Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat vapautettu useissa syöpiä, kuten peräsuolen syöpä. MiR-30c kuuluu miR-30 perheen, ja on mukana erilaisissa pahanlaatuisia sairauksia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme ilmaus miR-30c koolonsyöpäsolulinjaa ja kliinisistä paksusuolensyöpä yksilöitä. MiR-30c osoitettiin olevan merkittävästi alassäädetty sekä solulinjoissa ja syöpä kudoksiin. Lisäksi miR-30c voi estää syöpäsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasion in vitro. Tasaisen, stabiilin yli-ilmentyminen miR-30c esti kasvun ja keuhkojen etäpesäkkeiden paksusuolen syövän solujen ksenograftien in vivo. Lisäksi bioinformatiikan algoritmi ja lusiferaasireportterista määritys osoitti ADAM19 välittömänä kohteena miR-30c. Kohteisiin, lisäksi kokeet osoittivat, että inhibitio ADAM19 by miR-30c osittain välitteistä kasvaimen vastainen vaikutus miR-30c. Kaiken kaikkiaan meidän tutkimus antaa uutta tietoa, joka miR-30c esti koolonsyöpäsoluihin kautta kohdistaminen ADAM19. Siten miR-30c voisi toimia lupaava terapeuttinen strategia paksusuolen syövän hoitoon.

Citation: Zhang Q, Yu L, Qin D, Huang R, Jiang X, Zou C, et al. (2015) Role of mikroRNA-30c kohdistaminen ADAM19 sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (3): e0120698. doi: 10,1371 /journal.pone.0120698

Academic Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, SAKSA

vastaanotettu: 11 marraskuu 2014; Hyväksytty 26. tammikuuta 2015 Julkaistu: 23 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat erittäin konservoituneita, 22 nukleotidin pituinen ei-koodaavat RNA: t. MiRNA voi säädellä geeniekspressiota transkription jälkeen vuorovaikutuksessa komplementtijaksoja (sijaitsee tavallisesti 3′-alue (3′-UTR) nukleotidista) lähetti-RNA (mRNA) tavoitteita. Nämä vuorovaikutukset voivat johtaa proteiinin translaation estäminen tai kohde-mRNA: iden hajoaminen riippuen siitä miRNA ja niiden tavoitteet ovat täysin toisiaan täydentäviä [1]. MiRNA ovat väärin säädellystä eri syöpien ja miRNA tärkeä rooli kasvainten synnyssä [2,3,4,5]. Useita miRNA on havaittu toimivan tuumorisuppressoreilla [2,6,7,8]. Viime vuosina miRNA on kirjattu kriittinen sääntelyviranomaisten kehittymistä ja etenemistä syövän lukien peräsuolen syöpä (CRC) [9,10,11,12].

CRC on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja naisilla , arviolta 142820 uutta tapausta ja 50830 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2013. [13]. Vaikka huomattavaa edistystä on tapahtunut viime vuosikymmeninä, kuten leikkaushoitoa, sädehoito ja kemoterapia, eloonjäämisaste CRC potilaista on muuttunut vain vähän. On erittäin tärkeää etsiä varhaisen havaitsemisen menetelmä lisääntyneen etäpesäkkeiden ja kuolleisuus kehittyneiden korkealaatuisesta CRC.

MiR-30c on jäsenenä miR-30 perheen. Viisi erillistä kypsä miRNA sekvenssit sisältyvät tähän perheeseen: miR-30a /miR-30c-2, miR-30D /miR-30b ja miR-30e /miR-30c-1 [14]. Kertyvät todisteet osoittavat, että vapauttaminen miR-30c osallistuu erilaisiin pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien rintasyöpä, kohdun limakalvon syöpä, keuhkosyöpä, maksasyöpä [8,15,16,17]. MiR-30 estää tumorous prosesseja näissä edellä syöpien suoraan vuorovaikutuksessa niiden vastaavat tavoitteet. On kuitenkin olemassa suhteellisen vähän tutkimuksia saatavilla raportointi seuraus miR-30c etenemisessä paksusuolensyöpä.

Tutkimuksessamme määritimme mahdollista vaikutusta miR-30c paksusuolen syövän etenemisessä. Tuloksemme osoittivat, että miR-30c on alempi ilmentymistaso ihmisen paksusuolen syövän näytteitä. Mitä enemmän tutkimme mekanismeista rooli miR-30c paksusuolen syövän kehittymisessä. Tulokset osoittivat, että miR-30c on keskeinen rooli lukuisia biologisia prosesseja säätelemällä ADAM19 ihmisen paksusuolen syöpä. Siksi uudelleen ilmentävät miR-30c ja /tai häiritsemällä ADAM19 toiminta voisi olla lupaava paksusuolensyöpä terapeuttinen strategia.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Sixty paksusuolensyöpä näytteet ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa kerättiin paksusuolen syöpäpotilaiden toisen Affiliated sairaala Harbin Medical University (Harbin, Kiina) leikkauksen aikana ja heti säilyttää nestetypessä käyttöön saakka. Ei potilasta oli hoidettu sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean 2

toinen Affiliated sairaala Ha’erbin Medical University. Kaikki kliiniset tutkimuksen suorittanut periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Kirjallisen suostumus saatiin kunkin potilaan ja hyväksymä paikallinen eettinen komitea.

Soluviljely

HCT116 ja SW620 ihmisen paksusuolen syöpä solulinjoja lahjoja Pro. LQ [18], ja niitä kasvatettiin RPMI 1640 tai L15 (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA) ja HEK293T-soluja kasvatettiin DMEM-alustassa. Kaikki väliaine täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliini G: tä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO2.

Vektorit rakentaminen, oligonukleotidisynteesiin ja transfektio

HSA-miR-30c jäljittelevät, miR-30c estäjä, matkivat negatiivinen kontrolli (NC matkivat), estäjä negatiivinen kontrolli (NC estäjä) sekvenssit ja ihmisen ADAM19 siRNA oli peräisin Gene Pharma Company (Shanghai, Kiina). Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) käytettiin solujen transfektoimiseksi. ADAM19 cDNA ilman 3′-UTR (2757 bp) insertoitiin pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) rakentaa plasmidi pcDNA3.1 (+) – ADAM19. 513 bp: n segmentti, joka sisältää pre-miR-30c ligoitiin pcDNA3.1 (+) -vektori rakentaa stabiili miR-30c yli-ilmentymisen soluissa. Taulukko 1 listattu kaikki siihen liittyvät DNA-sekvenssit.

stabiili transfektointi miR-30c

2 x 10

5 HCT116-soluja kasvatettiin 60-mm: n levy, kunnes yhtymäkohta saavutti 60-70% RPMI1640 media. PcDNA3.1 (+) – pre-miR-30c plasmidi transfektoitiin sitten solut Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vakaa solulinjoja seulottiin 1 mg /ml G418 (Sigma, Shanghai, Kiina), ja positiiviset kloonit tunnistettiin käyttämällä qRT-PCR.

Quantitative reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagensseja (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen, RNA käänteiskopioitiin, sen jälkeen qRT-PCR suoritettiin käyttäen 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Mannheim, Saksa) seuraavasti: 94 ° C: ssa 3 minuuttia ja sitten 40 sykliä 94 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, 72 ° C 30 s ja askeleen 82 ° C: 5s. Fluoresenssi havaittiin lopussa kussakin jaksossa.

Solujen lisääntyminen ja pesäkemuodostusta

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi ( MTT) annettiin arvioida solujen elävyyttä kuten aiemmin on kuvattu [18]. Arvioidaan pesäkemuodostusta kyky, HCT116 tai SW620-solut ympättiin 3,5 cm levyjä (1000 solua /malja). Pesäkkeet kiinnitettiin metanoli, värjättiin 0,1% kristalliviolettia (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja laskettiin 2 viikon kuluttua.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Voit selvittää siirtymisen kyky solujen in vitro, Transwell määritys tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Havaitsemiseksi hyökkäyksen solujen kykyä, kalvo Transwell-yksikön päällystettiin 40 ui matrigeeliä (BD Biosciences, SanJose, CA, USA) 37 ° C: ssa 4 h kehittää rekonstruoitu tyvikalvo. Solut käsiteltiin samalla tavalla kuin migraatiokokeessa. Haavojen paraneminen määritys hyväksyttiin myös tutkia solujen vaeltamiseen kyky. -Soluja siirrostettiin 3,5 cm: n levyjen tiheys 70-80%. Jälkeenpäin solut naarmuttaa 200 ui pipetinkärjet rakentaa keinotekoinen haava. Vaeltavat etäisyys mitattiin 24-72h.

Western blot-analyysi

Yhteensä solu tai kudos uutteet uutettiin soluhajotuspuskurin seurasi immunoblottauksella anti-ADAM19 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), ja anti-β-aktiini (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kuten aiemmin on kuvattu [12].

lusiferaasireporttiterilla määritys

rakentaa pMIR-ADAM19-3’UTR plasmidi, joka sisälsi mahdollisen sitoutumiskohdat ADAM19 3′-UTR alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geeni, joka on 282 ep: n sekvenssi monistettiin ja insertoitiin Spel ja Hindlll-kohtiin pMIR-REPORT Luciferase vektori (Ambion, Austin, TX, USA). Plasmidi kanssa miR-30c kohdepaikkaan poistetaan ADAM19 3′-UTR rakennettiin myös. HEK293 ja HCT116-soluja käytettiin mittaamaan lusiferaasiaktiivisuus. Kun kasvoi 60-70% konfluenssiin, solut ko-transfektoitiin 100 ng lusiferaasiplasmidia ja 50 ng Renilla-plasmidia (Ambion, Austin, TX, USA) sekä 650 ng miR-30c matkivat tai NC, kuten edellä on kuvattu. Kun oli inkuboitu 48 h 37 ° C: ssa, lusiferaasiaktiivisuus havaittu Dual Luciferase Reporter 1000 Assay System (Promega, Madison, WI, USA).

In vivo kasvaimen kasvun määritykset

nainen joilta puuttuu kateenkorva BALB /c nu /nu hiirille (ikä 4 viikkoa) hankittiin Shanghai Laboratory Animal Center (Shanghai, Kiina). Kaikki eläin menettelyt olivat mukaisesti Harbin Medical University Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. 2. Affiliated sairaala Harbin Medical University Animal Care ja Käytä komitea hyväksyi tätä tutkimusta. Eläimiä pidettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. 5 x 10

6 HCT116-solut, jotka oli transfektoitu stabiilisti miR-30c injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen nude-hiirten. Kasvaimen koko mitattiin paksuus 4 päivän välein. Sekä maksimi (L) ja minimi (W) pituus kasvain mitattiin ja kasvaimen koko laskettiin ½LW

2. 30 päivän kuluttua hiiret tapettiin ja valokuvattiin. Kasvaimet kerättiin ja punnittiin. Lisäksi 2 x 10

6 solua injektoitiin häntälaskimoiden nude-hiirten. 18 päivän jälkeen, keuhkot poistettiin ja huuhdeltiin, ja keuhkojen metastasoitunut pesäkkeet laskettiin silmämääräisesti. Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Kolme eläintä kuhunkin ryhmään kuuluvan.

Tilastollinen

Ohjelmisto SPSS V20.0 käytettiin tilastolliseen analyysiin. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM, ja kaikki tiedot on toistettu ainakin kolme kertaa. Studentin t-testejä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi väliset erot ryhmien. Spearmanin korrelaatio levitettiin tunnistamaan korrelaatio miR-30c ilmaisun ja ADAM19 ilme. Erot

p

0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

MiR-30c on säädellä vähentävästi paksusuolensyöpä kudoksissa

Voit selvittää lauseke Mir-30c kliinisissä kudoksissa, keräsimme 60 paria ihmisen paksusuolen syövän näytteiden ja niiden vieressä, ei-kasvain-limakalvon kudoksissa. Kuten osoitetaan tulosten qRT-PCR-analyysi, miR-30c ilmentymistaso oli ilmeisesti säädellä vähentävästi 54 ulos 60 kasvain näytteissä verrattuna viereisen normaalin limakalvon kudoksissa (Fig. 1). Yhdistyksen välillä miR-30c ja kliinis ominaisuus analysoitiin (taulukko 2). Nämä tulokset osoittavat, että miR-30c on vähentynyt paksusuolensyöpä, ja se saattaa korreloida ihmisen paksusuolen syövän etenemistä.

MiR-30c ilmentymistä tutkittiin qRT-PCR 60 paria ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin. 54 ulos 60 kasvainnäytteestä osoitti vähentynyt ilmentyminen miR-30c verrattuna viereisen normaalin limakalvon kudoksissa. MiR-30c ilmentymistä normalisoida että U6 kussakin näytteessä.

MiR-30c esti solujen proliferaatiota in vitro

QRT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan suhteellisen ilmentymistason Mir-30c eri koolonsyöpäsolulinjoissa ja Lovo käytettiin kontrolliryhmän. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, HCT116 oli suhteessa alhaisemman miR-30c ekspressiotaso Näihin viiteen solulinjoista. Siksi me transfektoitiin lyhytaikaisesti miR-30c matkii osaksi HCT116 soluihin ja miR-30c inhibiittori Lovo soluihin ja miR-30c ilmentyminen oli vahvistanut qRT-PCR (Kuva. 2B). Nämä solut altistetaan seuraavaksi MTT-määritys. Kuten odotettua, miR-30c estäjä edistää samalla miR-30c jäljitellä tukahdutti solujen lisääntymistä (Fig. 2C, 2D). Tutkia perusteellisesti fenotyyppi, pesäkemuodostusta hyväksyttiin. Johdonmukaisesti miR-30c yli-ilmentyminen tukahdutetaan pesäkkeen muodostumista paksusuolen syövän soluja (kuvio. 2E, 2F).

(A) Suhteellinen ekspressiotasot miR-30c viisi koolonsyöpäsolulinjoissa havaittiin kvantitatiivista todellisia -aika PCR (qRT-PCR). Pylväät, keskimäärin kolmen erillisen kokeen; baareja, S. E. (B) HCT116 tai Lovo soluja transfektoitiin ohimenevästi miR-30c matkivat tai NC matkivat ja inhibiittorin tai NC-estäjä vastaavasti. Ilmaisu Mir-30c määritettiin qRT-PCR jälkeen 24h. (C-D) vaikutukset miR-30c proliferaatioon tutkittiin MTT: llä. Pisteet ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen; pylväät edustavat S.E .; *

p

0,05; **

p

0,01. (E) Effects of miR-30c proliferaatioon HCT116-soluja tutkittiin pesäkemuodostusta. (F) kloonien lukumäärä analysoitiin kvantitatiivisesti. *

p

0,05; **

p

0,01.

MiR-30c esti solumigraation ja invaasiota kyky koolonkarsinoomasoluissa

Ymmärtää vaikutuksen miR-30c päälle solujen migraation ja invaasion, TranswellTM muuttoliikkeen ja invaasion ja haavan paranemista määritykset suoritettiin. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-30c ilmeisesti esti samalla alas-säätely miR-30c edistänyt muuttoliike ja hyökkäys kyvyt koolonkarsinoomasoluissa (Fig. 3A-3D). Lisäksi haavan paranemista määritys sovellettiin tutkia vaikutuksen miR-30c siirtolaisuudesta SW620-soluissa (kuvio. 3E, 3F). Tulokset osoittivat, että miR-30c voivat estää maahanmuuttoluku koolonkarsinoomasoluissa. Yhdessä miR-30c oli todennäköisesti tärkeä rooli solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

(A-B) vaikutukset miR-30c muuttoliikettä analysoitiin TranswellTM migraatiokokeessa. A edustava valokuvia; B, kvantitatiivinen analyysi. (C-D) vaikutukset miR-30c on invaasio analysoitiin TranswellTM invaasiomääritys. C, edustaja valokuvia; D, kvantitatiivinen analyysi. (E-F) F, Haavan paranemista määritys annettiin arvioida vaikutuksia miR-30c maahanmuutosta. Keinotekoinen ero oli keskiakselin läpi, kun solut saavuttivat tiheyden 80%. Kuvia solut otettiin 0 ja 24 tuntia. E, edustaja valokuvia; F, kvantitatiivinen analyysi. *

p

0,05; **

p

0,01.

ADAM19 oli välittömänä kohteena miR-30c

Bioinformatics strategioita käytettiin etsimään mahdollisia kohteita miR-30c että välittämä miR-30c: n kasvua ja etäpesäkkeiden estoa. Kaikki neljä bioinformatiikan algoritmeja, miRBase, TargetScan, PicTar, Miranda käytettiin ja sitten miR-ontologia Database sovellettiin. Lopuksi, ADAM19 tunnistettiin syöpään liittyvän geenin. ADAM19 3′-UTR hallussaan täydellinen komplementaarinen alue asemassa 3539-3546nt Mir-30c. Lisäksi, TargetScan osoitti, että sitoutumiskohtien miR-30c ovat evoluutiossa säilyneitä eri selkärangan lajien (Fig. 4A). Lisäksi sekä western blot ja qRT-PCR ehdotti alas-säätely ADAM19 vuonna HCT116-soluissa transfektion jälkeen miR-30c matkivat (Fig. 4B, 4C). Lisäksi kokeet osoittivat, että ekspressiotasot miR-30c ja ADAM19 oli käänteisesti verrannollisia useita koolonsyöpäsolulinjoissa ja kliinisten kasvainten näytteet määritettiin qRT-PCR: llä (Fig. 4D, 4E). Consitently, ADAM19 oli yläreguloituja tuumorikudoksissa havaitaan western blot (kuvio. 4G). Nämä tiedot osoittivat, että ADAM19 oli todennäköisesti kohdistetaan miR-30c sekä transkriptionaalisesti ja transkription jälkeen. Selittää yksityiskohtaisesti mekanismi, lusiferaasireportterista määritys suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, ohimenevä kotransfektoimalla miR-30c matkivat ja pmiRGLO-wt 3′-UTR vektorin (joka sisälsi miR-30c kohdesivustoa) osaksi HEK293T soluihin johti vähentynyt selvästi reportteriaktiivisuutta. Kuitenkin vähentäminen kumottiin kun miR-30c matkivat ja konstruktio, jossa kohdesivustoa poistettiin ADAM19 3′-UTR-reportteri transfektoitiin HEK293T soluihin (Fig. 4F). Yhdessä nämä havainnot paljastivat, että miR-30c esti ADAM19 ilmentymisen suoraan kohdistamalla ADAM19 3′-UTR.

(A) Ennustettu kohdistaminen sivuston miR-30c ADAM19 3′-UTR; MiR-30c kohdennussekvenssiä of ADAM19 3′-UTR ovat evoluutiossa säilyneitä kautta kahdeksan lajia (Hsa: ihmisen, Ptr: simpanssi, Mml: rhesus; Oga: bushbabay; TBE: Tupaijat; mmu: hiiri, RNO: rotta, ja Ocu: kani .). Kohdennusvektori sivustot on korostettu punaisella. (B-C) qRT-PCR ja western blot analyysiä sovellettiin havaitsemaan mRNA ja proteiini ilmentymistä ADAM19 vuonna HCT116-soluissa transfektion jälkeen miR-30c matkivat tai NC matkivat. (D) ADAM19 mRNA ja miR-30c ekspressiotaso määritettiin viiden paksusuolen syövän solulinjojen qRT-PCR: llä. (E) ADAM19 mRNA ja miR-30c tasot korreloi käänteisesti paksusuolen syövän kudoksissa määritettynä qRT-PCR. β-aktiinin ja U6 käytettiin endogeenisen valvontaa, vastaavasti. (F) HEK293T solut kotransfektoitiin villityypin tai mutantti Toimittajat ja miR-30c matkivat tai negatiivinen kontrolli (NC matkivat). 48 tunnin kuluttua Luciferase /Renillaa aktiivisuus mitattiin. (G) ADAM19 on yliaktiivista paksusuolensyöpä kudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin, kuten Western-blottauksella.

ADAM19 välittämä kasvaimen estävää vaikutusta on miR-30c

Näiden edellä todisteet , teimme hypoteesin, että ADAM19 johtuvan anti-tumorous vaikutus miR-30c. Todistaa tämän untested hypoteesi, rakensimme vektoriin käyttäen cDNA, joka ei sisällä 3′-UTR ADAM19, sen jälkeen vektori ja miR-30c matkivat /NC jäljittelevät kotransfektoitiin osaksi HCT116-soluissa. MiR-30c ja ADAM19 ilmentymistä tutkittiin qRT-PCR: llä ja western blot vastaavasti (Fig. 5A, 5B). TranswellTM muuttoliike ja hyökkäys määritykset osoittivat, että palauttaminen ADAM19 pystyi poistamaan miR-30c aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasiota esto (Fig. 5C, 5D). Kiinnostaa, TranswellTM tutkimukset osoittivat, että knockdovvn ADAM19 siRNA voi tukahduttaa muuttoliike ja invaasion soluja, jotka oli samanlainen vaikutus miR-30c yli-ilmentymisen (Fig. 5E, 5G ja 5H). Lisäksi olemme määritti miR-30c ja ADAM19 EMT prosessiin. QRT-PCR-tuloksiin demonstrateed että E-kadheriinin oli voimistunut, kun N-kadheriinin ja vimentiinista inhiboi yli-ilmentymisen miR-30c tai vaiennettu ADAM19 (Fig. 5F), siis miR-30c ja ADAM19 saattaa olla mukana säätelyssä EMT käsitellä asiaa. Kaiken ADAM19 saattaa olla toiminnallinen kohde miR-30c.

(AB) ilmentyminen miR-30c ja ADAM19 tutkittiin qRT-PCR (A) ja Western blot-analyysi (B), vastaavasti HCT116 solut, jotka oli ko-transfektoitiin miR-30c matkivat (tai NC matkivat) ja ADAM19 (tai pcDNA3.1 (+)). p-aktiini käytettiin endogeenisen ohjaus. (C-D) Soluja altistettiin TranswellTM muuttoliikettä ja invaasion määrityksissä. C, edustaja Transwell kuvia; D, kvantitatiivinen analyysi. (E) HCT116-solut transfektoitiin ADAM19 siADAM19 tai siRNA negatiivinen kontrolli (sinc). 48 tunnin kuluttua ADAM19 ilmentyminen havaittiin Western blot. (F) E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinista havaittiin qRT-PCR jälkeen transfektoitu siADAM19 /sinC ja miR-30c matkivat /NC matkivat. Pylväät edusti suhteessa lauseke sinc ja NC matkivat potilaista. (G-H) jälkeen transfektoitu siRNA tai sinc, HCT116-soluja altistettiin TranswellTM muuttoliikettä ja invaasion määrityksissä. G, edustaja Transwell kuvia; H, kvantitatiivinen analyysi. *

p

0,05; **

p

0,01.

MiR-30c esti kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden in vivo

analysoimiseksi funktio miR-30c in vivo nude-hiirissä ksenograftimallissa käytettiin. Ensin rakennettiin miR-30c stabiilisti yli-ilmentävät solut käyttäen HCT116-solulinjaa (Fig. 6A). Koska se oli korkein miR-30c ilmaisu, # 4 klooni valittiin seuraavissa kokeissa. Solut ihon alle injektoitiin karvattomien hiirten kyljen ja kasvainten kokoa tarkkailtiin joka neljäs päivä. Hiiret tapettiin ja ihonalainen kasvaimet punnittiin neljän viikon kuluttua. Tulokset paljastivat, että miR-30c johti selvästi laskevan kasvaimen koon ja painon verrattuna mock ryhmän (Fig. 6B-6D). Kuten on esitetty kuviossa. 6E, miR-30c laski kasvuvauhti kasvaimiin in vivo. Lisäksi, ekspression miR-30c miRNA hoidetussa ryhmässä oli suurempi kuin, että mock ryhmässä (Fig. 6F). Mitä enemmän, in vivo tuumorimetastaasissa määritys osoitti, että miR-30c voi estää keuhkometastaasitestissä (Fig. 6G, 6H). Kaiken kaikkiaan tulokset viittasivat kasvaimen vastainen vaikutus miR-30c in vivo.

(A) stabiili yliekspressio miR-30c HCT116 solukloonien määritettiin qRT-PCR. (B) 5 x 10

6 HCT116-soluja, jotka oli stabiilisti transfektoitu miR-30C tai tyhjän vektorin (vale) injektoitiin subkutaanisti nude-hiiriin (n = 3). Hiiret tapettiin 28 vuorokauden kuluttua injektion. (C) Kasvaimet kerättiin ja edustava kasvaimia näytettiin. (D) Kasvaimet punnittiin ja miR-30C yliekspressio ryhmä oli pienempi paino verrattuna mock ryhmään. (E) MiR-30c yli-ilmentyminen johti kasvunopeutta. (F) ilmentyminen miR-30c havaittiin qRT-PCR kasvaimissa. (G-H) hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset osien keuhkojen ja tilastollisia tuloksia etäpesäkkeiden solmuja. **

p

0,01.

Keskustelu

miRNA sääntely on purettu eri syöpien ja siten toimia kasvaimeen vaimentimet tai onkogeeni vuorovaikutuksella niiden vastaavat tavoitteet. Kuitenkin suhteellisen vähän tietoa taustalla yksityiskohtainen mekanismi miRNA osallisuudesta syöpien tunnetaan. MiR-30c on tutkittu useissa syövissä. Se säätyy alas useimmat raportoitu tutkimuksia, kuten ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, eturauhassyöpä, leukemia, kohdun limakalvon syöpä, rintasyöpä ja peräsuolen syöpä [8,19,20,21,22]. Kuitenkin useat tutkimukset ovat raportoineet säätely ylöspäin miR-30c rintasyövän, munuaissolukarsinooma [23,24]. MiR-30c kykenee sen toiminta ottamalla kasvaimen etenemisen ennustamiseen ennustetta tai kemoterapian tehoa näillä syöpiä. Kiinnostaa, joitakin kiistanalaisia ​​todisteita suhteen esiintyy toiminnan miR-30c. Tämä valottaa monimutkaista roolia miR-30c tuumorigeneesiä ja etenemiseen, vaikka sen anti-kasvain tai onkogeenisten luonto. Tutkimuksessamme esitämme, että miR-30c voi käänteisesti säädellä paksusuolensyöpä etenemisen tukahduttamalla solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Lisäksi miR-30c on vähentynyt sekä kliinisistä näytteistä ja solulinjoissa yhdessä säädelty tasoa ADAM19. ADAM19 on suoraan toiminnallinen kohde miR-30c tunnistaa Lusiferaasimäärityksiä ja in vitro kokeissa. Kaikki tiedot viittaavat siihen, että miR-30c on tärkeä rooli paksusuolen syövän.

Tunnistaa mahdollisia kohteita miR-30c, neljä bioinformatiikan algoritmeja sovellettiin. Jälkeen alustavan seulonnan, ADAM19 tunnistetaan tavoitteeksi miR-30c, koska se liittyy läheisesti tumorous prosessiin. ADAM on matriksimetalloproteinaasi-liittyvä proteiini perhe, joka kuuluu sinkki proteaasin superperheen. ADAM perhe voisi sitoutua integriinireseptoriantagonisteja ja toimivat metalloproteaasi. Ne ovat myös esitetään sytoplasmadomeeni [25]. Adams (disintegriini- metalloproteaasien) perhe osallistuu lukuisia aktiviteetteja, kuten kalvofuusioon, kasvutekijä sytokiinien ja irtoaminen, solumigraatio yhdessä kehittyneet lihakset, lannoitus, ja solujen kohtalon määrittämiseen [26]. ADAM voisi huonontaa ECM molekyylejä ja edistää syövän etäpesäkkeiden johtuu niiden proteinaasiaktiivisuudella joka on samanlainen kuin MMP. On yli kaksikymmentä jäsentä ADAM perhe. ADAM19 on tärkeä jäsen ADAM perhe. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ADAM19 on mukana monissa eri sairauksia. On todettu, että mahdollisuus, että mutaatiot ADAM19 voi edistää ihmisen synnynnäinen sydämen venttiili ja väliseinän viat [27]. Jotkut tutkijat Kiinasta osoitti, että ADAM19 saattaisi olla vaikutuksia kiveksissä kehitykseen ja keuhkoahtaumatauti. kuten syövän. Mitä enemmän, jotkut tiedot viittaavat siihen, että ADAM19 voi osallistua keskeisten prosessien rauhas eritystä, trophoblast invaasion ja hajoamista soluväliaineen raskauden alkuvaiheessa [28]. Lisäksi ADAM19 havaittiin olevan säädellään ylöspäin munuaissolukarsinooma ja ensisijainen aivokasvaimia ja edistänyt invasiivisuus kasvainten [29,30]. On suhteellisen vähän tutkimuksia miRNA kohdistaminen ADAM huolimatta, että tuoreessa tutkimuksessa todettiin transformoiva kasvutekijä-β signalointi säätelee ADAM ilmaisun koe munuaisfibroosi kautta miR-29 [31]. Funktio ADAM19 edelleen epäselvä. Tutkimuksessamme havaitsimme, että ADAM19 voisi edistää invasiivisuuden koolonkarsinoomasoluissa ensimmäistä kertaa.

MiR-30c kuuluu miR-30 perheen, joka koostuu viidestä jäsenestä: miR-30a, b, c , d, ja e. Mielenkiintoista, nämä viisi jäsentä on eri tehtävät. MiR-30c on osoitettu toimivan joko onkogeeni tai kasvaimia estävä eri syöpätyyppien. Johdonmukaisesti miR-30a toimii tuumorisuppressori huomattavan erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyöpä, rintasyöpä, mahasyöpä, kilpirauhasen syöpä ja leukemia [6,32,33,34,35]. MiR-30b voisi kieltää apoptoosin glioomasoluihin ja keuhkosyövän soluihin [36]. Katsovat, miR-30b on omiaan vähentämään solujen kasvua rintasyövän ja estää EMT maksasyöpää kanssa vuorovaikutus sykliini E2 (CCNE2) ja Snail1 vastaavasti [32,37]. Kuitenkin miR-30d voivat toimia onkogeenin enemmistö tutkimukset [38,39,40,41]. Samoin kanssa miR-30a, miR-30e saattaa estää proliferaatiota syöpiin [16] ja se on myös tunnustettu ennuste ennustaja nenänielun karsinooma [42]. Tämä ilmiö on kohtuullinen miRNA esiintymään tavoitteita riippuvia ja kudosspesifisiä tavalla. Mirna-30 perheen sama siemen-sekvenssin, mutta ei dramaattinen muita vaikutuksia on tuotettu jälkeen täytäntöön ilmentymistä nämä viisi jäsentä samanaikaisesti (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen ei ole synergisiä vaikutuksia niitä. Estyminen vaikutus miR-30c on ADAM19 on ilmeisin joukossa kaikki viisi jäsentä miR-30 perheen merkitty qRT-PCR ja lusiferaasianalyysissä. Siksi keskitymme miR-30c Tutkimuksessamme.

On hyvin tunnettua, että yksi ainoa miRNA voisi säädellä useita tavoitteita ja kunkin mRNA voitaisiin myös ohjata useita miRNA. Tutkimuksessamme havaitsimme, että miR-30c indusoi 20% vähennys ADAM19 ilmaisun kuitenkin muuttoliike ja invaasion nousi yli 20% (kuvio. 5B VS 5D). Se osoitti, että jotkut muut geenikohteet ovat mukana aiheuttamien muutosten miR-30c.

Yhdessä esillä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että miR-30c estää syöpäsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä suoraan kohdistaminen ADAM19 joka voisi edistää malignance paksusuolen syöpäsoluissa. Hiljattain tunnistettu miR-30c /ADAM19 akselin uutta tietoa Mirna-pohjainen sääntelymekanismiin. Kun otetaan huomioon ratkaisevaa roolia miR-30c paksusuolen syöpä, manipulointi miR-30c voi edustaa potentiaalinen uusi terapeuttinen kohde hoidettaessa paksusuolen syövän.

Kiitokset

Kiitämme Mr. Zhao hiirille pitäminen .