Krooninen sairaus

tiivistelmä

lisääntynyt ilmentyminen Bcl-xL: n syövän on osoitettu resistenssin laajan apoptoottisen ärsykkeen ja moduloimaan useita muita näkökohtia solujen fysiologiaa, mukaan lukien energia-aineenvaihduntaan, solusyklin autophagy, mitokondrioiden fissio /fuusio ja soluadheesiota. Kuitenkin vain harvat näistä toiminnoista on mekanistinen selitys. Tässä käytimme Tandem Affiniteettipuhdistus tunnistaa uusia Bcl-x L vuorovaikutuksessa proteiineja, jotka voisivat selittää dalmatialaistäpläisiä Bcl-xL yli-ilmentymisen. Joukossa useita proteiineja yhteistyössä puhdistavaa Bcl-xL, keskityimme Praf2, proteiinia, jonka ennustettu rooli kaupan. Vuorovaikutus Praf2 Bcl-xL: n havaittiin olevan riippuvainen transmembraanidomeeni Bcl-xL. Huomasimme, että Bcl-2 myös vuorovaikutuksessa Praf2 ja että Bcl-x L ja Bcl-2 voi olla vuorovaikutuksessa myös Arl6IP5, joka on homologi Praf2. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen Praf2 johtaa translokaatio Bax ja mitokondrioita ja induktio apoptoottisen solukuoleman. Praf2 riippuvainen solukuoleman estetään kotransfektiojärjestelmää Bcl-xL: n, mutta ei sen transmembraanidomeeni poistettu mutantti. Niinpä knock-alas Praf2 lisää kyky muodostaa klooneja U2OS soluissa etoposidi hoidon vähentämällä solukuolemaa. Lopuksi näyttö varten Bcl-x-vuorovaikutuksessa kalvoproteiinien olkaamme tunnistaa uutta proapoptoottiset proteiinia, jonka toiminta on vahvasti torjua ainoastaan ​​kalvo kohdistettuja Bcl-x.

Citation: Vento MT, Zazzu V, Loffreda A, Cross JR, alaspäin J, Stoppelli MP, et al. (2010) Praf2 on uusi Bcl-xL /Bcl-2 Vuorovaikutus proteiini, jolla on kyky moduloida Survival of Cancer Cells. PLoS ONE 5 (12): e15636. doi: 10,1371 /journal.pone.0015636

Editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasilia

vastaanotettu: 09 syyskuu 2010; Hyväksytty: 18 marraskuu 2010; Julkaistu: 20 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Vento et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Association for International Cancer Research, Grant Ref .: 05-0416 (https://www.aicr.org.uk/index.stm), ja Euroopan tiedesäätiön (ESF), Eurocore verkoston kalvo Arkkitehtuuri ja Dynamics, Contract n.LSHC-CT-2003-503297, MPS Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hankittu kyky paeta apoptoosin vaaditaan useita vaiheita aikana syövän kehittymisen. Yli-ilmentyminen Bcl-x L-proteiinin tiedetään resistenssin laajan mahdollisesti apoptoottisen ärsykkeen aikana syntyvät syövän kehitykseen, kuten onkogeenin aktivaatio, hypoksia ja matriisi irtoaminen [1] – [3]. Heikentynyt apoptoosin koska yli-ilmentymisen Bcl-x L-geeni on siksi ratkaisevan tärkeää aikana syövän etenemisessä. Heikentynyt apoptoosin on myös suuri este tehokkaalle syövän hoitoon, koska sytotoksisen hoitomuotoja syöpään voimakkaasti riippuvaisia ​​apoptoosin induktion. Mielenkiintoista, Bcl-x L on ehdotettu ainutlaatuinen rooli yleensä vastustuskyky sytotoksisille aineille, koska silmiinpistävä korrelaatio lisääntynyt Bcl-ilmentymisen tason ja kestävyys laajaa paneelia tavanomaisen kemoterapian aineita. Bcl-x L: n vaikutusmekanismi on siis tärkeä osa chemoresistance syöpäsoluissa [4]. Bcl-x L kuuluu Bcl-2-perheen proteiinien, joiden jäsenet voivat olla joko anti-apoptoottisen tai pro-apoptoottisia toimintoja. Proapoptoottiset jäsenet Bcl-2-perheen jakaa kahteen subsets. Ns multidomain tekijät (Bax ja Bak) ovat proteiineja, jakaa useampi kuin yksi Bcl-2 Homologia (BH) domain. Toinen alaperhe käsittää proteiinit jakaa ainoastaan ​​BH3 domain. Kuva on syntynyt viittaa siihen, että ”BH3 vain” proteiineilla on erilaisia ​​mekanismeja sääntelyn ja kohdistetaan anturit eri lähteiden solun stressistä. Niiden ensisijainen tehtävä näyttää olevan sitova ja neutralointi anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen membres [5], vaikka jotkin niistä on myös raportoitu pystyä aktivoimaan suoraan multidomain proapoptoottiset perheenjäsenten [6], [7]. Sen vuoksi yleisesti hyväksytty, että kohonnut Bcl-x L-proteiinin taso laskee alttius apoptoosiin, koska se lisää solujen potentiaalia inaktivoimiseksi pro-apoptoottiset ”BH3 vain” proteiinit [8].

Sen lisäksi kyky estää ytimen apoptoottisen koneet, Bcl-x L: n on osoitettu moduloivan useiden muiden näkökohtien solun fysiologiaa. Sen yli-ilmentyminen, esimerkiksi on korreloinut korkea kasvaimen ja kasvanut kyky hyökätä ja etäispesäkkeitä, riippumatta sen kyky ylläpitää eloonjäämisen ilman matriisikiinnitysalueet [9] – [11]. Bcl-x L on havaittu täydentämään

S. cerevisiae

geenejä, jotka helpottavat siirtymistä glykolyyttisistä oksidatiivista metaboliaa [12]. Bcl-x L on myös mahdollisuus moduloida kalsiumhomeostaasiin [13], edistää synapsi muodostumista [14], hidas solusyklin etenemistä [15], moduloivat autophagy [16], [17], lisätään mitokondrioiden fission /fuusio [18] ja moduloivat metaboliitin välistä vaihtoa ulompi mitokondrion kalvon [19]. Jotkut näistä ”epätyypillisen” Bcl-x toimintaa voidaan selittää sen kyky olla vuorovaikutuksessa proteiineihin kuin pro-apoptoottinen ”BH3 vain” tekijöistä. Bcl-x L on todellakin osoitettu olevan vuorovaikutuksessa VDAC1 [20], jossa IP3-reseptorin [21], jossa Beclin1 [22] ja useita muita proteiineja.

Bcl-x L on sekä sytosolin ja kalvoon liittyvä proteiini [23]. Vaikka soluliman Bcl-xL näyttää olevan homodimeeri [24], kvaternaariset rakenne kalvoon sitoutuneen Bcl-x L ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti, vaikka on raportoitu, että sitä voidaan harjoittaa korkean molekyylipainon komplekseja [25] ( Borner henkilökohtainen tiedonanto). Tässä tutkimuksessa esitämme näyttöä siitä, että Bcl-x on todellakin osa korkean molekyylipainon komplekseja ja pyrimme tekemään kattavan analyysin proteiinien pystyvät sitoutumaan Bcl-x L käyttäen Tandem Affinity Purification. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että Bcl-xL vuorovaikutuksessa proteiinien mukana useissa solun prosesseihin. Niistä eritysreitille oli yksi edustaa reittejä. Kun tavoitteena on validoida luettelon proteiinien vuorovaikuttavat Bcl-x L, päätimme keskittyä analyysimme vuorovaikutukseen Bcl-x L ja Praf2, pieni proteiini kuuluva Prenyloitu Rab Acceptor perhe, jossa on ennustettu rooli ER Golgi liikenteen [26]. Osoitamme, että Praf2 indusoi apoptoottista solukuolemaa ilmentymisen jälkeen ja että Bcl-x L ehkäisee Praf2 n apoptoottista aktiivisuutta. Lopuksi käy ilmi, että Praf2 hiljentämisen U2OS soluissa tekee niistä resistenttejä apoptoosin indusoiman sytotoksisen lääkkeen etoposidi.

Tulokset

tutkimaan mahdollisuutta, että Bcl-x L liittyy membraaniproteiineja korkean molekyylipainon komplekseja, olemme käyttäneet sakkaroosigradientissa fraktiointeja CHAPS-liukoiseksi kokonaisia ​​soluja uutteet. Analyysi suoritettiin käyttäen U2OS solulinja, koska se ilmaisee korkeita Bcl-xL: n ja näyttää ”riippuvaisiksi” Bcl-xL lauseke eloonjäämisen (ei esitetty). Esipuhdistettiin solu-uutteet ladattiin sakkaroosigradienteissa ja ultrasentrifugoitiin määritellyt materiaalit ja menetelmät. Fraktiot kerättiin, SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblot. Kuvio 1 osoittaa, että pienen molekyylipainon proteiinit, kuten sytokromi c (12 kDa), Rab 4 (25 kDa) tai Bax (20 kDa) esiintyy fraktioissa kaltevuus, jossa alhaisen molekyylipainon proteiinien odotetaan sedimenttiin. Bcl-x L, sen sijaan, on levinnyt fraktioissa vaihtelevat alhaisesta korkeaan molekyylipainot. Tämä tulos viittaa siihen, että näissä koeolosuhteissa Bcl-xL voidaan harjoittaa useilla eri molekyyli- komplekseja.

Sakkaroosi kaltevuus jakotislaamalla U2OS koko solu-uutteiden. U2OS (60 x 10

6 solua) lyysattiin CHAPS uuttopuskuriin ja kirkastettiin sentrifugoimalla. Uutteet fraktioitiin käyttäen 10-40% sakkaroosia kaltevuus ja yhtä suuret tilavuudet fraktiot analysoitiin immunoblottauksella läsnäolon Bcl-x L, Bax, Rab4 ja Sytokromi c.

perustaminen ilmentävien HeLa-solujen TAP-Bcl-x kimeeraproteiinia

jotta voitaisiin tunnistaa joukko proteiinien kanssa vuorovaikutuksessa Bcl-xL olosuhteissa analysoitu, olemme käyttäneet Tandem affiniteettipuhdistus [27], [28]. Bcl-x L on hännän ankkuroitu proteiini, joka hankkii membraanilokalisaatiota lisäämällä sen C-terminaalinen hydrofobinen häntä lipidikaksoiskerrokseen useiden kalvon osastoja. Häiriön välttämiseksi Bcl-kalvo lisäys, me tuotti ilmentävät vektori laittamalla TAP tag N-päässä Bcl-xL. Olemme myös saaneet ohjaus- vektorin, jossa on lopetuskodoni lisättiin alavirtaan TAP-sekvenssin. Molemmat rakenteet transfektoitiin HeLa-soluissa saada klooneja jotka ilmentävät pysyvästi joko TAP-Bcl-TAP-stop vain. Valitsimme HeLa-solut, koska ne voidaan helposti mukauttaa kasvamaan suspensiossa kulttuureissa, jotta voidaan tuottaa lähtöaineena sopivaa biokemiallisia purifications. Toisin U2OS, HeLa-solut, lisäksi, on suhteellisen alhainen ilmentymistaso endogeenisen Bcl-x L (kuva S1), joka voi kilpailla TAP-Bcl-x L sitoutumisesta kumppaneita. Testata, jos lisäämällä TAP tag Bcl-x L voisi heikentää sen kykyä suojata apoptoosin, me haastoi solut, jotka ilmentävät TAP-Bcl-xL (HeLa /TAP-Bcl-x) tai TAP-stop (HeLa /TAP) kanssa UV-säteilyä ja analysoi pilkkominen asema PARP, mittana solun kaspaasi 3 toimintaa. Kuten kuviossa 2A, verrattuna TAP-stop, HeLa ilmentävät TAP-Bcl-x näkyy alentuneen tason PARP pilkkominen tuote. Siksi lisäämällä TAP tag: n N-terminukseen Bcl-x L ei estä kykyä Bcl-x L ja suojaamaan soluja UV: n indusoiman apoptoosin. Seuraavaksi testasimme, mikäli lisäämällä TAP tag Bcl-x L voisi muuttaa sen subsellulaariset jakeluun. HeLa /TAP-Bcl-x L-solut fraktioitiin soluliman (S100), ydin- (ytimiä), raskas kalvoja (HMM) ja kevyt kalvoja (LMM) jakeet differentiaalisentrifugoinnilla. Solunosasijaintia TAP-Bcl-x L verrattuna endogeenisen Bcl-x L analysoitiin immunoblottauksella. Analyysi on suoritettu käyttäen yhtä suuria määriä proteiineja kunkin annetun osa ja se ei ole informatiivinen suhteellisen jakauman proteiinien analysoitiin eri soluosastoihin. Laatu fraktioinnin määriteltiin käyttäen vasta-aineita tunnettuja markkereita subsellulaaristen: PARP varten tumafraktios-, Sec23 varten LMM jae (mikrosomeissa) ja Sytokromi c varten HMM jae (mitokondrioita). Olemme myös analysoineet lokalisointia Bax, toisen jäsenen Bcl-xL proteiini perhe, joka tiedetään paikallistaa sekä mitokondriot in sytosoliin. Kuvio 2B esittää, että samalla tavoin kuin endogeenisen Bcl-x L, TAP-Bcl-x L paikantuu HMM osa, jotta LMM ja S100 jakeet. Sen vuoksi, lisäksi TAP tag ei ​​häiritse kykyä Bcl-x L hankkia membraanilokalisaatiota.

(A) HeLa-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti TAP-merkityn Bcl-x L ovat vastustuskykyisempiä kuin ohjaimen UV-induced apoptoosin. Analyysi PARP lohkaisu ilmentävien HeLa-solujen TAP yksin tai TAP-Bcl-xL: n ja säteilytetty tai UV (200 J /m

2). Solut kerättiin 2 ja 4 tuntia säteilytyksen jälkeen ja analysoitiin immunoblot ulkonäkö katkaistun tuotteen PARP. (B) TAP-merkitty Bcl-xL paikantuu samaan solunsisäiseen osastoon endogeenisen Bcl-xL. HeLa-soluja, jotka ilmentävät TAP-Bcl-x L fraktioitiin differentiaalisentrifugaatiolla saamiseksi: kaista 1, soluliman proteiinien (S100); kaista 2, tumaproteiinit (Nuclei); kaista 3, raskas membraanifraktio (HMM); kaista 4, valo membraanifraktio (LMM). 20 ug kutakin fraktiota analysoitiin immunoblot läsnäolon TAP-BclxL (käyttäen sekundaarinen vasta-aine vain) ja endogeenisen Bcl-xL. Laatu fraktioinnin määritettiin käyttämällä vasta-aineita Sec23 (LMM), Sytokromi c (HMM), Bax (S100 ja HMM) ja PARP (Nuclei). (C) HeLa-soluja transfektoitiin stabiilisti TAP yksin tai TAP-Bcl-x L tehtiin Tandem affiniteettipuhdistus. Kuviossa on esitetty tyypillinen Coomassie värjätty SDS-PAGE suoritettiin pelkistävissä olosuhteissa, jota käytetään ratkaisemaan eluaatit purifications. Puhdistukset suoritettiin käyttäen kalvoa CHAPS otteita HeLa ilmentävien TAP yksin (kaista 1) tai HeLa ilmentävät TAP-Bcl-xL: n (kaista 2).

tunnistaminen uusien Bcl-x L: n kanssa vuorovaikutuksessa proteiinin välillä käyttäen Tandem Affinity puhdistus

jotta saadaan sopiva lähtöaine TAP puhdistukset, HeLa /TAP-Bcl-xL: n ja HeLa /TAP-solut sopeutettiin kasvamaan suspensioviljelmässä käytetään pyörivää lasipulloissa. Koska kiinnostus kalvo interaktioiden päätimme keskittyä purifications suoritetaan käyttämällä membraaniuutteita. Solusakat mekaanisesti hajotettiin käyttäen Dounce homogenisaattoria pesuainetyyppisellä vapaa hypotoninen puskuri. Sentrifugointi Jälkimmäisen solulysaatin pystyimme erottua yhteensä kalvoja sytosolisista proteiineista. Yhteensä kalvot uutettiin käyttäen CHAPS sisältävällä puskurilla ja altistetaan tandem affiniteettipuhdistuksella. Eluaatit viimeisen puhdistusvaiheen konsentroitiin ja eroteltiin SDS-PAGElla. Kuva. 2C esitetään edustavat kuvat TAP puhdistuksia analysoitiin Coomassie-värjätyillä geeleillä TAP vain ilmentäviä soluja (kaista 1) tai TAP-Bcl-xL: n ilmentäviä soluja (kaista 2). Vähän materiaalia syntyi puhdistukset valmistettu TAP vain ilmentävien solujen, mikä osoittaa, että taustan antaman epäspesifisiä adsorptio kromatografiaväliaineesta käytetään vähäinen. Vastaavat juovat runsain proteiini lajeja leikattiin irti geeleistä ja niiden identiteettiä arvioitiin LC-MS /MS: llä. Luettelo proteiinin havaittiin myötäeluoituvat TAP-Bcl-x on esitetty taulukossa 1.

Bcl-x pystyy vuorovaikutuksessa proteiinien mukana useissa soluprosesseissa

Vaikka luettelo Bcl-x L vuorovaikutuksessa proteiinien esitetty taulukossa 1 ei voida pitää tyhjentävä, se voidaan pitää korkea luottamus lista. Olemme jakaa kaikki tunnistetut proteiinien erilaisia ​​toiminnallisia luokkiin ja kunkin proteiinin olemme määrittänyt tunnetun tai otaksutun solukomponenttien lokalisointi. Olemme myös todennut, jos proteiini oli jo aiemmin todettu vuorovaikutuksessa Bcl-xL. On kiinnostavaa huomata, että useimmat anti-apoptoottisen jäseniä Bcl-2-proteiinin perhe, joka on kuvattu aikaisemmin vuorovaikutuksessa Bcl-x L ovat läsnä lopullisessa eluaatissa. VDAC1 myös jo kuvattu vuorovaikutuksessa Bcl-xL: n [20], kun taas VDAC2, vähemmän runsas isoformi, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa multidomain Bcl-2-perheen jäsenen Bak [29]. ATP2A2 /Serca2 sijaan, on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa Bcl-2 [30]. Kaiken läsnäolo näiden proteiinien lopullisessa eluaatissa meidän puhdistus muodostaa hyvä osoitus spesifisyyden vuorovaikutuksia havaittu. Lisäksi Bcl-2-perheen jäsentä, me koota joukko proteiineja, jotka ovat kaikki mitokondrioiden ja ovat toiminnallisesti mukana energia-aineenvaihduntaan ja mitokondrioiden fysiologiaa. Tähän ryhmään kuuluu 10 17 alayksiköiden ATP syntaasi moniproteiinikompleksin, alayksiköt II ja IV sytokromi c: ja sytokromi b5 tyyppi B, kaikki osa biokemiallisia ketjun vastaavat oksidatiivisen fosforylaation ja ATP-tuottamista. Se sisältää myös mitokondrioiden karbamoyyli-syntetaasia 1, jolla on tärkeä rooli poistamalla ylimääräinen ammoniakki solusta, ja VDAC1 ja 2, tärkein säätelijöinä mitokondrion läpäisevyyden. Tässä ryhmässä sisältyvät kaksi mitokondrioiden proteiineja tunnistettiin Bcl-xL: n liittyvä: Stomatin-kaltainen proteiini 2 (StomL2) ja Prohibitin 2. StomL2 on äskettäin osoitettu olevan osa kompleksin Mitofusin 2 [31], kun Prohibitin 2 on oletettu osansa säätelyssä mitokondrion hengitystä.

Toinen joukko proteiineja voidaan ryhmitellä toiminnallisen luokan kuljettajat. Ne sijaitsevat eri kalvo osastoja, ja ne ovat: aminohappojen kuljettajaa SLC3A2; solukalvon Na + /K + transporter ATPaasi ATP1A1; ER asukas kalsium transporter ATPaasi ATP2A2 /Serca2; transferriinireseptorigeenin, että voitaisiin pitää epätyypillinen kuljettaja. Neljäs funktionaalinen ryhmä proteiinien suoraan tai epäsuorasti liittyvät Bcl-x koostuu proteiineista, joilla on otaksuttu tai vakiintunut asema erityskanavien haara solunsisäistä kuljetusta. Ne ovat komponentteja translokaation kompleksin (Sec61 beta, Sec11A), saattajia mukana proteiinia taitto apua ER (kalneksiini), proteiinit, jotka osallistuvat ER tietyn proteiinin muunnoksia (Ribophorin I, OST48, MPDU1) ja proteiinien oletetun roolin ER ja Golgin trasport (Sec22b, Ergić-32, TMP21, TMED5, Praf2) sekä ER säilyttäminen (SSR4, KDEL-reseptori 1). Muut kaupan liittyvien proteiinien Bcl-x olivat Rab7, pieni GTPaasina roolin kanssa loppuvuodesta endosomissa kypsymisen ja VAMP3, proteiini kosketukseen oletetun roolin endosomeihin kierrätykseen. Lopuksi tunnistettu uusia Bc-xL vuorovaikutuksessa proteiinien ryhmä tekijöitä joko tuntematon tai hyvin huonosti kuvattu toiminto (taulukko 1).

validointi vuorovaikutusta Praf2 ja Bcl-x L

suhde erittäviä haara solunsisäistä kuljetusta ja apoptoottisen solukuoleman on kaukana ymmärretään. Niistä vasta tunnistettu proteiineja, Praf2 on ehdotettu rooli ER Golgin liikenteen [26]. Praf2 kuuluu Prenyloitu Rab Acceptor (PRA) proteiinien perheen, jonka perustaja, PRA1 /Rabac1, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa viruksen Bcl-2-homologin BHRF1, ja moduloivat sen aktiivisuutta [32]. Saada tietoa suhdetta vesicular liikenteen ja apoptoosin, päätimme keskittää huomiomme Praf2. CDNA, joka koodaa ihmisen Praf2 saatiin IMAGE konsortion ja kloonattiin pcDNA3, jossa on kolminkertainen HA-merkki fuusioituna sen C-terminuksessa. Voidakseen vahvistaa vuorovaikutusta Praf2 ja Bcl-x L, 293T-solut transfektoitiin joko Praf2

HA ja

FLAGBcl-xL ekspressioplasmidien yksin tai transfektoitiin yhdessä sekä plasmideilla. 24 tuntia transfektioiden jälkeen solut hajotettiin ja Praf2 immunosaostettiin käyttäen monoklonaalista anti-HA-konjugoitu agaroosia. Kuten on esitetty kuviossa. 3A,

FLAGBcl-xL oli havaittavissa sakan vasta kun koekspressoitu Praf2. Olimme siis voinut vahvistaa vuorovaikutusta Bcl-x L ja Praf2 myös kahden komponentteja järjestelmä, jossa Bcl-x L ja Praf2 ovat samanaikaisesti yliekspressoidaan.

(A) HEK 293T-solut joko transfektoitu Ha- merkitty Praf2 tai FLAG-merkitty BclxL tai kotransfektoitiin sekä ekspressiovektoreilla. Näytteet altistettiin immunosaostus käyttäen anti HA-konjugoitu agaroosia ja molemmat yhteensä lysaatit (tulot) ja agaroosihelmiä eluaatit (IP) analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-HA: n ja anti-FLAG-monoklonaalisia vasta-aineita. (B) U2OS solut transfektoitiin HA-merkitty Praf2 tai tyhjän vektorin (Vec) ja solulysaatit altistettiin immunosaostus käyttäen HA-konjugoidun agaroosia. Sekä lysaatit ja agaroosihelmet analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-HA ja anti Bcl-x L-vasta-aineita.

Havainto, että Praf2 puhdistuivat yhdessä Bcl-xL by Tandem affiniteettipuhdistus osoittaa selvästi, että Bcl-x L on voivat olla vuorovaikutuksessa endogeenisten Praf2 HeLa-soluissa. Nyt tutkitaan, jos endogeenisen Bcl-x pystyy vuorovaikutuksessa Praf2 in U2OS soluissa. U2OS solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai kanssa Praf2

HA ilmentävät vektori, ja lysaatit immunoprecipitaed käyttäen anti HA-konjugoitu agaroosia. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, anti HA-konjugoitu agaroosia voi nimenomaan saostua endogeenisen Bcl-in U2OS transfektoiduissa soluissa Praf2

HA mutta ei tyhjän vektorin.

Useita jäseniä Bcl-2-perheen pystyvät vuorovaikutukseen useita jäseniä PRA perheen

perustajajäsenenä PRA perheen proteiinien, PRA1 /Rabac1, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa viruksen Bcl-2-homologin BHRF1, mutta ei Bcl-2 itse [32] . Siksi kysytään sitomiskykyä Praf2 rajoittui Bcl-voitaisiin laajentaa Bcl-2 samoin. Pyysimme myös, jos läheinen homologi Praf2, Arl6IP5, pystyy myös vuorovaikutuksessa Bcl-xL ja /tai Bcl-2. Kuva. 4 osoittaa, että Praf2

HA voi olla vuorovaikutuksessa myös

FLAGBcl-2 (kaista 4), ja että, Arl6IP5

HA voivat olla vuorovaikutuksessa sekä

FLAGBcl-xL ja

FLAGBcl-2 ( kaista 5 ja 6). Arl6IP5

HA ilmaisun tuloksia bändejä eri elektroforeettinen liikkuvuus. Ottaen huomioon, että ne ovat kaikki immunosaostettiin anti-HA-vasta-aineella ja koska se on kuvattu, että sekä Praf2 ja Arl6IP5 voi aiheuttaa SDS-liukenemattomia lajien [33], uskomme, että havaitut vyöhykkeet vastaavat monomeerit, dimeerit ja multimeerit Arl6IP5 .

HEK 293-solut joko transfektoitiin FLAG-merkitty BclxL tai Bcl-2 yksin (kaista 1 ja 2), tai ko-transfektoitiin HA-merkitty Praf2 tai HA-merkitty Arl6IP5 (kaistat 3-6) . Näytteet altistettiin immunosaostus käyttäen HA-konjugoituja aga- ja sekä lysaatit ja agaroosihelmet analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-HA: n ja anti-FLAG-vasta-aineita. Arl6IP5 monomeeri: *; Arl6IP5 dimeeri: **; Arl6IP5 multimeeri: ***.

Transmembraanidomeeni Bcl-xL: n on välttämätöntä sen vuorovaikutus Praf2

kyky Bcl-xL: n vuorovaikutuksessa pro-apoptoottisten jäsenten Bcl-2-perheen tiedetään välittävän hydrofobisen halkeaman, joka on muodostettu sen pinnalle, jotka BH1-, BH2- ja BH3-domeenien [34]. Päinvastoin, Bcl-2 /xL Raf ja Ras: n on osoitettu riippuu BH4 verkkotunnuksen [35], [36]. Jotta voitaisiin määrittää verkkotunnuksia Bcl-xL vastaavat sen vaikutuksen Praf2, me tuotti Bcl-mutantti poistetaan sen ensimmäisen 24 aminohappoa vastaava BH4 domain (Bcl-xLΔBH4). Olemme myös tuotti Bcl-xL: n mutantti, jossa tyrosiini 101 on korvattu lysiinillä (Bcl-xLY101K) (Fig. 5A), joka on mutaatio, joka on kuvattu poistamaan Bcl-x L: n kyky olla vuorovaikutuksessa Bax [37]. Lopuksi, koska Praf2 on kalvoproteiini [33], me tuotti Bcl-xL mutantti poistetaan sen C-päätteen 22 aminohappoa, jotka vastaavat sen transmembraanidomeeni (Bcl-xLΔTM). Kuten on esitetty kuviossa. 5B, ei poistaminen BH4 verkkotunnuksen eikä Y101K mutaatio vaikuttaa Bcl-x L: n kyky olla vuorovaikutuksessa Praf2. Kuitenkin deleetio C-terminaalista transmembraanidomeeni, poistetaan kokonaan Praf2 /Bcl-x L vuorovaikutusta, mikä osoittaa, että TM-domeeni on välttämätön tämän vuorovaikutuksen.

(A) Kaavamainen esitys Bcl-xL ekspressiorakenteita käytetään tässä tutkimuksessa. Bcl-x L: täyspitkä Bcl-x; Bcl-xLΔBH4: Bcl-x L, jolta puuttuu ensimmäiset 24 aminohappoa; Bcl-xLΔTM: Bcl-x puuttuu viimeinen 22 aminohappoa; Bcl-xLY101K: Bcl-x kanssa korvaaminen Tyrosiini 101 lysiiniä. (B) HEK 293-solut ko-transfektoitiin HA-merkitty Praf2 ja BclxL konstruktit on kuvattu (A), joka kantaa FLAG-tag: n N-päähän. Näytteet altistettiin immunosaostus käyttäen HA-konjugoituja aga- ja sekä lysaatit ja agaroosihelmet analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-HA: n ja anti-FLAG-vasta-aineita.

Praf2 yli-ilmentyminen indusoi apoptoottista solukuolemaa

on yleisesti hyväksytty, että kohonnut Bcl-x L-proteiinin tasojen lasku herkkyyttä apoptoosia sitomalla ja inaktivoimalla pro-apoptoottisia proteiineja, [8]. Lisäksi on raportoitu, että yli-ilmentyminen Yip3p (hiiva PRA1 /Rabac1 homologi) vakavasti estivät solujen kasvua [38]. Siksi testattiin, jos Praf2 yliekspressio voi aiheuttaa solukuoleman, ja jos tämä voidaan estää samanaikaisesti Bcl-xL tai Bcl-xLΔTM mutantin, joka on osoitettu olevan kykenemätön sitoutumaan Praf2. HeLa-soluja transfektoitiin pelkällä vektorilla, jossa Praf2 tai ko-transfektoitiin Praf2 ja Bcl-x L tai Praf2 ja Bcl-xLΔTM. Kuva. 6A osoittaa, että Praf2 transfektio johti vahva solukuoleman induktioon, lähes 65% soluista tulee PI positiivinen. Mielenkiintoista Praf2 solukuolema inhiboitui täysin samanaikainen transfektio koko pituudeltaan Bcl-x L, mutta ei inhibitiota havaittiin, kun Praf2 kotransfektoitiin kanssa Bcl-xLΔTM mutantti. Lisäksi indusoimaa solukuolemaa Praf2 liittyy kaspaasi-aktivaation arvioituna ulkonäkö katkaistun muodon PARP. Jälleen, tämä ilmiö on täysin estetty Bcl-x L, mutta ei Bcl-xLΔTM mutantti (Fig. 6B). Inhibitio Praf2 aiheuttaman PARP lohkaisu myös estää samanaikainen ilmentyminen Bcl-2 (tuloksia ei ole esitetty).

(A) FACS-analyysi HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu mainituilla ilmentämis- vektoreita ja värjättiin propidiumjodidia ( PI). Prosenttiosuudet PI positiivisia soluja merkitty sivun vasemmassa kunkin kaavion. (B) alikvootit transfektoiduissa HeLa-soluissa, kuten (A) analysoitiin immunoblot ulkonäkö katkaistun muodon PARP. Ekspressiotasot Praf2, Bcl-x L ja Bcl-xLΔTM on myös merkitty. (C) analyysi GFP-Bax lokalisointiin U2OS transfektoitu tyhjällä vektorilla (vec) tai HA-koodattu Praf2. Valokuvat ovat edustavat kaksi GFP-Bax lokalisoinneissa havaittiin näytteissä: hajanainen soluliman ja yhdistää. Yläpuolella valokuvat osoittivat% GFP-positiivisten solujen koostetussa lokalisointi jälkeen transfektoimalla soluja tyhjä vektori tai HA-merkitty Praf2 kahdessa itsenäisessä kokeessa.

Seuraavaksi halusimme arvioida jos Praf2 aiheuttamaa apoptoosin mukana translokaation Bax mitokondriot, varhainen tapahtuma luontainen apoptoottisen reitin. Siksi kotransfektoitiin GFP-Bax rakentaa kanssa Praf2 tai vektorisäädön in U2OS. Kuva. 6C osoittaa, että GFP-Bax ilmentymistä U2OS solut voivat olla joko diffuusia soluliman värjäystä tai voidaan yhdistää klustereihin. Olemme aiemmin osoittaneet, että GFP-Bax aggregaatiota samassa solulinjassa, oli yhtenevä mitokondrioiden, mitattuna menetys ΔΨm [39]. Käytimme ylimäärä Praf2 ilmentävien tai tyhjä (Vec) plasmidien saamiseksi, että kaikkien solujen vastaanottamiseksi GFP-Bax sai myös Praf2 ja laskenut% transfektoitujen solujen diffuusia tai yhteen GFP-Bax-signaalin. Tulos esitetty kuvassa. 6C osoittaa, että Praf2 kotransfektioon liittyi yli 30% soluista näyttää GFP-Bax yhdistettyjä värjäys, suhteen vain 2% havaittiin tyhjiä vektori co-tansfected soluissa.

Knock-alas Praf2 lisää solu- selviytyminen

halusimme seuraavaksi määritellä, jos vähentäminen Praf2 ilmentymisen RNA-interferenssi voi vaikuttaa myös solujen elinkelpoisuus. Luusarkoomasolulinja U2OS ilmentää suhteellisen korkeita Praf2. Koputimme alas Praf2 ilmentymisen U2OS soluissa kahdella eri siRNA kohdistaminen eri alueilla ihmisen Praf2 mRNA. Western blot-analyysi Praf2 osoittaa voimakas lasku Praf2 ilmentymisen suhteen kontrolli-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 7A). Ei selvää morfologinen ero oli havaittavissa välillä ohjaus ja Praf2 knock-down-solut 72 tuntia transfektion jälkeen normaaleissa kasvuolosuhteissa. Siksi kysytään Praf2 hiljentäminen voi vaikuttaa solujen herkkyys myrkyllisen vaikutuksen kemoterapeuttisen aineen, kuten etoposidin. Kuten on esitetty kuviossa. 7B vaiennettu Praf2 kanssa sekä siRNA: t valitun vähensi yli 50%: n vapautumisen suhteessa kontrolliin transfektoitujen solujen. Niinpä kyky muodostaa klooneja U2OS käsiteltyjen solujen etoposidia kasvanut alle 20%: Ctrl transfektoitujen solujen lähes 60% Praf2 vaiennetaan soluissa (Kuva. 7C). Lasku kaspaasin aktivaation jälkeen havaittiin Praf2 RNAi ei ollut apoptoottista ärsyke-spesifinen eikä solutyyppispesifinen, koska se oli havaittavissa myös U2OS soluissa, joita käsiteltiin paklitakselia tai doksorubisiinin (Fig. S2A) ja rintasyövän solulinjan MDA-MB 231 käsitelty etoposidia (Fig. S2B).

(A) analyysi immunoblottia tehoa Praf2 kaataa seuraava transfektion U2OS solujen kahdella eri siRNA kohdistaminen Praf2 mRNA. (B) U2OS transfektoitujen solujen ohjaus (Ctrl) tai Praf2 kohdistaminen siRNA (siRNA5 ja siRNA6) 48 tunnin kuluttua, käsiteltiin 50 uM etoposidin 24 tuntia. Cellular kaspaasi 3 ja 7 toimintaa mitattiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 luminometrisellä määrityksessä. Kuvaaja osoittaa prosenttiosuuden kaspaasi 3 ja 7 aktivoinnin käsitellyt näytteet Praf2 kohdistaminen siRNA: t verrattiin aktiivisuuteen läsnä soluissa, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA 3 itsenäisestä kokeesta. (C) kyky muodostaa klooneja U2OS transfektoitujen solujen valvontaa tai Praf2 kohdistaminen siRNA ja käsitellyn tai etoposidia. 48 tunnin transfektion jälkeen U2OS solujen ohjaus siRNA tai Praf2 siRNA6, soluja käsiteltiin 50 uM etoposidin 3 tuntia ja yli siirtynyt jälleen normaaliin väliaineessa 2 viikkoa. Pesäkkeet värittää kristalliviolettia. Kaavion prosentteina pesäkkeiden kasvanut jälkeen etoposidia hoidon suhteen käsittelemättömään kontrolliin.

Keskustelu

Bcl-x L on C-hännän ankkuroitu proteiinin kyky paikallistaa useita solunsisäisiä kalvoja. Jotta on laaja kuva joukko membraaniproteiineja vuorovaikutuksessa Bcl-x L, suoritimme Tandem Affinity Puhdistaminen yhteensä solukalvoissa HeLa-solujen, jotka ilmentävät stabiilisti TAP-merkityn Bcl-xL. Ottaen huomioon, että ei-ionisten pesuaineiden, kuten Triton-100 tai NP-40 tiedetään muuttaa konformaatiota proteiinien Bcl-2-perheen [23], kaikki kokeet suoritettiin läsnä CHAPS, pesuaineen, joka lähtee konformaatio Bcl-xL ennallaan. Kuten taulukossa 1, löysimme paljon proteiineja yhteistyössä puhdistavaa TAP-Bcl-xL. Kuitenkin ne heijastavat todennäköisesti totta proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia ainakin kahdesta syystä. Ensinnäkin, kuten on esitetty kaistalla 1 kuvion. 2C, purifications samasta solulinjasta kuljettaa TAP-tag-vasta rakentaa takaisin lähes huomaamaton proteiineja, mikä viittaa siihen, että kaikki talteen proteiinit todellakin liittyy Bcl-xL. Toiseksi, kuten jäljempänä, käyttäen tätä menetelmää löydettiin co-eluoiden Bcl-xL monien proteiinien tiedetään olevan kykenee spesifisesti vuorovaikutuksessa Bcl-xL. Olemme jaotella luettelo proteiinien vuorovaikuttavat Bcl-xL osaksi toimintakategorioihin jäljempänä. On syytä huomata, että kaikki proteiinit löytyi ovat joko transmembraaninen proteiinien tai liukoisten proteiinien lokalisoitu solunsisäisen organelles. Useimmat niistä paikallistaa että solukomponenttien osastoja tiedetään kohdistetaan Bcl-x. Monet niistä ovat useita komponentteja proteiinin komplekseja. Nämä havainnot ovat hyvä osoitus voimassaolon lähestymistavan ja spesifisyys ja herkkyys käytettävää tekniikkaa. Voimme siis päätellä, että Bcl-x voidaan harjoittaa useilla eri proteiinikomplekseina useissa solukomponenttien sivustoja. Tätä päätelmää tukee lisäksi sakkaroosigradienttisedimentaatiolla fraktiointi tiedot esitetty kuvassa.