Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme aiemmin osoittaneet, että ihmisen eturauhasen syöpäsolujen osaa hakea pahanlaatuisten attribuutteja vuorovaikutuksessa stroomasoluista kasvain microenvironment, kun taas vuorovaikutuksessa stroomasoluissa voi myös tulla vaikuttaa sekä fenotyyppisiä ja genotyypin muutoksia. Tässä tutkimuksessa käytettiin yhdessä viljelemisen mallin tutkimiseksi taustalla oleva mekanismi co-evolution syövän ja strooman soluja. Punainen fluoresoiva androgeeniriippuvaisissa LNCaP eturauhassyövän solua viljeltiin sopiva pari normaalia ja syöpään liittyvän eturauhasen myofibroblastin solujen simuloida syöpää strooman vuorovaikutus, ja solumuutoksia Yhdessä viljelemisen dokumentoitiin seuraamalla punaisen fluoresenssin. Löysimme usein spontaani välisiä fuusioita syövän ja stroomasolujen koko yhteistyön kulttuuri. Vuonna pesäkkeenmuodostus määrityksissä arvioimiseksi kohtalo Hybridisoluja, useimmat syöpä-strooman fuusio hybridit pysyi kasvu-pidätetty ja lopulta menehtyi. Kuitenkin jotkut hybridit säilynyt muodostamaan pesäkkeitä rinnakkaisviljelemällä syöpään liittyvän stroomasoluissa. Nämä johdannainen kloonit osoittivat genomista muutoksia yhdessä androgeenista riippumaton fenotyyppi. Tulokset tästä tutkimuksesta osoittavat, että eturauhassyövän solut ovat fusogeenistä, ja syöpä-strooman vuorovaikutus voi johtaa spontaaniin fuusiota kahden solutyyppien. Vaikka syöpää strooman fuusio strategia voi sallia strooman lokero tuhota tunkeutuvat syöpäsoluja, tietyt syövän strooman hybridejä elonjäämisetua suorituskyky voidaan välttää tuhon muodostamaan johdannaisen syöpäsolun väestöstä on muuttunut genotyyppi ja lisääntynyt maligniteetti. Cancer-strooman fuusio täten luo pohjan alituinen co-evolution välillä syövän ja syöpään liittyvien strooman solujen kasvaimen mikroympäristössä.

Citation: Wang R, Sun X, Wang CY, Hu P, Chu CY Liu S, et ai. (2012) Spontaani Cancer-stroomakasvaimet Cell Fusion mekanismina Eturauhassyöpä androgeenin Independent eteneminen. PLoS ONE 7 (8): e42653. doi: 10,1371 /journal.pone.0042653

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: toukokuu 29, 2012; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2012; Julkaistu: 03 elokuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee tutkimusapurahoja R21CA112330 ja CA132388 NCI /NIH (National Cancer Institute of National Institutes of Health Yhdysvalloissa.), ja PC040578 mistä puolustusministeriön ja Ruoxiang Wang; ja NCI /NIH avustus CA98912-02 Leland W. K. Chung. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä hoito on usein takaiskun androgeenista riippumaton etenemistä ja luun etäpesäke. Kun taas ensisijainen syöpä on aluksi androgeeniriippuvaisissa ja voi olla kovettaa androgeenideprivaatio, androgeeni-itsenäisyys on yhteinen toistuva syövän ja etäpesäkkeitä, jotka ovat usein parantumattomia. Yhdessä etenemistä ensisijaisen että metastaattisessa syöpäsolut ovat saaneet tietyt piirteet suotuisa hengissä ilman androgeenien [1], [2].

syy androgeeniriippumattomuuteen vielä selvittämättä. Kohonnut androgeenireseptorin (AR) aktiivisuus ja tehostettu selviytyminen syöpäsoluissa voidaan vaikuttaneet tekijät [3], [4], mutta stroomasolut kasvaimen mikroympäristössä myös tärkeä rooli [5]. Normaalissa eturauhasessa, rauhasten epiteelin kerros rakenteellisesti erotettu ympäröivästä stroomaan laminaarisen tyvikalvon. Eturauhassyövän, soluttautuminen syöpäsolut muodostaisivat suoria yhteyksiä stroomasolujen, sijoittamalla syövän etenemisen prosessin yhteydessä strooman mikroympäristön. Rajata mekanismi syöpää strooman vuorovaikutus on ensisijaisen tärkeää parantaa eturauhassyövän hoidossa.

Olemme määritelleet pakollinen rooli mesenkymaalisten strooman eturauhassyövässä etenemisessä androgeeniriippumattomuuteen mallintamalla vuorovaikutusta syövän ja stroomasoluissa [6], [7], [8], [9]. LNCaP ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, esimerkiksi, on androgeeni-riippuvaisia, kun analysoitiin kasvainten muodostumista kastroitu uros kateenkorvattomissa hiirissä. Nämä solut, voivat kuitenkin muodostaa usein kasvaimia kun samanaikaisesti ympätty solujen luuytimen mesenkymaaliset stromal linjaa [9], [10]. Kiinnostavaa syöpäsolut talteen tuloksena kasvaimia androgeenista riippumaton, konstitutiivisesti tuottaa suuria määriä prostataspesifisen antigeenin (PSA), toistettavasti muodostavat androgeeni-riippumaton ksenograftikasvaimissa, ja usein osoittaa metastaattisen kyvyn luun [9], [10]. Simuloi

in vivo

syöpää strooman vuorovaikutus, teemme yhteistyötä viljelty syövän ja stroomasoluissa tavanomaisissa ja 3-ulotteinen olosuhteissa. Kun suora yhteyttä, myofibroblastin strooman solut voitaisiin pelastaa LNCaP androgeenista nälkään aiheuttama kuolema [11], kun taas 3-ulotteinen co-kulttuuri johti konstitutiivista ilmaisulliset muutoksia sekä syövän ja stroomasoluissa [12], [13], mikä co-evolution syövän ja mesenkymaalisten stroomasolujen havaittiin eturauhassyövän etenemistä ja luun etäpesäke. Kiehtovan, syöpäsolut haettu yhdessä viljelemisen synnytti pysyviä genomista muutokset, havaitaan ulkonäkö merkki kromosomeja. Genominen muuttaminen voi olla perusta aneuploidian, näkyvin poikkeavuus metastaattisessa syövissä [14], [15]. Tutkimuksen suoria yhteyksiä syövän ja stroomasolujen voi paljastaa mekanismia, jolla syöpää strooman vuorovaikutus edistää eturauhassyövän etenemistä ja luun etäpesäkkeitä.

Tässä raportissa, käytimme yhdessä viljelemisen menetelmiä tutkia tarkemmin syyn androgeeniriippumattomuuteen. LNCaP-solut, jotka on merkitty punaisen fluoresenssin proteiinia päällekkäin päälle yksikerroksinen eturauhasen myofibroblastin solujen helpottaa suoria yhteyksiä kahden solutyyppien. Seuraamalla punaisen fluoresenssin, olemme huomanneet, että syöpäsolut voivat spontaanisti fuusioituvat stroomasoluissa. Seuraamalla kohtalo syövän strooman hybridit, olemme huomanneet, että useimmat fuusioituneen solut kuolivat, kun taas muutama selviäisi muodostaa klooneja. Johdannainen kloonia kromosomi menetys, nopeutuneen kasvun ja kohonnut PSA tuotantoa androgeeni-riippumattomalla tavalla. Cancer-stroomasolulinja fuusio on siis edistää mekanismi androgeenista riippumaton eturauhassyöpä etenemisen.

Methods

Solut ja Soluviljelyolosuhteiden

alkuperä LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinja käytettiin tässä tutkimuksessa on aiemmin raportoitu [16]. Perustaminen RL-1, joka on LNCaP klooni ilmentämään AsRed2 fluoresoivaa proteiinia, yhdessä eristäminen ja luonnehdinta sovitetun parin HPS-14 normaali ja HPS-15 syöpään liittyvän ihmisen eturauhasen myofibroblastin strooman klooneista on aikaisemmin raportoitu [11]. MRC-5 ja MRC-9 ihmisen sikiön keuhkojen strooman solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kyseistä luottoa, ensisijainen normaalia ihmisen eturauhasen stroomasolulinja, ostettiin Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville, MD). Kaikki nämä solut pidettiin 37 ° C: ssa T-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ampisilliinia (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml), jossa kostutettua ilmaa täydennetään 5% CO

2. Normaaleja ihmisen luuytimen multipotentteja mesenkymaaliset stroomasolujen transdusoitu lentiviruksen vihreää fluoresoivaa proteiinia (hMSC-GFP) ostettiin Tulane Center for Gene Therapy (Tulane University, New Orleans, LA) ja viljeltiin α Minimum Essential Medium (Invitrogen), joka sisälsi 16,5 % FBS ja 2 mM L-glutamiinia [17].

Co-kulttuuri

Direct-kulttuurin syövän ja stroomasoluissa aikaisemmin raportoitu [11]. Muodostamaan stroomasolujen yksikerroksinen, 5 x 10

5 stroomasolut 2 ml: ssa alustaa, maljattiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kasvaa täyteen yhtymäkohta. Väliaine poistettiin ja 5 x 10

5 solua punainen fluoresoiva LNCaP RL-1-klooni 4 ml: lla tuoretta elatusainetta päällekkäin yksikerroksen päälle. Co-viljelyväliaine vaihdettiin joka kolmas päivä.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut tutkitaan kerättiin seuraavat trypsiini-EDTA-käsittely ja laimennettiin alhaisen tiheyden yhden solususpensiota (4 solua /ml). Kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle, 100 pl suspensiota levitettiin. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen levyjä tutkittiin mikroskoopilla ja kuopista, jotka sisälsivät yhden solun oli merkitty. Kun 8 viikon viljelyn, muodostuneiden pesäkkeiden merkittyyn kuoppiin monistettiin edelleen karakterisointia.

Androgeenien hoito

Protokolla hoitoon viljeltyjä soluja androgeenireseptorin on aiemmin raportoitu [18]. Lyhyesti, sama määrä soluja (5 x 10

5 /kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Kiinnittymisen jälkeen androgeenipuutteen tehtiin viljelemällä soluja fenolipunaista RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), 48 tunnin ajan. Väliaine vaihdettiin fenolipunaista RPMI 1640, joka sisälsi 1% dekstraani-hiilellä käsiteltyä FBS: aa. Synteettinen androgeenireseptorin metyylitrienolonia (R1881, Perkin Elmer, Waltham, MA) lisättiin hoitoryhmässä 5 nM. 24 tunnin kuluttua hoidon jälkeen viljelyväliaine kerättiin PSA mittaus ja solut kerättiin kokosolulysaatissa valmistamiseksi.

PSA ELISA

Soluviljelyelatusaine havaitsemiseen käytettiin PSA tuotannon käyttämällä aiemmin raportoitu protokollaa [11]. Kaupallinen PSA ELISA Kit (United Biotech Inc., Mountain View, CA) käytettiin ja kolmena määritykset suoritettiin kullekin näytteelle.

Soluproliferaatiomääritys

käytetty protokolla analysoimiseksi solujen lisääntymisen kanssa MTT konversio raportoitu aiemmin [11]. Lyhyesti, yhtä suuri määrä soluja (5 x 10

5 /ml) maljattiin 96-kuoppalevylle. Sen jälkeen, kun androgeenien hoitoon, kuten edellä on kuvattu, solut altistettiin proliferaatiomäärityksessä. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kunkin ryhmän.

Western blotting

Protokolla Western blot raportoitu aiemmin [18]. Tässä tutkimuksessa 20 ug kokosolulysaatissa proteiini fraktioitiin ja blotattiin nitroselluloosakalvolle. Kalvon havaittiin spesifisiä vasta-aineita AR (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA). Taso β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

PCR-analyysillä

Olosuhteet genomista DNA vahvistus on raportoitu aiemmin [18]. Tässä tutkimuksessa sukupuolikromosomeiksi havaittiin kanssa oikeuslääketieteen tuotettuihin menetelmä [19]. Käytetyn alukeparin havaitsemiseen amelogenin geenien oli 5’CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3 ’ja 5′-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3′ [20]. Pari havaitsee sekä X-sidottu ja Y-sidottu amelogenin geenien, joka tuottaa 977 emäsparin (bp) tuotteen intronin 3 X-kromosomiin liittyvä geeni ja 788 emäsparin tuote Y-sidottu geeni yhdessä PCR-analyysillä. Alukepari 5’-ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC-3 ’ja 5′-CTACAGCTTTGTCCAGTGGCTGTAGCGGTC-3’ käytettiin havaitsemaan koodaavan alueen (615 bp), Y-spesifisten SRY-geenin. Tuotteen reaktio fraktioitiin 1% agaroosigeelielektroforeesilla ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä.

Fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS)

protokolla FACS-määritys aikaisemmin kuvatulla tavalla [11]. Tässä tutkimuksessa, viljellyt solut irrotettiin trypsiini-EDTA: ta. Pesun jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ja kiinnitettiin 75% etyylialkoholi, solut värjättiin propidiumjodidilla, kun läsnä on RNaasi A: lla 30 minuutin ajan ja altistettiin FACS-analyysi solusyklin profilointia. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja kahdelta Terveiden miesten käytettiin tavanomaista valvontaa varten genomista sisältöä. Käyttö Luovutusnäyteytimet hyväksyi Institutional Review Board of Emory University School of Medicine (IRB numero 278-2006), jossa kirjallinen suostumus osallistujilta.

Fluoresenssimikroskopia

Protokolla punaisen fluoresenssikuvantamiseen aikaisemmin raportoitu [11]. Tässä tutkimuksessa, vertailun vuoksi kaikki punaiset fluoresoiva kuvat otettiin kiinteillä asetuksilla: 4.15 sekuntia kuvantaminen 40-kertaisella suurennuksella, 2,075 sekuntia kuvantaminen 100 x suurennus, ja 1,0375 sekuntia kuvantamisen 200 x suurennus.

tulokset

1. Ominaisuudet eturauhassyövän ja strooman solujen yhteisviljelmässä järjestelmä

käytetään punaista fluoresoivaa proteiinia seurata LNCaP-solujen yhteisviljelmässä [11]. Edustava punaisia ​​fluoresoivia LNCaP klooni, RL-1, käytettiin tässä tutkimuksessa. RL-1 soluilla kasvu (kuvio 1A), PSA tuotanto (kuvio 1 B) ja AR tasolla (kuvio 1 C) samanlainen kuin vanhempien LNCaP. Tällä genominen tasolla, RL-1-solut sisälsivät Y-kromosomi (kuvio 1 D), genomista ominaisuus, joka katosi, kun androgen riippumaton eteneminen [21]. Sekä RL-1 ja vanhempien LNCaP näytetään identtisellä lähes tetraploidi genomista sisältöä (kuvio 1 E), mikä osoittaa XXYY karyotype [21]. Kun analysoitiin ksenografti kasvainten muodostumista, RL-1 solut eivät muodosta ihonalainen kasvaimia kateenkorvattomissa hiirissä, säilyttäen näin ei tuumorigeenisen ominaisuus vanhempien LNCaP.

, Differential kasvuvasteeseen androgen. Alkuperäinen LNCaP ja punainen fluoresoiva RL-1-klooni, yhdessä sopiva pari eturauhasen stroomasolujen, HPS-14 (normaali) ja HPS-15 (syöpään liittyvän), verrattiin leviämisen MTT muuntaminen. Sen jälkeen kun 48-tunnin seerumistarvaatio, soluja käsiteltiin tavanomaisessa viljelyväliaineessa (Control), androgeenideprivaatio väliaine (Deprivaatio), ja androgeenideprivaatio alustalla, joka sisälsi 5 nM synteettistä androgeenireseptorin R1881 (R1881). MTT-määrityksissä suoritettiin 48 tuntia myöhemmin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolminkertaisessa määrityksessä. B, Differential PSA tuotantoa. Viljelyalusta hoidetuista soluista havaittiin PSA-pitoisuus ELISA. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolminkertaisista määrityksistä. C, Differential AR ilme. Solut altistettiin Western blotting AR ilmaisua. Ihmisen normaaleissa strooman kyseistä luottoa solulinjaa käytettiin vertailussa. Taso β-aktiinin ilmentymistä käytettiin latauskontrollina. Tuloksena oli tyypillinen kaksi erillistä koetta. D, Differential karyotyyppi. Perimän DNA PCR käytettiin havaitsemaan sukupuolikromosomeiksi kanssa oikeuslääketieteen tuotettuihin menetelmä [20]. MRC-5 ja MRC-9-soluja valmistamiseksi miesten ja naisten genomista DNA: ta, vastaavasti. Ylähavaksessa (Amelogenin), X-kromosomin havaittiin ylempänä bändi, kun taas Y-kromosomi havaittiin kuin alempi kaista. Alemmassa paneelissa (SRY), kromosomi-spesifinen SRY lokuksen käytettiin varmistamaan läsnäolo Y-kromosomi. E, Differential genomista sisältö. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) terveestä miespuolisesta käytettiin osoittamaan normaalin diploidinen genomi-pitoisuus mitattuna FACS. RL-1-soluissa oli lähes tetraploideja genomisen sisältöä, samanlainen kuin vanhempien LNCaP-soluja [21]. HPS-14 ja HPS-15-solut osoittivat genomista sisältö samanlainen normaalin PBMC.

aiemmin tunnettu pareittain normaalin HPS-14 ja syöpään liittyvän HPS-15 ihmisen eturauhasen strooman kloonit [11] , jotka olivat suuria ja hitaasti kasvava myofibroblasteja (kuvio 1A), jotka eivät ilmennä PSA (kuvio 1 B). Mielenkiintoista, kumpikaan strooman klooneista havaittavaa AR Western blottauksella (kuvio 1C) tai RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). HPS-14 solujen sisälsi Y-kromosomi, joka hävisi syöpään liittyvän vastine (kuvio 1 D). Virtaussytometria osoitti, että molemmat HPS-14 ja HPS-15 säilyttänyt genomista sisältöä lähellä, että normaalin ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (kuvio 1 E).

2. Spontaani fuusio syövän ja stroomasolujen

tutkimiseksi syövän strooman vuorovaikutuksen yhteisviljelmässä, RL-1-soluja päällekkäin päälle yksisolukerroksena HPS-14 tai HPS-15-soluissa, joten syöpäsolut olivat suoraa kosketusta stroomasoluihin. RL-1-solut osoittivat koko on noin 15 pm x 50 um (kuvio 2A), kun taas stroomasolut olivat huomattavasti suurempia ja laajennettu muoto, mutta ilman punaisen fluoresenssin (kuvio 2B).

RL-1 -solut (A) ja HPS-15-soluja (B) on esitetty erillisessä kulttuuriin. 7 vuorokauden yhteisviljelmässä, spontaani fuusio voidaan nähdä (C). Suurempi suurennus, fuusioidun solun sisälsi kaksi ydintä, yksi fluoresoivasti punainen ja toinen fluoresoivasti vaalean (D). Cancer-strooman fuusio usein nähty alueilla, joilla RL-1 ja HPS-15 muodostetaan tiiviisti yhteyttä (E). Joissakin tapauksissa solujen keskellä fuusio voidaan nähdä (F). Kaksi ytimet voidaan pitää lähellä toisiaan (G) tai erillään (H). Kunkin mielestä faasikontrastikuvassa (ylhäällä) ja punaisen fluoresenssin kuva (alhaalla) on esitetty. Nuolet käytetään osoittamaan ytimeksi.

Daily tarkastus paljasti, että solut strooman yksikerroksista voisi kääntää fluoresoivasti punainen yhdessä viljelemisen aikana (kuviot 2C ja 2D). Että punainen fluoresoiva stroomasoluissa johtui fuusion kanssa RL-1 syöpäsolujen määritettiin perustuu seuraaviin havaintoihin. Ensimmäinen, fluoresoivasti punainen stroomasolut havaittiin enimmäkseen vieressä syöpäsolujen (kuvio 2E). Toiseksi, vaikka reaaliaikaisen tekniikka ei ollut käytetty tallentaa dynaamista fuusio, ei ollut vaikea löytää tapauksia, joissa syöpäsolu oli puolitiehen fuusioidaan stroomasolulinja (kuvio 2F). Kolmanneksi monet näistä stroomasolujen sisälsi kaksi ydintä, yksi fluoresoivasti punainen osoittaa sen johdettu siitä syöpäsolu ja muut fluoresoivasti vaalean johtaa sen strooman alkuperä (kuviot 2C 2H). Punasolujen strooman yksikerroksista kanssa strooman ulkonäkö olivat sytoplasmisen fuusio hybridit välillä syövän ja strooman solut.

Muita stromasoluja viljeltiin yh- tarkkailla syöpää strooman fuusio. Yhdessä tutkimuksessa oli mukana kulttuuri RL-1-solujen hMSC-GFP, normaaleja ihmisen luuytimen mesenkymaaliset stroomasolujen ilmentävät vihreää fluoresoivaa proteiinia [17]. Yhdessä viljelemisen nähtiin 4 viikon noin 25% väestöstä dually fluoresoivien solujen, vihreitä fluoresoivia soluja erottuva strooman morfologia emittoivat punaista fluoresenssia, useimmat ylimääräinen punainen fluoresoiva tuma (kuviot 3). Kaikki nämä tutkimukset vahvistivat, että, että punainen fluoresoiva LNCaP eturauhassyövän solut fusogeenistä. Kun suorassa kosketuksessa, RL-1-solut voisivat kiinnity stroomasoluihin.

edustaja syöpää stroomasolulinja fuusio tapahtumia yhteistyössä kulttuurin RL-1-solujen hMSC-GFP solut näkyvät. A, Yksittäinen fuusio tapahtuma päivänä 7 on esitetty Kirkas, vihreä fluoresenssi, ja punainen fluoresenssi. Vihreä ja punainen fluoresenssi kuvat yhdistetään (sulautunut fluoresenssi) näyttämään kaksi ydintä eri fluoresenssin. B, Yhdistetty fluoresenssi kuvien 4 lisäfuusioproteiinien tapahtumat näytetään, tapahtumia 1 ja 2 nauhoitettu päivä 7, ja 3 ja 4 päivänä 14. Nuolet käytetään osoittamaan ytimiä. Kaikki kuvat näkyvät 200 x suurennus.

3. Ominaisuudet syövän strooman solufuusio

Koska stroomasolujen pari on hitaasti kasvava, ja sen kasvun inhiboimiseksi RL-1-solujen [11], co-kulttuuri voidaan ylläpitää 8 viikkoa määräajoin asiakirjat 4 kokeiden toisto. Pieni solufuusio nähtiin ensimmäisen 48 tunnin yhteistyön kulttuuri. Punaisia ​​fluoresoivia soluja strooman kerros alkoi ilmestyä jälkeenpäin päivittäin yhä enemmän tasanteelle noin 4 viikkoa, jolloin enintään 20% strooman väestöstä oli mukana fuusio (kuva 4). Syöpä-strooman fuusio oli siis spontaani ja krooninen prosessi.

Co-viljelmistä RL-1 ja HPS-15-solujen havaittiin viikoittain taajuuden solun fuusion. Kunkin mielestä faasikontrastikuvassa (ylhäällä) ja punaisen fluoresenssin kuva (alhaalla) on esitetty. On käytetty nuolia osoittamaan syöpää stroomasolujen fuusio tapahtumia. Kaikki kuvat näkyvät 40-kertaisella suurennuksella.

Syöpä-strooman fuusio tapahtui vasta kun elinkelpoisia syöpäsoluja käytettiin. Rinnakkaisviljelemällä dead RL-1-soluissa, tappoi androgeenideprivaatio, germisidinen ultraviolettisäteily, snap jäädyttämällä tai tyhjiö kuivumisesta, ei pystynyt tekemään stroomasoluissa fluoresoivasti punainen 8 viikossa. Lisäksi inkuboimalla puhdistettua genomista DNA: RL-1-soluissa (10 ug /ml) tai pAsRed2 plasmidi-DNA (10 ug /ml) ei aiheuttanut punainen fluoresenssi stroomasoluissa. Spontaani syöpää strooman fuusio näytti aktiivinen prosessi, joka edellyttää osallistumista sekä syövän ja strooman solut.

4 erillistä co-kulttuuri kokeissa emme löytäneet eroa normaalin HPS-14 ja syöpä liittyvä HPS-15 stromasoluja käyttömahdollisuus niiden taajuuden fuusio syöpäsoluja. RL-1 voi myös fuusioitua muiden pareittain ihmisen eturauhasen stroomasolujen perustettu laboratoriossamme [11] ja stroomasoluja, jotka ovat peräisin muista kudoksista, mukaan lukien luuytimen mesenkymaaliset stroomasolut (kuvio 3). Fusogeenistä syöpäsolut tuntui olevan potentiaalia fuusioitua laaja joukko muita soluja.

rinnakkaisviljelemällä eturauhasen stroomasolut, huomasimme, että hybridisoluista harvoin tuottanut jälkeläisistä että säilytti strooman morfologia. Noudattamalla 32 hybridisoluista päivästä 7 päivään 28 rinnakkaisviljelmätilanteessa Esimerkiksi emme löytäneet hybridien jakautumassa klonaalinen klustereiden strooman morfologia, eikä siitä rinnakkaisviljelemällä hMSC-GFP-solujen (kuvio 3). Hybridit tuntui olevan mielenkiintoinen kohtalo: ne joko oli vaikeuksia aloittamista solunjakautumisen tai niiden jälkeläisten oli hankkinut eriäviä morfologia.

4. Fate of syöpää strooman hybridit

Solujen yhdistäminen on biologinen prosessi, jossa tarjoillaan olennaiset toiminnot [22], [23], [24], [25]. Vaikka sytoplasminen fuusio

sinänsä

on mekanismi Synergismin, se tarjoaa myös mahdollisuuden ydinfuusion, mikä johtaa tuotannon tytärsolujen heterogeeninen molemmilta vanhemmiltaan. Olemme seurataan kohtalo syövän strooman hybridisoluja arvioida patologisen merkityksen. RL-1-soluja viljeltiin yhdessä HPS-14 ja HPS-15-solujen 4 viikkoa, ja ne käsiteltiin sitten G418: aa (200 ug /ml) 7 päivää poistamiseksi stroomasolut eivät osallistu fuusio. RL-1-solujen kiinnittämiseksi näihin stroomasolut poistettiin samanaikaisesti. Rikastetun hybridi solut kerättiin yhden solususpensiota maljataan rajoittavalla laimennuksella, ja altistettiin pesäkkeenmuodostusta vielä 8 viikkoa.

hybridit yhteisiä morfologisia ja käyttäytymisen ominaisuuksia koko pesäkemuodostusta. Alussa yksikössä hybridit osoittivat huomattavasti laajennettu kokoja, useimmat sisältävät kaksi ydintä, molemmat osoittavat samanlaisia ​​punaisen fluoresenssin (kuvio 5A). Hybridi voi hengissä yli 4 viikkoa määritysolosuhteissa, sopimasta merkitty selviytymisen mahdollisuuksia vanhempien stroomasolujen [11]. Huomattavaa on, hybridi solut näyttivät lepotilassa, koska mitään solun jakautumisen aikana ei nähty ensimmäisen 4 viikkoa pesäkemuodostuksen. Vertailun vuoksi vanhempien RL-1 ja stroomasolujen tällä kertaa muodostunut merkittävä pesäkkeitä huomattavia koossa rinnakkain vertailukokeineen. Sen jälkeen kun 4 viikkoa pesäkemuodostuksen, monet hybridisolut antoi epätyypillinen morfologioita ja kertynyt ylimääräinen ytimet (kuvio 5B). Kyvyttömyys jakamalla näytti johtuvan puutteista sytokineesiin sijaan DNA-replikaation.

edustaja morfologiat Hybridisoluja aikana pesäkkeen muodostumisen näkyvät. A, Kaksi viikkoa kulttuuriin, useimmat hybridit sisälsivät kaksi ydintä samanlaisten fluoresenssin. Ei solunjakautumisen havaittu. B, neljä viikkoa yhdessä viljelemisen, hybridisoluilla hyväksyi morfologisesti epätyypillisiä useita ytimiä. Ei solunjakautumisen havaittu. C, Kuusi viikkoa kulttuuriin, loput hybridisoluilla tuli ohut tai kapea, jossa on useita ytimiä segmenteissä solun. D, kahdeksan viikkoa kulttuuriin, solunjakautumisen yleistyi. Solun jakautuminen oli epänormaali, koska se tuotti tytär soluja vaihteli muotoja ja joilla on alentunut elinkelpoisuutta. Kunkin mielestä faasikontrastikuvassa (ylhäällä) ja punaisen fluoresenssin kuva (alhaalla) on esitetty. Tarvittaessa, on käytetty nuolia osoittamaan ytimiä. Kaikki kuvat näkyvät 200 x suurennus.

Noin puolet hybridien menehtyi 6 viikkoa osaksi pesäkkeiden muodostumista. Vaikka syy solukuoleman on vielä määriteltävä, tiedetään, että fuusio välillä soluja erisuuruisten leviämisen johtaa mitoottisiin katastrofiin [26], [27]. Sisällä syöpää strooman hybridi, ristiriitaiset valvonta mitoosin kahden asynchronized ytimet voivat johtaa joko epäonnistuminen aloittamisen solunjakautumisen tai epänormaali mitoosin ja epäsymmetrinen jako. Solu mitoosi katastrofi kuolee kautta geneettisesti ohjelmoitu mekanismien [28]. Syy hybridin solukuolema oli todennäköisesti mitoottisiin katastrofi.

Loput solut tällä kertaa tuli kutistunut, näytetään pitkänomainen muoto, joka sisältää useita ytimiä eri segmenttien parin (kuvio 5C). Mikään näistä soluista selviytyi kasvaa pesäkkeitä. Erityisesti solunjakautumisen ei ilmeisesti aloitetaan alle 5% jäljellä hybridit, koska usean solun alkoi näkyä muutaman viljelykuoppiin.

solunjakautumisen ainoastaan ​​tullut näkyvään 8 viikkoa. Koska vain pieni osa hybridien säilynyt tällä kertaa, solunjakautumisen oli vallalla. Jako kuitenkin ilmestyi epänormaali koska tytär solut osoittivat keskenään erisuuntaiset morfologit (kuvio 5D), ja useimmat kuolivat lopulta. Näiden havaintojen perusteella ja seuraamalla 2800 hybridien 4 toistettiin tutkimuksissa (taulukko 1), päättelimme, että pääasiallinen kohtalo syövän strooman hybridit oli kuolema. Eturauhasen stroomasolut, kun se on fuusioitu syöpäsolujen, voisi toimia esteenä selviytymisen syöpäsoluja.

Verrattuna normaaliin vastine, este toiminto syöpään liittyvän HPS-15 stroomasoluissa voisi olla puutteellinen, koska jotkut hybridit päässä fuusio HPS-15 selvisi ja kasvoi pesäkkeitä. 4 tutkimuksissa RL-1 ja HPS-15 co-kulttuuri, pystyimme luomaan 9, 6, 12, ja 14 kloonia kustakin tutkimuksessa (taulukko 1). Morfologia ja kasvu johdannaisen solujen muuttunut matkan kloonaus prosessi. Yleensä soluja useita ytimiä häviäisi, ne morfologisesti epätyypillisiä tuhoutuisivat, solukokoja laskisi, ja kasvuvauhti nousisi. Mennessä kloonit kasvoi 1 x 10

6 väestö, joka kesti noin 20 rajapinnoilla ja solujen johdannainen klooni näyttäisi yhtenäisellä morfologia oli lähes mahdoton erottaa vanhempien syöpäsolujen (kuva 6). Näytti siltä, ​​että välitön jälkeläisten syöpää strooman hybridit olivat epävakaita. Epävakaus oli kuitenkin vähitellen menettänyt aikana sulkuprosessista.

Morfologia johdannaisen pesäkkeen seurasi aikana kloonaus prosessin, kasvaa yhdestä kuoppaan 96-kuoppalevyllä yhteen kuoppaan 24- kuoppalevyllä, yhteen kuoppaan 6-kuoppalevylle, ja 10 cm: n maljalla. Kunkin mielestä faasikontrastikuvassa (ylhäällä) ja punaisen fluoresenssin kuva (alhaalla) on esitetty. Kaikki kuvat näkyvät 100 x suurennus.

5. Androgeeniriippumattomuuteen johdannaisen kloonit syövän strooman fuusio

tunnettu siitä, ensimmäinen 9 johdannainen saadut kloonit RL-1 fuusio HPS-15-soluissa (taulukko 1), joka nimettiin välillä RLH15-1 ja RLH15 -9. Tällä genominen tasolla, kaikki kloonit menettivät kokonaan Y kromosomit (kuvio 7A). Sen sijaan, että XXYY karyotyypin tiedossa vanhempien RL-1-soluissa, nämä kloonit porata XX karyotyyppi on samanlainen kuin androgeenin riippumattoman C4-2 johdannaisen solujen LNCaP linjan [21]. Vaikka nämä kloonit ilmaistaan ​​samalla tasolla AR proteiinin emo RL-1-soluissa, muutaman (

eli

, kloonit 1, 6, 8, ja 9), joka näkyy jatkuva AR tasoilla aikana androgeenien puute (kuvio 7B), viittaavia androgen välinpitämättömyys. Mikä tärkeintä, nämä kloonit ilmaistaan ​​selvästi kohonneet PSA, joista suurin osa oli tuskin pienentää, kun androgeenien puute (kuvio 7C), mikä osoittaa, androgeeniriippumattomuuteen. Vuonna Soluproliferaatiomäärityksiä, kaikki kloonit osoittivat merkittävästi lisääntynyt kasvu verrattuna emo-RL-1-soluissa, kun taas androgeenien vain osittain inhiboivat näiden kloonien (kuvio 7D). Lisääntynyt AR tasolla, PSA tuotannon ja leviämisen nopeus, sekä ali androgeenideprivaatio, liittyvät yleensä pahanlaatuinen tila. Näytti siltä, ​​että johdannainen kloonit oli hankkinut lisää pahanlaatuinen piirteitä.

Genotyyppisen ja fenotyyppisen parametrit ensimmäisen 9 klooneja RL-1 ja HPS-15 fuusio hybridit verrattiin 12 ensimmäisen kloonit ohjaus kloonauksesta . Verrattuna RL-1-kloonien, kaikki johdannainen kloonit menettivät Y-kromosomia (A versus B). Havaitaan Western blottauksella, jotkut johdannaisen klooneista osoittivat pysyviä AR ilmaisu jopa androgeenista deprivaton (C vs. D). Näissä tutkimuksissa soluja viljeltiin 48 tunnin ajan tavanomaisessa viljelyväliaineessa (C), androgeenien väliainetta (-), ja androgeenien elatusaineessa, joka sisälsi 5 nM R1881 (+). Johdannainen kloonit havaittiin ilmaista kohonneeseen PSA edes androgeenipuutteen (E vastaan ​​F). Kun kasvu määritettiin MTT muuntaminen, kloonit on johdettu syöpää strooman fuusio näytetä kiihtynyt kasvu androgeenista riippumaton muoti (G vs. H). Data edustaa keskiarvoa kolmesta määrityksissä. Kaikkien datapisteet, keskihajonta oli alle 5% keskimääräisestä eikä sitä ole esitetty.

Samanlainen tutkimus suoritettiin kanssa yksisoluiset RL-1 klooneja eristettiin rinnakkaista ohjaus siirtomaa muodostuminen määrityksessä (Taulukko 1). Ensimmäiset 12 kloonia tutkittiin. Mikään näistä klooneista menetetty Y-kromosomia (Kuva 7E), eikä kestävää AR havaittiin, kun androgeenideprivaatio (kuvio 7F). Kaikki nämä klooneista androgeeniriippuvaisissa PSA tuotantoa (kuvio 7G) ja kasvua (kuvio 7H). Tulokset Tämän kontrollin tutkimuksessa todettiin, että kehitys androgeeniriippumattomuuteen johdannaisten kloonit syöpää strooman hybridit johtui syövän strooman fuusio, pikemmin kuin klonaalinen poikkeama RL-1-solujen

sinänsä

.

Keskustelut

tutkimus altistuvat spontaani fuusion välillä eturauhassyövän ja stroomasolut (kuviot 1, 2 ja 3), ja paljastui fusogenecity ja sen spontaanisuus kuin ominaispiirteistä syöpäsoluja. Tämä raportti kuvaa spontaani fuusio välillä yhden RL-1-kloonin ja yhdet eturauhasen stroomasolujen olemme havainneet usein syöpää strooman fuusio päässä co-kulttuuri 5 ylimääräisiä punaisia ​​fluoresoivia LNCaP kloonia 3 pareittain eturauhasen stroomasolulinja linjat, jotka muodostetaan ja tunnettu aiemmin [11];