Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Useita muutoksia RNA-aineenvaihduntaan on löytynyt keuhkosyöpäsolut; Tämä viittaa siihen, että RNA aineenvaihduntaan liittyvät molekyylit ovat mukana kehittämässä tätä patologian. Tässä tutkimuksessa etsittiin RNA aineenvaihduntaan liittyvien geenien näytteille eri ekspressiotasot normaalin ja kasvaimen keuhkojen kudoksia. Havaitsimme kahdeksan geenit ilmentyvät differentiaalisesti keuhkoadenokarsinooma microarray aineistoja. Näistä seitsemän oli säädelty taas yksi oli alassäädetty. Mielenkiintoista on, että useimmat näistä geeneistä ei ollut aiemmin liittynyt keuhkosyöpä. Nämä geenit pelata erilaisia ​​rooleja mRNA aineenvaihdunta: kolme jotka liittyvät silmukointiyksikkövälitteiseen (ASCL3L1, SNRPB ja SNRPE), kun taas toiset osallistuvat RNA liittyvissä prosesseissa kuten kääntämisen (MARS ja MRPL3), mRNA: n stabiilisuuteen (PCBPC1), mRNA liikenne (RAE ), tai mRNA: n muokkaus (ADAR2, joka tunnetaan myös ADARB1). Lisäksi löysimme yleisyydestä Heterotsygotian menetys kromosomissa 21q22.3, jossa ADAR2 lokus sijaitsee, NSCLC solulinjoissa ja ensisijainen kudoksissa, mikä viittaa siihen, että downregulation ADAR2 keuhkosyövässä liittyy erityisiä geneettisiä tappioita. Lopuksi, sarjassa adenokarsinooma potilailla, ekspression viisi vapailla geenien (ADAR2, Mars, RAE, SNRPB ja SNRPE) korreloi ennusteeseen. Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, että muutokset RNA aineenvaihdunta on patogeneesiin liittyvien keuhkosyövän, ja tunnistaa uusia mahdollisuuksia tavoitteet tämän taudin hoitamiseksi.

Citation: Valles I, Pajares MJ, Segura V , Guruceaga E, Gomez-roomalainen J, Blanco D, et al. (2012) tunnistaminen Novel vapautettiin RNA Metabolism liittyvistä Geenit ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (8): e42086. doi: 10,1371 /journal.pone.0042086

Editor: Stefan Maas, Lehigh University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 02 elokuu 2012

Copyright: © Valles et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut ”UTE projekti CIMA”; Espanjan hallitus (ISCIII452RTICC RD06 /0020/0066, PI02 /1116 ja PI10 /00166), Euroopan aluekehitysrahasto (EAKR) ”Una manera de hacer Europa”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä ihmisen syöpien ja johtava syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [1], [2]. Se sisältää kaksi pääasiallista histologista alatyyppiä, pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), ja jälkimmäinen osuus 80-85% kaikista tapauksista. Keuhkosyöpä on usein havaitaan pitkälle, jossa vaiheessa sairaus on lähes parantumaton. Edelleen luonnehdinta biologisista muutoksista liittyy sen synnyssä voisi mahdollisesti auttaa tunnistamaan uusia biomarkkereita varhaisen diagnoosin ja uudet tavoitteet tehokkaampia hoitomuotoja.

vaihtoehtoinen silmukointi on biologinen prosessi välttämätön proteiinin monimuotoisuutta. Vaihtoehtoisen silmukoinnin, useita kopioita tuotetaan yhdestä mRNA prekursorin. Muutoksia vaihtoehtoisen silmukoinnin on osoitettu liittyvän erilaisiin sairauksiin, mukaan lukien syöpä. Useat vaihtoehtoisesti silmukoituneet geenituotteita on liitetty kehittämiseen neoplastisen taudin [3]. Syöpään liittyvän silmukoitumisvarianttia saattavat toimia ja ennustavia välineitä sekä terapeuttisia kohteita syöpään [4]. Keuhkosyövän, monet silmukoinnin muutoksia on kuvattu aikaisemmin syöpään liittyvien prosessien, kuten solun kasvussa, solusyklin kontrolli, apoptoosin, tai angiogeneesi [5] – [9]. Esimerkiksi korkeita tasoja anti-apoptoottista variantti Bcl-xL: n on raportoitu edistää syövän etenemisen sekä SCLC ja NSCLC [10], [11]. Viime aikoina liittämiseen muutokset vaikuttivat selostukset VEGFA, MACF1, APP, ja NRON oli osoitettu potilailla, joilla keuhkojen adenokarsinooma [9]. Lisäksi ilmaisu tietyn isoformin NRON Tuumorinäytteissä osoitettu edistävän solujen lisääntymistä [9]. Lisäksi modulaatio kaspaasi 9 vaihtoehtoisen silmukoinnin osoitettiin vaikuttavan herkkyyteen NSCLC-solujen jossain kemoterapia-aineiden [12].

Mekanismit poikkeava vaihtoehtoisen silmukoinnin keuhkosyövässä yhä puutteellisia. Joissakin tapauksissa mutaatiot silmukoinnin säätelyelementtejä nukleotidisekvenssin sisällä geenin tuloksen muutoksia liitoksen paikan valintaa, mikä vuorostaan ​​vaihtoehtoisesti liitettyjä transkriptien [13]. Muissa tapauksissa muutokset proteiineja, jotka liittyvät mRNA-aineenvaihdunnan ovat vastuussa epänormaali liitoksen kuvioita. Jotkut tutkimukset ovat raportoineet muutoksia pitoisuuden, lokalisointi, koostumus tai aktiivisuutta useiden RNA-sitovia proteiineja keuhkosyövän [14] – [19], mikä viittaa siihen, että tämän reitin usein muuttunut ja on tärkeää pahanlaatuisiin. RNA sitovan proteiinin SF2 /ASF yliekspressoituu NSCLC kasvaimia ja edistää selviytymistä tehostamalla surviviinin ilmaisun [18]. Tutkimukset eläinmalleissa osoittavat, että muuttamalla tasapaino eri RNA-sitovia proteiineja myötävaikuttaa keuhkojen syövän synnyn [20], [21]. Kuitenkin luonnehdinta ohjelmistoon RNA aineenvaihduntaan liittyvien molekyylien mukana keuhkosyöpä on tällä hetkellä epätäydellinen, ja lisätutkimukset ovat perusteltuja.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan uusia RNA aineenvaihduntaan liittyvien geenien, joilla on muuttunut ilmentyminen ensisijainen keuhkokasvaimia. Käyttämällä keuhkoadenokarsinooma microarray aineistoja, etsittiin geenejä, jotka osoittivat merkittävästi erilaiset ekspressiotasot normaalin ja kasvaimen keuhkojen kudoksia. Havaitsimme seitsemän mRNA aineenvaihduntaan liittyviä proteiineja säädellään ylöspäin kasvain kudosten ja yksi alas-säädellä. Noin yli-ilmentyvien geenien kuuluvat perheeseen spliceosomal proteiinien, syytetään tämä solukoneisto kehittämiseen NSCLC. Vaimentua geeni ADAR2 sijaitsi alueella, jossa tiheä deleetioita NSCLC. Lisäksi ilmaisu viisi näiden geenien liittyi ennusteen potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma, tukemalla merkitys RNA-aineenvaihdunnan keuhkosyöpä biologiassa.

Tulokset

Gene Valitse Bioinformatics Analysis

Genes kuuluvat RNA aineenvaihduntaan liittyvät luokat poimittiin Gene ontologia tietokanta (www.godatabase.org). Kolme suurta RNA aineenvaihduntaan liittyvät luokat valittiin: ”RNA sitova”, ”Silmukointi”, ja ”silmukointiyksikkövälitteiseen monimutkainen”. Kertamuutoksen (FC) geeni-ilmentymisen tason normaalin ja adenokarsinooma keuhkokudoksessa laskettiin käyttäen tietoja kolmen microarray kokeissa [22] – [24]. Joukko geenien mRNA ekspressiotasot huomattavasti toisistaan ​​normaalin ja syövän kudoksissa saatiin kustakin kolmesta microarray kokeiluja (taulukko S1). Edustava esimerkki on esitetty kuviossa 1A, ja päällekkäisyyttä eri luettelot esitetään kuviossa 1B. Lisäksi olemme havainneet, että nämä geenit ilmentyvät differentiaalisesti okasolusyöpä, pienisoluinen keuhkosyöpä, ja karsi- tapauksissa läsnä aineistot (tuloksia ei ole esitetty). Vahvistavan pätevyyden tämän valinnan, lisää

in silico

validointi suoritettiin neljäs riippumaton kohortin keuhkoadenokarsinooma potilaista [25], ja tulokset vahvistivat havainnot alkuperäisessä kokeessa (taulukko S2).

) RNA liittyvien geenien kanssa ekspressiotasot merkitsevästi erilainen (p 0,01) välillä keuhkoadenokarsinooma näytteiden ja normaali keuhkojen näytteitä (viimeinen 10 sarakkeet) yhdessä mikrosirun tietokantojen tutkimuksessa käytetyt [23]. Punainen väri tarkoittaa korkeampia ekspressiotasoja, kun taas vihreä väri osoittaa alemman ekspressiotasoja. B) Venn-kaavio, joka vastaa geenejä merkittäviä ilme eroja normaalin ja adenokarsinooman näytteitä.

Expression of Selected RNA Metabolism liittyvien geenien Keuhkosyöpä Solulinjat ja Normaali Lung Ensisijainen Cultures

ekspressiotasot valittujen geenien arvioida tavanomaisilla PCR SCLC ja NSCLC solulinjoissa että ensisijainen NHBE soluissa. Useimmat geenit, mRNA-tasot keuhkosyöpää solulinjoissa olivat korkeammat kuin NHBE soluissa (kuvio 2). Lisäksi mRNA-tasot olivat yleisesti korkeammat SCLC solulinjoissa verrattuna NSCLC solulinjoja. Tämä tulos on yhdenmukaiset aiempien havaintojen jossa ekspressiotasoja muiden RNA-sitovien proteiinien selvitettiin myös olevan suurempi SCLC verrattuna NSCLC [15]. Vuonna ADAR2 useat keuhkosyövän solulinjoja näytteillä pienempi mRNA-tasot verrattuna NHBE soluihin. Olemme ulkopuolelle RNPS1 ja SNRPC seuraavissa analyyseissä, koska ekspressiotasot olivat homogeenisia kaikkien solutyyppien.

Expression tasot määritettiin keuhkosyövän solulinjat ja normaaleihin ihmisen keuhkoputken epiteelin (NHBE) soluja. GAPDH käytettiin kontrollina geenin. SCLC: pienisoluinen keuhkosyöpä; ADC: adenokarsinooma; SCC: okasolusyöpä; LCC: suuri karsinooma; CT: karsinoidituumori; NC: negatiivinen kontrolli (vesi).

määrittää erot ekspressiotasoja, reaaliaikainen PCR kunkin kahdeksan valittujen geenien tehtiin paneelin keuhkosyövän solulinjat, sekä NHBE solut ja normaali ensisijainen SAECs. Tämä analyysi vahvisti aiemmat tulokset: ekspression up-geenien oli korkeampi keuhkosyövän soluja verrattuna NHBE soluja tai SAECs. Sen sijaan, ADAR2 ilmentyminen keuhko- syöpäsoluja oli pienempi kuin NHBE soluissa tai SAECs (kuvio 3).

Expression tasot määritettiin keuhkosyövän solulinjat ja ei-pahanlaatuisten keuhko- primaariviljelmissä (NHBE ja SAEc). HPRT käytettiin kontrollina geenin. Pylväät edustavat normalisoitui ilmaus suhde suhteessa geenin tasoja NHBE soluissa. Tunnusluvut 1 osoittavat korkeampia ekspressiotasoja kuin NHBE soluissa, kun taas suhteet 1 merkitsevät alhaisempia ekspressiotasoja.

geneettisiä muutoksia tällä ADAR2 Locus

ominaista geneettisiä muutoksia liittyvän jossa ADAR2 alassäätöä keuhkosyövässä. Näin ollen meidän arvioida läsnä LOH on 21q22.3, sijainti ADAR2 lokukseen. Käytimme paneeli kahdeksan heterotsygoottista mikrosatelliitteihin. Mikrosatelliitit monistettiin PCR: llä ja analysoitiin kapillaarielektroforeesin. Mikrosatelliitti heterotsygotian alun perin arvioitiin paneelin keuhkosyövän solulinjoja ja tulokset on esitetty kuviossa 4. kuuden solulinjoissa (H23, HCC827, A549, H322, H1385, ja H1299), kaikki mikrosatelliitteihin olivat homotsygoottisia. Vaikka läsnäolo heterotsygoottisuuden menetys (LOH) ei ole lopullisesti ratkaiseva, koska ei ole sovitettu normaalin genomisen DNA: n, tämä homotsygoottisiksi on erittäin epätodennäköistä, ja viittaa vahvasti menetyksen geneettistä materiaalia. Muissa solulinjoissa tulokset olivat vaihtelevia, ja tietyissä tapauksissa ehdotti paikallisia alueita LOH (esim kaikkein sentromeerista alueella H157-soluissa). Seuraavaksi verrattiin homotsygootista 21q22.3 ja ADAR2 mRNA: n ilmentymisen tasoja (aikaisemmin saatu). Kaikki solulinjat homotsygoottisia mikrosatelliitteihin ilmaisi alhainen ADAR2 mRNA-tasoja. Itse asiassa kaksi kolmesta solulinjojen alin ADAR2 mRNA: n ekspression tasojen (A549 ja H1385) kuuluvat tähän ryhmään. Sitä vastoin viisi solulinjat, joilla on korkein ADAR2 ekspressiotasot (H82, H187, H157, H226 ja H460) olivat enimmäkseen heterotsygoottinen mikrosatelliitit reunustavien ADAR2 lokuksen (D21S171 ja D21S1574).

homotsygoottisiksi (vihreä) tai heterotsygotian (punainen) määritettiin kussakin solulinjassa. Mikrosatelliitit tilataan eniten sentromeerisen kaikkein telomeerisesti. ADAR2 lokus sijaitsee D21S171 ja D21S1574.

Tutkimme läsnäolo homotsygootista 21q22.3 perimän DNA 48 potilaalla on keuhkosyöpä. Arvioinnin kahdeksan mikrosatelliitit kasvainkudoksissa ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin antoi meille mahdollisuuden määrittää täsmällisesti taajuus LOH tämän kromosomaalisen alueen. Kuvio 5A esittää kolme vaihtoehtoista elektroforeesitekniikalla kuviot saadaan: ei-informatiivinen tapauksessa säilyttäminen Heterotsygoottisuuden, ja LOH. Sen jälkeen microsatellite analyysi, LOH tunnistettiin noin 30-40%: ssa tapauksista (kuvio 5B). LOH on 21q22.3 oli merkittävästi korkeampi okasolusyöpää kuin adenokarsinoomat (25 ± 6% vs. 49 ± 7%, p = 0,003). Mitään eroja taajuutta LOH välillä ei havaittu vaiheiden (vaihe I: 37 ± 2% vs. vaiheet II-III: 34 ± 7%, p = 0,279). Arvioida ADAR2 lokuksen tarkemmin, SNP sijaitsevat ADAR2 geenin (rs1051367) analysoitiin. Kahdestakymmenestä informatiivinen tapauksissa (ts tapauksissa heterotsygoottinen SNP rs1051367 normaalissa kudoksessa), viidentoista (75%) olivat homotsygoottisia vastaavaan sovitettu kasvainkudoksessa. Vertailu saadut tulokset mikrosatelliittimerkki analyysin ja SNP sekvensointi osoitti välistä yhdenmukaisuutta vastaavien tekniikoiden vaikka potilaiden määrä LOH klo ADAR2 SNP oli suurempi (30-40% vs. 75%).

genominen DNA ensisijainen keuhkosyövässä ja niiden vastaavia normaalin keuhkojen kudoksia käytettiin. A) Edustavia esimerkkejä Elektroforeesitekniikalla kuviot saadaan mikrosatelliittimerkkien analyysi: ei-informatiivinen tapauksessa vain yksi vahvistus huippu; Heterotsygoottisuuden säilyttäminen, jossa on kaksi piikkiä sekä normaali- että kasvain näytteissä; ja Loh, kaksi piikkiä normaalissa näytteessä, mutta vain yksi piikki vastaavassa kasvaimen näyte. Nuolet osoittavat Mikrosatelliittimarkkerien alleeleja. B) LOH on ilmoitettua mikrosatelliitteihin analysoitiin 48 pienisoluista keuhkosyöpää. Mikrosatelliitit tilataan eniten sentromeerisen kaikkein telomeerisesti. LOH on ADAR2 lokukseen analysoitiin suoralla sekvensoinnilla polymorfismin rs1051367 (A /G). Vihreät laatikot edustavat Loh, punainen laatikot osoittavat säilyttäminen Heterotsygoottisuuden, ja keltainen laatikot eivät ole informatiivisia loci.

Expression of RNA Metabolism liittyvien geenien ja keuhkosyövän kliinistä hyötyä

Tutkimme onko ilmaus differentiaalisesti ilmaisi RNA aineenvaihduntaan liittyvien geenien liittyi kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma käyttävät yleisesti saatavilla microarray data [26]. Potilaat jaettiin mukaan korkean ja matalan mRNA: n ilmentymisen suhteen käyttäen mediaani kuin katkaista piste (kuva 6). Kun kyseessä on ASCC3L1, MRPL3, ja PABPC1 ei assosioitunut mRNA-tasoja ja potilaan kliinisten tulosten (tuloksia ei ole esitetty). Korkea ilmentymä MARS, RAE1, SNRPB, ja SNRPE oli merkitsevästi yhteydessä heikentyneeseen kokonaiselossaolo. Korkea ADAR2 mRNA tasot olivat merkitsevästi yhteydessä parempaan tulokseen. Yhdistetyssä analyysissä viiden prognostisia geenejä, potilaat jaettiin kolmeen ryhmään: potilailla, joilla ei purkamalla tapahtumia, potilailla, yhdestä kolmeen tapahtumia, ja potilailla, joilla on neljä tai viisi tapahtumaa. Yhdistetyn pisteet viidestä geenien oli vahva prognostinen markkeri (kuvio 6). Siten potilailla, joilla ei purkamalla tapahtumia näytteillä erittäin hyvä selviytyminen. Sitä vastoin potilailla, joilla vapauttaminen neljän tai viiden geenien näytteille pahin selviytymistä. Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin arvioimaan ennustetekijöiden pisteet eloonjäämiseen, sekä yhden ja usean analyysi (taulukko 1). RNA-aineenvaihdunnassa tilanne oli itsenäinen ennustetekijä yleistä eloonjäämistä potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma.

Data saatiin microarray tutkimuksen [26]. Luvut osoittavat Kaplan-Meier käyrät ja log rank tilastot eloonjäämisaste potilaiden jaettu korkean ja matalan mRNA: n ilmentymisen (käyttäen mediaani kuin cut-off-piste). Viimeinen luku vastaa potilaita jaettuna sääntelyn purkamisesta tapahtumista (katso Materiaalit ja menetelmät).

Keskustelu

tunnistettu kahdeksan RNA liittyviä geenejä differentiaalisesti ilmaistut keuhkosyövän , toteamaan joka tukee oletusta, että RNA aineenvaihdunta on tärkeä patogeneesissä keuhkosyöpään. Seitsemän tunnistettujen geenien säädelty, kun taas vain yksi oli alassäädetty. Mielenkiintoista on, että useimmat näistä geeneistä ei ole aiemmin raportoitu liittyvän keuhkosyövän. Lisäksi ilmaus suurin osa näistä geeneistä näytteillä yhdessä eloonjäämiseen keuhkojen adenokarsinooma potilailla, mikä viittaa yhteyden RNA aineenvaihduntaa ja keuhkosyöpää synnyssä.

Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että RNA-aineenvaihdunnan geenit vapautettu ja sekaantunut pahanlaatuisiin keuhkojen soluihin [14], [16], [18]. Havainnot tutkimuksessamme tunnistaa uusia differentiaalisesti ilmaisi liittyviä geenejä RNA-aineenvaihduntaa. On selvää, että ilmaisu monien muiden RNA-liittyviä geenejä on muuttunut keuhkosyövässä. Ryhmä geenejä tunnistettu tutkimuksessamme vaikutti voimakkaasti tiukkoja strategian valinta. Tilastolliset analyysit olivat rajoittavia; Näin ollen, ainoastaan ​​merkittävimmät geenit valittiin. Lisäksi, muutokset liittämiseen, joita on raportoitu joissakin RNA liittyviä geenejä [17], [27], [28], ei voida havaita käyttämällä tätä analyyttistä lähestymistapaa.

Useimmat RNA liittyvien geenien tunnistettu tutkimuksessamme oli säädelty kasvainkudoksessa. Syy tähän on epäselvä; se voi johtua lisääntyneestä aineenvaihduntaa liittyy kasvainsolujen proliferaatiota. Kuitenkin valtaosa RNA liittyvien geenien ei esiintynyt eroja kasvaimen ja normaalin keuhkojen kudoksiin. Lisäksi yksi merkitystä tunnistetun geenin tutkimuksessamme säädeltiin vähentävästi (ADAR2), ja mRNA: n ilmentymisen viiden valitun geenien liittyy kliinisten tutkimusten tulosten kanssa sarjassa adenokarsinooma potilailla. Erityisesti korkea ilmentyminen up-geenien (MARS, RAE1, SNRPB, ja SNRPE) liittyi huonompi ennuste, kun taas korkea ilmentyminen säädeltiin vähentävästi geenin (ADAR2) korreloi parannetun selviytymistä. Mielenkiintoista, potilaiden ryhmässä, joilla ei ole vapauttamisen missään näistä geeneistä näytteillä erittäin hyvä selviytyminen. Toisaalta, suuri määrä vapauttamisessa tapahtumia on yhteydessä huonoon säilymiseen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktiivisuus RNA-aineenvaihdunnan koneet saattavat olla ennustetyövälineenä merkkiaine keuhkosyöpään.

Proteiinit käännetty kolme kahdeksasta up geenien kuuluvat perheeseen spliceosomal pienten ydinaseiden ribonukleoproteiineissa ( snRNP: eille): ASCC3L1, SNRPB, ja SNRPE. Silmukointiyksikkövälitteiseen on monimutkainen snRNP: eille sekä lukuisia liittyviä proteiineja. Tämä monimutkainen tunnistaa silmukointikohdista ja poistaa intronia pre-mRNA-molekyylejä. Tiedetään vähän koskien roolia silmukointiyksikkövälitteiseen syövän. Äskettäin käyttäen koko-exome Sekvensointianalyysin jotkut tutkimukset ovat tunnistaneet tiheä mutaatioiden erillisten komponenttien silmukointiyksikkövälitteiseen kroonisen lymfaattisen leukemian ja myelodysplasian [29] – [33], syytetään tämä solukoneisto kehittämisessä syövän [34] . Niinpä jotkut spliceosomal inhibiittoreita on testattu syöpäsoluja ja silmukointiyksikkövälitteiseen on ehdotettu syövän tavoite [35]. Tunnistaminen Kolmen spliceosomal proteiinien differentiaalisesti ilmaistut keuhkosyöpä viittaa siihen, että rooli on, että silmukointiyksikkövälitteiseen tässä maligniteetti. Valitettavasti on vähän julkaistua tietoa rooli näiden tiettyjen proteiinien syövän. ASCC3L1 (SNRNP200) koodaa helikaasi Brr2, joka on tärkeä osa spliceosomal snRNP U5. Tietääksemme tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa kuin ASCC3L1 liittyy maligniteetti. Pieni ydinaseiden ribonukleotidi liittyvän proteiinin B (SNRPB) on osa snRNP U1. SNRPB on raportoitu olevan etäpesäke vaimentimen hiiren allograftin malli eturauhassyövän [36]. Harvinainen polymorfismi SNRPB geeni on liittynyt pienempi riski rintasyöpään BRCA1-mutaation kantajia [37]. Yli-ilmentyminen pienten ydinaseiden ribonukleotidireduk- liittyvän proteiinin E (SNRPE) on tiettävästi liittynyt kasvun pysähtymisen G2 vaiheessa niin pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten solujen [38]. Kuitenkin linjassa tuloksia, SNRPE vahvistetaan ja yli-ilmennetään pahanlaatuinen gliooma ja suun okasolusyöpää [39], [40]. SNRPE myös vahvistetaan ja säädelty maksasolukarsinoomassa ja voi toimia onkogeenin tehostamalla solujen lisääntymistä [41].

muut proteiinit, jotka olivat säädelty tutkimuksessamme olivat MARS, MRPL3, PABPC1 ja RAE . Metioniini-tRNA-syntetaasin (MARS tai metrs) toimii katalyyttinä sitoutumisen metioniinin sen vastaavan tRNA. Lisääntynyt tämän entsyymin aktiivisuutta on raportoitu ihmisen paksusuolen syöpä [42]. Viime aikoina indusoinnin MARS ilmentymistä esitetty rintasyövän solulinjoissa stimuloitiin insuliinin kaltainen kasvutekijä [43]. Lukukehysmutaatioita in MARS on kuvattu maha- ja peräsuolen karsinoomat kanssa mikrosatelliittien epävakaus [44]. Mitokondrioiden ribosomaalinen proteiini L3 (MRPL3) on osa 39s alayksikön mitokondrioiden ribosomin. Korkea tämän proteiinin ilmentymisen on raportoitu maksasyöpä, paksusuolen syöpä, ja lymfooma, mielikuvan kyseessä tämän proteiinin korkean solunjakautumisen hinnat [45]. Poly-A sitovan proteiinin sytoplasmisen 1 (PABPC1) osallistuu poly-A lyheneminen 3 ’päähän eukaryoottisten mRNA: iden. Ristiriitaisia ​​tuloksia roolista tämän proteiinin syöpä, on raportoitu. Eräässä tutkimuksessa todettiin, että alhainen PABPC1 korreloi enemmän invasiivisia kasvaimia ja huonompi eloonjäämisluvut potilailla, joilla on ruokatorven syöpä [46]. Kuitenkin, muissa tutkimuksissa, PABPC1 yli-ilmentyminen on kuvattu eturauhas- kasvaimissa [47], maksasyövän [48], pinnallisen virtsarakon syövän [49], ja keuhkosyöpä [50]; jälkimmäisessä raportissa kirjoittajat ehdottivat osallistumista käännöksen aloittamista monimutkainen kasvainten synnyssä keuhkosyöpään. PABPC1 säännellään myös telomeraasiaktiivisuus, mikä johtaa kasvun etu keratinosyyteissä ilmentävät ihmisen papilloomaviruksen tyyppiä 16 E6 [51]. RNA vienti 1-homologi (RAE1) on tumasta proteiinia mukana mRNA kuljetukseen tumasta sytoplasmaan. RAE1 on myös ratkaiseva rooli ylläpidossa karan kaksinapaisuutta solunjakautumisen aikana [52], [53]. RAE1 mRNA ja proteiini tasoilla vähenemään esto neuroblastooma solujen lisääntymisen, ja sen yliekspressio estää retinoiinihappo aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja erilaistuminen [54]; kuitenkin, edellisen tutkimus osoitti, että RAE1 /NUP98 mutantti hiiret ovat alttiimpia DMBA-indusoidun keuhkojen kasvaimet verrattuna villin tyypin hiirissä, mikä osoittaa, että yhdistetty RAE1 /NUP98 HAPLO-vajaatoiminta mahdollisesti edistää tuumorigeneesiä [55].

vaimentua geeni adenosiinideaminaasigeenin toimiva RNA 2 (ADAR2 tai ADARB1) on RNA editase joka katalysoi adenosiini inosiiniksi deaminaation kaksijuosteisessa alueilla. Dysregulation adenosiini inosiiniksi muokkaamalla ihmisen syövissä mahdollisesti myötävaikuttaa muuttunut transkription ohjelma edellyttää jatkuvaa karsinogeneesi [56]. ADAR2 ilmentyy kaikkialla monissa kudoksissa, erityisesti keskushermostossa [57]. Varhain alkava epilepsia ja ennenaikaisen kuoleman raportoitu ADAR2 knock out hiirillä [58]. Syövän, aikaisemmassa tutkimuksessa raportoitiin yliekspressio ADAR2 in

in vitro

transformoitu ihmisen aikuisen mesenkymaalisten kantasolujen, muunnettava fibroblastien, ja jotkut solulinjat muista kudoksista [59]. Korkeammalla ADAR2 mRNA havaittiin myös androgeeni-riippumaton eturauhassyöpäsolulinjoissa suhteessa androgeenille reagoivien solulinjojen [60]. Kuitenkin useimmat raportit viittaavat syöpä, joilla on alentunut ADAR2 ilmentymistä tai aktiivisuutta. Täten lasku entsyymiaktiivisuus ADAR2 potilailla, joilla on monimuotoinen glioblastooma (KTK) liittyi suurempi Ca

2+ läpäisevyyttä ja aktivointi Akt-reitin, edistää kasvaimen kasvua ja aggressiivisuus [61], [62]. Pazin et ai. myös löytänyt laskua ADAR2 mRNA tasojen aivokasvaimia ja osoittanut, että sen yliekspressio käytettäessä MGB solulinjassa alensivat soluproliferaatioon [63]. Väheneminen ADAR2 muokkaus toimintaa, joka korreloi luokka maligniteetin, todettiin myös lapsipotilaiden astrosytoomissa [64]. Kun muokkaus tila oli palautunut kolmessa astrosytoomassa solulinjoissa, merkittävästi vähentää solujen pahanlaatuista käyttäytymistä todettiin [64]. Viime aikoina, Galeano et ai. havaittiin yleinen lasku ADAR2 välittämää editointi tapahtumia virtsarakon ja peräsuolen syöpä [65]. Kun kyseessä on keuhkosyöpä, vähentäminen ADAR2 ilmentyminen on aiemmin kuvattu okasolusyöpä keuhkosyöpä [66].

alassäätely ADAR2 keuhkosyövässä liittyy mahdollisesti geneettisiin muutoksiin on 21q22, jossa ADAR2 geeni on sijaitsevat. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet menetys geneettisen materiaalin pitkän varren kromosomin 21 potilailla, joilla on useita kiinteitä kasvaimia [67] – [71], mukaan lukien keuhkosyöpä [72] – [76]. Lee et ai. analysoidaan yhdeksän mikrosatelliittimarkkerin, väliin 21q21.1 ja 21q22.3 NSCLC potilailla. LOH havaittiin ainakin yksi heistä yli 55% kasvaimia, 26% -48% LOH esiintyvyys yksittäisissä mikrosatelliitteihin [74]. Sato et ai. kuvattu LOH at 21q22.3 28% näytteistä peräisin adenokarsinooma ja okasolusyöpä potilaille [72]. Keskityimme analysointiin 21q22.3 muutoksia alueella ADAR2. Löysimme ilmaantuvuus 30-40% LOH potilailla NSCLC, jossa lähes puolet kasvainten (23 out of 48) esillä LOH ainakin yksi mikrosatelliitteihin analysoitu. Aikaisempien tutkimusten levyepiteelikarsinoomien osoitti korkeampia taajuuksia LOH at 21q22 kuin adenokarsinooman. Lisäksi, erittäin korkea esiintyvyys LOH (75%) havaittiin, kun analyysi SNP sijaitsevat ADAR2 geenin. Nämä tulokset voidaan selittää olemassaolo vuorottelevat alueet ja ilman LOH, ja osoittavat, että ADAR2 geneettinen lokus on yksi useimmin muuttaa alueita keuhkoissa karsinogeneesissä. Yhdessä usein geneettinen tappiot ADAR2 locus ja pelkistetyssä ilmaisun mukaan ADAR2 mahdollisesti toimii tuumorisuppressori keuhkosyöpä. Toiminnalliset tiedot tukevat tätä hypoteesia, koska yli-ilmentyminen ADAR2 syöpäsolulinjoissa estää proliferaatiota ja muuttoliike [63], [64]. Lisäksi olemme osoittaneet, että alhainen ADAR2 mRNA-tasot liittyvät merkittävästi eloonjäämiseen keuhkojen adenokarsinooma potilailla. Ennustetyövälineenä pistemäärä perustuu ilmaus ADAR2 ja neljä ylimääräistä RNA aineenvaihduntaan liittyvien geenien (MARS, RAE1, SNRPB ja SNRPE) voidaan osittaa keuhkosyöpäpotilaita osaksi korkea ja matala riskiryhmiin syövän kuolemaan. Muita tutkimus on optio tutkimaan, onko tämä tieto voi olla hyödyllistä tunnistaa ne potilaat, joilla kokoisen NSCLC, joilla on suuri riski toistumista ja hyötyisivät adjuvanttihoito.

Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa tunnistettiin uusia RNA aineenvaihduntaa -aiheiset geenit ilmentyvät differentiaalisesti keuhkosyöpää ja liittyvät kliiniseen tulokseen. Nämä tulokset tukevat roolia RNA: n aineenvaihduntaa patogeneesissä tämän sairauden. Edelleen luonnehdinta sääntelymekanismeissa tämä prosessi voi mahdollisesti johtaa parannettujen strategioiden diagnoosi, ennuste, ja Keuhkosyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi eettisen valiokuntien Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, ​​Espanja) ja Hospital Marqués de Valdecilla (Santander, Espanja). Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Microarray Kokeet

neljä julkisesti saatavilla microarray kokeita käytetään tunnistamaan RNA-aineenvaihduntaan liittyvien geenien ilmentyvät differentiaalisesti välillä keuhkojen adenokarsinooma ja normaalin keuhkokudoksen [22] – [25]. Jotkut näistä kokeista sisältyy tietoja muista histologisia alatyyppejä. Viides mikrosiru koe käytettiin analysoimaan suhdetta geeniekspressiotasot ja ennusteen potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma [26]. Taulukko S3 sisältää tietoa näytteiden määrä ja histologinen alatyyppi läsnä jokaisessa tutkimuksessa.

Keuhkosyöpä Solulinjat ja Primary kulttuurien

Keuhkosyöpä solulinjat saatiin American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). Soluja kasvatettiin RPMI, jota oli täydennetty 2 mM glutamiinia, 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pieni hengitysteiden epiteelisolujen (SAEC) ostettiin Lonza (Walkersville, MD) ja viljeltiin pienten hengitysteiden epiteelin kasvualustaan ​​(SAGM, Lonza) täydennettynä SAGM SingleQuots (Lonza). Normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) soluja (Clonetics, San Diego, CA) kasvatettiin keuhkoputkien epiteelisolujen kasvua väliaineessa (BEGM, Clonetics), täydennetty kasvua täydentää ja BulletKit (Clonetics). Soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Ennen RNA: n tai DNA: n eristämiseksi, solut testattiin

Mycoplasma

saastuminen, mukaan valmistajan ohjeiden (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Cambrex, Rockland, ME).

Kliiniset näytteet

ensisijainen kasvaimia ja niiden vastaavassa normaalissa keuhkokudokset saatiin potilailta NSCLC hoidettu parantava resectional kirurgian Clínica Universidad de Navarra (Pamplona, ​​Espanja) tai sairaalan Marqués de Valdecilla (Santander, Espanja). Kukaan potilaista ei saanut kemo- tai sädehoidon ennen leikkausta. Kirurgisesti poistettu näytteet jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Vain näytteet, joissa on enemmän kuin 70% kasvainsoluja käytettiin. Histologialtaan ja vaiheissa kasvainten tutkimukseen sisältyvät on lueteltu taulukossa S4. Kasvaimet luokitellaan WHO 2004 luokittelun [77].

RNA

RNA suoritettiin käyttäen RNA Ultraspec (Biotecx Laboratories, Houston, TX). Primaari- kudosten RNA jälkeen tehtiin mekaanisia pirstoutuminen pakastettujen näytteiden avulla β-merkaptoetanolia ja RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki RNA-näytteet laimennettiin vedellä DEPC ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. RNA-pitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti (Nanodrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE).

käänteistranskriptio (RT) B

Kaksi mikrogrammaa RNA inkuboitiin 1 mM dNTP ja 50 ng /ul oligo -dTs 65 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Jälkeenpäin 4 ui 5 x RT-puskuria, 1 ui 0,1 M DTT, 40 U RNaasi Out ja 200 U Super Script III käänteistranskriptaasia (kaikki Invitrogen) lisättiin. Putkia inkuboitiin 50 minuuttia 50 ° C: ssa ja 15 minuuttia 70 ° C: ssa, ja laitettiin sitten jäihin. Lopuksi, 2 U RNaasi H: ta (Invitrogen) lisättiin, ja putkia inkuboitiin 20 minuuttia 37 ° C: ssa.