Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Etäpesäke liittynyt keuhkoadenokarsinooma transkriptio-1 (MALAT-1) on yli-ilmentynyt aikana syövän etenemiseen ja edistää solujen maahanmuuton ja invaasiota monissa kiinteitä kasvaimia. Kuitenkin, sen rooli munasarjasyövän edelleen huonosti ymmärretty.

Methods

ilmaisujen MALAT-1 havaittiin 37 normaalissa munasarjakudoksessa ja 45 munasarjasyövän kudoksista RT-PCR (RT- PCR). Proliferaatiota havaittiin CCK-8 määritys; Virtaussytometria käytettiin mittaamaan solusyklin ja apoptoosin; Solumigraation havaittiin siirtokuoppaan muuttoliike ja invaasiomääritys. Jotta voitaisiin arvioida toiminnan MALAT-1, shRNA yhdistettynä DNA-siru ja Functional rikastamiseen analyysi suoritettiin sen määrittämiseksi, transkription vaikutuksia MALAT-1 hiljentämisen OVCAR3 soluissa. RNA ja proteiinin ilmentyminen mitattiin qRT-PCR ja Western blottauksella, vastaavasti.

Tulokset

Huomasimme, että ylössäätely MALAT-1 mRNA munasarjasyövän kudoksissa ja parannettu MALAT-1 ilmentymisen liittyi kanssa FIGO vaiheessa. Knockdovvn MALAT-1 ilmentymisen OVCAR3 soluissa esti solujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio, joka johtaa G0 /G1 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Yli-ilmentynyt MALAT-1 ilmentymisen SKOV3- soluissa edistänyt solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Downregulation MALAT-1 johtanut merkittävään muutokseen geenien ilmentyminen (vähintään 2-kertaisesti) 449 geenit, jotka säätelevät lisääntymistä, solusyklin ja tarttuvuus. Seurauksena MALAT-1 pudotus, MMP13 proteiinin ilmentyminen väheni, kun taas ekspressio MMP19 ja ADAMTS1 lisättiin.

Päätelmät

Esillä oleva tutkimus osoitti, että MALAT-1 ilmentyy voimakkaasti munasarjojen kasvaimia. MALAT-1 edistää kasvua ja migraatiota munasarjasyöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että MALAT-1 voi olla tärkeä tekijä munasarjasyöpään kehittämiseen.

Citation: Zhou Y, Xu X, Lv H, Wen Q, Li J Tan L, et al. (2016) The Long Ei-koodaavat RNA MALAT-1 ilmentyy voimakkaasti Munasarjasyöpä ja edistää solujen kasvua ja Migration. PLoS ONE 11 (5): e0155250. doi: 10,1371 /journal.pone.0155250

Editor: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, Kiina

vastaanotettu: 04 tammikuu 2016; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2016; Julkaistu: toukokuu 26, 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia tiede ja tietotekniikan Agency Guangzhou (nro 2010GNE00221) ja mekanismin tutkimus MALAT1 edistää Invasion ja metastaasin munasarjasyövän Kohdennettu sääntely STAT3 signalointireitin (nro 2014A020212517).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpäpotilailla ( EOC) on tappavin gynecologic maligniteetti, osuus merkittävä syövän kuoleman vuosittain [1]. ja [2]. Johtuen epäspesifisiä oireita varhaisessa vaiheessa tauti ja tehottomuuteen seulontamenettelyjä klinikalla, suurin osa (75%) potilaista diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa, kun tauti on jo levinnyt lantion, tuloksena huonon ennusteen [3,4]. Huolimatta jatkuvasti pyrkimyksiä parantaa EOC diagnosointiin ja hoitoon, kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeiden edelleen merkittäviä esteitä onnistuneen hoidon EOC potilaiden [5]. Siten tutkimus munasarjasyövän varhaista havaitsemista ja parantaa nykyisten hoitostrategioiden tarvitaan kipeästi.

On yleisesti hyväksytty, että syöpä kehitys on seurausta muuttuneen geeniekspression ja /tai rakenteellisia muutoksia proteiinia koodaavan geenien. Kuitenkin genominlaajuisten sekvensointi paljastivat, että tuhansien geenien puuttuu proteiinia koodaavan kapasiteetti, pelatessaan tärkeä rooli sääntelyn solujen kasvua, selviytymistä ja apoptoosin, sekä kasvaimen kehittymisen tai muita sairauksia [6]. Tutkimus on keskittynyt MALAT-1, tunnistettiin alun perin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, on suuri ei-koodaava RNA, joka liittyy läheisesti kasvaimen etäpesäke ja säätelee ilmentymistä eri etäpesäkkeiden liittyvien geenien [7]. MALAT-1 sijaitsee kromosomissa 11q13.1, kulkee sen poikki 8.7kb genominen alue, ja se on laajalti ilmentyy normaaleissa kudoksissa, erityisesti keuhkoissa, ja haiman [8] ,. MALAT-1 on erityisesti säilytetty ydin- pilkkuja [9], jossa pre-mRNA tekijät rikastetaan ja siten voi toimia kokoonpanoa, varastointi ja /tai muutos osasto [10]. MALAT-1 on myös osallisena kasvaimen etenemistä [11]. Saadut tiedot ovat osoittaneet, että MALAT-1 oli mukana syövän kehitystä sääntelyn vaihtoehtoisen silmukoinnin sen kohdegeenien [12] tai geenin ilmentymisen [13,14]. MALAT-1 ilmentymisen on havaittu olevan säädelty monissa kiinteitä kasvaimia, kuten keuhko- [8], maksan [15], ja eturauhasen syövät [16] ja on kasvaimen edistämiseksi toiminto. Tässä tutkimuksessa mittasimme MALAT-1 ekspressiotasot perusterveydenhuollossa normaalissa munasarjassa ja munasarjan kasvain kudosten ja tutkittiin biologinen rooli MALAT-1 munasarjasyövän synnyssä.

Materiaalit ja menetelmät

2,1 Tissue näytteiden

37 epiteelin yksilöitä normaalista munasarjan ja 45 yksilöitä munasarjasyövän kudokset saatiin kolmas Affiliated sairaala Guangzhou Medical University vuosina 2009-2013. Kaikki munasarjasyöpä tapaukset eivät saaneet hoitoa ennen leikkausta ja todettiin histologisesti WHO: n mukaan kirjan gynekologisten patologian (taulukko 1). Nämä kudosnäytteet olivat snap-jäädytetty nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Tutkimus hyväksyi Institutional Review laajojen Kantonin Medical University ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen osallistumista tutkimukseen.

2.2 Solun viiva ja kulttuuri

munasarjasyövän solulinja OVCAR3, SKOV3 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% streptomysiiniä /penisilliiniä 37 ° C: ssa 5% CO

2. Solut kerättiin logaritmisessa kasvuvaiheessa kaikissa kokeissa kuvattu alla.

2.3 RNA: n eristys ja qRT-PCR

Solun kokonais-RNA eristettiin kudoksista ja solulinjasta käyttämällä Trizol reagenssia (Takara Bio, Inc., Shiga, Japani), ja sitten käänteisesti cDNA: ksi käyttäen PrimeScript RT master Mix (Takara) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. qPCR suoritettiin ekspression määrittämiseksi MALAT-1, MMP-13, MMP-19, ADAMTS1, ja β-aktiini-mRNA: n käyttämällä SYBR Green MIX kit Promega (Madison, WI, USA) valmistajan protokollien. Alukkeita sekvenssit on esitetty taulukossa 2. β-aktiini-mRNA tasot käytettiin sisäisenä päättely.

2.4 Rakentaminen MALAT-1vectors ja geenitransfektion

roolin arvioimiseksi of MALAT-1 munasarjasyövän, me pudotti MALAT-1 ilmentymisen käyttäen shRNAs ja yli-ilmentyy MALAT-1 ilmentymisen käyttäen pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 (a-MALAT-1). Me suunniteltu ja rakennettu neljä MALAT-1 shRNA oligonukleotideja (shM1-M4) ja kloonattiin heidät pGPU6 /GFP /Neo vektorin (Jima, Shanghai, Kiina). Sekvenssit olivat MALAT-1-shM1, 5′-GCCGAAATAAATGAGAGAT GA-3 ’; shM2, 5’-GG CAGCTGTTAACAGATAAGT-3 ’; shM3, 5’-GCTGTGGAGTTCTTA AATATC-3 ’; shM4, 5’-GGGCTTCAGTGATGGGATAGT-3 ’. PGPU6 /GFP /Neo vektori, joka sisältää satunnaisen DNA-sekvenssin, käytettiin sekoituskoodin ohjaus (shNC). Kloonauksen jälkeen, vahvistus, ja DNA: n sekvensointi, transfektoimme nämä vektorit OVCAR3 soluihin. Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin yön yli, kun saavutetaan 70-80%: n konfluenssiin. OVCAR3 transfektoitiin shM1, shM2, shM3, shM4 tai shNC käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. SKOV3 transfektoitiin pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 ja pcDNA3.1 (SKOV3-NC). Solut tutkittiin 48 tuntia transfektion jälkeen alle fluoresenssikäänteismikroskooppia arvioida transfektion tehokkuutta. Sitten solut otettiin talteen ja saatettiin qRT-PCR-analyysi MALAT-1 ilmentymisen. Koska MALAT-1 shM3 oli tehokkaimmin saavutetaan knockdovvn MALAT-1 ilmentymisen, kaikki myöhemmät kokeet suoritettiin käyttäen tätä shRNA.

2.5 Soluproliferaatiomääritys

vaikutusten arvioimiseksi MALAT-1 munasarjan syöpäsolujen ensin ympättyä solua 96-kuoppalevyille 5 x 10

3cells /syvennys ja viljeltiin yön yli. Sitten solut transfektoitiin MALAT-1-shM3, shNC, aMALAT-1 ja SKOV3-NC. Solujen lisääntyminen mitattiin käyttäen CCK-8 määritys (Biyuntian, Shanghai, Kiina) 24h välein jopa 96 tuntia. Lyhyesti, 10 ui CCK-8-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan soluviljelmässä ja levyjä inkuboitiin edelleen vielä 2,5 h. Optinen tiheys mitattiin sitten FACS-analyysillä on absorbanssi 450 nm: ssä. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa itsenäisesti.

2,6 TranswellTM kasvainsolun maahanmuutto- ja invaasiomääritys

TranswellTM kammiot 8 um huokosia saatiin Corning (Corning, NY, USA ). Transfektoidut solut otettiin talteen, suspendoitiin uudelleen DMEM ilman FBS: ää pitoisuutena 1 x 10

6 solua 100 ul: ssa, ja sitten ympättiin yläkammioiden 24-kuoppaiselle levylle. Alakammioissa täytettiin 600 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin sitten 24 tuntia. Lopussa kokeen, solut, jotka muuttivat kääntöpuolelle Transwell kalvo kiinnitettiin metanolilla, värjättiin kristallivioletilla, ja sitten laskettiin valomikroskoopilla on x100 suurennoksella. Keskimäärin viisi näkökentät tutkittiin. Sillä kasvainsolun invaasiomääritys, Transwell kalvo oli esipäällystetty 30 ui Matrigel (1: 3 sekoitettu PBS: llä, BD Biosciences, Heidelberg, Saksa) ja eteni sama kuin edellä on kuvattu.

2,7 Cell syklin ja apoptoosin virtaussytometria määrityksessä

solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen tiheydeksi 5-10 x 10

6 solua /ml, ja kiinnitettiin sitten 75%: isella jääkylmällä etanolilla ja värjättiin 400 ul: propidiumjodidilla (PI) liuosta (BestBio, Shanghai, Kiina) 30 minuutin ajan ja altistetaan sitten syklin analyysi virtaussytometrillä (BD). Apoptoosin analyysiä varten solut värjättiin 5 ui anneksiini V-FITC: tä (BD Biosciences) 15 minuuttia ja 5 pl PI vielä 5 min, ennen kuin ne tehtiin virtaussytometria-analyysi.

2,8 profilointi ero geenin ilmaisun jälkeen MALAT-1 knockdovvn in munasarjasyöpäsoluja

Kokonais-RNA eristettiin kanssa TRIZOL reagenssin ja kvantifioitava NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). Integriteetti RNA: t arvioitiin käyttäen Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). cDNA-kirjastot konstruoitiin näytteiden RNA eheyden numero (RIN) ≥7.0. Yhteensä RNA: t transkriptoidaan kaksijuosteisen cDNA ja sitten syntetisoitiin cRNA. Seuraavaksi toinen sykli cDNA syntetisoitiin cRNA. Seuraaja pirstoutuminen ja biotiini merkintöjä, 2. jakso cDNA hybridisoitiin päälle mikrosirulla. Pesun ja värjäys, taulukot skannattiin jonka Affymetrix Scanner 3000 (Affymetrix).

2,9 geeniekspressioanalyysissä

GeneSpring (versio 12.5, Agilent Technologies) käytettiin loppuun geeniekspression analyysi. Ilmentyvät eri geenit (DEG) tunnistettiin käyttäen kertainen muutos sekä P-arvo laskelmat. Kynnys valitaan ilmentyvät eri geenit oli kertainen muutos 2.0 ja P-arvo 0,05. Kegg ja GO analyysi suoritettiin määrittämään reitit ja GO liittyvät termit ilmentyvät eri mRNA: t. Hierarkkinen Klusterointi (HCL) suoritettiin näyttämään erotettavissa geeni ”ekspressiokuviota joukossa näytteitä.

2.10 analyysi mRNA: n ilmentymisen DEGS by qRT-PCR

todentamiseksi microarray tuloksia, kaksitoista eri tavalla ilmaistuna geenit valittiin qRT-PCR validointi käyttäen SYBR GREEN MIX kit (Promega, USA) ja FAST 7500 Real-Time PCR järjestelmä seuraten valmistajan ohjeita, usingβ-aktiini sisäisenä kontrollina. Vertaileva kvantifiointi määritettiin 2-ΔΔCt laskentamenetelmä. Kandidaattigeenit andβ-aktiini-geeni monistettiin samassa reaktiossa, ja suoritettiin kolmena kappaleena. PCR-aluke sekvenssejä lueteltu taulukossa 2.

2,11 Proteiinin uuttaminen ja Western blot

Yhteensä solun uutettiin transfektoiduista soluista ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä Kit (Beyotime, Beijing , Kiina). Nämä proteiini näytteet erotettiin 10% SDS denaturoitua polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin PVDF-membraaneja, joiden huokoskoko oli 0,45 um (Millipore, Billerica, MA, USA). Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-pohjainen suolaliuos-Tween 20 (TBST) ja 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, membraaneja inkuboitiin hiiren /kaniinin anti-humaani-vasta-aineita on suositeltu laimennus [ADAMTS1 ja MMP19 laimennoksella 1: 1000, MMP13 1: 500 (kaikki Abcam, Cambridge, MA, USA)], yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen kun pesty TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin edelleen sekundaarinen anti-hiiri (1: 2500) tai anti-kani (1: 10000) vasta-aine, 1 h. Enhanced kemiluminesenssin (ECL) lisättiin membraaneis- ja proteiinien ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen laboratoriotyöskentelyyn Image Acquisition ja Analysis Software (UVP, Upland, CA, USA). Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin latauskontrollina.

2,12 Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Erot kahden ryhmän arvioitiin käyttäen Fisherin tarkkaa testiä tai opiskelijan

t

testissä, kun taas ero joukossa useita ryhmiä analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA seurasi Bonferroni monivertai- testi. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien jälkeen knockdovvn MALAT-1 ilmentymisen arvioitiin käyttämällä cDNA mikrosiru (Affymetrix HTA 2,0), tunnistettiin kertaiseksi muutoksia ja analysoitiin käyttäen Studentin

t

testiä. p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1 Differential ilmentymistä MALAT-1-mRNA munasarjasyövän kudosnäytteistä

MALAT-1 mRNA: n ekspression kontrolli normaalissa munasarjassa ja ensisijainen munasarjasyöpä kudoksia arvioitiin qRT-PCR ja normalisoitiin sisäisen valvonnan (β-aktiini). Expression of MALAT-1 munasarjasyövän kudoksissa on huomattavasti suurempi kuin normaalissa munasarjassa (kuvio 1). Lisäksi MALAT-1 ilmentyminen merkitsevästi liittyy FIGO vaiheissa, mutta ei yhdistys välillä havaittiin MALAT-1 ilmentymisen ja ikä, histologinen tyyppi, laatu, tai läsnäolo askites (taulukko 1). Nämä tiedot osoittivat, että korkean tason MALAT-1 ilmentyminen liittyi munasarjasyöpä etenemiseen.

MALAT-1 ilme on huomattavasti korkeampi munasarjasyövän kudoksissa. *

p

0.05.

3,2 MALAT-1 liittyy solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion munasarjasyöpäsoluja

Seuraavaksi rakennettiin neljä shRNAs kohdistaminen MALAT-1. shRNA3 oli tehokkain vaientaa MALAT-1 ilmentymisen OVCAR3 soluissa (kuvio 2A). Siksi käytimme tätä shRNA kaikissa seuraavissa kokeissa. MALAT-1 Knockdown vähensi merkittävästi munasarjasyövän solujen lisääntymistä alkaen päivänä 2 saavuttaa korkeimman päivällä 5 (kuvio 3A). Lisäksi MALAT-1 Knockdown myös merkittävästi tukahdutti OVCAR3 muuttoliikettä ja invaasiota kapasiteetti (kuvio 3C ja 3E). SKOV3 oli erittäin ilmaistaan ​​transfektoitiin pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 ja ylössäätely MALAT-1 aiheuttama SKOV3 lisääntymisen, migraation ja invaasion (kuvio 3B ja 3D ja 3F).

(A) qRT- PCR-analyysi MALAT-1 ilmentymisen seuraavat shRNA pudotus. OVCAR3 soluja kasvatettiin ja transfektoitiin neljä eri MALAT-1 shRNA vektorit (shM1 on shM4), ja sitten altistettiin qRT-PCR-analyysi. *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmiin. (B) SKOV3- soluja kasvatettiin ja transfektoitiin pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 ja pcDNA3.1 (NC) ja alistettiin qRT-PCR-analyysi, *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmiin.

(A) ja (B) Solujen proliferaatio CCK-8-määrityksessä. Munasarjasyöpä soluja kasvatettiin ja transfektoitiin ja alistetaan sitten CCK-8-määrityksessä. *

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmiin. (C) ja (D) Transwell kasvainsolujen migraatiokokeessa. Munasarjasyöpä soluja kasvatettiin ja transfektoitiin ja alistetaan sitten Transwell kasvainsolujen migraatiokokeessa. (E) ja (F) Transwell kasvainsolun invaasiota määrityksessä. Munasarjasyöpä soluja kasvatettiin ja transfek- ja sen jälkeen niille TranswellTM kasvainsolun invaasiomääritys **

p

0,0001 verrattuna kontrolliryhmiin.

3,3 knockdovvn MALAT-1 ilmentymisen indusoi apoptoosia ja pidätykset solukierrossa G0 /G1 vaihe

Koska knockdovvn MALAT-1 esti solujen lisääntymistä (kuvio 3A ), me tutki MALAT-1 toiminto säätelyssä munasarjasyövän solusyklin etenemisen ja apoptoosin. Meidän tiedot osoittivat, että apoptoottisten solujen OVCAR3-shM3 solut lisääntyi merkittävästi 17,8%, verrattuna 0,03% on OVCAR3-shNC solujen ja 0,02% vanhempien OVCAR3 soluissa (p 0,001, kuvio 4A ja 4C). Lisäksi solusyklin analyysi virtaussytometrialla osoittaneet, että pudotus on MALAT-1 ilmentymisen pidätti OVCAR3-shM3 solujen Go /G1 vaiheen solusyklin ja prosenttiosuudet solujen S ja G2 /M-faasit myös vähentynyt (P 0,0001 vastaan ​​kontrollit. (D) kvantifiointi datan B, * p 0,05 vs. kontrollit,.

3,4 alassäätely MALAT-1 vaikuttaa ilmentymisen suuri määrä geenejä

geenin ilmentymisen profiilit OVCAR3-shNC ja OVCAR3-shM3 solut analysoitiin mikrosiruanalyysi, ja 449 merkittävästi ilmentyvät eri geenit ( 2-kertainen) tunnistettiin. Niistä 206 geeniä alassäädetty, kun taas 243 geenejä säädellään ylöspäin munasarjasyövän solujen shRNA välittämää MALAT -1-hiljentäminen kontrolliin verrattuna OVCAR3 soluja. Erillinen luettelo geenejä säätelee MALAT-1 osoituksena valvomatta hierarkkinen klusterointi (kuvio 5A). Suoritimme sitten qRT-PCR 12 satunnaisesti valittua genesto vahvistavat mikrosirulla tuloksia. QRT-PCR tulokset ovat erittäin vertailukelpoisia tuloksia cDNA microarray analyysi, jossa

FRK

,

MUC16

,

MAP2K6

,

FXYD3

,

FDCSP

,

MAOB

,

GBP2

, ja

TNFSF10

oli alas- säännelty,

NEXN

,

TSPAN2

,

ANKRD1

, ja

BHLHE41

olivat säädellään ylöspäin OVCAR3-shM3 solujen verrattuna shNC soluihin (kuvio 6). Lisäksi GO ja Kegg rikastaminen analyysi eniten ylä- ja alas geenien vastaavasti, jonka tunnuksena merkittävästi yliedustettuna tehtävät korostamalla roolia MALAT -1 liittyvien ja metastaasit munasarjasyöpä soluja. Lisäksi regul ation transkription positiivinen säätely solujen jakautumisen, solusyklin, solujen kasvuun ja soluadheesiota MAPK signalointi tai P53 signalointireitteihin vaikutti MALAT-1 ilmentymisen. (S1-S4 kuviot).

valvomaton hierarkkinen ryhmittely analyysi globaalin ilmentymisen profiilit eri ilmaisi geenejä. Sarake edustaa sampl, ja rivi edustaa geeniä, vihreä edustaa alemman tason geenien ilmentyminen ja punainen edustaa suhteellisen korkea geeniekspression.

kuvaaja osoitti keskimääräistä kertainen ero, FRK, MUC16, MAP2K6, FXYD3 , FDCSP, MAOB, GBP2, TNFSF10 olivat alassäädetty, NEXN, TSPAN2, NKRD1, BHLHE41 oli säädellään ylöspäin OVCAR3-shM3 soluissa. (P 0,05).

3,5 MALAT-1 voi osallisena munasarjasyövän säätelemällä ilmaus

MMP-13

,

MMP19

,

ADAMTS1

näistä DEGS, 79 geenejä merkittävästi säädelty tai alassäädetty vähintään 3-kertainen. Mukaan aiemmin tutkimuksissa

MMP19

,

ADAMTS1

ja

MMP-13

geenit tiiviisti mukana etäpesäke ja kehitystä pahanlaatuisia kasvaimia. Suoritimme sitten qRT-PCR ja Western blotting vahvistamaan ilmentymistä

MMP19

,

ADAMTS1

ja

MMP-13

geenien välillä OVCAR3-shM3 ja OVCAR3-shNC soluissa. MRNA ilmaus

MMP-13

on vaimentua siinä shM3 soluissa, kun taas ilmaus

MMP19 ja ADAMTS1

nostettiin (** P 0,01, kuvio 7A). Proteiinin ekspressio oli yhdenmukainen mRNA tuloksiin (kuvio 7B). Suppressio MALAT-1 johti vähen- tämisessä ilmaus

MMP-13

ja ylös-ekspressiota sääteleviä

MMP19 ja ADAMTS1

geenejä, mikä osoittaa, että MALAT-1 voi osallisena munasarjasyövän säätelemällä lauseke on

MMP-13

,

MMP19

,

ja ADAMTS1

geenejä.

(A) mRNA ilmentymä ADAMTS1, MMP13, ja MMP19 säätelee MALAT -1. * P 0,05 verrattuna kontrolliryhmiin. (B) ADAMTS1, MMP13, ja MMP19 proteiinin ilmentyminen on muuttunut seurauksena MALAT-1 pudotus. (C) kvantifiointi B. * p 0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

Keskustelu

Ihmisen genomin DNA sekvensointi data on osoittanut, että vaikka tuhansien geenien puuttuu proteiinia koodaavan kapasiteetin, ne voivat kuitenkin tärkeä rooli säätelyssä solujen kasvua, selviytymistä, apoptoosin, ja kasvaimen kehittymisen [6]. Ei-koodaavat RNA voidaan luokitella niiden koon tulee miRNA (22 nt), piRNAs (18-30 nt), lyhyet translaation-sääntelyyn RNA: t (100-200nt), ja paljon pidempi ncRNAs (jopa 10.000 nt) [17] . Pitkään ei-koodaavat RNA, jonka pituus on 200 nt saavuttanut merkittävää huomiota viime aikoina. Nykyisessä tutkimuksessa tutkimme MALAT-1 ilmentymisen epiteelin munasarjasyövän kudosten ja tutkittiin miten MALAT-1 säätelyssä kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota in vitro. Huomasimme, että MALAT-1-mRNA yli-ilmentyy kasvaimeen tissuesand MALAT-1 ilmentyminen liittyi munasarjasyöpä etenemiseen. Knockdovvn MALAT-1 ilmentymisen tukahdutetaan kasvainsolujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio, pidätti solut G0 /G1 vaiheessa solusyklin, ja indusoi apoptoosin. Olemme lisäksi tunnistettu 79 geenejä, joiden ilmentyminen oli muuttunut merkittävästi ( 3-kertainen) seuraavat MALAT-1 knockdown. Mielenkiintoista, kolme näistä geeneistä,

MMP19

,

ADAMTS1

, ja

MMP-13

, on aiemmin liitetty angiogeneesin säätelyyn, soluväliaineessa, soluadheesiota, ja syövän etenemisessä. Näin ollen tietomme osoittavat, että yli-ilmentyminen MALAT-1 voi edistää munasarjasyövän etenemisen ekspressiota sääteleviä

MMP19

,

ADAMTS1

ja

MMP13

geenejä.

etäpesäke on tärkein kuolinsyy syöpäpotilailla. Taustalla mekanismi kasvainten etäpesäkkeiden ja toistuminen on hyvin monimutkainen, mukaan lukien kasvain soluadheesiota, invaasio, intravasation, liikkeeseen, ekstravasaatio, ja kasvu kaukaisissa organisaatioiden [18]. Muutokset solunsisäisiä signalointireitteihin, jotka ohjaavat solujen lisääntymistä ja apoptoosia sekä solunulkoista eritystä proteiineja, joita liittyi solun tarttumiseen, muuttoliike, ja proteolyysi ovat ensiarvoisen tärkeitä syövän etäpesäkkeiden [19]. Äskettäin toiminta ei-koodaavan RNA, kuten MALAT-1, etäpesäkkeen muodostumisen aikana on alettu ymmärtää, [8, 14]. Naistentautien maligniteetit, munasarjasyöpä on yleensä diagnosoitu etäpesäkkeitä. Nykyinen tutkimus osoittaa, että ylössäätely MALAT-1 liittyy munasarjasyöpä etenemiseen. Todellakin, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MALAT-1 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin useita erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien keuhko-, maksa-, haima- ja eturauhassyövissä. Lisäksi MALAT-1 on toiminut metastasoitunut ja toistumisen biomarkkeri ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja maksan syöpä [15]. Kuitenkin tulevissa tutkimuksissa suurempien otoskoko on vahvistettava tuloksemme.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kasvaimen solut kykenivät tuottamaan tekijöitä, jotka aiheuttavat kasvaimen angiogeneesiä sekä metalloproteinaasientsyymien ja liittyvät molekyylien hajota soluväliaineen [20 ]. Nykyinen tutkimus osoitti MALAT-1 pudotus moduloitu ilmentymistä MMP-13 ja MMP19, jäsenet matriisin metalloproteinaasi (MMP) -perheen proteiinit, jotka ovat mukana muuttunut soluväliaineen aineenvaihduntaa, kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [21, 22]. Jotkin aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että MMP-13 on poikkeuksellisen ilmaistaan ​​joitakin kiinteitä kasvaimia, kuten papillaarinen kilpirauhassyövän ja peräsuolen syöpä ja liittyy etenemiseen ja etäpesäkkeitä [23,24]. Sen sijaan, MMP19, joka näyttää ainutlaatuinen rakenteelliset ominaisuudet, on kaksijakoinen rooli kudoksissa. Toisaalta, MMP19 puute lisäsi alussa angiogeenisen vasteen, joka toimii negatiivisena säätelijänä hyökkäystä. Kuitenkin MMP-19, joka on säädelty eri syövän kudoksissa, helpottaa kasvaimen invaasio [25]. Yhdenmukainen antiangiogeenisen tehoa MMP19, useita raportteja ovat osoittaneet, että metallopeptidaasi kanssa trombospondiini tyypin 1 motiivi (ADAMTS1), joka säädellään ylöspäin MALAT-1-hiljentäminen solujen estävän angiogeneesiä [26-28]

, ja laski ADAMTS1 stimuloi muuttoliike ja hyökkäys rintasyövän soluja [29].

Toistaiseksi ei ole olemassa raportti syyllistämättä MALAT-1 säätelyssä MMP tai ADAMTS1 ilmentymistä munasarjasyöpä. Kuitenkin perustuu tämänhetkisiin tietoihin oletamme, että tehokkuus MALAT-1 edistämisessä munasarjasyövän etenemistä voitaisiin välittämä lisäävä säätely MMP-13 ja alas-säätely MMP19 ja ADAMTS1.

edelleen valaista molekyylimekanismeja MALAT-1-indusoidun etäpesäke, olemme määritelleet geenejä säädellään MALAT-1 ilmentymisen, vertaamalla shRNA-esti verrokkiin munasarjasyöpä soluja. Tutkia tarkemmin kohdegeenien ja signalointireitin antaa uutta tietoa molekyylimekanismeihin MALAT-1 mukana munasarjasyöpä etenemistä ja auttavat rakentamisessa vahvempi ennustaminen ja ehkäisy sääntö munasarjasyöpä.

tukeminen Information

S1 kuvio. GO rikastaminen analysointi biologisen prosessin ajan säännelty ja alas geenien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0155250.s001

(JPG)

S2 Kuva. GO rikastaminen analyysi solukomponenttiin säädelty ja alassäädetty dokumenttinsa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0155250.s002

(JPG)

S3 Fig. GO rikastaminen analyysi molekyylien toimintoja säädellään ylöspäin ja alassäädetty dokumenttinsa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0155250.s003

(JPG)

S4 Fig. Kegg rikastus analyysi (koulutusjakson analyysi).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0155250.s004

(JPG) B

Kiitokset

Kiitämme Jiachun Lv varten hyödyllisiä neuvoja kokeiluja .