Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Liukoinen guanylyl cyclase (neuvosto) on keskeinen rooli typpioksidin (NO) -välitteisen signaalitransduktion sydän, hermoston ja ruoansulatuskanavan järjestelmiä. Vaihtoehtoinen Silmukointi on tullut potentiaalinen mekanismi moduloida sGC ilmaisun ja toimintaa. C-α1 sGC on vaihtoehtoinen liitos muodossa, joka on vastustuskykyinen hapettumista aiheuttamaa proteiinien hajoaminen ja osoittaa etuoikeutettu subcellular jakelua hapettunut ympäristöön Endoplasmakalvosto (ER).

Menetelmät /Principal Havainnot

Kirjoittajat raportoivat, että liitos on C-α1 sGC voidaan puuttua H

2O

2 hoitoa BE2 neuroblastooma ja MDA-MD-468 adenokarsinooman ihmisen soluja. Lisäksi osoitamme, että H

2O

2 hoidossa MDA-MD-468-solut selektiivisesti vähentää proteiinin tasot PTBP1 ja hnRNP A2 /B1 liitos tekijät potentiaalisia α1 geeninsiirrot sääntelyviranomaiset mukaan

in silico

analyysi. Me osoittavat lisäksi, että alas-säätely PTBP1 H

2O

2 tapahtuu proteiini tasolla vaihteleva sääntely havaittiin eri rintasyövän soluja.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset osoittavat, että H

2O

2 säätelee RNA: n silmukoinnin ilmentymisen indusoimiseksi hapettumista kestävää C-α1 sGC-alayksikköä. Olemme myös ilmoittaa, että H

2O

2 käsittely valikoivasti muuttaa ilmaus keskeisten liitos sääntelyviranomaisten. Tämä prosessi saattaa olla tärkeä rooli sääntelyn solujen sopeutuminen olosuhteet oksidatiivisen stressin.

Citation: Cote GJ, Zhu W, Thomas A, Martin E, Murad F, Sharina IG (2012) vetyperoksidi Alters Jatkaminen Liukoisten Guanylyl syklaasiin ja valikoidusti Moduloi ilmentäminen Jatkaminen Regulators in ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (7): e41099. doi: 10,1371 /journal.pone.0041099

Editor: Marcelo G. Bonini, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 marraskuu 2011; Hyväksytty: 21 kesäkuu 2012 Julkaistu: 20 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Cote et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH myöntää RO1 HL088128 ja 3R01HL088128 ja AHA South Central Affiliate Grant-in-Aid 09GRNT2060182 EM ja osastojen käynnistyksen varoja IS Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vaihtoehtoinen silmukointi laajenee transcriptome monimuotoisuuden [1], [2] ja sallii solujen täyttää alati muuttuvan solun ulkopuolelle. Yhteinen stressitekijät kuten lämpösokkipromoottereista, aminohappo nälkään tai etanolin myrkyllisyys on osoitettu säätelemään vaihtoehtoisen silmukoinnin [3], [4]. Oksidatiivisen stressin usein jatkuu solujen mikroympäristössä kun on epätasapainossa tuotannon ja poistaminen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Tämä epätasapaino liittyy lukuisia patologisten tilojen kuten syövän synnyn, kardiovaskulaaristen häiriöiden ja hermoston rappeutumiseen [5], [6], [7], [8], [9]. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että vaihtoehtoisen silmukoinnin voidaan vaikuttaa muutokset oksidatiivisen tasapainossa. Hypoksinen ja hypoksia /uudelleenhapetukselle olosuhteissa, jotka muuttavat ROS homeostaasiin, on osoitettu muuttaa silmukoinnin useita geenejä normaaleissa kudoksissa ja syöpäsolulinjoissa [10], [11], [12], [13], [14]. Lisäksi kehittyvien tulokset osoittavat, että ROS voi myös muuttaa runsaasti silmukoinnin tekijöitä tai muuttaa niiden toimintaa. Pieniä pitoisuuksia vetyperoksidia (H

2O

2), joka on kaikkialla läsnä ROS-molekyylin, on osoitettu aiheuttavan fosforylaation silmukoinnin tekijä hnRNP C johtaa modulaatio sen RNA-sitoutumisaffiniteetin [15]. Lisääntynyt hnRNP-C ilmaisu löytyy myös intiman liikakasvun ja ateroskleroosi, joka on ehdotettu liittyvän nousu H

2O

2 tasossa tuottavat aktivoidut verisuonten endoteelin [16].

Liukoinen guanylyl tisyklaasi (sGC) on keskeinen entsyymi typpioksidin (NO) signalointireitin ja sillä on tärkeä rooli sydän, hermosolujen ja ruoansulatuskanavan toiminnot [17]. Aktiivinen sGC proteiini on rauta Hemi sisältävän heterodimeerin, joka koostuu α ja β-alayksiköitä, jotka on aktivoitu vasteena sitoutumisen NO sen hemiosan. Hemi hapetus on ehdotettu olevan yksi niistä mekanismeista, joka vastaa vaimennusta NO /cGMP signalointi olosuhteissa oksidatiivisen stressin [18]. SGC-spesifinen estäjä 1 H- [1], [2], [4] oksadiatsolo [4,3, -a] kinoksalin-1-oni (ODQ) hapettaa sGC rauta Hemi on ferrimuodossa tukahduttaa sitoutumisen NO. Altistuminen solujen ja kudosten ODQ laukaisee sGC hajoamista ei epävakauteen sGC heterodimeerin kautta ubikinaation ja kohdennettujen proteasomaalisten hajoaminen [18]. Olemme aikaisemmin tunnistaneet uuden vaihtoehtoisesti liitettyjä isoformin sGC, C-α1, joka on täysin toimiva, vaikka laajan deleetion N-päässä [19]. Yllättäen C-α1 liitos muoto oli merkittävästi vastustuskykyisempi proteiinien hajoaminen aiheuttama hoito ODQ [19] ja oli eri solusijaintipaikan erottamaan kantasoluja kuin kanoninen α1 sGC [20]. Viimeaikaiset tutkimukset Kraehling et al. paljasti, että, toisin kuin kanoninen α1 sGC-isoformia, C-α1 isoformi pyrkii lokalisoituvat hapettuneempi ympäristön endoplasmakalvoston (ER) solun sisällä [21]. Nämä havainnot ovat johtaneet meidät ehdottamaan, että ilmaus vaihtoehtoisen C-α1 proteiinin isoformi voidaan aiheuttaa oksidatiivisen stressin osana adaptaatiomekanismi säilyttämiseksi sGC toimintaa Hapettavissa olosuhteissa.

Tässä tutkimuksessa selvitimme jos silmukointi α1 sGC geeni voidaan moduloida ROS, erityisesti käsittelemällä H

2O

2. Huomasimme, että H

2O

2 indusoi ilmentymisen C-α1 transkriptio ja C-α1 proteiinin ihmisen syöpäsoluja ilmentävät α1 /β1 sGC. Pyrkiessään perehtyä sääntelymekanismi, tutkimme ekspressiotasot useiden RNA sitovien proteiinien mahdollisesti mukana silmukoinnin C-α1 silmukointivariantti. Tutkimuksemme osoittavat, että H

2O

2 käsittely valikoivasti vähentää ilmentymistä oletettujen α1 sGC liitos sääntelyviranomaisten PTBP1 ja hnRNP A2 /B1. Lisäksi osoitamme, että H

2O

2-indusoitu hajoaminen PTBP1 vaihtelee eri rintasyöpäsolulinjoissa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että H

2O

2 aiheuttamaa oksidatiivista stressiä vaikuttaa vaihtoehtoisen silmukoinnin sGC ja valikoivasti moduloi proteiinin taso splice- tekijöistä.

Tulokset

H

2O

2 indusoi ilmentymisen C-α1 sGC silmukointivariantti

tutkimiseksi jos vaihtoehtoisen silmukoinnin GUCY1A3 (α1 sGC alayksikkögeeni) säädellään vasteena oksidatiivisen stressin, käsittelimme ihmisen rintasyöpä MDA468 ja ihmisen neuroblastooma BE2 solulinjoissa 1 mM H

2O

2. MDA468 ja BE2 solut ilmentävät endogeenisesti α1 ja β1 sGC. H

2O

2 pitoisuus valittiin perustuu aikaisempien havaintojen osoittavat, että vuorovaikutus seerumin proteiinien soluviljelyalustoissa imeytyminen solun kalvot ja neutralointi entsymaattisesti komponentteja solujen anti-oksidatiivisen puolustus kuluttaa merkittävän osan eksogeenisesti lisättyä H

2O

2 [22], [23]. MDA468 ja BE2 solut osoittivat merkittävän kasvun C-α1 sGC vaihtoehto transkriptioekspressiokuvio upon H

2O

2 hoitoa (Fig. 1 A, B). Suhteellinen kasvu C-α1 isoformi verrattuna α1 transkriptio oli suurempi BE2 soluissa, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [19]. Tulokset osoittivat, että GUCY1A3 liitos on muutettu mahdolliseksi tunnustaa C-α1 erityinen 3 ’silmukoitumiskohta eksonissa 4 vastauksena H

2O

2 altistumista. Vaikka joissakin kokeissa taso C-α1 korotettiin ODQ kumpikaan solulinja osoitti tilastollisesti merkittäviä muutoksia C-α1 transkriptin tason viittaa siihen, että ODQ hoito ei yksin riitä vaikuttamaan liittämiseen sääntelyä.

: RT PCR havaitseminen α1 (ylhäällä) ja C-α1 (bottom band) sGC selostukset hoidon jälkeen H

2O

2 (1 mM) tai ODQ (20 uM), kuten on osoitettu. RT-PCR-tuotteet erotettiin 3% agaroosigeelillä ja värjättiin etidiumbromidilla. Ylempi alue edustaa sanoman koodaavat kanoninen α1 proteiinia (Transcripts 1-4, 270 bp); Keskellä bändi on epäspesifinen tuote; pohja bändi osoittaa C-α1 sGC transkripti (Transcript 5, 94 bp). Biologinen triplikaatteina edustaja kolmen erillisen kokeen näkyvät. B: Ratio (keskiarvo ± SD) on suhteellinen runsaus C-α1 ja α1 selostukset määrällisesti densitometrialla. * P 0,05 Studentin t-testiä. C: Western blot havaitseminen α1 (ylhäällä) ja C-α1 (alhaalla) proteiineja. MDA468-soluja käsiteltiin 1 mM H

2O

2 esitettyjä läsnä ollessa tai ilman MG132 (10 uM). Näkyy blots edustavat neljää itsenäistä koetta samoin tuloksin. D: Suhde suhteellisen runsaasti C-α1 ja α1 proteiinit kvantitoitiin densitometrialla. Tiedot näytetään keskimääräisenä ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta.

Seuraavaksi arvioimme ajan kuluessa muutosten runsaasti α1 ja C-α1 sGC proteiineja vastauksena H

2O

2. Yhtäpitävä nousu GUCY1A3 silmukoinnin havaitsimme ajasta riippuva modulaatio α1 ja C-α1 sGC proteiinin tasoja. Kuten on esitetty kuviossa. 1C ja D, H

2O

2 lisääntynyt suhteellinen pitoisuus C-α1 proteiinin MDA468 soluissa. Vaikutuksen arvioimiseksi proteasomeja riippuvaisten hajoamista sääntelyn α1 sGC jatkos muotoja, teimme kokeilun läsnäollessa MG132, voimakas solun läpäisevä proteasomin estäjä. Huomasimme, että esikäsittely MG132 ei vaikuttanut kertymisnopeus C-α1 silmukointivariantti, tai taso kanonisen α1 sGC alayksikköä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että havaitut lisäys C-α1 proteiinin runsauden (Fig. 1 D) johtuu todennäköisesti lisätyn C-α1 ilmaisua, eikä selektiivinen hajoaminen kanonisen α1 sGC. Huomattavaa on, että MG132 hoito myös kohonneet tuntemattoman polypeptidin tunnustettu anti-α1 vasta-aineiden molekyylipaino pienempi kuin C-α1 sGC (Fig. 1 D). Koska identiteetti tämän proteiinin Vielä on selvitettävä, sen intensiteetti ei sisälly densitometrian analyysissä.

Yhdessä meidän tulokset viittaavat siihen, H

2O

2 indusoi etuoikeutetut liitos ja ilmentyminen C-α1 sGC liitos muodossa meidän solumalleja.

in silico

analyysissä kerrotaan mahdollisista α1 sGC (GUCY1A3) liitos sääntelyviranomaisten

saadakseen alkuperäisen käsityksen mahdollisia mekanismeja α1 sGC liitos sääntely, suoritimme

in silico

analyysi käyttämällä useita bioinformatiikan työkaluja [24]. C-α1 silmukointivarianttia tuotetaan käyttämällä vaihtoehtoista 3 ’silmukoitumiskohta 179 emäsparia alavirtaan konstitutiivisen päällä (Fig. 2A, kuviossa. S1). Konstitutiiviset ja vaihtoehtoisen silmukoinnin sivustoja eksoni 4 α1 sGC määriteltiin kanssa UCSC Genome Bioinformatics työkalu ja niiden suhteellinen konsensusarvon tutkittiin käyttäen Human Jatkaminen Finder [25], [26]. Vaihtoehtoinen silmukointi eksonin 4 on keskeinen rooli GUCY1A3 transkriptio monimuotoisuutta; lisäksi konstitutiivista sivuston, eksoni sisältää 2 vaihtoehtoisia luovuttajan sivustoja ja 2 vaihtoehtoisten akseptorikohdat (kts. 2A ja Fig. S1). Lukuun ottamatta konstitutiivisen 5 ’silmukoitumiskohta luovuttaja suhteellinen yksimielisyys vahvuus kaikkien sivustojen osoittautunut pieni (Kuva. S1). Tämä on yleinen piirre vaihtoehtoisesti käsitelty eksonien joka on ajateltu helpottamaan sääntelyä seriini-arginiini rikas (SR) ja heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiini- (hnRNP) proteiinit [2]. ASD, Alternative Jatkaminen /Jatkaminen Rainbow työkalu Euroopan molekyylibiologian laboratorion [27], käytettiin analysoimaan asiaa eksonin ja proksimaalinen intronisekvensseistä mahdollisten SR ja hnRNP säätelijöinä eksonin 4 liittämiseen. Meillä syntyy komposiitti katsauksen säädin sitoutumiskohtien käyttäen johdettuja arvoja yksittäisten SR ja hnRNP proteiinit (taulukko S1). Tämä analyysi tunnisti suhteellisen tasainen jakautuminen SR sitoutumiskohtien koko eksonin 4 ja reunustavat alueet. Samaan aikaan, konstitutiivinen 3 ’silmukoitumiskohta intronialueesta osoitti tiheän huippu hnRNP sitoutumiskohtien (Fig. 2A). Lähempi tarkastelu tunnistettu tässä järjestyksessä useita päällekkäisiä sitoutumiskohtia hnRNP 2A /B1, polypyrimidiinijuosteen-suolikanavan sitovan proteiinin 1 (hnRNP I, PTBP1), SRp20, SRp40 ja Hu antigeenin R (Hur ELAVL1) liittämiseen sääntelyviranomaisten (Fig. S1) . Sijainti näiden sivustojen ehdotti, että vastaava liitos tekijät vaikuttavat todennäköisesti käyttää sekä kanoninen ja vaihtoehtoisten liitoskohdat, edistämällä sukupolven C-α1 sGC transkriptin.

V: Kaaviokuva GUCY1A3 vaihtoehtoisen silmukoinnin ja tuottaa C-α1. Suhteellinen jakauma ennusti SR ja hnRNP sitoutumiskohtien näkyy. B: Western-analyysi PTBP1, hnRNP2A /1B, Hur ja SR proteiinien ilmentyminen ohjaus ja H

2O

2-käsitelty (1 mM, 24 tuntia) MDA468 soluja. C: H

2O

2 annoksesta riippuvaa arviointi PTBP1 ja hnRNP A2 /B1-proteiinin tasot MDA468 soluissa. On esitetty Western-blotit edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen tulokset olivat samanlaiset. D, F: Densitometria analyysi PTBP1 ja hnRNP A2 /B1-proteiinin tasot normalisoidaan β-aktiini. Tiedot näytetään keskimääräisenä ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

H

2O

2 valikoidusti muuttaa ilmaus silmukoinnin tekijöiden

On hyvin osoitettu, että ilmaisu tasot ja suhteellinen stoikiometria jatkos tekijöiden moduloida vaihtoehtoisen silmukoinnin [28]. Siksi tutkimme vaikutus H

2O

2 altistuksen proteiinin tasot jatkoksen tekijöistä meidän

in silico

analyysissä mahdollisina sGC sääntelyviranomaisten. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, altistuminen MDA468 solun H

2O

2 valikoivasti vähensi proteiinin taso PTBP1 ja hnRNP A2 /B1 liittämiseen repressors. H

2O

2 ei ollut vaikutusta tasoon HUR säädin ja vain hieman erilaisissa tasot SRp40 proteiinin SR perheen liitos parantajia. Sekä PTBP1 ja hnRNP A2 /B1-proteiineja pieneni annoksesta riippuvalla tavalla MDA468-soluissa (kuvio. 2 C, D ja F). Tuloksemme osoittavat, että havaitut H

2O

2-riippuvaista kytkintä silmukointi GUCY1A3 geenin yhteneväinen tason muutoksista sääntelyn jatkos tekijöistä. Kuitenkin tarkka mekanismi ja panos erityisten jatkos tekijöitä säätelyssä sGC liitos on vielä määrittämättä.

oivalluksia mekanismia H

2O

2 aiheuttamaa PTBP1 proteiinien hajoaminen

Seuraavaksi tutkimme mahdollisia mekanismeja hnRNP sääntelyn H

2O

2. Päätimme keskittyä PTBP1 koska laajalti tutkittu RNA sitovan proteiinin tärkeä rooli erilaisissa vaiheissa solun mRNA käsittelyä, mukaan lukien silmukointi, sääntely vakautta, lokalisointi ja kääntäminen [29]. Lisäksi PTBP1 on osoitettu olevan välttämättömiä sääntelyn solujen kasvua ja syöpäsolujen selviytymisen [30], [31], [32]. Kyky H

2O

2 vähentää PTBP1 tasolle ehdotti, että lisäksi se voi olla rooli sääntelyn solujen sopeutuminen Hapettavissa olosuhteissa. Kuitenkin vaikutus kohonneen ROS tasoilla PTBP1 ilmaisu ei ole koskaan aiemmin tutkittu.

Ensimmäinen selvitettävä, jos H

2O

2 sivupersoonat PTBP1 mRNA vakaan tilan tasot. RT-qPCR-analyysi suoritettiin RNA-näytteet eristettiin MDA468-soluja käsiteltiin erilaisilla H

2O

2 pitoisuuksia ei löytynyt yhtään muutoksia PTBP1 mRNA-tasojen (Fig. 3C), mikä osoittaa, että PTBP1 todennäköisesti valvottava proteiinin tasolla. Jotta voidaan tutkia roolia proteasomaalisten hajoamista, tarkkailtiin dynamiikan muutosten PTBP1 proteiinia vasteena H

2O

2 hoitoon yli 16 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa proteasomin inhibiittoria MG132. Olemme havainneet, että PTBP1 proteiini pelkistettiin ajan riippuvalla tavalla alkaen 8 tuntia altistuksen jälkeen (Fig. 3 A, B). Mielenkiintoista, proteiinien hajoaminen ei ole estetty, vaan pikemminkin vahvistaa, jonka MG132 hoito. Tämä oli erityisen ilmeistä 16 tuntia ja myöhempinä ajankohtina (Fig. 3A ja tietoja ei ole esitetty). Näin ollen, vaikka MG132 käsittely osoitti, että proteasomin ollut suoraa vaikutusta PTBP1 hajoamiseen, että sen estäminen kiihdyttää hajoamista merkitsee välillistä osuutta asetuksessa, todennäköisimmin kautta vakauttaminen tuntemattoman proteaasin tai proteiinin kofaktorin. Esikäsittelyssä ja MDA468 solujen sykloheksimidillä (CHX, estäjä

de novo

proteiinisynteesiä) ei myöskään estä PTBP1 laskua, mikä osoittaa, että H

2O

2 on indusoiva ennestään proteiinien hajoaminen reitin (Fig. 3d). Aikaisemmin on osoitettu, että solun apoptoosin johtaa PTBP1 hajoamisen kautta Capase-3 aktivaation [33]. Niinpä selvitimme mahdollisuutta, että kaspaasi-3 saattaa olla merkitystä H

2O

2 aiheuttamaa PTBP1 pienenee. Kuitenkin olemme huomanneet, että lisäämällä kaspaasi-3-estäjällä IV (Ac-DMQD-CHO, Calbiochem) ei estä H

2O

2-indusoidun PTBP1 hajoamisen (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että kaspaasi-3: ei ole mukana tässä prosessissa. Sen määrittämiseksi, ovatko muut ulkoisten lähteiden lisäksi suora lisääminen H

2O

2 ratkaisu, saattaa vaikuttaa vakauteen PTB1, haimme glukoosioksidaasi (GO) ja soluviljelyväliaineista. Yhdenmukainen suora rooli H

2O

2 induktioon PTBP1 hajoamisen, steady-state tuotanto H

2O

2 GO käsittely jäljentää vaikutus.

: PTBP1 hajoaminen tapahtuu ajan riippuvaisella tavalla ja ei ole estänyt sitä proteasomin estäjä MG132. MDA468-soluja käsiteltiin, kuten on esitetty. 1C, 1 mM H

2O

2: n läsnä ollessa tai ilman MG132 (10 uM). Western blot -analyysi suoritettiin havainnollistamaan ilmentymisen PTBP1. β-aktiini toimi latauskontrollina. Biologiset kahtena kappaleena kullekin hoitoon on esitetty; blots edustavat kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin. B: Densitometria analyysi PTBP1 proteiinin tasot normalisoidaan β-aktiini. Keskiarvot edustavan biologisen kahtena kappaleena kullekin hoitoon on esitetty. C: H

2O

2 altistumista ei vaikuta PTBP1 mRNA-tasoja. MDA468-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla H

2O

2: ssa 24 tuntia. Suhteellinen runsaus PTBP1 mRNA näytteissä analysoitiin RT-qPCR analyysi. Keskimäärin ACt ± SD biologiseen triplikaatit näkyvät. D: PTBP1 hajoaminen riippuu tioli hapettumista ja ei pelastanut estämällä

de novo

proteiinisynteesiä. Western blot-analyysi suoritettiin MDA468 solulysaateista käsiteltiin 24 tuntia proteiinisynteesin inhibiittori cycloxemide (2 ug /ml) ja eri tekijöiden indusoimalla oksidatiivisen stressin: 1 mM BSO (GSH ehtyminen indusoija); 1 mM HEDS (tioli hapetus indusoija) ja 0,01 yksikköä /ml glukoosioksidaasia (lisää tuotantoa ROS). Näkyy Western blotit edustavat kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin.

H

2O

2 indusoi translaation jälkeinen proteiinin muunnoksia kuten hapettumisen solunsisäisen tiolien ja tiolaat- anioneja. Nämä muutokset ovat erottamaton osa H

2O

2 signalointi vaikuttaa erilaisia ​​soluprosesseja [34]. Aikaisemmin on osoitettu, että oksidatiivinen olosuhteissa PTBP1 voi muodostaa dimeerejä muodostumisen vuoksi molekyylien välisten disulfidisiltojen [35]. Itse asiassa kokeissa olemme myös havainneet muodostumista suuren molekyylipainon proteiinin kaista tunnustettu PTB1-vasta-aineita sen jälkeen, kun hoito MDA468 soluja H

2O

2 (tuloksia ei ole esitetty).

arvioidaan osuus tiolin hapettumisen PTBP1 hajoamista, otimme esiin MDA468 solut kaksi erilaista yhdistettä muuttamalla solun tioli aineenvaihduntaan. Käsittely 2-hydroksietyyli disulfidi (HEDS), aine, joka toimii tioli-specific hapetin, laski merkittävästi PTBP1 tasoilla (Fig. 3d), mikä osoittaa, että suora tioli hapetus voi olla tärkeä rooli PTBP1 hajoamista vasteen. Edelleen testi, jos PTBP1 hajoamisen aiheuttama vähentynyt solun tioli vähentävää toimintaa vastauksena H

2O

2, myös käsiteltyjen solujen L-buthionine-S, R-sulfoksimiinin (BSO). BSO on peruuttamaton estäjä glutationin biosynteesin, vähentämällä solunsisäisten glutationin allas. Olemme havainneet merkittävää hajoamista PTBP1 vastauksena BSO, viittaa siihen, että vähentynyt taso GSH ei ole riittävä aiheuttamaan PTBP1 (Fig. 3d) hajoaminen. Nämä tulokset voivat myös liittyä luontainen kyky MDA468 solujen korvaamiseksi GSH menetyksen aiheuttamaa BSO, kuten on aikaisemmin raportoitu solulinjoja, joilla on korkea SOD ilmaisun [36]. Siten hapetus Cys tiolien H

2O

2 voisi käynnistää muodostumista PTBP1 dimeerejä ja edistää myöhempien proteiinien hajoamista.

H

2O

2 vaikutus PTBP1 proteiini tasot vaihtelevat eri rintasyöpäsolulinjoissa

määrittämiseksi yleisyyttä H

2O

2 aiheuttamaa PTBP1 hajoamista, testasimme muita rintasyövän linjat, mukaan lukien: MDA-MD-453, MDA- MD-231 ja MCF7. Western blot-analyysi H

2O

2-käsitellyt solut osoittivat eriasteista PTBP1 väheneminen MDA468, MCF7 ja MDA231 soluja, mutta mitään muutosta MDA453 soluissa (Kuva. 4A). Epäonnistuminen aiheuttaa PTBP1 hajoamisen MDA453 soluissa havaittiin H

2O

2 pitoisuuksina, jotka helposti herättänyt merkittävää pienenemistä MDA468 soluissa (vertaa Fig. 4B kuvioon. 2B ja C). Nämä tiedot osoittivat, että laajuus H

2O

2 aiheuttamaa hajoamista PTBP1, ajatteli vallalla, on edelleen melko solulinja erityisiä. Tutkia, jos vastus PTBP1 proteiinien hajoaminen liittyy lisääntynyt solujen kykyä selviytyä oksidatiivista stressiä, vertasimme H

2O

2-indusoitua sytotoksisuutta MDA468 ja MDA453 soluja. MDA468 solut olivat vähemmän vastustuskykyisiä H

2O

2 aiheuttama sytotoksisuuden (IC

50 = 450 ± 60 uM) verrattuna MDA453 soluihin (IC

50 = 660 ± 2 uM) (Fig. 5 ). Yrittäessään yhdistää suoraan vähenemiseen PTBP1 tasoilla H

2O

2-indusoidun sytotoksisuuden suoritimme siRNA-välitteinen PTBP1 pudotus on MDA453 soluissa. Huolimatta yli 50% vähennys PTBP1 mRNA (havaittuna RT-qPCR), solujen elävyyden mittaukset paljastivat vain pieni merkityksetön lasku vastustuskyky H

2O

2 hoitoa (Kuva. S2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että taso PTBP1 ilmentymisen yksinään ei ole ratkaisevan tärkeää tukea oksidatiivisen resistenssin MDA435 soluissa.

: Western blot-analyysi tutkii PTBP1 ekspressiota MDA231, MDA453, MDA468 ja MCF7-soluja käsiteltiin 1 mM H

2O

2 18 tuntia. Edustavia biologinen kaksoiskappaleet näkyvät. B: MDA453 solut ovat resistenttejä H

2O

2 aiheuttamaa PTBP1 hajoamista.

Ylälevy

: MDA453 solu käsiteltiin eri pitoisuus H

2O

2 ja solulysaateista tehtiin Western blot-analyysi vasta-aineilla kohti PTBP1 ja β-aktiini. Näkyy blots edustavat neljää itsenäistä koetta samoin tuloksin.

Pohjalevy

: densitometria analyysi PTBP1 proteiinin tasot normalisoidaan β-aktiini tasot. Keskiarvot edustavan biologisen kahtena kappaleena kullekin hoitoon on esitetty.

Survival käyrä syntyi vastauksena H

2O

2 annosta käyttäen tryptan sulkemismenetelmällä ja ilmaistiin% säilyminen käsittelemättömien kontrollien . Keskiarvo ± SD kolme riippumatonta kohtia suoritettiin kolmena rinnakkaisena esitetään, * – p 0,05 Studentin t-testiä verrattuna hallita.

Keskustelu

Tässä raportissa osoitetaan, että oksidatiivisen stressin aiheuttama H

2O

2 vaikutteita silmukoinnin α1 sGC geeni (GUCY1A3) ja selektiivisesti vähentää proteiinin taso PTBP1 ja hnRNP A2 /B1 liittämiseen tekijöitä. Olemme aikaisemmin todettu, että GUCY1A3 transkriptit tehdään vaihtoehtoisen silmukoinnin ja että C-α1 sGC liitos isoformi koodaa proteiinia, joka on resistentti ODQ-indusoimaa hajoamista [19], [37]. ODQ indusoi hajoamista hapettumisen seurauksena sGC proteesin hemiryhmään, mikä horjuttaa proteiinia. Samanlainen prosessi on ehdotettu tapahtuvan olosuhteissa oksidatiivisen stressin ja olevan vastuussa laski tasolle sGC proteiinin verisuonten tulehdus [23]. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, jos sGC liitos voidaan puuttua ROS mahdollisena mekanismi suosia ilmentymisen hapettumista C-α1 liitoksen muoto.

H

2O

2 on läsnä ROS molekyyli, joka on tuotettu soluissa Superoksididismutaasi metaboliitti, jota superoksidianionin (O

2-). H

2O

2 on suhteellisen vakaa ja neutraalisti veloitetaan jonka avulla se voi helposti ylittää solukalvojen. Nämä ominaisuudet ovat johtaneet ehdotukseen, että H

2O

2 voi olla mukana parakriinisella oksidatiivista stressiä signalointi [38], [39]. Niinpä päätimme tutkia H

2O

2 välittäjänä oksidatiivisen stressin meidän tutkimuksia ihmisen BE2 neuroblastooma ja MDA468 rinnan adenokarsinooman solulinjoja. Tuloksemme osoittivat ensimmäistä kertaa, että altistuminen H

2O

2 lisää suhteellinen määrä C-α1 mRNA ja proteiini näissä solulinjoissa (Fig. 1). Tämä tulos vahvistetaan, että C-α1 liitos voidaan moduloida fysiologisesti relevantti ROS yhdiste, ja ehdottaa, että liitos voi olla tärkeä rooli moduloivan sGC entsymaattisia ominaisuuksia vastauksena muutoksiin oksidatiivisen tasapaino microenvironment. Lisätutkimuksessa tueksi tätä ajatusta on äskettäin raportoineet Kraehling et al. [21]. Tässä raportissa itsenäisesti vahvistaneet aikaisempia havaintoja, C-α1 sGC muodot erittäin vakaa ja täysin aktiivinen heterodimeerejä β1 sGC. Lisäksi ero subsellulaariseen jakelu C-α1 ja kanonisen α1 sGC alayksiköitä on osoitettu käyttämällä fluoresoivasti merkitty proteiini; C-α1 isoformi paikallistettiin enemmän hapettunut ympäristön endoplasmakalvoston. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että vaihtoehtoisen silmukoinnin ja GUCY1A3 geenin voisivat osallistua mukautuva soluvasteen säilyttämiseksi sGC toiminnon oksidatiivista stressiä. Lisätutkimukset arvioimaan fysiologisia tärkeää tällainen sopeutuminen ovat tarpeen.

Saadakseen käsityksen mahdollisia mekanismeja vaihtoehtoisen silmukoinnin α1 sGC, teimme

in silico

analyysi asiaan GUCY1A3 introni ja eksonisekvenssit tunnistaa mahdolliset säätelyelementit [40], [41]. Jakauma ennustettu

cis

sääntelyvälineitä sekvenssit oli yhdenmukainen sellaista mallia, että SR proteiineja suosisi kanoninen silmukointikohtaemäsasemasta käyttöä, kun taas sitoutuminen hnRNPs, erityisesti PTBP1 ja hnRNP A2 /B1, estäisi tunnustamista eksoni 4 konstitutiivista 3 ’silmukointikohtaan edistää C-α1 isoformin tuotanto (Fig. 2A ja Fig. S1). Testata mallimme tarkastelimme ilmaus liitos tekijöistä ennen ja jälkeen altistuksen H

2O

2. Vaikka liitos sääntely on yleisesti aikaan moduloimalla ekspressiotason sääntelyn tekijät [28], vaikutus oksidatiivisen stressin tätä prosessia ei ole selvitetty aiemmin. Vastoin odotuksia, tiedot osoittivat, että H

2O

2 altistuksen aiheuttama selektiivinen väheneminen PTBP1 ja hnRNP A2 /B1 ja ei ollut vaikutusta HUR ja SR proteiinin ilmentymisen (Fig. 2). Meidän kokeelliset tulokset osoittavat monimutkaisemman sääntelyn sGC liitos kuin on ennakoitu

in silico

mallissa. Lisätutkimukset ovat tarpeen selittää tätä eroa. Toisessa kädessä, erityinen ja dramaattinen väheneminen kaksi keskeistä Silmukointi tekijät ehdottivat, että selektiivinen alas-säätely liitos sääntelyviranomaisten voisi olla yksi mekanismeista muutokset vaihtoehtoisen silmukoinnin vastauksena oksidatiivista stressiä.

PTBP1 näytelmiä keskeinen rooli useissa transkription jälkeinen sääntelyprosesseille, ja sen toiminta on yhdistetty soluproliferaatioon, apoptoosin, kasvaimen kehittymisen ja vastaus hypoksia [30], [42], [43], [44]. Siksi päätimme tutkia edelleen vaikutusta H

2O

2 kohtelu PTBP1 ilmaisua. Tuloksemme osoittivat, että H

2O

2 pienenee PTBP1 ilmentymisen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Fig. 2C, F ja Fig. 3A, B). Ei muutosta PTBP1 mRNA tasolla havaittiin, mikä osoittaa, että alassäätö tapahtuu transkription jälkeen (Kuva. 3C). Lisäksi useita tunteja viive vastauksena H

2O

2 hoitoa ehdottaa epäsuora mekanismi PTBP1 alassäätöä. Tätä päätelmää tukee se havainto, että proteasomin estäjä MG132 helpottuu, eikä estyy, H

2O

2 aiheuttama lasku PTBP1 proteiinia (Fig. 3A, B). Koska PTBP1 hajoamista ei edellytä uutta proteiinisynteesiä (sitä ei estänyt sykloheksimidikäsittelylle) havaintomme osoittavat, että H

2O

2 voi mahdollisesti lisätä proteasomaalisten hajoamisen joidenkin tuntematon tekijä vastuussa PTBP1 vakauttamiseen. Koska H

2O

2 altistumisen tiedetään aiheuttavan apoptoosia [45], me pidetään kaspaasivälitteinen hajoamista PTBP1. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PTBP1 on kohdistettu Capase-3 aikana apoptoottisen vasteen [33]. Kuitenkin Inhibitor IV onnistuttu estämään H

2O

2-välitteinen väheneminen PTBP1 proteiinin tasot (tuloksia ei ole esitetty). Täten voimme päätellä, että H

2O

2 luultavasti indusoi PTBP1 hajoamista eri aiemmin kuvattu mekanismeista.

On myös tärkeää huomauttaa, että PTBP1 hajoaminen ei rajoitu suoraan lisäämällä H

2O

2 ratkaisu soluihin. Sovellus solunulkoisen glukoosioksidaasi (GO), joka katalysoi glukoosin H

2O

2 ja D-glukono-δ-laktoni, myös indusoi merkittävän laskun PTBP1 proteiinin MDA468 soluissa (Kuva. 3D) .

reaktio H

2O

2-proteiinin tiolien (R-SH) ja tiolaat- anionit (RS

-) tunnetaan tuottaa sulfenic hapot (RSOH) muutokset ja edistää disulfidin sidoksen muodostumisen. Näiden proteiinien osallisena erilaisia ​​biokemiallisia vaikutuksia välittävien ROS signalointi [34], [46]. Mielenkiintoista on, että dimerointi PTBP1 molekyylien kautta molekyylien välisiä Cys sillan muodostuminen on aiemmin havaittu Hapettavissa olosuhteissa [35]. Olemme tutkineet mahdollisuutta, että alas-säätely PTBP1 proteiinin H

2O

2 välittää tioli hapettumista. Todellakin, epäspesifinen tioli hapettamalla yhdiste HEDS herättänyt merkittävää laskua PTBP1 tasoilla, samanlainen suora H

2O

2 altistus (Fig. 3d). Siten dimerointi kautta kysteiinin hapettumisen voisi kohdistaa PTBP1 proteiinin myöhempää hajoamista. Rajaaminen tarkka mekanismi vastaa selektiivisen ROS aiheuttama hajoaminen tämän tärkeän säädin voi tarjota lisää tärkeitä tietoja solujen oksidatiivista vastetta.

Aiemmin PTBP1 ilme on korreloinut lisäykset leviämisen ja metastaattisen potentiaalin syöpäsolujen;