Krooninen sairaus

tiivistelmä

määrä Munuaisten syöpien on kasvanut viimeisten kymmenen vuoden aikana ja potilaan eloonjäämisen vaiheissa edelleen erittäin huono. Siksi tarvitaan uusia terapeuttisia lähestymistapoja munuaissyövän ovat välttämättömiä. Englerin A on luonnollinen tuote, jossa on hyvin tehokas ja selektiivinen sytotoksisuus munuaisten syöpäsoluja. Tämä tekee siitä lupaava lääke ehdokas, joka voi parantaa nykyistä hoitonormien munuaisten syöpiä kaikissa vaiheissa. Kuitenkin vähän tiedetään englerin A: n toimintatapa kohdentamisessa nimenomaan munuaisten syöpäsoluja. Tutkimuksemme on ensimmäinen tutkia biologista mekanismia englerin Toimintaa yksityiskohtaisesti. Me raportoimme, että englerin A on spesifinen munuaisten kasvainsoluja ja ei vaikuta normaaliin munuaissoluja. Huomaamme, että englerin Hoidon indusoi nekroottisen solukuoleman munuaisten syövän soluissa, mutta ei normaaleissa munuaissoluissa. Olemme osoittavat lisäksi, että autophagic ja pyroptotic proteiinit eivät vaikuta yhdisteen ja että nekroottisen signalointia näissä soluissa samaan aikaan reaktiivisten hapen lajien ja kalsiumin sytoplasmaan. Koska ensimmäinen analysoidaan biologisia vaikutuksia englerin A työmme tarjoaa tärkeän perustan arviointia ja validointi yhdisteen käytettäväksi kasvaimen vastainen lääke. Se tarjoaa myös puitteet, joissa voidaan tunnistaa erityistä tavoitetta tai tavoitteet englerin A munuaissyöpäsoluissa.

Citation: Sulzmaier FJ, Li Z, Nakashige ML, Fash DM, Chain WJ, Ramos JW (2012) Englerin selektiivisesti indusoi kuolion Human munuaissyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (10): e48032. doi: 10,1371 /journal.pone.0048032

Editor: Kalpana Ghoshal, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 26 syyskuu 2012; Julkaistu: 22 lokakuu 2012

Copyright: © Sulzmaier et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health, National Institute of General Medicine (R01GM088266 on JWR) ja Victoria S. ja Bradley L. Geist Foundation (47030 ja WJC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuainen syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia Yhdysvalloissa oli arviolta 60920 uutta tapausta ja 13120 kuolemantapausta vuonna 2011. Noin 85% kaikista munuaisen syövistä on luokiteltu munuaisten solukarsinoomat, maligniteetti johtuvat munuaisten epiteelin [1], [2]. Ensisijainen hoito munuaisten-karsinooma on kirurginen. Kuitenkin noin 25% potilaista on merkkejä paikallisen invaasion tai etäpesäkkeen tekee täydellisen leikkaaminen vaikea [2]. Kun tauti on edennyt pitkälle, leikkaus ei yksin riitä, ja 5 vuoden elossaololuku laskee 70%: sta alle 20% [1], [3]. Historiallisesti uusinta hoito potilailla, joilla munuaissyövän on immunomodulaarisia interferoni-α tai interleukiini-2 [4]. Kuitenkin viime vuosina lisääntyneet käytön paremmin kohdennettuja lähestymistapoja hoitoon pitkälle munuaisten syöpiä. Löytö von Hippel-Lindaun (VHL) tuumorisuppressorigeenin johtaa kehitystä reseptorityrosiinikinaasin hoidoissa on kohdistettu VEGF: n tai TGF-α-signalointireitin [5], [6]. VHL angiogeneesiä säätelevän ja tämän geenin menetys syöpäsoluissa johtaa lisääntyneeseen kasvutekijöiden kuten VEGF [7]. Vaihtoehtoisesti reseptori tyrosiinikinaasin estäjät kuten Sorafenibi että suojastusviestintä kautta vaikuttaa reitit ovat nyt hyväksytty tai kliinisissä kokeissa edenneen munuaisten syövistä [8]. Nämä lääkkeet eivät ole sovellettavissa kaikille potilaille, joiden munuaisten syöpiin ja vakavia haittavaikutuksia on raportoitu joissakin tapauksissa [2], [9].

Englerin A on guaiane sesquiterpene joka osoitti kiehtova spesifisyys kuin estäjä munuaisten syöpäsolujen kasvua [10]. Luonnollinen tuote eristettiin kuori

phyllanthus engleri

, kasvi kotoisin Tansaniassa ja Zimbabwessa. Englerin A seulottiin tiettyyn sytotoksinen vaikutus paneelin syöpäsolulinjoissa (NCI 60-cell panel). Tässä näytössä yhdiste osoitti munuaissyövän erityinen GI

50-arvot, jotka olivat jopa 1000fold alhaisempi kuin muissa syöpäsolulinjoissa. GI

50-arvot määritettiin oli niinkin alhainen kuin 11 nM tiettyjen munuaissyövän solulinjoissa [10], [11]. Englerin paitsi osoitti satunnaisia ​​spesifisyys munuaissyöpäsoluissa, joissakin tapauksissa sen teho oli jopa suurempi silloin uusinta hoitoja kuten Sorafenibi [10], [12]. Sen jälkeen alustava kuvaus vuonna 2009, labs ympäri maailmaa ovat kuvattu synteettinen strategioita tehdä luonnontuote [13], [14], [15], [16], [17], sekä kasvava määrä rakenne-aktiivisuussuhde data [11], [18], [19], [20], [21], [22]. Huolimatta suuri vaikutus, kirjallisuutta englerin A vielä vähäistä ja julkaissut artikkeleita pääasiassa käsitellä synteesi yhdisteen. Nyt raportoivat ensimmäisen kerran mekanismi, jolla englerin vaikuttaa munuaissyöpäsoluissa estävän solujen kasvua. Tuloksemme osoittavat, että englerin pyynnöstä erityisesti indusoi nekroottisen solukuoleman munuais- syövän solulinjoissa, mutta ei vaikuta elinkelpoisuutta glioblastooma tasyöpäsolulinja tai normaali munuaissoluissa. Tutkimuksemme saadaan lisätietoa biologista aktiivisuutta englerin A.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Englerin A syntetisoitiin laboratoriossa Dr. William J. Chain mukaan protokollan aiemmin julkaistu [12]. Staurosporiini ostettiin EMD Chemicals (Merck, Darmstadt, Saksa), ionomysiini ja klorokiini difosfaatiksi ostettiin Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).

Solulinjat ja soluviljelmästä

ihmisen munuaissyövän linjoja A-498 ja UO-31, samoin kuin ihmisen glioblastoomasolulinjan SF-295 saatiin DCTD Kasvain Repository of National Cancer Institute, Frederick, Maryland. Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Mediatech Inc., Manassas, VA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Life Technologies, Grand Island, NY), 1% MEM-ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Mediatech) ja 1% penisilliini- streptomysiiniä (PenStrep, Mediatech). HEK293-solut hankittiin ATCC: ltä (Rockville, MD) ja pidettiin DMEM: ssa (Mediatech), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% NEAA: ta ja 1% PenStrep. Munuaisten proksimaalisen tubulussolut (RPTC) ostettiin Lifeline Cell Technology (Frederick, MD). Soluja viljeltiin RenaLife täydellisessä alustassa (Lifeline Cell Technology). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kostutetussa inkubaattorissa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 90 ul: ssa RPMI ilman fenolipunaista ja ilman antibiootteja, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 2 mM L-glutamiinia. Cell ympättiin tiheydellä 5000 solua per kuoppa. Solujen annettiin ankkuri alas 60min 37 ° C: ssa ja 5% CO 2: ssa kosteutetussa ilmakehässä. 60 minuutin jälkeen, 10 ui englerin työliuos tai vastaava määrä DMSO: ta RPMI väliainetta lisättiin. Englerin kantaliuos valmistettiin liuottamalla yhdiste DMSO: hon pitoisuutena 10 mM. Kaikki ylimääräiset englerin Toimiva liuokset valmistettiin laimentamalla Kantaliuoksesta kanssa RPMI haluttuun loppukonsentraatioon kuten. Tilavuus englerin kantaliuos tai DMSO kantoaallon ohjauksessa näin ollen koskaan ylittänyt 0,1%: n lopullinen tilavuus. Lisäämisen jälkeen yhdiste, soluja inkuboitiin 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen proliferaatiomääritystä (XTT) mukaisesti valmistajan protokollan (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).

Solut maljattiin tiheydellä 5000 solua per kuoppa 96-kuoppaisen levyn 90 ui kulttuuri media ilman fenolipunaista ja antibiootteja. Solujen annettiin ankkuri alas 60min säännöllisesti viljelyolosuhteissa. Inkubointiajan jälkeen 10 ui englerin laimennoksia tai liuotin DMSO kontrollina lisättiin kuoppiin. Soluja inkuboitiin 48 h yhdisteen kanssa ennen alistamalla ne solunlisään- (XTT) mukaan valmistajan protokollan (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).

Mikroskopia

Brightfield micrographs otettiin käyttäen Zeiss Axiovert200M mikroskoopilla 40x tavoite. Hankitut kuvat analysoitiin käyttämällä AxioVision ohjelmistoa. Mittaviivat edustaa 20 um.

anneksiini V /PI määritys

Soluja käsiteltiin joko 1 uM englerin A kantaja DMSO tai 5 uM staurosporiinille varten ilmoitettu aikaa (1h tai 3h) . Inkubaation jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja värjättiin solunulkoisen fosfatidyyliseriinin ilmaisu käyttäen FITC-merkitty anneksiini V: n ja propidiumjodidin (PI), kuten co-tahra testata solukalvon eheyden (BD Biosciences, San Jose, CA). Väriaineet käytettiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Värjätään solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja CellQuest Pro analyysiohjelmistoa.

Solulyysis ja immunoblottauksella

Solulysaatit valmistettiin käyttäen MLB lyysipuskuria (1% NP-40, 25 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 10% glyserolia, 10 mM MgCl

2, 1 mM EDTA: ta ja proteaasi /fosfataasi-inhibiittorit). Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus. Proteiinin ekspressio havaittiin tarkat ensisijainen vasta-aineita PARP, kaspaasi 3 ja GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), samoin kuin kaspaasi 1 (EMD Millipore, Billerica, MA), Beclin-1 (Epitomics, Burlingame, CA) ja LC-3 (Novus Biologicals, Littleton, CO). Sitoutuminen primaaristen vasta-aineiden havaittiin käyttäen IRDye 680 vuohen anti-hiiri ja IRDye 800 vuohen anti-kaniini-vasta-aineita. Bändit visualisoitiin käyttämällä Odyssey Infrapuna Imaging System (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE).

kaspaasi 3 aktiivisuusanalyysiä

kaspaasi 3 aktiivisuutta soluissa käsitelty englerin A staurosporiinia tai DMSO harjoittaja kontrolli analysoitiin käyttämällä kaspaasi 3 Activity Assay Kit (Roche Diagnostics). Inkubaation jälkeen yhdisteen solut hajotettiin ja solulysaateista analysoitiin mukaan valmistajan protokollan.

ROS detektiomäärityksessä

Solut, jotka käsitelty englerin A, staurosporiinia tai kantaja-ohjaus DMSO testattiin niiden tuotannon reaktiivisen hapen ja typen lajit käyttäen Total ROS Detection Kit (Enzo Lifesciences, Farmingdale, NY). Soluja käsiteltiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Suhteellinen muutos reaktiivisen hapen tai reaktiivisia typen muodot mitattiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja CellQuest Pro analyysiohjelmistoa.

Solunsisäiset Ca

2+ määrityksessä

Solunsisäinen kalsiumpitoisuus mitattiin sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin englerin A, kantaja-DMSO: ssa tai ionomysiinillä positiivisena kontrollina. 30 minuutin kuluttua inkuboinnin yhdisteen 2 uM Fluo-3 AM: n (Life Technologies) lisättiin myöhemmin 30 minuutin inkuboinnin. Inkuboinnin jälkeen solut trypsinoitiin ja pestiin 1 x PBS: llä. Fluo-3 sitoutumisen Ca

2 + ionit mitattiin lisääntynyt fluoresenssiemissio värille 520 nm virityksessä 485 nm. Solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja CellQuest Pro analyysiohjelmistoa.

Tulokset

kemiallisesti syntetisoitu englerin vähentää elinkelpoisuus munuaissyövän solulinjojen

Englerin on kuvattu olevan voimakas aktiivisuus inhiboimaan munuaisten syöpäsolujen kasvua [10]. Viimeaikaiset julkaisut kuvaavat menetelmiä synteettisen tuotannon englerin A ilman tarvetta eristää luonnon tuotteen [13], [14], [16], [17]. Kaikki englerin A tutkimuksessamme (kemiallinen rakenne, ks. 1

) on syntetisoitiin seuraamalla protokollaa kuvattu tuoreen artikkelin Li ja työtovereiden [12]. Jotta voitaisiin arvioida teho synteettisen englerin WE seulotaan sen sytotoksisia vaikutuksia kahdessa ihmisen munuaisen syöpäsolulinjoissa (UO-31 ja A-498), joka on kuvattu aikaisemmin olevan herkkiä luonnollinen tuote. Koska ohjaus solulinjaa käytimme ihmisen glioblastoomasolulinjan (SF-295), aiemmin raportoitu olevan vastetta englerin [10]. Lisäksi olemme analysoineet vaikutuksia englerin Hoito elinkelpoisuudesta immortalisoitu munuais- solulinja on johdettu normaalista ihmisen alkion munuaissoluja (HEK293), ja normaaleihin ihmisen munuaisten epiteelisoluja (munuaisten proksimaalisten tubulussolut, RPTC). Elinkyky määritettiin mittaamalla metabolinen aktiivisuus solujen.

(A) kemiallinen rakenne englerin A. (B) Glioblastooma (SF-295), normaali kuolemattomiksi munuaissolut (HEK-293), munuaisen proksimaalisen tubule solut (RPTC) ja munuaisten syöpäsolujen (UO-31, A-498) inkuboitiin ilmoitetun pitoisuuden englerin A 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus analysoitiin käyttäen XTT proliferaatiomääritystä. Tulokset on esitetty% elinkelpoisuuden verrattuna solun käsitelty näyte kantajan kanssa DMSO. Arvot esitetään edustavat keskiarvoa ± SEM kaikki kokeet (n≥6). IC50-arvot laskettiin Prism 5 käyttäen ei-lineaarista regressiota fit (log (estäjä) vs. normalisoitu vastaus – muuttuja kulmakerroin).

Huomasimme, että englerin alennettu elinkelpoisuutta munuaisten syöpäsoluja ja se ei ollut sytotoksisia vaikutuksia glioblastooma ohjaus solulinja (Fig. 1

B

). Mielenkiintoista, yhdiste ei vaikuttanut elinkelpoisuutta HEK293 solujen joko ja vain muuttuneet solujen elinkelpoisuutta RPTCs hyvin suurilla pitoisuuksilla (Kuva. 1

B

,

jäljellä

). IC

50-arvot määritettiin 140,3 nM UO-31-solut ja 53,25 nM A-498-soluissa. IC

50 RPTCs oli noin seitsemän suuruuksia korkeampi ja laskettiin 2,53 M.

Englerin aiheuttaa morfologisia muutoksia eroaa staurosporiinille indusoiman apoptoosin

Jos haluat jättää englerin vaikutukset solujen leviämisen että osuus olisi ollut havaitun laskun aineenvaihdunta analysoitiin solujen morfologia hoidon jälkeen englerin käyttäen brightfield mikroskooppia. Morfologiset muutokset myös antanut meille mahdollisuuden erottaa apoptoottisen ja nekroottinen solukuolema. Tätä analyysiä varten olemme lisäksi verrattiin solujen morfologia vasteena inkubaation staurosporiini, tunnettu apoptoosin indusoija [23].

Huomasimme, että englerin Hoito Munuaissyöpäsolujen johti selvästi muuttunut solujen morfologia osoittaa solukuolemaan (Fig. 2). Mitään eroja solun muotoon tai rakenteeseen ei voitu havaita glioblastoomasoluissa SF-295, käsiteltiin yhdisteellä. Munuaissyöpäsoluissa käsitelty englerin Kadonneesta filopodia laajennuksia saavuttavat lopulta pyöreä, symmetrinen rakenne, ennen täysin irrotessa matriisin. Staurosporiini indusoi apoptoosia sekä glioblastooma ja munuaisten syöpäsoluja. Apoptoottista solukuolemaa oli ominaista kutistuminen solujen ja muodostumista apoptoottisten kappaleiden ympäröivän kuolevan solun. Vaikka hoito englerin aiheutti suhteellinen lasku soluvolyymiä, emme voi tarkkailla muodostumista selvä apoptoottisia kappaleita. Sekä staurosporiini ja englerin aiheutti munuaisten syövän solut kuolevat, mutta morfologisesti eri tavalla.

mikrovalokuvat osoittavat sellaisten solujen morfologian käsiteltiin englerin A tai staurosporiinin, tunnettu apoptoosin indusoija. Soluja käsiteltiin joko 1 uM englerin A tai kantaja-DMSO: ssa 60 minuuttia, tai 1 uM staurosporiini 5 tuntia. Kuvat otettiin käyttäen Zeiss Axiovert200 M mikroskooppi, jossa on 40 x vaiheen tavoite. Jokaista hoitoa, 5-10 satunnainen näkökenttävaatimusten hankittu. Koe toistettiin kolme kertaa, micrographs esitetään edustavat keskimääräistä solumorfologian käsittelyllä. Mittaviivat edustaa 20 um.

Englerin Hoidon johtaa menetykseen kalvon eheyden, mutta ei ylössäätöä ulkoisen fosfatidyyliseriinin osoittaa varhaisessa apoptoottisten vaiheessa

morfologisesti erilaiseen lopputulokseen soluissa käsitelty apoptoosin indusoija staurosporiinille johti meidät analysoimaan jos munuaissyöpäsoluissa kuolevat kautta necrotic signaaliprosesseja sijaan apoptoosin inkuboidaan englerin A. kuitenkaan suoria toimenpiteitä kuolion ovat niukat ja yleisin tapa vahvistaa nekroottista soluun kuolema tapahtuu ilman, että solu kuolee apoptoosin kautta [24]. Varhainen apoptoottiset vaiheet on tunnusomaista kasvua fosfatidyyliseriinin (PS) solunulkoiseen puolella solukalvon seuraa menetys kalvon eheyden myöhään apoptoottiset vaiheessa [25]. Käytimme FITC-leimattu anneksiini V ja propidiumjodidin analysoimaan näitä kahta muuttujaa virtaussytometrialla, joka on yhteinen lähestymistapa onko solukuolema on apoptoottinen tai nekroottisten [26], [27]. Kvantitoimme solualapopulaatioiden vastaa alussa apoptoottisten ja myöhäisten apoptoottisten /nekroottisen vaiheissa mittaamalla ekspressoivien solujen prosenttiosuus solunulkoisen PS kanssa tai ilman menetyksen kalvon eheyden (Fig. 3).

Soluja käsiteltiin joko 1 uM englerin A tai kantaja-DMSO: ssa 60 minuuttia, tai 5 uM staurosporiini 3 tuntia. Inkubaation jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja värjättiin solunulkoisen fosfatidyyliseriinin ilmaisu käyttäen FITC-merkitty anneksiini V: n ja propidiumjodidin (PI), kuten co-tahra testata solukalvon eheyden. Näkyy on seurausta edustava kolmen itsenäisen kokeellista toistoa. Kvantitatiivinen ja tilastoja kaikki tiedot kuvattu pylväskaaviot ja näyttää jakautuminen solujen testaus positiivisia anneksiini V: n sitoutumisen (varhainen apoptoottinen vaiheita) tai anneksiini V: n sitoutumisen ja propidiumjodidilla oton (myöhäinen apoptoottiset vaiheita /nekroottisen kuoleman). Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 3), tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty tähdellä (*** p 0,001), ei riittävä = Ei merkitsevä.

Kuten odotettua, ohjaus solulinja SF-295 eivät osoittaneet merkittävää kasvua apoptoottisten solujen populaatioissa, kun niitä käsitellään englerin A tai DMSO kantoaallon ohjauksessa. Staurosporiini hoito aiheutti apoptoottisen solukuoleman kaikissa solulinjoissa liittyy lisää sekä varhainen ja myöhäinen apoptoottiset solupopulaatioiden. Munuaissyöpäsoluissa A-498 olivat kaikkein herkimpiä, jolla on suurin prosenttiosuus (27%) myöhään apoptoottiset /kuolleita soluja. SF-295 ja UO-31 solulinjat osoittivat kohonnut väestö varhaisessa apoptoottisen vaiheissa noin 12-20%. Selkeä lisäys alussa apoptoottiset solut oli myös nähtävissä jälkeen 1h hoidon staurosporiinille (Fig. S1).

Mielenkiintoista, englerin Hoito ei vaikuttanut solupopulaatioiden samalla tavalla. Löysimme mitään merkittävää muutosta aikaisin apoptoottisten solupopulaatioiden (anneksiini V single positiivinen) joko UO-31 tai A-498-solujen hoidon jälkeen englerin A. käsittely aiheutti solujen menettää kalvon eheys aikaisin, mikä kaksinkertainen positiivinen värjäytyminen soluja. Vaikka solujen prosenttiosuus alussa apoptoottisen sektori ei lisääntynyt, havaitsimme tilastollisesti merkittävää kasvua noin 10-15% kuolleita soluja UO-31 solunäytteillä ja kaksinkertainen positiivinen väestöstä jopa 27% A-498-solujen jälkeen 1 h hoidon (Fig. 3, bar kaavioita). Jopa myöhemmin pisteen Määrässä yhden positiivisen, varhainen apoptoottiset solut eivät kasvavan englerin hoitoja (Fig. S1). DMSO hoitoa sekä munuaissyövän solulinjoissa (UO-31 ja A-498) ei aiheuttanut merkittäviä säätely ylöspäin joko yksi positiivinen (anneksiini V) tai kaksinkertainen positiivinen (anneksiini V ja PI) populaatioissa.

Englerin solukuolema on riippumaton PARP pilkkominen ja kaspaasi 3 aktiviteetti

Apoptoottista solukuolemaa on osittain välittyy efektori caspases kuten kaspaasi 3, jotka pilkkovat ja aktivoi alavirran tavoitteita kuten poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) . PARP ajatellaan tukea apoptoottinen signalointi kuluttamalla solujen energiavarojen [28]. Lohkaisu ja aktivointi näiden proteiinien on siis markkeri aktivoitu apoptoottisen signalointiryöpyn. Edelleen vahvistaa, että munuaissyöpäsoluissa käsitelty englerin A, eivät kuole apoptoosin kautta testasimme pilkkomista PARP (Fig. 4

) ja pilkkominen ja kaspaasi 3 (Fig. 4

ja B

). Kontrollina, hoito SF-295-solujen staurosporiinia 4 tai 5 h johti katkaistun proteiinin vyöhykkeet 17 ja 19 kDa: n, joka osoittaa aktiivisen proteiinin fragmentteja. Vastaavasti, staurosporiini hoito SF-295-solujen aiheuttaman pilkkoutumisen PARP kuten on esitetty 89kDa lohkaista fragmentti. Olemme havainneet, että englerin A ei vaikuta pilkkomisen näiden kahden proteiinin SF-295 tai munuaisten syöpäsolujen (UO-31 ja A-498). Emme havainneet taajuusalueiden lohkaistaan ​​kaspaasi 3 tai PARP hoidettaessa solulinjaa englerin A 1 tai 4 tuntia (Kuva. 4

). Vertailumalja kaikkien solulinjojen kantajan kanssa DMSO saman verran aikaa ei aiheuttanut havaittavia pilkkomalla kaspaasi 3 tai PARP (Fig. 4

A

oikea paneeli).

Cells käsiteltiin joko 1 uM englerin A, kantaja-DMSO: ssa tai 5 uM staurosporiini varten ilmoitettu määrä aikaa. (A) Inkubaation jälkeen solut lyysattiin ja lysaateista analysoitiin immunoblottaamalla PARP katkaisun tai täyspitkä ja pilkottiin kaspaasi 3 (Casp3-fl, Casp3-cl). Equal Proteiinilisäyksen vahvistettiin hyvää GAPDH. Täyspitkä ja katkaistun vanteet on merkitty. Koe toistettiin kolme kertaa. (B) Vaihtoehtoisesti inkuboinnin jälkeen solut hajotettiin ja kaspaasi 3 aktiivisuus testattiin käyttämällä kaspaasi 3 aktiivisuusanalyysiä kit. Esitetyt arvot ovat ± SEM (n = 6), tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty tähdellä (*** p 0,001). (C) Soluja käsiteltiin joko 1 uM englerin A, kantaja-DMSO 60min tai 50 uM klorokiinin difosfaattia (kloori) 18 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut lyysattiin ja lysaateista analysoitiin immunoblottauksella varten Beclin-1, LC3-I /II ja kaspaasi 1 pilkkominen (proentsyymi p45 ja pilkotaan aktiivisen alayksikön p20). Equal Proteiinilisäyksen vahvistettiin hyvää GAPDH. Kaikki kalvot analysoitiin käyttäen IRDye toissijainen vasta ja Licor Odyssey järjestelmä. Kalvot osoittaneet ovat edustavia kokeita.

Vahvista tämä tulos analysoimme kaspaasi 3 aktiivisuus ELISA perustuvaa määritystä, joka mittaa entsyymiaktiivisuus suoraan pilkkomista kaspaasi 3 alustaan. Kuten odotettua, staurosporiini hoito johti lisäystä kaspaasi 3 toimintaa sekä glioblastooma ohjaus solulinjaa ja munuaissyövän solulinjaa A-498. Englerin Hoito ei johtanut mihinkään merkittävään kasvuun entsyymiaktiivisuutta osoituksena kaspaasi 3 aktivaation (Fig. 4

B

).

Englerin A ei indusoi kaspaasi 1 pilkkominen

Pyroptosis on tila solukuoleman aiheuttama tulehdus reittejä. Signalointi on riippumaton apoptoosin liittyviin efek- caspases 3 ja 7, mutta liittyy vapautumista aktiivista interleukiini-1β välittävät kaspaasi 1 [29], [30]. Tässä me mitata kaspaasi 1 pilkkoutumisen indikaattorina pyroptotic solukuoleman. Olemme seuranneet dynamiikka kaspaasin 1 aktivoitumisen ilmaisemiseksi tasot 45 kDa: n pro-entsyymi ja 20 kDa: n alennetussa kaspaasi 1 isoformi käsittelyn jälkeen englerin A (Fig. 4

C

). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että kaspaasi 1 aktivoidaan alhaisella tasolla sekä Testauksen solulinjoja, joilla on erilaiset ekspressiotasot, jotka ovat korkeimmat SF-295-solut ja pienin A-498-soluissa. Olemme havainneet lievää taajuusalueiden lohkaista kaspaasi 1 kationi näytteitä SF-295 glioblastoomasolut ja UO-31 munuaissyöpäsoluissa. Kuitenkin hoito englerin A ei merkittävästi lisää kaspaasi 1 pilkkominen osoitus pyroptotic signalointi. Band intensiteetit halkaistut kaspaasi 1 fragmentti on vastaavasti alhainen. Tasot p45 pro-entsyymi tuskin muuttaa upon englerin Hoito (Fig. 4

C

) B

Englerin A ei indusoi autophagy

Autophagy on soluprosessin jossa sytoplasman materiaali hajotetaan avulla lysosomeihin. Mekanismi itsessään on kierrätys polku, joka liittyy yleensä solujen eloonjäämistä. On kuitenkin olemassa raportteja solujen käynnissä tilassa solukuoleman, jossa solut säätää ylös autophagic signalointi (vaikka autophagy ei ole syy solukuoleman tässä skenaariossa). Tuloksena on nimeltään autophagic solukuolemaa [31], [32]. Aktivointi autophagy voidaan analysoida seuraavien käsittelyä autophagic merkki LC3 ja sen muuntaminen päässä LC3 I isoformin että LC3 II muodossa mukana on molekyylipainon muutoksen [31]. Toinen aiemmin merkkiaine autophagy on Beclin-1, joka on ajan säädellään induktio autophagy ja laukaisee muodostumista autophagosomes [33], [34].

määrittää, jos englerin Hoidon aiheuttamaa autophagy kokeellisissa solulinjat seuraamalla muutoksia LC3 ja Beclin-1 (Fig. 4

C

). Positiivisena kontrollina havaitsemiseksi LC3 II isoformin käsittelimme kaikissa solulinjoissa, 50 uM klorokiinin (kloori) 18 tuntia, ainetta esitetty pidättämään autophagy on autophagosomal vaiheessa johtaa kohonneeseen LC3 II [35], [ ,,,0],36]. Hoito klorokiinin seurasi voimakas kasvu LC3 II tasot kaikilla testatuilla soluissa. LC3 I isoformi oli havaittavissa kaikissa solulinjoissa kaikissa hoidon olosuhteissa. Kuitenkin hoito englerin A tai kantaja-DMSO ei johtanut merkittävään säätely ylöspäin LC3 II. Vaikka pystyimme havaitsemaan heikkoa vyöhykettä tähän LC3 isoformien SF-295 ja UO-31 soluja, taso jos LC3 II ei lisännyt merkittävästi upon englerin Hoito (Fig. 4

C

).

Beclin-1 tasot voitiin havaita kaikilla koe solulinjoissa. Alin tasot löytyivät SF-295-solut, korkeimman A-498-soluissa. Käsittely englerin A tai klorokiinin ei johtanut eroihin Beclin-1 tasot joko glioblastooma tai munuaisten syöpäsoluja. Englerin A ei johda merkittävään säätely ylöspäin Beclin-1 ilmentymisen tasot (Fig. 4

C

).

Englerin aiheuttaa reaktiivisten happiradikaalien

Oksidatiivinen stressi aiheuttama liiallinen reaktiivisten hapen lajien (ROS) on tunnettu aiheuttava tekijä nekroottisen solukuoleman [24]. Siksi pyrittiin analysoimaan jos englerin aiheutti solunsisäisen ROS. Käsittelimme SF-295 ja A-498-solujen kanssa, yhdiste ja mitataan pitoisuus koko reaktiivisen hapen ja typen lajien (Fig. 5

).

(A) Soluja käsiteltiin joko 1 uM englerin A tai kantaja-DMSO: ssa 60 min. Suhteellinen muutos reaktiivisen hapen (ROS) tai reaktiivisia typen lajit (RNS) verrattuna soluihin, käsitelty kantaja-DMSO mitattiin käyttäen Total ROS havaitseminen kit. Histogrammit osoittavat fluoresenssivoimakkuudet edustavassa kokeessa (vasen paneeli). Määrällisesti suhteelliset muutokset ROS /RNS esitetään (oikea paneeli) ovat keskiarvoja ± SEM (n = 5), tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty tähdellä (* p 0,05). (B) Soluja käsiteltiin joko 1 uM englerin A tai kantaja-DMSO: ssa 60 minuuttia, tai 10 uM ionomysiinillä 50 min. Fluo-3 sitoutumisen Ca

2 + ionit mitattiin lisääntynyt fluoresenssiemissio värille 520 nm virityksessä 485 nm. Histogrammit osoittavat fluoresenssivoimakkuudet edustavassa kokeessa (vasen paneeli). Määrälliset suhteelliset muutokset solunsisäisessä kalsiumionien esitetään (oikea paneeli) ovat keskiarvoja ± SEM (n = 3), tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty tähdellä (* p 0,05, *** p 0,001).

tutkimuksessamme englerin A ei vaikuta suhteellinen määrä ROS SF-295-soluja verrattuna käsittelemällä kantaja-ohjaus DMSO. Kuitenkin, A-498-solut reagoivat voimakkaasti englerin A tuottamalla ROS pitoisuudet huomattavasti korkeampi kuin kontrollisoluissa. Kokonaismäärä reaktiivisia lajeja oli noin 2,5 kertaa suurempi, kun A-498-soluja käsiteltiin englerin A.

Englerin indusoi solunsisäisen Ca

2+ pitoisuus

Kalsium on osoitettu säätelevän nekroottisen signalointia. Liiallinen tulva solunulkoisen Ca

2 + soluihin voivat stimuloida sekä reaktiivisten happiradikaalien ja nekroottinen solukuolema [24]. Mittasimme vaikutukset englerin A solunsisäinen Ca

2+ pitoisuuksia käyttäen kalsium osoitin Fluo-3. Tämä väriaine pystyimme määrittämään määrään solunsisäisen kalsiumionien käsittelyn jälkeen englerin A (Fig. 5

B

). Suhteellinen Ca

2+ pitoisuus ei muuttunut, kun SF-295-soluja inkuboitiin englerin A. Ionomycin, tunnettu indusoija Ca

2+ virtaa soluun, kaksinkertaisti mitattuna ionit [37]. Hoito A-498 munuaissyöpäsoluissa kanssa englerin lisäsi merkitsevästi solunsisäisen kalsiumin vielä suuremmassa määrin silloin ionomysiinillä. Vaikka ionomysiini kaksinkertaistunut määrä solunsisäisen kalsiumin, englerin johti 4-kertaisesti suurempina pitoisuuksina.

Keskustelu

ilmaantuvuus lisääntyi munuaisten kasvaimia ympäri maailmaa aiheuttaa vakavan ongelman [1], [ ,,,0],38]. Jos potilaalla on munuaisten kasvaimia vaiheissa, tehokas kemoterapeuttisten ovat niukat ja yleisesti käytettyjä lääkkeitä, kuten Sunitinibi on liittynyt vakavia sivuvaikutuksia [9]. Etsittäessä uusia terapeuttisten vuoksi on keskittynyt hoitoja, jotka eivät ole ainoastaan ​​tehokkaita taistelussa kasvaimia, mutta myös riittävän tarkka ei haittaa ei-kasvainsoluihin ja välttää haitallisia sivuvaikutuksia. Luonnontuotteen englerin A on yhdiste, joka mahdollisesti täyttää nämä kriteerit. Sen korkea selektiivisyyden ja tehon vastaan ​​munuaissyöpäsoluissa laittaa sen painopiste useat tutkimusryhmät. Kuitenkin vähän tiedetään sen toimintatapa, paitsi kohdistaminen nämä solut, joilla on korkea spesifisyys [10]. Jotta täysin arvioida englerin A: n käyttöä terapeuttisena aineena ja ennakoida mahdolliset haittavaikutukset on välttämätöntä ymmärtää, että mekanismi, jolla yhdiste vaikuttaa munuaisten syöpäsoluja.

Tässä me osoitamme ensimmäistä kertaa, miten englerin tappaa munuaissyöpäsoluissa. Mikä tärkeintä, me myös ilmoittaa, että englerin A on itse asiassa spesifinen syöpä munuaisten solut ja ei vaikuta normaaliin munuaissoluja. Mitä tulee toimintatavasta, huomasimme, että englerin indusoi nekroottinen solukuoleman muoto herkällä soluissa. Apoptotic markkereita kuten fosfatidyyliseriini ulkoistamista, efek- kaspaasi aktivointia tai PARP lohkaisu eivät ole säädelty hoidon jälkeen englerin A. Plasmamembraanin läpäiseväksi tapahtuu nopeasti ja solut eivät muodosta apoptoottisia kappaleita. Samalla autophagy tasoja ei vaikuta hoidon ja yhdisteen ei näytä aiheuttavan pyroptosis kaltaisia ​​prosesseja. Kuitenkin tila solukuoleman sisältää lisääntynyt reaktiivisten happiradikaalien ja nousussa solunsisäisen kalsiumionien joko osana nekroottisen signalointi tai sen seurauksena.

potenssi yhdiste on tärkeä mittari sen luokittelu huume. Puolet maksimaalisesta estävät pitoisuudet (IC

50) nanomoolialueella tai pienempi ovat toivottavia.