cm

2, ja niitä inkuboitiin joko seerumin rikastetun väliaineessa tai pohja-alustassa (joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiini), johon on tai ei ole eri pitoisuuksien rekombinantti CCL5 (Peprotech, Neuilly sur Seine, Ranska) 5 päivää ennen kuin ne irrotettiin trypsiinillä, kerättiin ja lueteltu kuten aikaisemmin on kuvattu [11].

In vitro

kemotaksiamäärityksessä

Kemotaktiset vasteita koolonkarsinoomasoluissa arvioitiin käyttämällä 24-kuoppaista kemotaksista kammiot ja polyetyleenitereftalaatti lisätään 8 um huokosia (Becton Dickinson, San Jose, CA ) päällystetty 6,5 ug /ml fibronektiiniä (Sigma, Lyon, Ranska) tai 50 ug /ml kollageenia (Becton Dickinson) ja CT26-solut tai HT29, vastaavasti [11]. Koolonsyöpäsoluja, esikäsitelty tai ei ole TAK-779 tai anti-CCL5 vasta-aineita (ilmoitettuina pitoisuuksina), sijoitettiin ylempään ja (5 x 10

4-solut) ja eri pitoisuuksia rekombinantti CCL5 (Peprotech) lisättiin alempiin kuoppiin. Sen jälkeen, kun levyjä oli inkuboitu 18 tuntia (CT26-solut) tai 40 tunnin ajan (HT29) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä, ei-siirretyn solut poistettiin ylemmältä hyvin ja siirrettyjä soluja kerätään alempi puoli insertin värjättiin kristallivioletilla väriainetta ja lueteltu. Migration indeksi laskettiin suhteena lukumäärän siirtynyt solujen kemoattraktantti sisältävien kaivojen jaettuna solujen määrän, jotka kulkeutuivat perustaa pelkästään elatusainetta.

PDGFRβ ilmentämisvektorin

koodaavan DNA: mPDGFRβ kloonattiin ja liitettiin pTOPO-cDNA3 eukaryoottiekspressiovektoriin (Invitrogen). Identiteetit sense (pcDNA3-PDGFRβ) ja antisense (kontrollivektori) tuotteet varmistettiin sekvensoimalla.

Plasmidi valmistelemiseksi ja

DNA-rokote plasmidi (pcDNA3-PDGFRβ) ja vastaava kontrollivektorin käytettiin antigeeneinä. Kaikki plasmidit puhdistettiin käyttämällä EndoFree plasmidin puhdistusta pylväät (Qiagen) ja vahvistettiin olevan vapaa endotoksiinikontaminaatio (endotoksiini 0,1 EU /ug plasmidi-DNA: ta) Limulus amoebocyte lysaattimäärityksessä (Lonza, Le Perray en Yvelines, Ranska). Tetrafunctionalized amfifiilinen lohkokopolymeeri 704 (MW 5500) toimitti In-Cell-Art (Nantes, Ranska). Kantaliuokset valmistettiin 20%: n (w /v) vedessä ja varastoitiin 4 ° C: ssa. Formulaatioita DNA 704 (lopullinen konsentraatio 0,3%) valmistettiin välittömästi ennen lihaksensisäistä injektiota, jonka equivolumetric sekoittuminen kopolymeerien veden kanssa DNA-liuosta, kuten aiemmin on kuvattu [25], [26]. DNA annokset on ilmoitettu koko tutkimuksen ajan.

Transfektio PDGFRβ ilmentämisvektorin

oikea ekspressio mPDGFRβ varmistettiin lyhytaikaisella transfektiolla CHO-solujen kontrollivektorilla ja DNA-rokotteen plasmidi ( pcDNA3-PDGFRβ) käyttäen AMAXA Biosystems (Lonza). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solulysaatit CHO-solut valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [27] ennen SDS-PAGE: lla. Western-blottaus suoritettiin joko vuohen anti-hiiri PDGFRβ vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, Ranska) tai laimennetulla seerumilla saatu PDGFRβ-vaccinated- hiirillä. Detection tehtiin joko kaniinin anti-vuohi ABS- tai vuohen anti hiiri ABS- konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Dako, Trappes, Ranska). Bändit tehtiin näkyviksi kemiluminesenssi-parannettu reaktio (Amersham, Les Ulis, Ranska).

Hiiri malleja

ihon alle, maksan ja keuhkojen etäpesäke malleja.

induktioon ihonalaisen ja maksan kasvainten, CT26-solut (5 x 10

4) tai HT29 (3 x 10

6) injektoitiin kylkeen tai sen maksan kapseli BALB /c- tai SCID-hiiriin, vastaavasti. Induktioon keuhkometastaasien, CT26-solut (3 x 10

4) tai HT29 (2 x 10

6) toimitettiin laskimoon häntäinjekti- BALB /c tai SCID-hiiriin, vastaavasti. Lopetettaessa täydellistä post mortem tutkimukset tehtiin. Ihonalainen ja maksan kasvaimet irrotettiin, punnittiin ja mitattiin liukumitalla kahdessa kohtisuorassa akselia (

ja

b

). Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla

ab

2π /6.

Lihakseen DNA- rokotteissa.

jälkeen profylaktisen ympäristössä, nukutettiin hiiriä rokotettiin 3 kertaa 3 viikon välein (päivinä 0, 21 ja 42), jonka lihakseen DNA-polymeerin formulaatioiden sekä

tibialis anterior

lihaksia kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [26]. Kolme viikkoa viimeisen sysäyksen (päivä 66), hiiret altistettiin injektoimalla 5 x 10

4 CT26 hiiren koolonkarsinoomasoluja alla maksan kapseli.

Hiiri hoitoja.

Anti -CCL5 tai ohjaus isotyypin IgG-vasta-aineiden (32 ug hiirtä kohti, Peprotech) injektoitiin vatsakalvon BALB /c-hiirten 72 tuntia tuumorin implantaation jälkeen, ja kahdesti viikossa ajaksi kokeissa (päivästä 69-87). TAK-779, pienten molekyylin CC kemokiinireseptori 5 (CCR5) estäjä [28], [29] ruiskutettiin hiiriin (150 ug /hiiri) 72 h kuluttua kasvainsolujen inokulaation ja päivittäin sen jälkeen, kunnes uhri (päivästä 69-87 ).

uhri (päivä 87), maksan kasvaimet leikattiin irti ja punnittiin. Ilmaantuvuus peritoneaalikarsinoosi hiiriin ilmaistiin prosentteina syöpätauti kantavien eläinten lukumäärä kussakin ryhmässä.

määritys seerumin mPDGFRβ-spesifisten Ab: ELISA

Seerumi kerättiin retro-orbitaaliverestä eri ajankohtina rokotuksen jälkeen immunisoiduista hiiristä. ELISA-levyt päällystettiin 2 ug /ml anti-hiiri-PDGFRβ vasta-aineita (Santa Cruz) 100 ul: ssa PBS: ää yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana aamuna levyt pestiin kaksi kertaa PBS /Tween 20 (PBST), kyllästettiin 30 minuutin ajan fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 1% kuorittua maitoa ja 0,12% Triton X-100 (määrityspuskuri), pestiin jälleen kaksi kertaa ennen kuin inkuboitiin 18 h huoneenlämmössä hiiren rekombinantti PDGFRβ. Toistuvan pesun sarjalaimennoksia seeruminäytteitä immunisoiduista hiiristä lisättiin hyvin kaksoiskappaleet. Levyjä inkuboitiin edelleen 2 h, pestiin neljä kertaa PBST: llä, ja sitoutuneen entsyymin aktiivisuus paljastui kromogeenisen OPD-substraattiliuosta ja mitattiin 490 nm: ssä.

Histologia /immunohistokemia

Formaliini -Kiinteä, parafiiniin upotetut leikkeet paksusuolen syöpä metastasoitunut kudokset värjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla morfologinen arviointi. Immunovärjäystä CD45 suoritettiin anti-hiiri-CD45 mAb (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, Ranska) avidiini-biotiini monimutkainen immunoperoksidaasimenetelmällä seuraavat mikroaaltouuni antigeeni haku. Ensisijainen vasta-aine korvattiin isotyyppiyhteensovitettu vasta viereisissä kudosleikkeiden negatiivisena kontrollina. Expression of CD45 hiiren perna käytettiin positiivisena kontrollina.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. ja analysoitiin käyttämällä paritonta Studentin

t

testiä tai Kruskal-Wallisin testiä monimuuttujille.

Tulokset

ilmentäminen CCL5- ja sitä vastaavan reseptorien resektoitua kolorektaalikarsinoomasta yksilöt

analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä (reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR) ekspressiotasot ihmisen CCL5 ja sen CCR1, CCR3 ja CCR5 kirurginen resektio paloja ihmisen ensisijainen paksusuolen kasvaimet, pariksi maksan ja keuhkojen peräsuolen syövän etäpesäkkeitä ja vastaavien terveiden kudosten kerätty samalta potilaista. Havaitsimme kohonneeseen CCL5- ilmentymisen Kolorektaalituumorien (6 kertainen, P 0,05), maksametastaaseista (8,5 kertaiseksi, P 0,05) ja keuhkojen etäpesäkkeet (4 kertaa, P 0,05) verrattuna terveisiin yksilöihin (kuvio 1A, Taulukko S1 ). Koska CCL5- toimii spesifisten reseptorien kautta, me tarkasteltiin myös tällaisten reseptoreita, joita esitettiin sisällä kasvain ja metastaattisen yksilöitä. Erilliset mallit niita ilmaisun mitattiin mukaan kohde-elin. Kun taas CCR1 ja CCR5 molemmat havaittiin yliekspressoituvat merkittävästi pahanlaatuisten maksan ja keuhkojen kudoksiin verrattuna vastaavaan kontrolliin koepaloja (P 0,01 maksassa, P 0,05 keuhkoissa), CCR3 havaittiin vain merkittävästi yliekspressoituvan perusterveydenhuollossa Kolorektaalituumorien verrattuna terveisiin elimiin (P 0,05) (kuvio 1A, Taulukko S1).

Analyysi ekspressiotasot ihmisen (h) tai hiiren (m) tavoitteet suoritettiin kvantitatiivinen RT-PCR-menetelmällä kirurginen resektio kappaletta ihmisen paksusuolen ja peräsuolen karsinooman (n = 10) (A), kokeellisissa ihonalainen kasvain (n = 6), maksassa (n = 6), ja keuhkometastaasien (n = 6), jotka ovat peräisin hiiren CT26-solut (B), tai jotka ovat peräisin ihmisen HT29 (C) verrattuna vastaavan terveen kudoksen (normaali ihmisen, n = 10, ja normaali hiiren paksusuolen, n = 6, vastaavasti). Suhteellinen ekspressiotasot laskettiin käyttäen standardin käyriä ja ilmaistaan ​​1 /ACt. ACt-arvot laskettiin substracting Ct normalisoimaan geenin Ct kohdegeenin, mitattiin samalla RNA: n valmistaminen. Vertaileva mRNA-ilmentymisen tasoa terveillä (

X

) ja metastaattinen kudoksiin (

Y

) laskettiin käyttämällä kaavaa Δ

C

T

Y

– Δ

C

T

X

ja ilmaistiin taita terve (2ΔΔ

C

T). Mustat palkit: ensisijainen tai ihon alle koolontuumoreissa; viivoitetut pylväät: maksametastaaseja; pilkullinen baareja: keuhkometastaaseista. * P 0,05, ** p 0,01.

Jotta voitaisiin edelleen arvioida roolia CCL5- /reseptorien akseli paksusuolensyöpä, olemme etsineet asiaan hiiren paksusuolen syöpä malli. Tätä varten olemme analysoineet kvantitatiivisella RT-PCR ilmentymistason CCL5- /niita ihmisen HT29 ja hiiren CT26 paksusuolen syöpäsoluja kasvatetaan viljelmässä. Havaitsimme CCL5- ja CCR5 ilmaisun molempien solulinjojen in vitro (taulukko S1). Mikään kahden muun CCL5 reseptoreihin (CCR1 ja CCR3) havaittiin HT29 taas CCR1 ekspressio havaittiin CT26 soluissa. Sen analysoimiseksi, onko ilmaisua malleja CCL5- /reseptoreihin pahanlaatuisia kudokset mukaisesti ne havaitaan ihmisen koepaloja, seuraavan kerran kehittäneet kokeellisissa malleissa ortotooppisten (maksan ja keuhkojen etäpesäkkeet) ja kohdunulkoinen (ihonalaiskerros) paksusuolensyöpä immunokompetenteilla ja immuunivajaissa hiirillä. Paksusuolen syöpäsoluissa hiiren (CT26) tai ihmisen (HT29) alkuperä ympättiin hiiriin joko ihon alle, alle maksan kapseli tai häntälaskimoinjektio tuottaa keuhkojen etäpesäkkeitä. Lopetettaessa tasot kemokiinien /reseptoreihin erillisten kohde-elimet arvioitiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä käyttäen hiiren alukkeita CT-26-johdettu tmors ja ihmisen alukkeet HT-29-ksenografteissa (kuvio 1 B ja C). Kohonneita CCL5- ilmentymisen havaittiin kaikissa kasvainmuodosta (ihonalainen, maksan ja keuhkojen) kehittyi hiiren CT26-solut ja ihmisen HT29 paitsi keuhkojen vaurioita peräisin CT26 soluista. Sitä vastoin kuviot ilmentymisen CCL5 reseptorien ovat monimutkaisia ​​ja muuttuvat, kun soluja kasvatettiin in vivo verrattuna viljelyolosuhteet. Kumpikaan kasvaimen mallit (CT26 ja HT29) täsmälleen näkyy rakenteessa kemokiinireseptoreiden ilmentymisen havaittiin ihmisen koepaloja. Sen vuoksi, joka perustuu siihen, että kaikki kolme CT26 kasvaintyypeissä (ihonalainen, maksan ja keuhkojen) ilmaistaan ​​sekä CCL5 ja CCR5 in vivo, kun taas HT29 ksenografteissa esillä tasot CCR5 alle kynnysarvon havaitseminen PCR-tekniikalla, olemme löytäneet tarkoituksenmukaista työskennellä CT26 mallien arvioida roolia CCL5- /CCR5 vuorovaikutusta kolorektaalikarsinoomasta. Lisäksi CT26 syngeeninen malli, joka on kehittynyt immunokompetenteilla hiirillä esiintyi myös sopivin ottamaan huomioon CCL5- /CCR5-riippuvaisen immuunimekanismeja varsinkin kun otetaan huomioon, että lopullisena tavoitteena oli yhdistää CCL5- saarto rokotteella strategiaa.

CCL5- tehostaa CRC solujen proliferaatio ja migraatio

in vitro

ilmentyminen CCL5- reseptoreihin ihmisen ja hiiren koolonkarsinoomasoluille on johtanut meidät kyvyn määrittämiseksi niiden yhteisten ligandin CCL5- edistää niiden leviäminen ja muuttoliike

in vitro

. Tätä varten tutkimme myös määrällisesti solujen kasvua pinnoituksen jälkeen CT26 ja HT29 5 päivää alhaisen tiheyden emäsväliaineessa yksin tai täydennetty eri pitoisuuksilla CCL5-. 5 päivän sisällä seerumistarvaatio, havaitsimme, että CRC-solut sekä alkuperän lisääntyä vasteena CCL5 hoitoon annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A ja C). Suurin kasvu havaittiin vastauksena 50 ng /ml CCL5-. Me seuraavaksi arvioitiin kyky CRC solujen siirtää vasteena CCL5. CT26 ja HT29-solut otettiin talteen, laitettiin muunnetut Boyden kammioihin ja annettiin siirtyä kohti erilaisia ​​pitoisuuksia CCL5. Kuvio 2B ja D osoittaa, että CRC solut muuttivat kemokiinin verrattuna emäsväliaineessa yksin. Koska keskeinen rooli CCR5 välittämisessä CCL5- toimia erilaisissa syöpäsoluissa, seuraavan kerran yritetty häiritä CCL5- /CCR5 Toiminnan TAK-779, ei-peptidi-CCR5-antagonisti on aiemmin kuvattu heikentää kasvainten kehittymistä haimasyövän [22]. Kasvavia annoksia TAK-779 (vaihteluväli 10-500 nM) testattiin CT26-solut mukaan IC50-arvot on kuvattu alhaisen nM [28], [29]. Havaitsimme annosriippuvainen vaikutus TAK-779 sekä kasvun ja vaeltavia vasteet CRC soluja, kuten on esitetty kuviossa 2E, ja F. Vahvin inhibitio saatiin 200 nM TAK-779, suuremmat annokset johtavat sytotoksisia vaikutuksia soluissa. Kuitenkin vain 28%: n CRC-vasteita kumottu CCR5 esto, mikä viittaa siihen, osallistuminen CCR5-riippumattomien mekanismien sekä soluprosesseihin. Eri pitoisuuksia anti-CCL5 vasta-aineet, jotka vaihtelevat 3-30 ug /ml, oli sitten soveltaa CT26-soluja. Kuten esitetään kuviossa 2G ja H, CCL5- neutralointi saatiin 10 ug /ml annos vasta täysin heikentynyt CRC soluja muuttavien ja kasvun vastauksia kemokiinin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että CCL5 /reseptorien aktivointi näkyy yhteinen piirre CRC-solujen erilliset alkuperää, ja että se voi välittää pahanlaatuisuuteen liittyvät ominaisuudet paksusuolen syöpäsoluja.

(A, C, E, G) lisäkasvu CT26 ja HT29 arvioitiin vastauksena 5 päivän hoidon emäsväliaineessa yksinään (BSA, avoimet pylväät), jossa seerumin rikastettu väliaineessa (FBS, viivoitetut pylväät) tai osoitetuilla pitoisuuksilla yhdistelmä-CCL5- ( täytetyt pylväät), läsnä ollessa tai puuttuessa TAK-779 tai anti-CCL5 vasta-aineita (ilmoitettuina pitoisuuksina). (B, D, F, H), CRC-solut analysoitiin kemotaksista vastauksena perustaa pelkästään väliaineen (BSA, avoimet pylväät), seerumin rikastettu väliaine (FBS, viivoitetut pylväät) tai ilmoitetun pitoisuudet rekombinantti CCL5 (täytetyt pylväät ), läsnä ollessa tai puuttuessa TAK-779 tai anti-CCL5 vasta-aineita. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM. kuusi määrityksiä. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

CCL5–niita vuorovaikutukset ovat osallisina paksusuolensyöpä kehittämiseen

koetin onko pahanlaatuisuuteen liittyvän ominaisuudet CCL5- kohdistaman päälle koolonkarsinoomasoluissa

in vitro

myös merkitystä

in vivo

, arvioimme vaikutus CCL5- neutralointi kehittämiseen CT26 paksusuolen kasvainten istutettiin ihonalaisesti immunopäte- Balb /c hiirillä. Päivänä 0, hiiret altistettiin ihon alle CT26-solut ihon alle. Eläimet käsiteltiin sitten päivinä +7, +10, +14 ja +18 kanssa kasvaimensisäisellä viranomaisten anti-CCL5- tai ohjaus isotyypin IgG. Lopetettaessa laajuus kasvaimen kehitystä arvioitiin mittaamalla kasvaintaakat. CT26-hiiriin kehittyi 7 päivän kuluessa ilmeni selvänä kasvain keskimäärin 20 mm

3 että kasvoi kooltaan ~336 mm

3 päivällä 21 (kuvio 3A). Sitä vastoin anti-CCL5 hoidetuissa hiirissä kehittyi kasvaimia, jotka kasvoivat alennettua verrattuna kontrolliin kasvaimia, tämä väheneminen on selvästi havaittavissa, kun kolmannen anti-CCL5 hoitoon (40%: n vähennys, P 0,01). Lopetettaessa niiden määrä oli kooltaan keskimäärin 202 mm

3, mikä vastaa 40%: n vähennys verrattuna ohjata taakkaa (P 0,05).

(A) Hiiret ihonalaisesti-altistettiin CT26 solujen vastaanotetun neljä kasvaimensisäisellä injektiota anti-CCL5- (open pistettä) tai isotyypin vasta-aineita (täytetty pisteet) on ilmoitettu aikoina. Kun uhri, laajuus kasvaimen kehitystä arvioitiin mittaamalla kasvaintaakat. (B) esiintyvyys ja laajuus kasvaimen kehitystä maksa CT26-hiiriin hoidettu anti-CCL5- tai isotyyppiyhteensovitettu vasta-aineita. (C) esiintyminen peritoneaalikarsinoosi ilmaistuna prosentteina hiirillä, syöpätauti. (N = 5 /ryhmä). * P 0,05, ** p 0,01.

Koska maksa on merkittävä kohde-elin CRC maligniteetti ja että korkeimmat ekspressiotasot CCL5-, CCR1 ja CCR5 löydettiin sisällä maksametastaaseja of ihmisen paksusuolen syövän potilaille, seuraavan kerran tavoitteena oli arvioida suojaava potentiaali anti-CCL5 käsittely kehittämällä kokeellisia maksametastaaseja immunopäte- hiirillä. Eläimet oli siis altistettiin injektio CT26 soluja maksassa kapseli ennen hoidettavan 72 tuntia inokulaation jälkeen ja kahdesti viikossa ajaksi kokeen kanssa vatsaonteloon viranomaisten anti-CCL5- vasta annoksella aiemmin osoitettu olevan tehokas [20], [21]. Vaikka 100% hiiristä Molempien ryhmien kehittynyt maksan kasvaimia, oli merkittävä väheneminen (30%) yleisessä kasvain kuorma maksa anti-CCL5- hoidetuissa hiirissä verrattuna kontrolliryhmään, jota arvioidaan mittaamalla maksan paino (1,24 vs 1,78, P 0,05) (kuvio 3B).

lisäksi maksan kasvaimet, myös havaitut erot laajuus macrospcopic peritoneaalikarsinoosi kahden ryhmän välillä hoitoja (kuvio 3C). Kun taas vatsakalvon levittäminen todettiin 100% verrokkihiirten, se havaittiin vain 40% niistä hoidettiin anti-CCL5- aineita.

mPDGFRβ rokottaminen vähentää kasvua CT26 paksusuolisyöpä etäpesäkkeitä

Koska anti-CCL5- strategia voisi johtaa vain kohtalainen terapeuttista vaikutusta paksusuolen syövän, me vieressä pyrittiin arvioimaan mahdollisuuksia CCL5- saarto antaa yhdistelmänä anti-PDGFRβ strategiaa. Todellakin, PDGF /PDGFRβ vuorovaikutuksen tiedetään avainasemassa edistettäessä useiden maligniteettien, mukaan lukien peräsuolen syöpä. Erityisesti Wehler et al [30], ovat osoittaneet, että PDGFRβ ilmaisu korreloi imusuonten levittämiseen ihmisen peräsuolen syöpä. Työskentely 99 ihmisen CRC koepaloja, kirjoittajat raportoitu immunohistokemiallisesti ja RT-PCR joka PDGFRβ ilmaisu esiintyi 60%: lla potilaista. Vastaavasti, PDGFRβ ekspressiota havaittiin ihmisen neljän CRC solulinjoissa: Caco-2, HT29, SW480 ja SW620. Tämän mukaisesti havaitsimme korkeita ekspressiotasoja mPDGFRβ in CT26 peräisin maksan metastaaseja (kuvio 4A). Näin ollen, olemme luoneet DNA-rokote, joka koodaa mPDGFRβ ja tarkasti oikein ilmentymisen mPDGFRβ Western Blot -analyysillä sen jälkeen, kun lyhytaikaista transfektiota CHO-solujen (kuvio 4B). Sitten valmistettiin formulaatiot DNA-rokotteen plasmideja 704, joka on tetrafunctionalized amfifiilinen lohkokopolymeeri, joka on aiemmin osoitettu parantavan lihakseen DNA- rokotteissa lisäämällä samanaikaisesti transgeeniekspression ja immuniteetin aktivoimista [25], [26]. Teho 704-formuloida DNA-rokote plasmidi sallimaan geenin toimittamisen

tibialis anterior

lihakset 6 viikkoa vanhoja Balb /c-hiirten arvioitiin Western blotting -tekniikalla (kuvio 4C), ja vahvisti lihasten proteiinin ekspression annon pieniannoksisen DNA (25 ug). Mukaan aiemmin optimoitua immunisointiprotokolla [25], [26], hiiret altistettiin päivänä 0, ja stimuloitiin uudelleen päivänä +21 ja päivä +42 DNA-rokotteella (50 ug) tai kontrolli vektorin formuloitu 0,3% polymeeriä 704. Kahden viikon kuluttua prime-boost immunisointi, seerumit molempien ryhmien eläinten analysoitiin läsnäolon mPDGFRβ spesifisten vasta-aineiden. Kuten on esitetty kuviossa 4D, immunisoiduista hiiristä osoitti humoraalivaste mPDGFRβ proteiinia havaita ELISA (P = 0,005). Spesifisten mPDGFRβ vasta-aineita seerumeissa varmistettiin edelleen testaamalla niiden kykyä reagoida kaistan puhdistettu antigeeni mPDGFRβ-transfektoitujen CHO-solujen Western blot -analyysillä (kuvio 4E) ja reprobing blotti kaupallisella spesifisen vasta-aineen että mPDGFRβ. Kyky meidän DNA-pohjainen rokotteena mPDGFRβ-spesifinen adaptiivinen immuunivasteen johti meidät tutkimaan, onko tämä lähestymistapa voisi suojata CT26-hiiriin. Seuraavat profylaktinen ympäristössä, me hallinnoivat mPDGFRβ mukainen rokote prime-boost-ohjelma edellä kuvatun ennen siirrostamalla CT26 soluja maksaan kapselin (kuvio 5A). Kaksikymmentäyksi päivää kasvainsolujen haastetta, vertasimme määrin kasvaimen kehityksen maksa sekä immunisoiduista ja kontrollieläimiin.